JPWO2006025477A1 - 工業的に有用な微生物 - Google Patents
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Abstract
本発明によれば、配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体DNAを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物、および該菌株を用いた有用物質の製造法、特にタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質の製造法が提供される。
Description
本発明は、有用物質を生産する能力を有する微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造法に関する。
微生物を用いたアミノ酸等の有用物質の製造法はこれまで数多く報告されているが、そのほとんどは(1)有用物質の生合成酵素遺伝子の発現が強化された微生物、(2)該遺伝子の脱感作型変異遺伝子を有する微生物、または(3)有用物質の分解酵素遺伝子が破壊された微生物等を用いた製造法である(非特許文献1〜3)。
上記(1)〜(3)以外の微生物を用いた有用物質の製造法としては、増殖速度を低下させる活性を有する蛋白質をコードするrmf遺伝子を破壊したEscherichia coliを用いたリジンの製造法(特許文献1)などが知られている。しかしながら、一般的には間接的に有用物質の生合成の促進や分解の抑制に関与している遺伝子を特定することは困難である。
上記(1)〜(3)以外の微生物を用いた有用物質の製造法としては、増殖速度を低下させる活性を有する蛋白質をコードするrmf遺伝子を破壊したEscherichia coliを用いたリジンの製造法(特許文献1)などが知られている。しかしながら、一般的には間接的に有用物質の生合成の促進や分解の抑制に関与している遺伝子を特定することは困難である。
多くの微生物では、その染色体DNAの全塩基配列が明らかになっている(非特許文献4)。また、相同組換え手法を用いて、微生物の染色体DNA上にある特定の遺伝子または染色体DNA上の領域を意図した通りに欠損させる方法は知られている(非特許文献5)。また染色体DNAの全塩基配列情報、および相同組換え手法を利用して微生物の染色体DNA上の各遺伝子を網羅的に破壊した変異株ライブラリー、および20kbp程度の削除可能な染色体DNA上の領域のそれぞれを網羅的に欠損させた変異株ライブラリーなども作製されている(非特許文献6および7)。
E.coliのintegration host factor[ihfA(himA)遺伝子産物およびihfB(himD)遺伝子産物の複合体。以下、ihfAB遺伝子産物複合体という]を構成する蛋白質のアミノ酸配列、および該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は既に知られている(非特許文献8)。また、E.coliにおいて、ihfAB遺伝子産物複合体が大腸菌染色体上の様々な部位に結合し、様々な遺伝子の転写制御を行っていることも知られている(非特許文献9)が、ihfAB遺伝子産物複合体の活性と有用物質の生産性との関係は知られていない。
特開2002−306191号公報 ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING BIOTECHNOLOGY,79,Springer社刊(2003) 核酸発酵,講談社サイエンティフィク社刊(1976年) J.Biosci.Bioeng.,90,522(2000) http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html J.Bacteriol.,180,2063(1998) 蛋白質 核酸 酵素、第46巻、2386頁、2001年 Nature Biotechnol.,20,1018(2002) Science,277,1453(1997) J.Bacteriol.,181,3246(1999)
本発明の目的は、有用物質の生産性が向上した微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造法を提供することにある。
本発明は、以下の(1)〜(7)に関する。
(1)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体DNAを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物。
(2)配列番号1または2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号3または4で表される塩基配列を有する遺伝子である、上記(1)の微生物。
(3)微生物が以下の[1]〜[5]から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強化された微生物である、上記(1)または(2)の微生物。
[1]有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和または解除する方法
[2]有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法
[3]有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法
[4]有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化または遮断する方法
[5]野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
(4)微生物がErwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属またはXanthomonas属に属する微生物である、上記(1)〜(3)のいずれか1つの微生物。
(5)微生物がErwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Serratia marcescens、Serratiaficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Proteus rettgeri、Pseudomonasputida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas thazdinophilum、Xanthomonas ovyzaeおよびXanthomonas capestrisからなる群より選ばれる微生物である上記(1)〜(4)のいずれか1つの微生物。
(6)上記(1)〜(5)のいずれか1つの微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取する、有用物質の製造法。
(7)有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、上記(1)〜(6)のいずれか1つの製造法。
(1)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体DNAを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物。
(2)配列番号1または2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号3または4で表される塩基配列を有する遺伝子である、上記(1)の微生物。
(3)微生物が以下の[1]〜[5]から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強化された微生物である、上記(1)または(2)の微生物。
[1]有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和または解除する方法
[2]有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法
[3]有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法
[4]有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化または遮断する方法
[5]野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
(4)微生物がErwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属またはXanthomonas属に属する微生物である、上記(1)〜(3)のいずれか1つの微生物。
(5)微生物がErwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Serratia marcescens、Serratiaficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Proteus rettgeri、Pseudomonasputida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas thazdinophilum、Xanthomonas ovyzaeおよびXanthomonas capestrisからなる群より選ばれる微生物である上記(1)〜(4)のいずれか1つの微生物。
(6)上記(1)〜(5)のいずれか1つの微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取する、有用物質の製造法。
(7)有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、上記(1)〜(6)のいずれか1つの製造法。
本発明により、有用物質の生産性が向上した微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造法を提供することができる。
1.本発明の微生物
本発明の微生物としては、配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質(IhfA蛋白質若しくはIhfB蛋白質)をコードする遺伝子、または配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体DNAを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物をあげることができる。なお、本明細書中では、遺伝子は構造遺伝子およびプロモーター、オペレーターなどの特定の制御機能を有する領域を含んでいる。
本発明の微生物としては、配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質(IhfA蛋白質若しくはIhfB蛋白質)をコードする遺伝子、または配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体DNAを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物をあげることができる。なお、本明細書中では、遺伝子は構造遺伝子およびプロモーター、オペレーターなどの特定の制御機能を有する領域を含んでいる。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol.,183,63(1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子(以下、ihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子と称す)の一部または全部が欠損した染色体DNAを有する微生物としては、染色体DNA上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失、置換または付加があるため、(1)ihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子のプロモーターまたはオペレーターなどの転写制御が機能せず、ihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子にコードされる蛋白質(以下、Ihf蛋白質またはそのホモログ蛋白質と称す)を発現しない微生物、(2)フレームシフトが生じ、Ihf蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発現しない微生物、(3)ihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子中の構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため、Ihf蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発現しない微生物、などをあげることができ、好ましくは(3)の微生物をあげることができる。
上記(3)の微生物として、より具体的には、配列番号3または4で表される塩基配列において、構造遺伝子の一部または全部が欠損しているため、Ihf蛋白質またはそのホモログ蛋白質が活性ある蛋白質として発現しない微生物をあげることができる。一部が欠損しているとは、配列番号1または2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質がその活性を喪失する欠損であれば、配列番号3または4で表される塩基配列中の構造遺伝子部分の1塩基の欠失でもよく、好ましくは配列番号3または4で表される塩基配列からなる遺伝子に含まれる構造遺伝子中の5〜10塩基、より好ましくは該遺伝子中の10〜50塩基、さらに好ましくは該遺伝子中の50〜100塩基の欠失をあげることができる。
本発明の微生物が生産する有用物質は、微生物が生産することができる工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、好ましくはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質などをあげることができ、より好ましくはタンパク質としては、イノシンキナーゼ、Glutamate 5−kinase(EC 2.7.2.11)、Glutamate−5−semialdehyde dehydrogenase(EC 1.2.1.41)、Pyrroline−5−carboxylate reductase(EC 1.5.1.2)、ヒト顆粒球コロニー刺激因子などをあげることができ、ペプチドとしては、グルタチオンなどをあげることができ、アミノ酸としては、L−アラニン、グリシン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−リジン、L−メチオニン、L−スレオニン、L−ロイシン、L−バリン、L−イソロイシン、L−プロリン、L−ヒスチジン、L−アルギニン、L−チロシン、L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−システイン、L−3−ヒドロキシプロリン、L−4−ヒドロキシプロリンなどをあげることができ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸などをあげることができ、ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができ、糖としては、キシロース、キシリトールなどをあげることができ、脂質としては、EPA(エイコサペンタエン酸)やDHA(ドコサヘキサエン酸)などをあげることができる。
また、本発明の微生物は、上記したように染色体DNA上のihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの属に属する微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
細菌としてはErwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属またはXanthomonas属に属する微生物、より好ましくはErwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Serratia marcescens、Serratia ficaria、Serrati afonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella typhimurium、Escherichiacoli、Proteus rettgeri、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas thazdinophilum、Xanthomonas ovyzaeまたはXanthomonas capestrisをあげることができ、さらに好ましくはE.coliをあげることができる。
2.本発明の微生物の製造法
本発明の微生物は、(1)有用物質を生産する能力を有する微生物の染色体DNA上に存在するihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部を欠損させる方法、または(2)染色体DNA上のihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物に、有用物質の生産性を付与する方法により製造することができる。
細菌としてはErwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属またはXanthomonas属に属する微生物、より好ましくはErwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Serratia marcescens、Serratia ficaria、Serrati afonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella typhimurium、Escherichiacoli、Proteus rettgeri、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas thazdinophilum、Xanthomonas ovyzaeまたはXanthomonas capestrisをあげることができ、さらに好ましくはE.coliをあげることができる。
2.本発明の微生物の製造法
本発明の微生物は、(1)有用物質を生産する能力を有する微生物の染色体DNA上に存在するihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部を欠損させる方法、または(2)染色体DNA上のihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物に、有用物質の生産性を付与する方法により製造することができる。
有用物質を生産する能力を有する微生物は、1種以上の有用物質を生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、該微生物としては自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、公知の方法により所望の有用物質を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
当該公知の方法としては、
(a)有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和または解除する方法、
(b)有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法、
(c)有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法、
(d)有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化または遮断する方法、および
(e)野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
当該公知の方法としては、
(a)有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和または解除する方法、
(b)有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法、
(c)有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法、
(d)有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化または遮断する方法、および
(e)野生型株に比べ、有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
上記(a)〜(e)の具体的な方法は、例えば有用物質がアミノ酸である場合については、上記(a)の方法に関してはAgric.Biol.Chem.,43,105−111(1979)、J.Bacteriol.,110,761−763(1972)およびAppl.Microbiol.Biotechnol.,39,318−323(1993)などに記載されている。上記(b)の方法に関しては、Agric.Biol.Chem.,43,105−111(1979)およびJ.Bacteriol.,110,761−763(1972)などに記載されている。上記(c)の方法に関しては、Appl.Microbiol.Biotechnol.,39,318−323(1993)およびAgric.Biol.Chem.,39,371−377(1987)などに記載されている。上記(d)の方法に関しては、Appl.Environ.Micribiol.,38,181−190(1979)およびAgric.Biol.Chem.,42,1773−1778(1978)などに記載されている。上記(e)の方法に関しては、Agric.Biol.Chem.,36,1675−1684(1972)、Agric.Biol.Chem.,41,109−116(1977)、Agric.Biol.Chem.,37,2013−2023(1973)およびAgric.Biol.Chem.,51,2089−2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。
さらに上記(a)〜(e)のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed.,Vol.6,Products of Primary Metabolism(VCH Verlagsgesellschaft mbH,Weinheim,1996)section 14a,14bやAdvances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79,1−35(2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら(1986)に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003−164297、Agric.Biol.Chem.,39,153−160(1975)、Agric.Biol.Chem.,39,1149−1153(1975)、特開昭58−13599、J.Gen.Appl.Microbiol.,4,272−283(1958)、特開昭63−94985、Agric.Biol.Chem.,37,2013−2023(1973)、WO97/15673、特開昭56−18596、特開昭56−144092および特表2003−511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより1種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。
染色体DNA上のihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子の一部または全部が欠損した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば下記した微生物の染色体DNA上の配列番号1または2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、またはihf遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列情報を利用して、微生物の染色体DNA上にあるihf遺伝子またはそのホモログ遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法により取得することができる。ihf遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列は、配列番号3または4で表される塩基配列を有するDNAの全部または一部をプローブに用いた、各種微生物の染色体DNAに対するサザンハイブリダイゼーションによりihf遺伝子のホモログ遺伝子を同定、取得し、または配列番号3または4で表される塩基配列に基づき設計したプライマーDNAを用い、各種微生物の染色体DNAを鋳型としたPCRによりihf遺伝子のホモログ遺伝子を同定、取得した後、常法により該遺伝子の塩基配列を解析することにより決定することができる。サザンハイブリダイゼーションおよびPCRに供する染色体DNAは、いずれの微生物の染色体DNAであってもよく、好ましくは、Erwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属またはXanthomonas属に属する微生物、より好ましくはErwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Serratia marcescens、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Proteus rettgeri、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas thazdinophilum、Xanthomonas ovyzaeおよびXanthomonas capestrisの染色体DNAをあげることができる。
具体的なihf遺伝子のホモログ遺伝子の塩基配列としては、Erwinia carotovora由来のihfAおよびihfB遺伝子の塩基配列(Genbank accession no.BX950851)、Pseudomonas aeruginosa由来のihfAおよびihfB遺伝子の塩基配列(Genbank accession no.AE004091)、Xanthomonas capestris由来のihfAおよびihfB遺伝子の塩基配列(Genbank accession no.AE008922)などをあげることができる。
微生物の染色体DNA上の遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドDNAと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。
該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体DNA上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜1日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体DNA上において2回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体DNA上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。
上記方法により、染色体DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入することができる微生物としては、例えばエシェリヒア属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖DNAを用いた方法をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖DNAを用いた方法をあげることができる。
具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖DNAを細胞内に取り込ませ、染色体DNAと導入した直鎖DNAとの間で相同組換えを起こさせる方法である。本方法は、直鎖DNAを効率よく取り込む微生物であれば、いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはエシェリヒア属、より好ましくはエシェリヒア・コリ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群(Red組換え系)を発現しているシェリヒア・コリをあげることができる。
λRed組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λRed組換え系遺伝子を有するプラスミドDNAであるpKD46[エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター(米国エール大学)より入手可能]を保有するエシェリヒア・コリJM101株等をあげることができる。
相同組換えに用いられるDNAとしては、
(a)薬剤耐性遺伝子の両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAまたは該DNAと相同性があるDNAを有する直鎖DNA、
(b)塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNA、または該DNAと相同性があるDNAを直接連結した直鎖DNA、
(c)薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が連結したDNAの両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAまたは該DNAと相同性があるDNAを有する直鎖DNA、および
(d)上記(a)の直鎖DNAにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAの間に、さらに酵母由来のFlp recombinase〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82,5875(1985)〕が認識する塩基配列を有するDNA、
をあげることができる。
相同組換えに用いられるDNAとしては、
(a)薬剤耐性遺伝子の両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAまたは該DNAと相同性があるDNAを有する直鎖DNA、
(b)塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNA、または該DNAと相同性があるDNAを直接連結した直鎖DNA、
(c)薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が連結したDNAの両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAまたは該DNAと相同性があるDNAを有する直鎖DNA、および
(d)上記(a)の直鎖DNAにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体DNA上の領域の両外側に存在するDNAの間に、さらに酵母由来のFlp recombinase〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82,5875(1985)〕が認識する塩基配列を有するDNA、
をあげることができる。
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にエシェリヒア・コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来のsacB遺伝子〔Appl.Environ.Microbiol.,59,1361−1366(1993)〕、およびエシェリヒア属に属する微生物由来のrpsL遺伝子〔Genomics,72,99−104(2001)〕等をあげることができる。
上記の直鎖DNAの両末端に存在する、染色体DNA上の置換または欠失の導入対象となる領域の両外側に位置するDNAと相同性があるDNAは、直鎖DNAにおいて、染色体DNA上の方向と同じ方向に配置され、その長さは10bp〜100bp程度が好ましく、20bp〜50bp程度がより好ましく、30〜40bp程度がさらに好ましい。
酵母由来のFlp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号7で表される塩基配列を有するDNA、および該DNAにおいて1個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のFlp recombinaseが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するDNAをあげることができる。
酵母由来のFlp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号7で表される塩基配列を有するDNA、および該DNAにおいて1個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のFlp recombinaseが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するDNAをあげることができる。
相同性があるとは、上記直鎖DNAが、染色体DNA上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは100%の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したBLASTやFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。
上記塩基配列の相同性は、上記したBLASTやFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。
上記直鎖DNAは、PCRにより作製することができる。また上記直鎖DNAを含むDNAをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖DNAを得ることもできる。
微生物の染色体DNAに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法1〜4があげられる。
方法1:上記(a)または(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法2:上記方法1により取得された形質転換株に、上記(b)の直鎖DNAを導入し、該方法により染色体DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法3:
[1]上記(c)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体DNA上の置換または欠失の対象領域の両外側に存在するDNAと相同性を有するDNAを、染色体DNA上における方向と同一の方向で連結したDNAを合成し、上記[1]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記[2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体DNA上から削除された株として選択する方法。
方法4:
[1]上記(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記[1]で得られた形質転換株にFlp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記[1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。
微生物の染色体DNAに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以下の方法1〜4があげられる。
方法1:上記(a)または(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法2:上記方法1により取得された形質転換株に、上記(b)の直鎖DNAを導入し、該方法により染色体DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法3:
[1]上記(c)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体DNA上の置換または欠失の対象領域の両外側に存在するDNAと相同性を有するDNAを、染色体DNA上における方向と同一の方向で連結したDNAを合成し、上記[1]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記[2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体DNA上から削除された株として選択する方法。
方法4:
[1]上記(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記[1]で得られた形質転換株にFlp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記[1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。
上記方法で用いられる、直鎖DNAを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110(1972)〕、プロトプラスト法(特開昭63−2483942)、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)〕等をあげることができる。
方法2または方法3[2]で用いられる直鎖DNAにおいて、該DNAの中央部付近に、染色体DNA上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖DNAを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体DNA上に挿入することができる。
上記方法2〜4では、最終的に得られる形質転換株の染色体DNA上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体DNA上の位置の異なる2以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
3.本発明の微生物を用いた有用物質の製造法
上記2の本発明の微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から有用物質を採取することにより、該有用物質を製造することができる。
上記方法2〜4では、最終的に得られる形質転換株の染色体DNA上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体DNA上の位置の異なる2以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
3.本発明の微生物を用いた有用物質の製造法
上記2の本発明の微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から有用物質を採取することにより、該有用物質を製造することができる。
該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
培養物中に生成、蓄積した有用物質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
ihfA遺伝子が欠損した有用物質生産株の造成
(1)直鎖DNAによる染色体DNA上の相同組換えが可能なE.coliの造成
(i)E.coli W3110red株の造成
直鎖DNAによる染色体DNA上の相同組換えが可能なE.coli KM22株[Gene,246,321−330(2000)]よりP1ファージを以下の方法により調製した。
(1)直鎖DNAによる染色体DNA上の相同組換えが可能なE.coliの造成
(i)E.coli W3110red株の造成
直鎖DNAによる染色体DNA上の相同組換えが可能なE.coli KM22株[Gene,246,321−330(2000)]よりP1ファージを以下の方法により調製した。
E.coli KM22株を20mg/lのカナマイシンを含むLB液体培地[10g/lバクトトリプトン(ディフコ社製)、5g/lバクトイーストエキストラクト(ディフコ社製)、5g/l塩化ナトリウム、1ml/lの1mol/l水酸化ナトリウム]を用いて30℃にて一晩培養した後、0.5mlの培養液、1.4mlの新しいLB液体培地および100μlの0.1mol/lの塩化カルシウム溶液を混合した。
該混合溶液を30℃で5〜6時間振とう培養した後、400μlの該混合液を滅菌したチューブに移した。そこに2μlのP1ファージストック溶液を添加し、37℃で10分間保温した後、50℃に保温したソフトアガー溶液(10g/lバクトトリプトン、5g/lバクトイーストエキストラクト、5mmol/l塩化カルシウム、1ml/lの1mol/l水酸化ナトリウム、3g/l寒天)を3ml添加して、よく攪拌し、Ca−LB寒天培地プレート(10g/lバクトトリプトン、5g/lバクトイーストエキストラクト、5mmol/l塩化カルシウム、1ml/lの1mol/l水酸化ナトリウム、15g/l寒天、プレートの直径は15cm)上にまいた。
該プレートを37℃で7時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収し、1500g、4℃、10分間遠心分離した。上清1.5mlに対し100μlのクロロホルムを添加し、4℃にて一晩保存した。翌日、溶液を15000gにて2分間遠心分離し、上清をファージストックとして4℃で保存した。
次に、取得したファージを用いてE.coli W3110株を形質転換した。Ca−LB液体培地で30℃、4時間培養したE.coliW3110株の培養液を200μl分取し、ファージストックを1μl添加した。37℃で10分間保温した後、5mlのLB液体培地と200μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。1500g、25℃、10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に1mlのLB液体培地と10μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を加え30℃で2時間保温した。100μlの該溶液を20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム3寒天平板培地に塗布し、30℃で一晩培養した。各々の欠損導入株毎に出現したコロニー24個をそれぞれ、20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム3寒天平板培地(0.15%肉エキス、0.15%酵母エキス、0.5%ペプトン、0.1%グルコース、0.35%塩化ナトリウム、0.132%リン酸水素二カリウム、1.5%寒天、pH7.0)に塗布し、その薬剤感受性を確認し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、直鎖DNAによる染色体DNA上の相同組換えを可能とする染色体DNA領域[Δ(recC ptr recB recD)::Plac−red kan]が形質導入されたE.coli W3110red株を取得した。
(ii)E.coli W3110red_tet株の造成
E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号6および7で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いたPCRを行った。PCRは、LA−Taq(タカラバイオ社製)を用い、染色体DNA10ng、プライマーDNA各50pmolを含む100μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
次に、取得したファージを用いてE.coli W3110株を形質転換した。Ca−LB液体培地で30℃、4時間培養したE.coliW3110株の培養液を200μl分取し、ファージストックを1μl添加した。37℃で10分間保温した後、5mlのLB液体培地と200μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。1500g、25℃、10分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に1mlのLB液体培地と10μlの1mol/lのクエン酸ナトリウム溶液を加え30℃で2時間保温した。100μlの該溶液を20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム3寒天平板培地に塗布し、30℃で一晩培養した。各々の欠損導入株毎に出現したコロニー24個をそれぞれ、20mg/lのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム3寒天平板培地(0.15%肉エキス、0.15%酵母エキス、0.5%ペプトン、0.1%グルコース、0.35%塩化ナトリウム、0.132%リン酸水素二カリウム、1.5%寒天、pH7.0)に塗布し、その薬剤感受性を確認し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、直鎖DNAによる染色体DNA上の相同組換えを可能とする染色体DNA領域[Δ(recC ptr recB recD)::Plac−red kan]が形質導入されたE.coli W3110red株を取得した。
(ii)E.coli W3110red_tet株の造成
E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号6および7で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いたPCRを行った。PCRは、LA−Taq(タカラバイオ社製)を用い、染色体DNA10ng、プライマーDNA各50pmolを含む100μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
目的とするDNA断片が増幅していることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該DNA断片をゲルから切り出して精製した。
次に、Tn10トランスポゾンを染色体DNA上に持つE.coli CGSC7465株(米国Yale大学で運営されているColi Genetic Stock Centerから入手可能)の染色体DNAを鋳型に用い、配列番号8および9で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いたPCRを行った。PCRは、LA−Taqを用い、染色体DNA10ng、プライマーDNA各50pmolを含む100μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で90秒間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
次に、Tn10トランスポゾンを染色体DNA上に持つE.coli CGSC7465株(米国Yale大学で運営されているColi Genetic Stock Centerから入手可能)の染色体DNAを鋳型に用い、配列番号8および9で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いたPCRを行った。PCRは、LA−Taqを用い、染色体DNA10ng、プライマーDNA各50pmolを含む100μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で90秒間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
目的とするDNA断片が増幅していることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該DNA断片をゲルから切り出して精製した。
次に、E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号10および11で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いたPCRを行った。PCRは、LA−Taqを用い、染色体DNA 10ng、プライマーDNA各50pmolを含む100μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
次に、E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号10および11で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いたPCRを行った。PCRは、LA−Taqを用い、染色体DNA 10ng、プライマーDNA各50pmolを含む100μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
目的とするDNA断片が増幅していることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該DNA断片をゲルから切り出して精製した。
次に、上記PCRで得られた3つのDNA断片を鋳型とし、配列番号12および13で表されるDNAをプライマーセットに用いたPCRを行った。PCRは、LA−Taqを用い、増幅DNA断片各10ng、プライマーDNA各50pmolを含む100μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
次に、上記PCRで得られた3つのDNA断片を鋳型とし、配列番号12および13で表されるDNAをプライマーセットに用いたPCRを行った。PCRは、LA−Taqを用い、増幅DNA断片各10ng、プライマーDNA各50pmolを含む100μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
上記PCRにより、カナマイシン耐性遺伝子に相同性のある配列を両端に持ち、中央部にテトラサイクリン耐性遺伝子を有するDNA断片が増幅していることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該DNA断片(以下、tet遺伝子断片という)をゲルから切り出して精製した。
次に、E.coli W3110red株のコンピテントセルを、Gene,246,321−330(2000)に記載の方法に従って調製し、1μgのtet遺伝子断片を用いて形質転換を行った。形質転換は、0.1cmのキュベット(BioRad社製)中で、1.8KV、25μFの条件で、エレクトロポレーションにより行った。
次に、E.coli W3110red株のコンピテントセルを、Gene,246,321−330(2000)に記載の方法に従って調製し、1μgのtet遺伝子断片を用いて形質転換を行った。形質転換は、0.1cmのキュベット(BioRad社製)中で、1.8KV、25μFの条件で、エレクトロポレーションにより行った。
形質転換した細胞を、2mmol/lのIPTGを含む1mlのSOC液体培地[20g/lバクトトリプトン(Difco社製)、5g/lバクトイーストエキストラクト(Difco社製)、0.5g/l塩化ナトリウム、0.2ml/lの5mol/l NaOH、10ml/lの1mol/l塩化マグネシウム、10ml/lの1mol/l硫酸マグネシウム、10ml/lの2Mグルコース]を用いて30℃で3時間培養した後、20μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート(LB液体培地に寒天を1.5%含むもの)上に塗布し、37℃で一晩培養した。
生育してきた株は、E.coli W3110red株の染色体DNA上のカナマイシン耐性遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と置換されている株であることを確認し、E.coli W3110red_tet株と命名した。
(2)プロリン生産株の造成
上記(1)で取得したE.coli W3110red株にプロリンを生産する能力を以下の方法により付与した。
(i)putA遺伝子欠損株の造成
pHSG398プラスミドDNA(タカラバイオ社より購入)を鋳型にし、配列番号14および15で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA断片を増幅した。PCRは、EX−Taq(タカラバイオ社製)を用いて、精製プラスミドDNA20ng、プライマーDNA各50pmolを含む反応液100μlをEX−Taqに添付の指示書に従い調製し、95℃で1分間保温後、94℃で30秒間、64℃で30秒間、72℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で3分間保温するという条件で行った。増幅DNA断片をQIA quick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、30μlのDNA溶液を得た。
(2)プロリン生産株の造成
上記(1)で取得したE.coli W3110red株にプロリンを生産する能力を以下の方法により付与した。
(i)putA遺伝子欠損株の造成
pHSG398プラスミドDNA(タカラバイオ社より購入)を鋳型にし、配列番号14および15で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA断片を増幅した。PCRは、EX−Taq(タカラバイオ社製)を用いて、精製プラスミドDNA20ng、プライマーDNA各50pmolを含む反応液100μlをEX−Taqに添付の指示書に従い調製し、95℃で1分間保温後、94℃で30秒間、64℃で30秒間、72℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で3分間保温するという条件で行った。増幅DNA断片をQIA quick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、30μlのDNA溶液を得た。
次に、混入している微量のプラスミドpHSG398を分解するため、該DNA溶液に制限酵素PstIとBglIそれぞれを10Uずつ添加し、37℃で2時間保温後、増幅DNA断片をQIA quick PCR Purification Kitを用いて精製し、30μlのDNA溶液を得た。
次に、該DNA溶液0.1μlを鋳型として、配列番号16および17で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を中央部に持ち、両端に配列番号18であらわされる塩基配列からなるDNA(putA遺伝子の5’末端側のDNA)および配列番号19であらわされる塩基配列からなるDNA(putA遺伝子の3’末端側のDNA)を有するDNA断片を増幅した。
次に、該DNA溶液0.1μlを鋳型として、配列番号16および17で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を中央部に持ち、両端に配列番号18であらわされる塩基配列からなるDNA(putA遺伝子の5’末端側のDNA)および配列番号19であらわされる塩基配列からなるDNA(putA遺伝子の3’末端側のDNA)を有するDNA断片を増幅した。
PCRは、EX−Taqを用いて、精製鋳型DNA10ng、プライマーDNA各50pmolを含む100μlの反応液をEX−Taqに添付の指示書に従い調製し、95℃で1分間保温後、94℃で30秒間、51℃で30秒間、72℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で3分間保温するという条件で行い、増幅DNA断片を上記と同様の方法で精製した。
次に、該DNA1μgを用いてE.coli W3110red株の形質転換を行った。形質転換は上記(1)のエレクトロポレーションと同様の条件で行った。
次に、該DNA1μgを用いてE.coli W3110red株の形質転換を行った。形質転換は上記(1)のエレクトロポレーションと同様の条件で行った。
形質転換した細胞を、2mmol/lのIPTGを含む1mlのSOC液体培地を用いて30℃で3時間培養した後、50μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート(LB液体培地に寒天を1.5%含むもの。以下、LBcm寒天培地プレートと略す)上に塗布し、37℃で一晩培養した。
生育してきた株は、E.coli W3110red株の染色体DNA上のputA遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換された株であることを確認し、該株をE.coli W3110redΔputA::cat株と命名した。
(ii)proBAオペロン欠損株の造成
次に、プラスミドpFastBACdual(インビトロジェン社より購入)を鋳型にし、配列番号20および21で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を増幅した。PCRは、LA−Taqを用いて、精製プラスミドDNA10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
生育してきた株は、E.coli W3110red株の染色体DNA上のputA遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換された株であることを確認し、該株をE.coli W3110redΔputA::cat株と命名した。
(ii)proBAオペロン欠損株の造成
次に、プラスミドpFastBACdual(インビトロジェン社より購入)を鋳型にし、配列番号20および21で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を増幅した。PCRは、LA−Taqを用いて、精製プラスミドDNA10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
反応終了後、増幅DNA断片を上記と同様の方法で精製し、50μlのDNA溶液を得た。上記PCRで得られた増幅DNA断片を鋳型とし、配列番号22および23で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、ゲンタマイシン耐性遺伝子を中央部に持ち、両端に配列番号24で表される塩基配列からなるDNA(proBAオペロンの5’末端側のDNA)、および配列番号25で表される塩基配列からなるDNA(proBAオペロンの3’末端側のDNA)を有するDNA断片を増幅した。
PCRは、LA−Taqを用いて、増幅DNA断片10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。得られた増幅DNA断片(増幅DNA断片Aという)は上記と同様の方法で精製した。
また、E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号26および27で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いたPCRにより、proBAオペロンの5’側上流域約1kbpのDNA断片を、配列番号28および29で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いたPCRにより、proBAオペロンの3’側下流域約1kbpのDNA断片を、それぞれ増幅した。
PCRは、染色体DNA10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温する条件で行った。増幅DNA断片(増幅DNA断片BおよびC)は上記と同様の方法で精製した。
次に上記で得られた増幅DNA断片A、BおよびCを鋳型に用い、配列番号26および配列番号29で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用い、PCRを行った。PCRは、LA−Taqを用い、増幅DNA断片A、BおよびC各10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
次に上記で得られた増幅DNA断片A、BおよびCを鋳型に用い、配列番号26および配列番号29で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用い、PCRを行った。PCRは、LA−Taqを用い、増幅DNA断片A、BおよびC各10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で3分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
DNA断片A、BおよびCが連結したDNA断片が増幅されていることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該DNA断片をゲルから切り出して精製した。該DNA断片は、両端にそれぞれ染色体DNA上のproBAオペロンの5’側上流および3’側下流の1kbpのDNAに相同性のある配列、中央部にゲンタマイシン耐性遺伝子を有するDNA断片である。
次に該DNA断片1μgを用い、E.coli W3110redΔputA::cat株の形質転換を行った。形質転換は、上記したE.coli W3110red株の形質転換法と同様にエレクトロポレーションで行った。ただし、形質転換株の選択培地は5μg/mlのゲンタマイシンを含むLB寒天プレートを用いた。該寒天プレート上で生育してきた株は、E.coli W3110redΔputA::cat株の染色体DNA上のproBAオペロンがゲンタマイシン耐性遺伝子と置換された株であることを確認し、該株をE.coli PK株と命名した。
E.coli PK株をM9最小寒天培地および8mg/lのプロリンを含むM9最小寒天培地に塗布して、30℃にて一晩培養し、E.coliPK株はプロリンを含む最小培地では生育するが、プロリンを含まない最小培地では生育しないことを確認した。
(iii)変異型proBAオペロン導入株の造成
E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型として、配列番号26および29で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、proBAオペロンを含む4kbpのDNA断片を増幅した。PCRは、LA−Taqを用いて、染色体DNA10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で4分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温する条件で行った。
(iii)変異型proBAオペロン導入株の造成
E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型として、配列番号26および29で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いたPCRにより、proBAオペロンを含む4kbpのDNA断片を増幅した。PCRは、LA−Taqを用いて、染色体DNA10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で3分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で4分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温する条件で行った。
目的とするDNA断片が増幅されていることをアガロースゲル電気泳動法にて確認した後、該DNA断片をゲルから切り出して精製し、PCR−Script Cloning Kit(QIAGEN社製)を用いて、プラスミドpPCR−Script Ampにクローン化しすることで、プラスミドpPCR proBAを作製した。
次に、QuickChange Kit(QIAGEN社製)を用いてpPCR proBAのproB遺伝子に点突然変異proB74〔Gene,64,199−205(1988)〕を該Kitに添付されている指示書に従って導入し、プラスミドpPCR proB74を作製した。変異点導入のために用いたプライマーDNAの塩基配列は配列番号30に示した。
次に、QuickChange Kit(QIAGEN社製)を用いてpPCR proBAのproB遺伝子に点突然変異proB74〔Gene,64,199−205(1988)〕を該Kitに添付されている指示書に従って導入し、プラスミドpPCR proB74を作製した。変異点導入のために用いたプライマーDNAの塩基配列は配列番号30に示した。
次に、プラスミドpPCR proB74を制限酵素BsrGIを用いて切断した後、アガロース電気泳動法にて変異型proBAオペロンを含むDNA断片を分離し、ゲルから回収、精製した。該DNA断片2μgを用いて、E.coli PK株の形質転換を行った。形質転換は上記したE.coli W3110red株の形質転換法と同様にエレクトロポレーションで行った。ただし、形質転換株の選択培地はM9最小寒天培地にて行い、プロリン要求性を示さない株を選択することにより、プロリンを生産する能力を有するE.coli PKB74株を取得した。
(3)ihfA遺伝子が欠損したプロリン生産株の造成
E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型とし、各々の3’末端の25塩基は、W3110red株染色体DNA上のカナマイシン耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計してある配列番号31および32で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用い、PCRを行った。PCRは、LA−Taqを用いて、染色体DNA断片10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
(3)ihfA遺伝子が欠損したプロリン生産株の造成
E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型とし、各々の3’末端の25塩基は、W3110red株染色体DNA上のカナマイシン耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計してある配列番号31および32で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用い、PCRを行った。PCRは、LA−Taqを用いて、染色体DNA断片10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
カナマイシン耐性遺伝子の5’末端側上流に配列番号33で表される塩基配列、3’末端側下流に配列番号34で表される塩基配列が付加した増幅DNA断片を上記と同様の方法で精製した。
次に該DNA断片を鋳型とし、配列番号35および36で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用い、PCRを行った。配列番号35で表される塩基配列からなるDNAは、5’末端側にihfA遺伝子の5’末端側領域付近との相同配列を有する40塩基からなる塩基配列を有し、3’末端側に配列番号33で表される塩基配列からなるDNAを有するDNAである。配列番号36で表される塩基配列を有するDNAは、5’末端側にihfA遺伝子の3’末端側領域付近と相同配列を有する40塩基からなる塩基配列塩基配列を有し、3’末端側に配列番号34で表される塩基配列にハイブリダイズする25塩基からなるDNAを有するDNAである。
次に該DNA断片を鋳型とし、配列番号35および36で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用い、PCRを行った。配列番号35で表される塩基配列からなるDNAは、5’末端側にihfA遺伝子の5’末端側領域付近との相同配列を有する40塩基からなる塩基配列を有し、3’末端側に配列番号33で表される塩基配列からなるDNAを有するDNAである。配列番号36で表される塩基配列を有するDNAは、5’末端側にihfA遺伝子の3’末端側領域付近と相同配列を有する40塩基からなる塩基配列塩基配列を有し、3’末端側に配列番号34で表される塩基配列にハイブリダイズする25塩基からなるDNAを有するDNAである。
PCRは、LA−Taqを用いて、増幅DNA断片10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
両末端にihfA遺伝子の両末端の40塩基と相同な領域を有するカナマイシン耐性遺伝子(km遺伝子)を含むDNA断片が増幅していることを確認し、該DNA断片を上記と同様の方法で精製した。
両末端にihfA遺伝子の両末端の40塩基と相同な領域を有するカナマイシン耐性遺伝子(km遺伝子)を含むDNA断片が増幅していることを確認し、該DNA断片を上記と同様の方法で精製した。
該DNA断片1μgを用いてE.coli PKB74_tet株を形質転換した。形質転換は、上記したE.coli W3110red株の形質転換法と同様にエレクトロポレーションで行った。形質転換した細胞をSOC培地を用いて上記と同様に培養した後、培養液を、50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上に塗布し、30℃で一晩培養した。
生育してきた株は、E.coli PKB74_tet株の染色体DNA上のihfA遺伝子が欠損していることを確認し、該株をE.coli PKB74_tetΔihfA株と命名した。
生育してきた株は、E.coli PKB74_tet株の染色体DNA上のihfA遺伝子が欠損していることを確認し、該株をE.coli PKB74_tetΔihfA株と命名した。
ihfA遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造
E.coli PKB74_tetΔihfA株および対照株であるE.coli PKB74_tet株を、それぞれ5mlのLB液体培地を入れた試験管に植菌し、30℃にて20時間、振とう培養し培養液を得た。500μlの該培養液を、50mlのMed7液体培地(3%グルコース、0.8%ペプトン、0.1%リン酸二水素カリウム、0.05%硫酸マグネシウム・七水和物、0.002%塩化カルシウム、1%炭酸カルシウム、1%硫酸アンモニウム、0.2%塩化ナトリウム、0.03%硫酸鉄)が入った300ml容の三角フラスコに植菌し、30℃で振とう培養した。
E.coli PKB74_tetΔihfA株および対照株であるE.coli PKB74_tet株を、それぞれ5mlのLB液体培地を入れた試験管に植菌し、30℃にて20時間、振とう培養し培養液を得た。500μlの該培養液を、50mlのMed7液体培地(3%グルコース、0.8%ペプトン、0.1%リン酸二水素カリウム、0.05%硫酸マグネシウム・七水和物、0.002%塩化カルシウム、1%炭酸カルシウム、1%硫酸アンモニウム、0.2%塩化ナトリウム、0.03%硫酸鉄)が入った300ml容の三角フラスコに植菌し、30℃で振とう培養した。
培養開始から30時間目、33時間目および36時間目に培養液の一部をサンプリングして遠心分離し、その上清を1000倍に希釈してダイオネクス社製のアミノ酸直接分析システムDXa−500を用いて培養液中のプロリン蓄積量を測定した。結果を表1に示す。
表1に示すように、プロリン生産株であるE.coli PKB74_tetから造成したihfA遺伝子欠損株であるE.coli PKB74_tetΔihfA株のプロリン生産性はE.coli PKB74_tetより優れていることが明らかになった。
E.coli PKB74_tetΔihfA株の遺伝子発現プロファイル解析
E.coli PKB74_tetΔihfA株とその親株であるE.coli PKB74_tet株の遺伝子発現プロファイル解析を以下のように行った。
実施例2に記載の培養において、培養開始28時間目のそれぞれの株の培養液を一部サンプリングし、大島らの方法[Mol.Microbiol.,45,673−695(2002)]に従い、DNAスライドアレイを用いた転写パターンの比較を行った。DNAスライドアレイはタカラバイオが発売している大腸菌用のものを購入して使用した。
E.coli PKB74_tetΔihfA株とその親株であるE.coli PKB74_tet株の遺伝子発現プロファイル解析を以下のように行った。
実施例2に記載の培養において、培養開始28時間目のそれぞれの株の培養液を一部サンプリングし、大島らの方法[Mol.Microbiol.,45,673−695(2002)]に従い、DNAスライドアレイを用いた転写パターンの比較を行った。DNAスライドアレイはタカラバイオが発売している大腸菌用のものを購入して使用した。
E.coli PKB74_tet株におけるmRNA量を基準にして、E.coli PKB74_tetΔihfA株の各遺伝子の発現量を解析したところ、解糖系の律速段階の酵素6−ホスホフラクトキナーゼの構造遺伝子であるpfkB遺伝子の発現量が12倍に上昇していることが判明した。またTCAサイクルを構成する酵素構造遺伝子群中の、acnA遺伝子およびsucAB遺伝子の発現量がそれぞれ8倍および3倍に上昇していた。
一方でプロリン生合成系遺伝子であるproBA遺伝子およびproC遺伝子の発現量はE.coli PKB74_tetと同等であった。
以上より、ihfA遺伝子欠損株のプロリン生産性の向上は、解糖系およびTCAサイクルなどの中央代謝系の活性増強によりもたらされたことが明らかになった。したがって、ihfA遺伝子欠損株はプロリン等のアミノ酸だけでなく、解糖系およびTCAサイクルを経由して生成される各種有用物質、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質などの生産性も向上することが示された。
以上より、ihfA遺伝子欠損株のプロリン生産性の向上は、解糖系およびTCAサイクルなどの中央代謝系の活性増強によりもたらされたことが明らかになった。したがって、ihfA遺伝子欠損株はプロリン等のアミノ酸だけでなく、解糖系およびTCAサイクルを経由して生成される各種有用物質、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質などの生産性も向上することが示された。
ihfA遺伝子欠損株の造成
実施例1の(3)で作製したE.coli PKB74_tetΔihfA株に実施例1の(1)記載の方法にてP1ファージを感染させ、そこから形質導入用のファージストックを回収した。取得した形質導入用ファージストックをE.coli W3110株に感染させ、実施例1の(1)記載の方法を用いてカナマイシン耐性株を分離した。このカナマイシン耐性株は、E.coli W3110株のihfA遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子により置換的に欠失した株であった。本菌株をE.coli W3110ΔihfA株と命名した。
実施例1の(3)で作製したE.coli PKB74_tetΔihfA株に実施例1の(1)記載の方法にてP1ファージを感染させ、そこから形質導入用のファージストックを回収した。取得した形質導入用ファージストックをE.coli W3110株に感染させ、実施例1の(1)記載の方法を用いてカナマイシン耐性株を分離した。このカナマイシン耐性株は、E.coli W3110株のihfA遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子により置換的に欠失した株であった。本菌株をE.coli W3110ΔihfA株と命名した。
ihfA遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造
E.coli W3110ΔihfA株および親株であるE.coli W3110株を、それぞれ5mlのLB液体培地を入れた試験管に植菌し、30℃にて20時間、振とう培養し培養液を得た。300μlの該培養液を、30mlのMed7液体培地(3%グルコース、0.8%ペプトン、0.1%リン酸二水素カリウム、0.05%硫酸マグネシウム・七水和物、0.002%塩化カルシウム、1%炭酸カルシウム、1%硫酸アンモニウム、0.2%塩化ナトリウム、0.03%硫酸鉄)が入った300ml容の三角フラスコに植菌し、30℃で振とう培養した。
E.coli W3110ΔihfA株および親株であるE.coli W3110株を、それぞれ5mlのLB液体培地を入れた試験管に植菌し、30℃にて20時間、振とう培養し培養液を得た。300μlの該培養液を、30mlのMed7液体培地(3%グルコース、0.8%ペプトン、0.1%リン酸二水素カリウム、0.05%硫酸マグネシウム・七水和物、0.002%塩化カルシウム、1%炭酸カルシウム、1%硫酸アンモニウム、0.2%塩化ナトリウム、0.03%硫酸鉄)が入った300ml容の三角フラスコに植菌し、30℃で振とう培養した。
培養開始から18時間目、30時間目および42時間目に培養液の一部をサンプリングして遠心分離し、その上清を1000倍に希釈してダイオネクス社製のアミノ酸直接分析システムDXa−500を用いて培養液中のグルタミン酸の蓄積量を測定した。結果を表2に示す。
表2に示すように、ihfA遺伝子欠損株は、E.coli W3110株の約2倍のグルタミン酸生産性を有することがわかった。
ihfB遺伝子欠損株の造成
E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型とし、各々の3’末端側の25merは、E.coli W3110red株の染色体DNA上のカナマイシン耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計した配列番号31および32で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用い、PCRを行った。
E.coli W3110red株の染色体DNAを鋳型とし、各々の3’末端側の25merは、E.coli W3110red株の染色体DNA上のカナマイシン耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計した配列番号31および32で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用い、PCRを行った。
PCRは、LA−Taqを用いて、染色体DNA断片10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
上記PCRにより、カナマイシン耐性遺伝子の5’側上流に配列番号33で表される塩基配列、3’側下流に配列番号34で表される塩基配列が付加したDNA断片が増幅していることを確認し、上記と同様の方法で該DNA断片を精製した。
上記PCRにより、カナマイシン耐性遺伝子の5’側上流に配列番号33で表される塩基配列、3’側下流に配列番号34で表される塩基配列が付加したDNA断片が増幅していることを確認し、上記と同様の方法で該DNA断片を精製した。
次に、該DNA断片を鋳型として、5’末端側の40merにihfB構造遺伝子の5’末端側と同じ塩基配列を有し、3’末端側に配列番号33で表される25merの塩基配列を有するDNAである、配列番号37で表される塩基配列からなるDNA、および5’末端側の40merにihfB構造遺伝子の3’末端側とハイブリダイズする塩基配列を有し、3’末端側に配列番号34で表される塩基配列にハイブリダイズする25merの塩基配列を有するDNAである、配列番号38で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いてPCRを行った。
PCRは、LA−Taqを用いて、増幅DNA断片10ng、プライマーDNA各20pmolを含む25μlの反応液をLA−Taqに添付の指示書に従い調製し、94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、55℃で20秒間、68℃で1分間のサイクルを30回繰り返した後、72℃で10分間保温するという条件で行った。
上記PCRにより、その両末端に、ihfB構造遺伝子の両末端の40塩基と同一の塩基配列を有するカナマイシン耐性遺伝子(km遺伝子)を含むDNA断片が増幅していることを確認し、上記と同様の方法で該DNA断片を精製した。
上記PCRにより、その両末端に、ihfB構造遺伝子の両末端の40塩基と同一の塩基配列を有するカナマイシン耐性遺伝子(km遺伝子)を含むDNA断片が増幅していることを確認し、上記と同様の方法で該DNA断片を精製した。
該DNA 1μgを用いてE.coli PKB74_tet株を形質転換した。形質転換は、上記したE.coli W3110red株の形質転換法と同様にエレクトロポレーションで行った。形質転換した細胞をSOC培地を用いて上記と同様に培養した後、培養液を、50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上に塗布し、30℃で一晩培養した。
生育してきた株は、E.coli PKB74_tet株の染色体DNA上のihfB遺伝子が欠損していることを確認し、該株をE.coli PKB74_tetΔihfB株と命名した。
生育してきた株は、E.coli PKB74_tet株の染色体DNA上のihfB遺伝子が欠損していることを確認し、該株をE.coli PKB74_tetΔihfB株と命名した。
ihfB遺伝子欠損株を用いた有用物質の製造
実施例2と同様の方法により、E.coli PKB74_tetΔihfB株および対照株であるE.coli PKB74_tet株を培養し、培養液中のL−プロリン蓄積量を測定した。結果を表3に示す。
実施例2と同様の方法により、E.coli PKB74_tetΔihfB株および対照株であるE.coli PKB74_tet株を培養し、培養液中のL−プロリン蓄積量を測定した。結果を表3に示す。
表3に示すように、プロリン生産株であるE.coli PKB74_tetから造成したihfB遺伝子欠損株であるE.coliPKB74_tetΔihf株のプロリン生産性はE.coli PKB74_tetより優れていることが明らかになった。
よって、ihfB遺伝子欠損株は、ihfA遺伝子欠損株と同様、各種有用物質の生産性が向上することが明らかになった。
よって、ihfB遺伝子欠損株は、ihfA遺伝子欠損株と同様、各種有用物質の生産性が向上することが明らかになった。
配列番号5−人工配列の説明;合成DNA
配列番号6−人工配列の説明;合成DNA
配列番号7−人工配列の説明;合成DNA
配列番号8−人工配列の説明;合成DNA
配列番号9−人工配列の説明;合成DNA
配列番号10−人工配列の説明;合成DNA
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Claims (7)
- 配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、または配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体DNAを有し、かつ有用物質を生産する能力を有する微生物。
- 配列番号1または2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子が配列番号3または4で表される塩基配列を有する遺伝子である、請求項1記載の微生物。
- 微生物が以下の[1]〜[5]から選ばれる方法によって有用物質を生産する能力が強化された微生物である、請求項1または2記載の微生物。
[1]有用物質の生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和または解除する方法
[2]有用物質の生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法
[3]有用物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法
[4]有用物質の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化または遮断する方法
[5]野生型株に比べ、該有用物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法 - 微生物がErwinia属、Serratia属、Salmonella属、Escherichia属、Proteus属、Pseudomonas属またはXanthomonas属に属する微生物である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の
微生物。 - 微生物がErwinia berbicola、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Serratia marcescens、Serratia ficaria、Serratiafonticola、Serratia liquefaciens、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Proteus rettgeri、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas thazdinophilum、Xanthomonas ovyzaeおよびXanthomonas capestrisからなる群より選ばれる微生物である請求項1〜4のいずれか1項に記載の微生物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取する、有用物質の製造法。
- 有用物質がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造法。
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