JP6177995B2 - L−トリプトファン産生能を有する微生物およびこれを用いてl−トリプトファンを産生する方法 - Google Patents
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Description
本発明の他の目的は、前記微生物を用いてL−トリプトファンを産生する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、前記エシェリキア属微生物を培養するステップと、前記培養液からL−トリプトファンを分離するステップと、を含むL−トリプトファンを産生する方法を提供することである。
本発明は、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を発現するように変形された、L−トリプトファン産生能が向上したエシェリキア属微生物を提供する。
アントラニル酸ホスホリボシル転移酵素は、アントラニル酸およびPRPPを用いてホスホリボシルアントラニル酸を合成する酵素である。L−トリプトファン産生能が強化された産生菌株の場合、強化されたシキミ酸経路を通じてコリスミ酸の合成が増加され、これは、アントラニル酸の増加につながる。増加されたアントラニル酸は、細胞内/外に蓄積されて細胞の正常生理活性を妨げてL−トリプトファンの産生を阻害する。
このため、アントラニル酸ホスホリボシル転移酵素の発現強化を通じて細胞内/外へのアントラニル酸の蓄積を防ぎ、L−トリプトファンの生合成を強化しようとする。
このとき、大腸菌のtrpD遺伝子が暗号化させるアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素よりもPRPPへの馴染み性により優れている酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を用いることにより、ホスホリボシルアントラニル酸の合成速度をさらに増加させようとする。
また、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号9のポリヌクレオチド配列または前記ポリヌクレオチド配列から製造されたプローブと厳しい条件下で混成化されてもよく、正常的に機能する酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を暗号化させる変異型であってもよい。
本発明の微生物には、L−トリプトファンが産生できる限り、原核微生物のいずれも含まれる。例えば、エシェリキア(Escherichia)属、エルウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属およびブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物菌株が含まれ得る。好ましくは、エシェリキア属に属する微生物であり、さらに好ましくは、大腸菌(Escherichia coli)である。
また、本発明は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を発現するように変形されたL−トリプトファン産生能を有するエシェリキア属微生物を培養するステップおよび前記培養液からL−トリプトファンを分離するステップを含むL−トリプトファンを製造する方法を提供する。
本発明の微生物の培養に用いられる培地およびその他の培養条件は、通常のエシェリキア属微生物の培養に用いられる培地であればいなかるものも使用可能であり、本発明の微生物の要求条件を適切に満たさなければならない。
このとき、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物、糖アルコール、グリセロール、ピルビン酸、乳酸およびクエン酸などのアルコールおよび有機酸、グルタミン酸、メチオニンおよびリシンなどのアミノ酸などが挙げられ、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜糖蜜、米糠、カッサバ、甘蔗の搾りかすおよびトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源が使用可能であり、好ましくは、グルコースおよび殺菌済みの前処理糖蜜(すなわち、還元糖に転換された糖蜜)などの炭水化物であり、その他の適正量の炭素源が制限なしに種々に使用可能である。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源;グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸およびペプトン、NZ−アミン、肉類エキス、酵母エキス、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物など有機窒素源が使用可能である。これらの窒素源は単独でまたは組み合わせて使用可能である。前記培地には、リン源として、リン酸第1カリウム、リン酸第2カリウムおよび対応するナトリウム含有塩が含まれ得る。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどが使用可能であり、これらに加えて、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが含まれ得る。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式により添加可能である。
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることはない。
1−1.CJ1プロモーター断片の準備
CJ1プロモーターを含むDNA断片を得るために、CJ1プロモーターを含んでいるpECCG117−CJ1プラスミド(米国登録特許番号第8048648号)を鋳型として用いて連鎖重合反応(polymerase chain reaction、以下、「PCR」と略称する。)を行った。PCRHLプレミックスキット(BIONEER社製、以下、同じ。)を用い、このときに用いたプライマーは、配列番号2および3であり、PCR反応条件は、変性(denaturation)は94℃で30秒間、アニーリング(annealing)は55℃で30秒間、伸張(elongation)は72℃で30秒間であり、これを30回繰り返し行った。
前記PCR結果物(以下、「PCJ1断片」と命名する。)は、1%アガロースゲルにおいて電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して得た。
trpD遺伝子のORFを得るために、野生型大腸菌K−12由来のW3110菌株を韓国微生物保存センサー(Korea Culture Center of Microorganisms)から購入し、trp4遺伝子のORFを得るために、酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株を米国生物資源センター(American Type Culture Collection)から購入した。
前記菌株から遺伝体DNA抽出キット(QIAGEN社製)を用いて遺伝体DNAを準備した。前記大腸菌遺伝体DNAを鋳型として、配列番号4および5のプライマーを用いて、PCRにより配列番号6のtrpD遺伝子ORFに相当するDNA断片1,607bpを増幅した。また、酵母遺伝体DNAを鋳型として、配列番号7及び8のプライマーを用いて、PCRにより配列番号9のtrp4遺伝子ORFに相当するDNA断片1,154bpを増幅した。前記PCR結果物(以下、それぞれ「trpD断片」、「trp4断片」と命名する。)は、0.8%アガロースゲルにおいて電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して得た。
前記実施例1−1において準備したPCJ1断片およびpCL1920ベクターを制限酵素EcoR1で処理した後、0.8%アガロースゲルで溶離した。それぞれのDNA断片をRapidDNA ligation kit(ROCHE社製、以下、同じ。)を用いて30分間結さつした後、大腸菌DH5α細胞に形質転換し、これをスペクチノマイシンを含有するLBプレートに塗抹して形質転換済み菌体を選別した。
選別された菌体は、白金耳を用いてスペクチノマイシン含有LB液体培地20mLに接種して一晩中培養した後、プラスミド抽出キット(QIAGEN社製、以下、同じ。)を用いてプラスミドDNAを回収した。組み換えベクターの大きさは制限酵素EcoRIを処理して確認し(データは図示せず)、配列番号2および3のプライマーでPCRを行ってクローンを確認した。前記組み換えベクターを「pCL−PCJ1」と命名した。
前記実施例1−2において準備したtrpD断片またはtrp4断片および前記pCL−PCJ1ベクターを制限酵素EcoRVおよびPstIで処理した後、0.8%アガロースゲルで溶離した。それぞれのDNA断片をRapidDNA ligation kit(ROCHE社製、以下、同じ。)を用いて30分間結さつした後、大腸菌DH5α細胞に形質転換した。形質転換された菌体は、上記の方法と同様にして選別し、同方法を用いて形質転換菌体からプラスミドDNAを回収した。組み換えベクターの大きさは、制限酵素EcoRIおよびPstIを処理して確認し(データは図示せず)、配列番号2および5、または配列番号2および8のプライマーでPCRを行ってクローンを確認した。前記組み換えベクターをそれぞれ「pCL−PCJ1−trpD」および「pCL−PCJ1−trp4」と命名した(図3)。
実施例1において準備したpCL−PCJ1−trpDおよびpCL−PCJ1−trp4組み換えベクターは、EPICENTRE社が供給するTSS試薬(Transformation and storage solution)を用いてL−トリプトファン産生母菌株に取り込んだ。
この実施形態においては、L−トリプトファン産生母菌株として大腸菌KCCM11166Pを用いた。大腸菌KCCM11166Pは、大腸菌KCCM10812P(大韓民国登録特許番号第10−0792095号)から製作されたL−トリプトファン産生菌株であり、染色体上のtehB遺伝子が不活性化され、NADキナーゼの活性が増加されたことを特徴とするL−トリプトファン産生能を有する組み換え大腸菌である(大韓民国特許公開番号第10−2012−0083795号)。
L−トリプトファン産生母菌株を一白金耳に見合う分だけ4mLのLB培地に接種して3時間培養した後に遠心分離した。分離した細胞に50ngのpCL−PCJ1−trpDベクタープラスミドまたはpCL−PCJ1−trp4ベクタープラスミドおよびTSS試薬を100μL添加して勢いよく混合した。その後、単一段階形質転換技法(One−step transformation; Chung et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86, 2172−2175, 1989)を用いてL−トリプトファン産生母菌株に取り込み、これをスペクチノマイシン含有LBプレートに塗抹して形質転換済み菌株を選別した。形質転換済み菌株を確認するために、形質転換済み菌株からプラスミドDNAを回収し、実施例1−3の方法と同様にして制限酵素処理およびPCRを行って確認した。前記形質転換済み菌株をそれぞれ「Con/pCL−PCJ1−trpD」および「Con/pCL−PCJ1−trp4」と命名した。
前記実施例2において準備した形質転換済み菌株を下記表1のトリプトファン力価培地を用いて三角フラスコにおいて培養してL−トリプトファン産生性を比較した。
特に、L−トリプトファン産生母菌株の場合、発酵中のアントラニル酸の蓄積を伴う異常発酵現象により正常的な発酵を維持できない場合がしばしば現れる。このため、L−トリプトファン産生母菌株の発酵に際しては、アントラニル酸が過度に蓄積されないように発酵因子を調節することが重要であり、持続的にモニターリングし続けなければならないという難点がある。このため、アントラニル酸が少量蓄積されるL−トリプトファン産生菌株は、異常発酵の頻度を下げることができるという点で重要視される。前記表2および図3に示すように、trpDまたはtrp4遺伝子をpCLベクターを用いて発現する形質転換済み菌株は、L−トリプトファン産生母菌株に比べてアントラニル酸が少量蓄積される現象を示した。
大腸菌由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素と、酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を発現させる形質転換済み菌株を比較する場合、PRPPへの馴染み性に優れたtrp4遺伝子を発現させる形質転換体の方が、L−トリプトファンの産生性の増加およびアントラニル酸の蓄積の減少の側面からみてなお一層優れていることを確認することができた。このため、この形質転換済み菌株を用いてL−トリプトファンを産生する場合、より高い産生性にてL−トリプトファンを産生することができるということを確認し、より高い発酵安定性を維持して全体的なL−トリプトファンの産生性を高く維持することができるものと結論付けることができる。
他のL−トリプトファン産生菌株からも実施例3と同じ効果が得られるか否かを確認するために、pCL−PCJ1−trp4ベクターを取り込んで実施例3の方法と同様にしてL−トリプトファン産生性を比較した。
この実施例に用いられたL−トリプトファン産生大腸菌は、KCCM10805P(大韓民国登録特許番号第0850853号)およびKCCM10814P(大韓民国登録特許番号第0838036号)である。KCCM10805P大腸菌変異株は、トリプトファン類似体であるトリプトファンヒドロキサメート耐性を有するL−トリプトファン産生大腸菌CJ285(大韓民国特許公告10−2005−0059685)由来の菌株であり、亜硝酸塩還元作用に与るnrfE遺伝子が相同組み換えにより不活性化されたことを特徴とするL−トリプトファン産生大腸菌である。KCCM10814P大腸菌変異株は、CJ285由来の菌株であり、内部生体膜を合成するのに必要なタンパク質をコーディングするyjeO遺伝子が欠損されたことを特徴とするL−トリプトファン産生大腸菌である。
L−トリプトファン産生菌株菌であるKCCM10805PおよびKCCM10814Pに組み換えベクターpCL−PCJ1−trp4を実施例2の方法と同様にして取り込んで形質転換済み菌株を製作し、前記形質転換済み菌株をそれぞれ「KCCM10805P/pCL−PCJ1−trp4」および「KCCM10814P/pCL−PCJ1−trp4」と命名した。
前記実施例4−1において製作した形質転換済み菌株を実施例3の方法と同様にして三角フラスコにおいて培養してL−トリプトファン産生性を比較し、その結果を下記表4に示す。
実施例3において製作したCon/pCL−PCJ1−trp4菌株の場合、形質転換済み菌株が細胞分列する過程でプラスミドを消失する可能性があり、これにより、trp4遺伝子の発現カセットを消失する虞がある。この場合、L−トリプトファン産生母菌株に戻ってしまい、安定したtrp4遺伝子の発現カセットが維持し難くなる。また、プラスミドにある抗生剤耐性選別マーカーがL−トリプトファン産生母菌株の遺伝体に取り込まれて当該抗生剤に対して耐性を有する突然変異菌株が生成されることが危惧される。
そこで、本発明においては、trp4遺伝子の発現カセットのみをL−トリプトファン産生母菌株の遺伝体にあるybiX遺伝子座に挿入してこのような問題を解決しようとする。
遺伝体の内部へのtrp4遺伝子発現カセットの挿入を確認するための選別マーカーとして、クロラムフェニコールに抵抗性を与えるクロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子を用い、このために、クロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子を含むpUCprmfmloxCベクター(大韓民国公開特許:第2009−0075549号)を用いた。
ybiX遺伝子(GeneID:12930961)は、これまで機能が明確に究明されていない遺伝子であり、欠損時に細胞内のATP水位が高まることが知られている(Hara et al.,FEMS Microbiol Lett, 297, 217−224, 2009)。大腸菌においてybiX遺伝子を欠損しても大腸菌の生理活性に大きく影響しないことが知られている。このため、本発明においては、trp4遺伝子発現カセットをL−トリプトファン産生母菌株の遺伝体にあるybiX遺伝子座に挿入した。
準備されたDNA断片は、5’および3’末端にそれぞれybiX遺伝子などの配列を100bp含む断片であり、L−トリプトファン産生菌株のybiX遺伝子座から遺伝子組み換え酵素により遺伝体内に挿入され得る。準備したDNA断片は、ナノドロップ(NanoDrop、サーモサイエンティフィック社製)を用いて濃度を測定し、これを「ybiX::Cm−PCJ1−trp4」と命名し、その配列を配列番号16に示す。
ybiX遺伝子座にtrp4遺伝子発現カセットを遺伝子組み換え酵素を用いて挿入した。このために、DatsenkoKAらが開発したラムダレッド組み換え酵素を用いた単一段階遺伝子不活性化技法を応用した(Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97, 6640−6645, 2000)。
ラムダレッド組み換え酵素を発現させるベクターであるpKD46プラスミドを実施例2の方法と同様にしてL−トリプトファン産生菌株(KCCM10812P)に取り込んだ。pKD46ベクターが取り込まれたL−トリプトファン産生菌株をアンピシリンを含むLB固体培地において選別した。選別したpKD46ベクターが取り込まれたL−トリプトファン産生菌株は、ラムダレッド組み換え酵素の発現を誘導するために、5mMのアラビノースを含む20mLの液体LB培地において培養した。菌体の量が510108cells/mLに増えたときに遠心分離して菌体を回収し、これを冷たい10%グリセロール溶液で3回洗浄した。
このようにして準備したL−トリプトファン産生菌株に電気穿孔法を用いて実施例5−2において準備した500ngのybiX::Cm−PCJ1−trp4DNA断片をと取り込んだ。前記DNA断片が取り込まれたL−トリプトファン産生菌株は、ラムダレッド組み換え酵素によりybiX遺伝子座において遺伝子組み換えが起きてクロラムフェニコール抵抗性遺伝子およびtrp4遺伝子発現カセットがybiX遺伝子座に挿入される。この菌株はクロラムフェニコールに対して抵抗性を示すため、クロラムフェニコールを含むLB固体培地において選別した。このようにして選別した菌株は、配列番号17および18のプライマーを用いて、コロニーPCRによりybiX遺伝子座にCm−PCJ1−trp4断片が挿入されたことを確認した。
次いで、pKD46ベクターは温度に敏感な複製起点を有しているため、選別した菌株を40℃以上で培養して菌体内からpKD46ベクターを除去し、これは、アンピシリンを含む固体LB培地において選別した菌株が生長しないことにより確認した。
次いで、L−トリプトファン産生菌株の遺伝体からクロラムフェニコールに対して抵抗性を示す遺伝子を除去するために、pJW168プラスミド(Palmeros et al., Gene,247, 255−264, 2000)を菌株に実施例2の方法と同様にして取り込んだ。取り込んだpJW168プラスミドからCre組み換え酵素を発現させるために、アンピシリンを含むLB培地にイソプロピル1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(Isopropyl−β−D−1−thiogalactopyranoside、IPTG)を塗抹して菌株を選別した。選別された菌株は、Cre組み換え酵素によりmutantloxP位において遺伝子組み換えが起きてクロラムフェニコールに対して抵抗性を示す遺伝子が除去され、これを配列番号17および18のプライマーで確認した。このようにして確認した菌株は、trp4遺伝子発現カセットが挿入されたL−トリプトファン産生菌株であり、「Con/ybiX::PCJ1−trp4」と命名した。
前記実施例5において準備した形質転換体を前記表1のトリプトファン力価培地を用いて三角フラスコにおいて培養してL−トリプトファン産生性を比較した。
37℃の培養器においてLB固体培地中において一晩中培養したL−トリプトファン産生母菌株(Con)、Con/ybiX::PCJ1−trp4菌株を表1の25mLの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを37℃、200rpmの培養器において40時間培養し、その結果を下記表5および6に示す。
また、表6に示すように、Con/ybiX::PCJ1−trp4は、ベクターとしてtrp4遺伝子発現カセットを取り込んだときと同様に、糖を用いる速度や細胞の成長の側面からみて母菌株とほとんど同じ様相を示し、発酵副産物であるアセテートの蓄積度もほとんど同じであるか、あるいは、それよりも低いレベルを示した(データは図示せず)。
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Claims (6)
- 酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素の活性を有する、L−トリプトファン産生能を有する組み換えトリプトファン産生エシェリキア属微生物。
- 酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1に記載のエシェリキア属微生物。
- 前記酵母由来のアントラニル酸ホスホリボシル転移酵素は、アントラニル酸ホスホリボシル転移酵素を暗号化させるポリヌクレオチドを含むベクターが形質導入されるか、あるいは、前記ポリヌクレオチドが染色体内に挿入されることを特徴とする、請求項1に記載のエシェリキア属微生物。
- 前記ポリヌクレオチドは、配列番号9の塩基配列を有することを特徴とする、請求項3に記載のエシェリキア属微生物。
- 前記エシェリキア属微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項1に記載のエシェリキア属微生物。
- 請求項1から請求項5のうちのいずれか一項に記載のエシェリキア属微生物を培養するステップと、
前記培養液からL−トリプトファンを分離するステップと、
を含むL−トリプトファンの産生方法。
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