JPWO2007037301A1

JPWO2007037301A1 - 有用物質の製造法

Info

Publication number: JPWO2007037301A1
Application number: JP2007537659A
Authority: JP
Inventors: 清敬原; 真輝子加藤; 英郎森
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2006-09-28
Publication date: 2009-04-09
Also published as: WO2007037301A1; US20100047861A1; EP1939301A1; EP1939301A4

Abstract

本発明によれば、染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を培地中で培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法が提供される。

Description

本発明は、微生物を用いた有用物質の製造法に関する。

微生物のＡＴＰ供給活性を用いた有用物質の製造法については、これまでに数多くの報告がある（非特許文献１〜４）。しかしながらこれらの報告では、ＡＴＰを使用して有用物質を生産する酵素について詳細な検討がなされているが、ＡＴＰを供給する複合的な酵素活性あるいは菌体活性について、詳しい解析はなされていない。上記報告では、グルコースの異化代謝によって得られるエネルギーを利用してＡＴＰを供給していることが記載されているにすぎず、ＡＴＰ供給に関与する複合的な酵素系は十分には解析されていない。

多くの微生物では、その染色体ＤＮＡの全塩基配列が明らかになっている（非特許文献５）。また、相同組換え手法を用いて、微生物の染色体ＤＮＡ上にある特定の遺伝子または染色体ＤＮＡ上の領域を意図した通りに欠損させる方法は知られている（非特許文献６）。また染色体ＤＮＡの全塩基配列情報、および相同組換え手法を利用して微生物の染色体ＤＮＡ上の各遺伝子を網羅的に破壊した変異株ライブラリー、および２０ｋｂｐ程度の削除可能な染色体ＤＮＡ上の領域のそれぞれを網羅的に欠損させた変異株ライブラリーなども作製されている（非特許文献７および８）。

E. coliのnlpD遺伝子産物は、リポ蛋白質であることが知られており、大腸菌のnlpD遺伝子破壊株は、長期間放置した場合の生菌数が野生株に比べ減少することが報告されている（非特許文献９）。また、nlpD遺伝子が破壊された大腸菌の変異株は、奈良先端科学技術大学院大学より入手することが可能である（非特許文献１０）。
しかしながら、nlpD遺伝子が欠損した微生物が有用物質の生産において有用であることは知られていない。
Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー）, 48, 693 (1997) Biosci. Biotechnol. Biochem.（バイオサイエンスバイオテクノロジーアンドバイオケミストリー）, 61, 960 (1997) Nature Biotechnol.（ネーチャーバイオテクノロジー）, 16, 847（1998） J. Appl. Biochem. （ジャーナルオブアプライドバイオケミストリー）, 5, 43 （1983） http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html J. Bacteriol.（ジャーナルオブバクテリオロジー）, 180, 2063 (1998) J. Biochem. Mol. Biol. （ジャーナルオブバイオケミストリーアンドモレキュラーバイオロジー）, 37, 83 (2004) Nature Biotechnol.（ネーチャーバイオテクノロジー）, 20, 1018（2002） J. Bacteriol. （ジャーナルオブバクテリオロジー）, 176, 1630 (1994) http://ecoli.aist-nara.ac.jp/GB5/search.jsp

本発明の目的は、ＡＴＰをエネルギー源として用いる有用物質の製造法において、効率のよい該製造法を提供することにある。

本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を培地中で培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（２）染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物の培養物または該培養物の処理物、ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素または該活性を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、炭素源、および該有用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該媒体中に有用物質を生成、蓄積させ、該媒体中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号２で表される塩基配列を有する遺伝子である、上記（１）または（２）の製造法。
（４）微生物または細胞が以下の［１］〜［５］から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強化された微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造法。
［１］有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
［２］有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
［３］有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
［４］有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
［５］野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
（５）微生物がAzotobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Klebsiella属、Methylobacillus属、Pseudomonas属、またはSalmonella属に属する微生物である、上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（６）微生物がAzotobater vinelandii、Erwinia carotovora、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Methylobacillus flagellatus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、またはSalmonella thypimuriumである上記（１）〜（５）のいずれか１つの製造法。
（７）有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、上記（１）〜（６）のいずれか１つの製造法。

本発明により、ＡＴＰをエネルギー源として製造される有用物質を、効率よく製造することができる。

１．本発明の製造法に用いられる微生物
本発明の製造法で用いられる微生物としては、染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、NlpD蛋白質とも称す）をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質（以下、NlpDホモログ蛋白質とも称す）をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物をあげることができる。なお、本明細書中では、遺伝子は構造遺伝子およびプロモーター、オペレーターなどの特定の制御機能を有する領域を含んでいる。

アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。

NlpD蛋白質をコードする遺伝子、またはNlpDホモログ蛋白質をコードする遺伝子（以下、nlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子と称す）の一部または全部が欠損しているとは、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失があるため、（１）nlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子のプロモーターまたはオペレーターなどの転写制御が機能せず、nlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子にコードされる蛋白質を発現しない微生物、（２）nlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子にフレームシフトが生じ、NlpD蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発現しない微生物、（３）nlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため活性ある蛋白質を発現しない微生物、などをあげることができ、好ましくは（３）の微生物をあげることができる。

上記（３）の微生物として、より具体的には、配列番号２で表される塩基配列において、構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため活性ある蛋白質を発現しない微生物をあげることができる。一部が欠損しているとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質がその活性を喪失する欠損であれば、配列番号２で表される塩基配列中の１塩基の欠失でもよく、好ましくは構造遺伝子中の５〜１００塩基、より好ましくは該遺伝子中の１０〜１００塩基、さらに好ましくは該遺伝子中の５０〜１００塩基の欠失をあげることができる。

また、本発明の製造法で用いられる微生物は、上記したように染色体ＤＮＡ上のNlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損している微生物であれば、いずれの属に属する微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
細菌としてはAzotobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Klebsiella属、Methylobacillus属、Pseudomonas属、またはSalmonella属に属する微生物、より好ましくはAzotobater vinelandii、Erwinia carotovora、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Methylobacillus flagellatus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putidaおよびSalmonella thypimuriumなどをあげることができ、さらに好ましくはE. coliをあげることができる。
２．本発明の製造法に用いられる微生物の調製
本発明の製造法で用いられる微生物は、（１）有用物質を生産する能力を有する微生物の染色体ＤＮＡ上に存在するnlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部を欠損させる方法、または（２）染色体ＤＮＡ上のnlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物に、有用物質の生産性を付与する方法により調製することができる。

有用物質を生産する能力を有する微生物は、１種以上の有用物質を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、該微生物としては自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、公知の方法により所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
当該公知の方法としては、
（ａ）有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。

上記（ａ）〜（ｅ）の具体的な方法は、例えば有用物質がアミノ酸である場合については、上記（ａ）の方法に関してはAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに記載されている。上記（ｂ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに記載されている。上記（ｃ）の方法に関しては、Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに記載されている。上記（ｄ）の方法に関しては、Appl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに記載されている。上記（ｅ）の方法に関しては、Agric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。

さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。

アミノ酸以外の有用物質を生産する能力を微生物に付与する方法もまた、多くの報告があり、従来知られているすべての方法は、本発明の製造法に用いられる微生物の製造に用いることができる。
染色体ＤＮＡ上のnlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば下記した微生物の染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、またはnlpD遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列情報を利用して、微生物の染色体ＤＮＡ上にあるnlpD遺伝子またはそのホモログ遺伝子に塩基の欠失を導入する方法により取得することができる。

nlpD遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列中の構造遺伝子の全部または一部をプローブに用いた、各種微生物の染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションによりnlpD遺伝子のホモログ遺伝子を同定、取得し、または配列番号２で表される塩基配列に基づき設計したプライマーＤＮＡを用い、各種微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりnlpD遺伝子のホモログ遺伝子を同定、取得した後、常法により該遺伝子の塩基配列を解析することにより決定することができる。

サザンハイブリダイゼーションおよびＰＣＲに供する染色体ＤＮＡは、いずれの微生物の染色体ＤＮＡであってもよく、好ましくはAzotobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Klebsiella属、Methylobacillus属、Pseudomonas属またはSalmonella属に属する微生物、より好ましくはAzotobater vinelandii、Erwinia carotovora、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Methylobacillus flagellatus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putidaおよびSalmonella thypimuriumなどの染色体ＤＮＡをあげることができる。

上記でいう「ハイブリダイゼーション」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。

ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。ストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。

上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。

具体的なnlpD遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列としては、Azotobater vinelandii由来のnlpD遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.AF421351）、Erwinia carotovora由来のnlpD遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.BX950851）、Pseudomonas fluorescens由来のnlpD遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.AF245440）、Pseudomonas putida由来のnlpD遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.AF260132）、Salmonella thypimurium由来のnlpD遺伝子の塩基配列（Genbank accession no.AE008833）などをあげることができる。

微生物の染色体ＤＮＡ上の遺伝子に塩基の欠失を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失が導入された変異遺伝子を、該欠失の導入対象である宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。

該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜1日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失が導入されたことを確認することができる。

上記方法により、染色体ＤＮＡ上の目的遺伝子に塩基の欠失を導入することができる微生物としては、例えばエシェリヒア属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法をあげることができる。
具体的には、塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在する領域を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えが起こさせる方法である。本方法は、直鎖ＤＮＡを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているエシェリヒア・コリをあげることができる。

λＲｅｄ組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λＲｅｄ組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるpKD46［エシェリヒア・コリジェネティックストックセンター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリ JM101株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるＤＮＡとしては、
（ａ）塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（ｂ）塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを直接連結した直鎖ＤＮＡ、
（ｃ）塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有するＤＮＡの両端に有する直鎖ＤＮＡ、および
（ｄ）上記（ａ）の直鎖ＤＮＡにおいて、薬剤耐性遺伝子と塩基の欠失の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性を有するＤＮＡの間に、さらに酵母由来のFlp recombinase〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5875 (1985)〕が認識する塩基配列を有するＤＮＡ、
などをあげることができる。

薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。

ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のsacB遺伝子〔Appl. Environ. Microbiol., 59, 1361-1366（1993）〕、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のrpsL遺伝子〔Genomics, 72, 99-104(2001)〕等をあげることができる。

上記の直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の塩基の欠失の導入対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡおよび該ＤＮＡと相同性と相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは10bp〜100bp程度が好ましく、20bp〜50bp程度がより好ましく、30〜40bp程度がさらに好ましい。
酵母由来のFlp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡにおいて１個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のFlp recombinaseが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。

相同性を有するとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したBLASTやFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。

上記直鎖ＤＮＡは、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
微生物の染色体ＤＮＡに塩基の欠損、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法１〜４があげられる。
方法１：上記（ａ）または（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（ｂ）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の領域を置換または欠失させる方法。
方法３：
［１］上記（ｃ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の塩基の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
方法４：
［１］上記（ｄ）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］上記［１］で得られた形質転換株にFlp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記［１］で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。

上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。

方法２または方法３［２］で用いられる直鎖ＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖ＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２〜４では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２つ以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
３．本発明の有用物質の製造法
本発明の製造法で製造される有用物質は、ＡＴＰおよび微生物または細胞が有する代謝能を用いて製造する際、その生合成において直接または間接的にＡＴＰを必要とする、工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、該物質としては、好ましくはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質などをあげることができ、より好ましくはタンパク質としては、イノシンキナーゼ、Glutamate 5-kinase (EC 2.7.2.11)、Glutamate-5- semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.41)、Pyrroline-5-carboxylate reductase (EC 1.5.1.2)、γ−グルタミルシステイン合成酵素(EC 6.3.2.2)、グルタチオン合成酵素(EC 6.3.2.3)、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、キシロースレダクターゼ、Ｐ４５０などをあげることができ、ペプチドとしてはグルタチオンなどをあげることができ、アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン、Ｌ−４−ヒドロキシプロリンなどをあげることができ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸などをあげることができ、ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができ、糖としては、キシロースなどをあげることができ、糖アルコールとしては、キシリトールなどをあげることができ、アルコールとしてはエタノールなどをあげることができ、有機酸としては乳酸、コハク酸などをあげることができ、生理活性低分子化合物としてはグルタチオンなどをあげることができ、脂質としては、EPA(エイコサペンタエン酸)やDHA（ドコサヘキサエン酸）などをあげることができる。

本発明の有用物質の製造法としては、１）上記２の微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から有用物質を採取する方法、および２）上記２の微生物の培養物または該培養物の処理物、ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素または該活性を有する細胞の培養物または該培養物の処理物、炭素源、および該有用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該媒体中に有用物質を生成、蓄積させ、該媒体中より該有用物質を採取する方法をあげることができる。
（１）発酵法による有用物質の製造
上記１）の方法において、該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。

無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。

また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

培養物中に生成、蓄積した有用物質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
（２）上記２の微生物をATPの供給源として用いる方法
上記２）の方法で用いられる上記２の微生物の培養物は、上記（１）の培養方法で上記２の微生物を培養することにより取得することができる。

微生物の培養物の処理物としては、該処理物がATPを生産する活性を有する限り、特に制限されないが、例えば、該培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物の浸透圧を下げて得られる処理物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の溶媒処理物および該細胞の固定化物などの細胞の形態を保持し、該培養物と実質的に同じ活性を有する処理物、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物などの粗酵素抽出物などをあげることができる。

媒体としては、水、水性媒体もしくは有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。また水性媒体としては、上記（１）の微生物を培養する際に用いる培養液、および該微生物を培養して得られる培養物の上清もあげることができる。

ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素としては、該酵素が担う反応にATPが必要な酵素であれば、特に制限されない。該酵素としては、例えばγ−グルタミルシステインシテターゼおよびグルタチオンシンテターゼなどをあげることができる。またATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する細胞としては、該細胞が有用物質の前駆体を代謝して該有用物質を生成する過程に直接または間接的にATPが関与する代謝系を有する細胞である限り、特に制限されず、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などをあげることができ、好ましくは微生物をあげることができる。該微生物としては、上記２の方法により、所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与した微生物が好ましい。

該細胞の培養物の処理物としては、該処理物がATPを用いて有用物質を製造する能力を有する限り特に制限されないが、例えば培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物の浸透圧を下げて得られる処理物、培養物を遠心分離して得られる細胞、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞の溶媒処理物および該細胞の固定化物などの細胞の形態を保持し、該培養物と実質的に同じ活性を有する処理物、並びに該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕物、該細胞から抽出される蛋白質分画物、および酵素の固定化物などの粗精製酵素などをあげることができる。

炭素源としては、本発明の製造法で用いられる微生物が代謝し、ATPの生成に用いることができる炭素源であれば特に制限されないが、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等をあげることができる。

有用物質の前駆物質としては、細胞内で代謝されて有用物質に変換される物質であれば、特に限定されず、所望の有用物質の公知の生合成経路上流にある物質から適宜選択することができる。
また、上記２）の製造法において、必要に応じてリン酸を媒体に添加してもよい。
さらに、媒体には必要に応じて、例えばトライトンX-100、ベンザルコニウムクロライドおよびドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤の濃度は、有用物質の生成を妨げない濃度であれば、いずれでもよいが、0.05〜5％、好ましくは0.1〜2％、より好ましくは0.2〜1％をあげることができる。

上記２）の製造法において用いられる微生物、およびATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する細胞の量は、その比活性等により異なるが、例えば、1mgの有用物質の前駆物質あたり、湿重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素の量は、有用物質の前駆物質1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mg添加する。反応は20〜50℃で行なうことが好ましく、特に25℃〜37℃で行なうことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常2〜150時間、好ましくは6〜120時間である。

媒体からの有用物質の採取は、上記（１）の方法により行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例におけるＤＮＡ操作等に関する方法は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載の方法を適宜用いることができる。

nlpD遺伝子欠損株の作製
奈良先端科学技術大学院大学より、カナマイシン耐性マーカーによってnlpD遺伝子が破壊されているE. coli BW25113 ΔnlpD::km（以下、E. coliΔnlpD-K株と表記する)を入手した。
トランスポゾンTn10を染色体ＤＮＡ上に持つE. coli CGSC7465株（米国Yale大学で運営されているColi Genetic Stock Centerから入手可能）の染色体ＤＮＡを鋳型に用い、配列番号４および５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、LA-Taq(タカラバイオ社製)を用い、染色体ＤＮＡ 10ng、プライマーＤＮＡ各50pmolを含む100μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で90秒間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。

目的とするＤＮＡ断片が増幅していることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製した。精製したＤＮＡ溶液 1μlを鋳型として、配列番号６および７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、テトラサイクリン耐性遺伝子を中央部に持ち、両端にnlpD遺伝子の５’末端側ならびに３’末端側と相同な配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、鋳型 1ng、プライマーＤＮＡ各40pmolを含む反応液50μlをLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で2分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。増幅ＤＮＡ断片をQIA quick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、30μｌのＤＮＡ溶液を得た。

E. coli BW25113/pKD46株（米国Yale大学で運営されているColi Genetic Stock Centerから入手可能）のコンピテントセルを、文献［Gene, 246, 321-330 (2000)］に記載の方法に従って調製し、先に調製した0.5μlのＤＮＡ溶液を用いて形質転換を行った。形質転換は、0.1cmのキュベット(BioRad社製)中で、1.8KV、25μFの条件で、エレクトロポレーションにより行った。

形質転換した細胞を、1mlのＬＢ液体培地［10g/l バクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/l バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）、5g/l 塩化ナトリウム、1ml/lの割合で1mol/l 水酸化ナトリウムを添加］を用いて30℃で2時間培養した後、15μg/mlのテトラサイクリン、100μg/mlのアンピシリン、1％グルコースを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を1.5％含むもの）上に塗布し、30℃で一晩培養した。生育してきた株は、E. coli BW25113/pKD46株の染色体ＤＮＡ上のnlpD遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と置換された株［E. coli BW25113/pKD46 ΔnlpD::tet］であった。該株をE. coli ΔnlpD-T株と命名した。

次にE. coli ΔnlpD-T株からＰ１ファージストックを以下の方法により調製した。E. coliΔnlpD-T株を15μg/mlのテトラサイクリン、100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ液体培地［10g/l バクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/l バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）、5g/l 塩化ナトリウム、1ml/lの割合で1mol/l 水酸化ナトリウムを添加］を用いて30℃にて一晩培養した後、そこから0.5mlの培養物をとり、1.4mlの新しいＬＢ液体培地および100μlの0.1mol/l 塩化カルシウム溶液を加え混合した。

該混合溶液を30℃で5〜6時間振とう培養した後、400μlの該混合液を滅菌したチューブに移した。そこに2μlのＰ１ファージストック溶液を添加し、37℃で10分間保温した後、50℃に保温したソフトアガー溶液（10g/l バクトトリプトン、5g/l バクトイーストエキストラクト、5mmol/l 塩化カルシウム、15g/l 寒天、1ml/lの割合で1mol/l 水酸化ナトリウムを添加）を3ml添加して、よく攪拌し、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（10g/l バクトトリプトン、5g/l バクトイーストエキストラクト、5mmol/l 塩化カルシウム、15g/l 寒天、1ml/lの割合で1mol/l 水酸化ナトリウムを添加。プレートの直径は15cm）上にまいた。

該プレートを37℃で7時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収し、1500×g、4℃の条件下で10分間遠心分離した。上清1.5mlに対し100μlのクロロホルムを添加し、4℃にて一晩保存した。翌日、溶液を15000×gにて2分間遠心分離し、上清をファージストックとして4℃で保存した。
E. coli ΔnlpD-T株をＬＢ寒天培地［10g/l バクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/l バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）、5g/l 塩化ナトリウム、15g/l 寒天、1ml/lの割合で1mol/l水酸化ナトリウムを添加］上に塗布し、43℃で一晩培養した。複数のコロニーを100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地と含まないＬＢ寒天培地に同時にスポットし、アンピシリンを含まないＬＢ寒天培地のみで生育したコロニーを選択することにより、E. coli ΔnlpD-T株から温度感受性プラスミドpKD46が脱落した株を取得し、E. coli BW25113ΔnlpD株と命名した。

nlpD遺伝子欠損株のATP生産活性の測定
ATPは生体の様々な反応に必須な高エネルギーリン酸化合物であり、補酵素である。ルシフェラーゼはルシフェリンとATPを基質として発光する。大腸菌はATP生産活性を有しており、発光を指標として大腸菌が有するATP生産能力を評価することができる。
（１）菌体の処理
E. coli BW25113ΔnlpD株とその親株であるE. coli BW25113株を、それぞれ1mlの3％グルコースを含むＬＢ液体培地（ＬＢＧ培地）を用いて、30℃で24時間、振盪培養した。培養終了時に濁度を測定（590nmの波長光で測定。以下、OD590nmと表記する）したところ、BW25113株の値を100としたとき、E. coli BW25113ΔnlpD株は109であった。得られた培養物200μlをそれぞれ遠心分離して菌体を沈殿させ、上清を取り除いた後に、100μlの40mmol/lトリス塩酸バッファー（0℃、pH7.4）を用いて該菌体を1回洗浄した後、30μlの40mmol/lトリス塩酸バッファー（0℃、pH7.4）に懸濁した。得られた菌体懸濁液に30μlのＧＴ溶液（40％グルコース、0.8％トライトンX-100）を加えてATP生産活性測定用の菌体懸濁液を調製した。
（２）ATPの生産活性の測定
90μlの反応液（0.5 mmol/l Ｄ-ルシフェリン、1.25μg/ml ホタルルシフェラーゼ、5 mmol/l 硫酸マグネシウム、100mmol/l エチレンジアミンテトラ硫酸、1mmol/l ジチオスレイトール、0.4％トライトンX-100、15mmol/lリン酸一カリウム、25mmol/l トリシンバッファー、pH7.4）に、上記（１）で取得した菌体懸濁液を10μl添加して室温で3分間発光を測定した。発光値の測定には、パーキンエルマー社製のプレートリーダーを用いた。発光値とは、測定器に依存する相対的な発光の検出値で、一般的にRLUと呼ばれているものである。

RLUの時間変化［RLU（3分）−RLU（0分）］／3からATPの生産速度を比較したところ、E. coli BW25113株のATPの生産速度を100としたとき、E. coli BW25113ΔnlpD株のATPの生産速度は182であった。この結果は、nlpD遺伝子欠損株ではATP生産活性が上昇していることを示している。

nlpD遺伝子欠損株によるグルタチオンの生産
グルタチオンは、3種類のアミノ酸（グルタミン酸、システイン、グリシン）からなるペプチド性物質である。γ−グルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素の働きにより、前述の３つのアミノ酸が縮合しグルタチオンが生合成される。ATPは、この縮合反応に必須な補酵素である。大腸菌はATP生産活性を有しており、グルタチオンの生産性を指標として大腸菌が有するATP生産活性を評価することができる。
（１）グルタチオン生合成酵素遺伝子の取得
特開昭58-20196号およびJ. Gen. Microbiol., 128, 1047-1052(1982) に記載の方法に従い、グルタチオンによるγ−グルタミルシステイン合成酵素の阻害が解除された変異株（大腸菌RC912株）を作製する。本菌株は微工研条寄第47号として入手することもできる。

次に特開平2-31690号およびAppl. Environ. Microbiol., 44, 1444-1448 (1982) に記載の方法に従い、大腸菌RC912株染色体上のγ−グルタミルシステイン合成酵素構造遺伝子を含むPstI断片を、プラスミドpBR322上にクローニングする。
さらに特開平2-31690号およびAgric. Biol. Chem., 47, 1381-1383 (1983) に記載の方法に従い、大腸菌RC912株染色体上のグルタチオン合成酵素構造遺伝子を含むHindIII断片を、プラスミドpBR322上にクローニングする。また特開平2-31690号およびBioprocess Technol., 19, 159-183(1994) に記載の方法に従い、それら二つのクローン化断片を一つのベクタープラスミドpBR325上に導入し、特開平2-31690号またはBioprocess Technol., 19, 159-183(1994) に記載のpBR325-gshI・IIまたはpGS500と同様のプラスミドを作製することもできる。該プラスミドを保有する株はFERM BP-337株として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに保存されている。FERM BP-337株から該プラスミドを分離し、pGS600と命名して以下の実験に用いた。
（２）nlpD欠損株ならびに親株へのプラスミド導入と菌体取得
E. coli BW25113株、およびE. coli BW25113を親株とするnlpD遺伝子欠損株であるE. coli ΔnlpD-K株を、pGS600を用いて塩化カルシウム法［モレキュラークローニング第３版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、2001年］により形質転換した。形質転換株は20μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートを用いて選択し、それぞれE. coli BW25113/pGS600株、およびE. coli BW25113ΔnlpD/pGS600株と命名した。

E. coli BW25113/pGS600株、およびE. coli BW25113ΔnlpD/pGS600株を、それぞれ2.5mlの3％グルコースを含むＬＢ液体培地（ＬＢＧ培地）を用いて、30℃で24時間、振盪培養し、得られた培養物200μlを20mlの新しいＬＢＧ培地が入った三角フラスコに植菌し、30℃で24時間、振盪培養した。培養終了時に測定した濁度(OD 590nm)を表１に記載した。
得られた培養物はそれぞれ遠心分離して菌体を沈殿させ、5mlの100mmol/lトリス塩酸バッファー（0℃、pH7.4）を用いて該菌体を2回洗浄した。得られた洗浄菌体に200μlのＧＴ溶液（20％グルコース、0.4％トライトンX-100）を加えて菌体懸濁液を調製した。
（３）グルタチオンの生産
900μlの反応液（2％グルコース、20mmol/l 硫酸マグネシウム、20mmol/l 硫酸二カリウム、0.22mmol/l 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、0.14mmol/l フラビンモノヌクレオチド、5mmol/l グルタミン酸、5mmol/lシステイン、5mmol/l グリシン、0.4％トライトンX-100、15mmol/l リン酸一カリウム、200 mmol/l MOPSバッファー、pH7.8）に、上記（２）で取得した菌体懸濁液を100μl添加して30℃で60分間振盪しながら反応を行った。反応液中に蓄積したグルタチオンの定量は、グルタチオン定量キット（同仁化学研究所社製）を用いて行った。結果を表１に示す。

表１に示すとおり、nlpD遺伝子欠損株のグルタチオン生産量は、親株に比べ菌体量の増加割合以上に多かった。この結果からnlpD遺伝子欠損株のATP合成活性の向上は、物質の生産性の向上につながることが示された。

nlpD遺伝子欠損株を用いたプロリン生産
（１）プロリン分解酵素遺伝子putA欠損株の作製
pHSG398プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ社より購入）を鋳型にし、配列番号８および９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、EX-Taq（タカラバイオ社製）を用いて、精製プラスミドＤＮＡ 20ng、プライマーＤＮＡ各50pmolを含む反応液100μlをEX-Taqに添付の指示書に従い調製し、95℃で1分間保温後、94℃で30秒間、64℃で30秒間、72℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で3分間保温するという条件で行った。増幅ＤＮＡ断片をQIA quick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、30μｌのＤＮＡ溶液を得た。

次に、混入している微量のプラスミドpHSG398を分解するため、該ＤＮＡ溶液に制限酵素PstIとBglIそれぞれを10Uずつ添加し、37℃で2時間保温後、増幅ＤＮＡ断片をQIA quick PCR Purification Kitを用いて精製し、30μlのＤＮＡ溶液を得た。
次に、該ＤＮＡ溶液 0.1μlを鋳型として、配列番号１０および１１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を中央部に持ち、両端にputA遺伝子の５’末端側ならびに３’末端側と相同な塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、EX-Taqを用いて、鋳型ＤＮＡ 10ng、プライマーＤＮＡ各50pmolを含む100μlの反応液をEX-Taqに添付の指示書に従い調製し、95℃で1分間保温後、94℃で30秒間、51℃で30秒間、72℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で3分間保温するという条件で行い、増幅ＤＮＡ断片を上記と同様の方法で精製した。

次に、該ＤＮＡ1μgを用いて実施例１と同様のエレクトロポレーションによりE. coli BW25113/pKD46株の形質転換を行った。形質転換した細胞を、2mmol/lのIPTGを含む1mlのＳＯＣ液体培地を用いて30℃で3時間培養した後、50μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を1.5％含むもの。以下、ＬＢｃｍ寒天培地プレートと略す）上に塗布し、37℃で一晩培養した。

生育してきた株は、E. coli BW25113/pKD46株の染色体ＤＮＡ上のputA遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換された株であることを確認し、該株をE. coli ΔputA-C株と命名した。
次に、E. coli ΔputA-C株から実施例１と同様の方法でP1ファージを取得した。Ｃａ−ＬＢ液体培地で30℃、4時間培養したE. coli W3110株の培養液を200μl分取し、ファージストックを1μl添加した。37℃で10分間保温した後、5mlのＬＢ液体培地と200μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。

1500×g、25℃の条件下で10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に1mlのＬＢ液体培地と10μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を加え30℃で2時間保温した。100μlの該溶液を50mg/lのクロラムフェニコールを含むアンチバイオティックメディウム3寒天平板培地（0.15％肉エキス、0.15% 酵母エキス、0.5% ペプトン、0.1% グルコース、0.35% 塩化ナトリウム、0.132% リン酸水素二カリウム、1.5% 寒天、pH7.0）に塗布し、30℃で一晩培養した。

出現したコロニー24個をそれぞれ、50mg/lのクロラムフェニコールを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性を確認し、クロラムフェニコール耐性株を選抜することにより、putA遺伝子欠損［ΔputA::Cm］が形質導入されたE. coli W3110株を取得し、E. coli W3110ΔputA株と命名した。
（２）E. coli W3110ΔputA株のnlpD遺伝子欠損株の作製
実施例１で作製したE. coli ΔnlpD-T株由来のP1ファージストックを用いて、上記（１）のファージによる形質導入と同様の方法にて、E. coli ΔnlpD-T株由来のnlpD遺伝子欠損［ΔnlpD::tet］をE. coliW3110ΔputA株へ形質導入し、20mg/lのテトラサイクリンに耐性を示す株として形質導入株を選択し、E. coliW3110ΔputAΔnlpD株と命名した。
（３）脱感作型proBAオペロンを保有するプラスミドの作製
（ｉ）変異型proBAオペロンを保有するプラスミドの作製
E. coli W3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１２および１３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、proBAオペロンを含む4kbpのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、LA-Taqを用いて、染色体ＤＮＡ 10ng、プライマーＤＮＡ各20pmolを含む25μlの反応液をLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で4分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温する条件で行った。

目的とするＤＮＡ断片が増幅されていることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して精製し、PCR-Script Cloning Kit（QIAGEN社製）を用いて、プラスミドpPCR-Script Ampにクローン化しすることで、プラスミドpPCR proBA を作製した。QuickChange Kit（QIAGEN社製）を用いてpPCR proBAのproBに点突然変異proB74〔Gene, 64, 199-205 (1988)〕を該Kitに添付されている指示書に従って導入し、プラスミドpPCR proB74Aを作製した。変異点導入のために用いたプライマーＤＮＡの塩基配列は配列番号１４に示した。

プラスミドpPCR proB74Aを鋳型にし、配列番号１５および１６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーとして用いて PCRを行い、SD 配列、BamHIおよびHindIIIの制限酵素サイトを付加したproB74A遺伝子を増幅した。PCR はPyrobest（タカラバイオ社製）を用いてプラスミドDNA 100ng、プライマーDNA 各20pmolを含む25μlの反応液を調製し、98℃で2分間保温後、98℃で10秒間、55℃で30秒間、72℃で2.5分間のサイクルを25 回繰り返す条件で行った。

増幅断片を精製し制限酵素 BamHI、HindIIIを用いて切断し、同じ制限酵素で処理した pQE80 （キアゲン社製）のベクター部分をアガロースゲル電気泳動で分離し切り出した後精製し、TaKaRa Ligation Kit で両断片を連結し、組換え体ＤＮＡを作製した。該組換え体ＤＮＡを用いて E. coli DH10B (Invitrogen社製) を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含有する LB 寒天培地に塗布し、出現したコロニーよりプラスミドを精製した。得られたプラスミドは、IPTGで誘導可能な脱感作型プロリン生合成酵素遺伝子を有するプラスミドであり、pQE80proB74Aと命名した。

E. coli W3110ΔputA株、およびE. coli W3110ΔputAΔnlpD株を、それぞれpQE80proB74Aを用いて塩化カルシウム法［モレキュラークローニング第３版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、2001年］により形質転換した。形質転換株は50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地を用いて選択し、それぞれE. coli ΔputA/pQE80proB74A株およびE. coli ΔputAΔnlpD/pQE80proB74A株と命名した。

上記形質転換株を、それぞれ5mlのＭｅｄ４液体培地（2％グルコース、1％ポリペプトン、0.5％バクトイーストエキストラクト、1％塩化ナトリウム、2％炭酸カルシウム）が入った試験管に植菌し、30℃にて20時間、振とう培養し培養物を得た。
300μlの該培養物を、30mlのＭｅｄ７液体培地（4％グルコース、0.8％ペプトン、0.1％リン酸二水素カリウム、0.05％硫酸マグネシウム・七水和物、0.002％塩化カルシウム、2％炭酸カルシウム、1％硫酸アンモニウム、0.2％塩化ナトリウム、0.03％硫酸鉄）が入った300ml容の三角フラスコに植菌し、30℃で振とう培養した。濁度（OD660nm）が0.7に到達した段階で、IPTGを終濃度50μmol/lになるように添加した。

培養開始から41時間目で培養を終了し、培養物の一部をサンプリングして遠心分離し、その上清を1000倍に希釈してダイオネクス社製のアミノ酸直接分析システムＤＸａ−５００を用いて培養物中のプロリン蓄積量を測定した。結果を表２に示す。

表２に示すとおり、nlpD遺伝子欠損株は、対照株に比べプロリン生産性が1.7倍以上であった。この結果は、nlpD遺伝子欠損株は、ATPがその生合成経路上で直接的に関与する物質生産のみならず、ATPが間接的に関与する、微生物および細胞を用いた様々な物質の生産にも利用できることを示している。

本発明により、有用物質を効率よく生産することができる。

配列番号３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明；合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明；合成ＤＮＡ

Claims

染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物を培地中で培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
染色体ＤＮＡ上の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損している微生物の培養物または該培養物の処理物、ATPをエネルギー源として有用物質を生成する活性を有する酵素または該活性を有する細胞の培養物もしくは該培養物の処理物、炭素源、および該有用物質の前駆物質を媒体中に共存せしめ、該媒体中に有用物質を生成、蓄積させ、該媒体中より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号２で表される塩基配列を有する遺伝子である、請求項１または２記載の製造法。
微生物または細胞が以下の（１）〜（５）から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強化された微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
（１）有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法
（２）有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
（３）有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（４）有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法
（５）野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
微生物がAzotobacter属、Erwinia属、Escherichia属、Klebsiella属、Methylobacillus属、Pseudomonas属、またはSalmonella属に属する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
微生物がAzotobater vinelandii、Erwinia carotovora、Escherichiacoli、Klebsiella pneumoniae、Methylobacillus flagellatus、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、またはSalmonella thypimuriumである請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造法。
有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造法。