JP6192824B2 - L−スレオニン産生微生物およびこれを用いたl−スレオニンの産生方法 - Google Patents
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Description
また、本発明は、前記RNAポリメラーゼシグマ32ファクター変異体をコードする塩基配列を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記塩基配列を含むベクターを提供することを目的とする。
さらにまた、本発明は、前記変異体を発現するL−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を提供することを目的とする。
これらに加えて、本発明は、前記組み換えエシェリキア属微生物を用いてL−スレオニンを産生する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記RNAポリメラーゼシグマ32ファクター変異体をコードする塩基配列を提供する。
さらに、本発明は、前記変異体を発現するL−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を提供する。
さらにまた、本発明は、前記組み換えエシェリキア属微生物を用いてL−スレオニンを産生する方法を提供する。
本発明は、配列番号17に記載のアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼシグマ32ファクター変異体を提供する。
本発明の好適な実施形態において、前記RNAポリメラーゼシグマ32ファクター変異体は、好ましくは、配列番号15の塩基配列を有していてもよい。
このため、本発明の塩基配列は、配列番号15に記載の塩基配列と80%以上の相同性、好ましくは、90%以上の相同性、さらに好ましくは、95%以上の相同性、最も好ましくは、99%以上の相同性を有していてもよい。
本発明において用いられるベクターは、宿主中において複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界における公知の任意のベクターを用いることができる。通常のベクターの例としては、天然状態や組み換え状態のプラスミド、コスミド、ウィルスおよびバクテリオファージが挙げられる。例えば、把持ベクターまたはコスミドベクターとして、pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4AおよびCharon21Aなどが使用可能であり、プラスミドベクターとして、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系およびpET系などが使用可能である。本発明において使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターが使用可能である。好ましくは、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどが使用可能である。最も好ましくは、pACYC177、pACYC184、pCL、pCC1BACベクターが使用可能である。
本発明において、前記変異体の発現は、前記変異体をコードする遺伝子を作動可能に含む組み換えベクターに形質転換されて達成されるか、あるいは、前記変異体を暗号化させるポリヌクレオチドが染色体内に挿入されて達成されるが、本発明はこれに特に限定されない。
本発明における用語「形質転換」とは、目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に取り込んで宿主細胞内において前記ポリヌクレオチドが暗号化させるタンパク質を発現させることを意味する。取り込まれたポリヌクレオチドは、宿主細胞内において発現可能である限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、あるいは、染色体外に位置する。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質を暗号化させるDNAおよびRNAを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に取り込まれて発現可能である限り、いかなる形で取り込まれても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要なあらゆる要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセットの形で宿主細胞に取り込まれてもよい。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子のオープンリーディングフレーム(open readingframe、以下、「ORF」と略称する。)に作動可能に連結されているプロモーター、転写終結信号、リボソーム結合部位および翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自体的に複製可能な発現ベクターの形であってもよい。なお、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に取り込まれて、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
本発明の前記培養過程は、当業界における公知の適当な培地および培養条件により行われる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて手軽に調整して用いることができる。前記培養方法としては、回分式培養、連続式培養および流加式培養が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の微生物培養に用いられる培地およびその他の培養条件は、通常のエシェリキア属微生物の培養に用いられる培地であれば、いかなるものも使用可能であるが、本発明の微生物の要求条件を適切に満たさなければならない。
このとき、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物、糖アルコール、グリセロール、ピルビン酸、乳酸およびクエン酸などのアルコールおよび有機酸、グルタミン酸、メチオニンおよびリシンなどのアミノ酸などが挙げられ、澱粉加水分解物、糖みつ、廃糖みつ、米糠、カッサバ、バガスおよびトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源が使用可能であり、好ましくは、グルコースおよび殺菌済みの前処理糖みつ(すなわち、還元糖に転換された糖みつ)などの炭水化物であり、その他の適正量の様々な炭素源が制限なしに使用可能である。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源;グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸およびペプトン、NZ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物など有機窒素源が使用可能である。これらの窒素源は、単独でまたは組み合わせられて使用可能である。前記培地には、リン源として、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウムおよび対応するナトリウム含有塩が挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどが使用可能であり、これらに加えて、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが使用可能である。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式により添加可能である。
(1)rpoH遺伝子断片の準備
rpoH遺伝子(配列番号14、アミノ酸配列番号16)を含むDNA断片約1.0kbを得るために、キアゲン社製のGenomic−tipシステムを用いて大腸菌野生株であるW3110の染色体DNA(gDNA)を抽出し、前記gDNAを鋳型としてPCRHLプレミックスキット(BIONEER社製、以下、同じ。)を用いて重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction、以下、「PCR」と略称する。)を行った。
rpoH遺伝子を増幅させるための重合酵素連鎖反応(PCR)は、配列番号1および2のプライマーを用いて、94℃における30秒間の変性、55℃における30秒間のアニーリングおよび72℃における1分間の伸張よりなるサイクルを27回繰り返し行った。
前記重合酵素連鎖反応(PCR)結果物をEcoRIで切断して1.0Kbの大きさのDNA断片(以下、「rpoH断片」と命名する。)を0.8%のアガロースゲルにおいて電気泳動した後、溶離して得た。
複製数調節pCC1BAC EcoRIクローニングレディベクター(Copycontrol pCC1BAC EcoRI cloning−ready vector;EPICENTRE(USA))および実施例1−(1)において得られたrpoH断片をそれぞれ制限酵素EcoRIで処理し、結さつしてpCC1BAC−rpoHプラスミドを製作した。
(1) エラープローン 重合酵素連鎖反応(PCR)を用いたrpoH変異体の準備
無作為的突然変異が取り込まれたrpoH変異体断片よりなるDNAプールを得るために、実施例1−(1)において抽出したW3110のgDNAを鋳型としてクローンテック社製のdiversifyPCRrandommutagenesiskit(カタログ番号K1830−1)のユーザーマニュアルに提示されている表3の突然変異反応4の条件で重合酵素連鎖反応(PCR)を行った。重合酵素連鎖反応(PCR)は、配列番号1および2のプライマーを用いて、94℃における30秒間の変性、68℃における1分間の伸張よりなるサイクルを25回繰り返し行った。
前記重合酵素連鎖反応(PCR)結果物をEcoRIで切断して1.0Kbの大きさのDNA断片(以下、「rpoHm断片」と命名する。)を0.8%のアガロースゲルにおいて電気泳動した後、溶離して得た。
複製数調節pCC1BAC EcoRIクローニングレディベクターを実施例2−(1)において得られたrpoHm断片と結さつしてpCC1BAC−rpoHmベクターを製作した。
これをトランスフォーマックスEPI300エレクトロコンピテント大腸菌(TransforMax EPI300 Electrocompetent E.coli;EPICENTRE(USA))に形質転換し、LBプレート+15μg/mlクロラムフェニコール+40μg/ml X−Gal+0.4mM IPTGにおいて選別して青いコロニーが出ないことを確認し、取得されたコロニーを集めてプラスミドプレップを行ってpCC1BAC−rpoHの変異体ライブラリーを製作した。
前記実施例1−(2)において得られたpCC1BAC−rpoHおよび実施例2−(2)において得られたpCC1BAC−rpoHの変異体ライブラリーをコンピテントな状態で製造したスレオニン産生菌株である大腸菌KCCM 10541にそれぞれ形質転換して取り込み、得られた菌株をそれぞれKCCM10541/pCC1BAC−rpoHおよびKCCM 10541/pCC1BAC−rpoH変異体ライブラリーと命名した。
この実施例において用いられた母菌株である大腸菌KCCM 10541は、メチオニン栄養要求性、イソロイシン漏出型要求性、L−スレオニン類似体(例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシヒドロキシ酪酸;AHV)に対する耐性、L−リシン類似体(例えば、S−(2−アミノエチル)−L−システイン;AEC)に対する耐性、イソロイシン類似体(例えば、α−アミノ酪酸)に対する耐性、メチオニンの類似体(例えば、エチオニン)に対する耐性などの特性を有する母菌株である大腸菌(Escherichia coli)KCCM 10236の染色体の内部に存在するtyrR遺伝子およびgalR遺伝子を不活性化させることにより向上したL−スレオニン産生能を有する菌株である(大韓民国特許登録番号第10−0576342号)。
この実施例においては、温度に耐性を有するRNAポリメラーゼシグマ32ファクター変異体を選別するための実験を行った。
前記実施例2−(3)において製造した大腸菌KCCM10541/pCC1BAC−rpoHおよび大腸菌KCCM 10541/pCC1BAC−rpoH変異体ライブラリーを37℃、33℃の培養器においてLB固体培地中に一晩培養し、これをそれぞれ下記表1の25mLの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを37℃、33℃の震とう培養器において200rpmにて48時間それぞれ培養した。
前記pCC1BAC−rpoH2−G6の変異を確認するために、複製数調節pCC1BAC EcoRIクローニングレディベクターキットに確認用プライマーとして提供されるpIBFP(配列番号3)およびpIBRP(配列番号4)を用いてpCC1BAC−rpoH2−G6の重合酵素連鎖反応(PCR)を行い、得られた重合酵素連鎖反応(PCR)結果物の配列を分析した。配列を分析したところ、rpoHの変異体であるrpoH2−G6(配列番号15)は、配列番号17のアミノ酸配列を有することを確認した。
前記実施例3において得られたベクターpCC1BAC−rpoH2−G6を大腸菌KCCM 10541に形質転換して大腸菌KCCM 10541/pCC1BAC−rpoH2−G6を製造した。
母菌株である大腸菌KCCM 10541、大腸菌KCCM 10541/pCC1BAC−rpoHおよび大腸菌をKCCM 10541/pCC1BAC−rpoH2−G6をそれぞれ上記表1のスレオニン力価培地を用いて三角フラスコにおいて培養してL−スレオニン産生性を確認した。その結果を下記表2に示す。
37℃では母菌株(KCCM 10541)および対照群菌株(KCCM10541/pCC1BAC−rpoH)の歩留まり率が下がる様相を示すのに対し、KCCM 10541/pCC1BAC−rpoH2−G6菌株は温度による濃度低下現象を示さず、31.8g/LのL−スレオニンを産生して高温における培養時に対照群に比べて約8%向上したスレオニン産生能が与えられたことを確認することができた。
(1) ABA5G/pAcscBAR'−M、pC−Ptrc−scrAB菌株におけるrpoH変異体(rpoH 2−G6 )効果の確認
前記実施例4において効果が確認されたベクターpCC1BAC−rpoH2−G6をスレオニン産生菌株であるABA5G/pAcscBAR'−M、pC−Ptrc−scrAB(大韓民国特許登録番号第10−1145943号)に取り込んでABA5G/pAcscBAR'−M、pC−Ptrc−scrAB、pCC1BAC−rpoH2−G6を製作し、下記表3に示す力価培地を製造して力価評価を行った。その結果を下記表4に示す。
この実施例において用いられた母菌株であるABA5G/pAcscBAR'−M、pC−Ptrc−scrABは、スレオニン産生菌株であるABA5G菌株(母菌株である大腸菌W3110のN−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)突然変異の誘起により製作された菌株であり、メチオニン要求性、イソロイシン漏出、α−アミノ−β−ヒドロキシヒドロキシ酪酸に対する耐性、2−アミノエチル−1−システインに対する耐性、1−アゼチジン−2−カルボン酸に対する耐性を有する)にpAcscBAR'−M遺伝子群およびpC−Ptrc−scrAB遺伝子群を含むベクターに形質転換して得られたL−スレオニン産生能を有する大腸菌である。
さらに他のスレオニン産生菌株である大腸菌KCCM11167P(大韓民国特許出願番号第2011−0005136号)にベクターpCC1BAC−rpoH2−G6を取り込んで大腸菌KCCM11167P/pCC1BAC−rpoH2−G6を製作し、上記表1の力価培地を製造してスレオニン産生能を評価した。その結果を下記表5に示す。
この実施例において用いられた母菌株である大腸菌KCCM11167Pは、KCCM 10541菌株(大韓民国特許登録番号第10−0576342)にtdcBを不活性化させ、nadKを2copyに強化させてNADキナーゼ活性を強化させた菌株である。
(1) rpoH 2−G6 挿入用カセット断片の準備
前記実施例3において選別されたrpoH2−G6変異体を染色体に追加的に挿入するために線形挿入用カセットを製作した。線形挿入用カセットは、下記の方法に従い製作した。
配列番号5および6のプライマーを用いて、大腸菌W3110 gDNAを鋳型として重合酵素連鎖反応(PCR)を行った。重合酵素連鎖反応(PCR)は、94℃における30秒間の変性、55℃における30秒間のアニーリングおよび72℃における30秒間の伸張よりなるサイクルを27回繰り返し行った。このようにして得られたDNA断片を相同性部位1と命名した。
配列番号7および8のプライマーを用いて、pMloxCmtを鋳型として変異体loxP−Cmr−loxPカセットを増幅させるための重合酵素連鎖反応(PCR)を行い、94℃における30秒間の変性、55℃における30秒間のアニーリングおよび72℃における1分間の伸張よりなるサイクルを27回繰り返し行った。このようにして得たDNA断片を相同性部位1と命名した。ここで、鋳型として用いられたpMloxCmtは、鈴木らがlox71およびlox66と命名した変異体loxPを用いた改善された遺伝子の欠失方法について報告した内容を応用して当業者が製作したベクターである(Suzuki N. et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:8472, 2005)。
このようにして得た相同性部位1および変異体loxP−Cmr−loxPカセット部分を配列番号5および8を用いて重複伸長重合酵素連鎖反応(PCR)を行い、相同性領域1−変異体loxP−Cmr−loxPを得た。このとき、重合酵素連鎖反応(PCR)は、プライマーがない状態で、94℃における30秒間の変性、55℃における30秒間のアニーリングおよび72℃における1分30秒間の伸張よりなるサイクルを5回繰り返し行った後、プライマーを入れて23サイクルをさらに行った。
配列番号9および10のプライマーを用いて、pCC1BAC−rpoH2−G6を鋳型として重合酵素連鎖反応(PCR)を行った。94℃における30秒間の変性、55℃における30秒間のアニーリングおよび72℃における1分間の伸張よりなるサイクルを27回繰り返し行った。
配列番号11および12のプライマーを用いて、大腸菌W3110 gDNAを鋳型として重合酵素連鎖反応(PCR)を行った。94℃における30秒間の変性、55℃における30秒間のアニーリングおよび72℃における30秒間の伸張よりなるサイクルを27回繰り返し行った。このようにして得たDNA断片を相同性部位2と命名した。
上記のrpoH2−G6および相同性部位2の部分に対して配列番号9および12を用いて重複伸長重合酵素連鎖反応(PCR)を行ってrpoH2−G6−相同性部位2を得た。このとき、重合酵素連鎖反応(PCR)は、プライマーがない状態で、94℃における30秒間の変性、55℃における30秒間のアニーリングおよび72℃における1分30秒間の伸張よりなるサイクルを5回繰り返し行った後、プライマーを入れて23サイクルをさらに行った。
このようにして得た相同性部位1−変異体loxP−Cmr−loxP、rpoH2−G6−相同性部位2を鋳型として、配列番号5および12を用いて重複伸長重合酵素連鎖反応(PCR)を行ってrpoH2−G6挿入用カセットを製作した。このとき、重合酵素連鎖反応(PCR)は、プライマーがない状態で、94℃における30秒間の変性、55℃における30秒間のアニーリングおよび72℃における3分間の伸張よりなるサイクルを5回繰り返し行った後、プライマーを入れて23サイクルをさらに行った。このような過程を経て配列番号13に記載のrpoH2−G6挿入用カセットを製作した。
染色体の上に既に選別されたrpoH2−G6変異体を挿入するために、大腸菌KCCM 10541に前記実施例6−(1)において製作したrpoH2−G6挿入用カセットDNA断片を分離精製して公知の1段階不活性化(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000)の方法と同様にして既存の内在されたrpoHの後ろの染色体部分にrpoH2−G6変異体をさらに挿入した。次いで、抗生剤耐性標識遺伝子を除去してrpoH2−G6変異体がさらに挿入された菌株を製作し、塩基配列の分析を行って重合酵素連鎖反応(PCR)エラーが導入されていないことを確認した。製作されたrpoH2−G6の追加挿入菌株をFTR2700と命名し、前記形質転換された大腸菌FTR2700を2013年2月5日付けで韓国微生物保存センター(KoreanCulture Center of Microorganisms、以下、「KCCM」と略称する。)に寄託した(受託番号KCCM 11368P)。
前記実施例6−(2)において製造した組み換え微生物を上記表1のスレオニン力価培地を用いて三角フラスコにおいて培養してL−スレオニン産生性を確認した。
33℃、37℃の培養器においてLB固体培地中に一晩培養した大腸菌KCCM 10541および大腸菌KCCM 11368Pをそれぞれ上記表1の25mLの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを33℃、37℃の震とう培養器において200rpmにて48時間培養した。
下記表6に記載されているように、母菌株である大腸菌KCCM 10541菌株は、48時間培養した場合に30.3g/LのL−スレオニンを産生し、本発明の前記実施例6−(2)において製作されたKCCM11368P大腸菌菌株は30.0g/LのL−スレオニンを産生して母菌株と略同じL−スレオニン産生性を示した。37℃では母菌株(KCCM 10541)の歩留まり率が下がる様相を示すのに対し、KCCM 11368P菌株は温度による濃度低下現象を示さず、濃度が上がる様相を示した。
これにより、ベクターの形で取り込まれて形質転換された菌株と同様に、37℃の培養時にも33℃の培養時と略同じレベルのスレオニン産生能あるいはこれを上回るレベルのスレオニン産生能が与えられたことを確認することができた。
寄託機関名:韓国微生物保存センター(海外)
受託番号:KCCM 11368P
受託日:2013年02月05日
寄託機関の名称
韓国微生物保存センター
寄託機関の住所(郵便番号および国名を含む)
〒120-091 韓国ソウル特別市西大門区弘済1洞361-221番地ユリムビル 寄託日
2013年02月05日
寄託番号
KCCM 11368P
Claims (9)
- 配列番号17に記載のアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼシグマ32ファクター変異体。
- 請求項1のRNAポリメラーゼシグマ32ファクター変異体をコードする塩基配列を含む核酸。
- 前記塩基配列は、配列番号15に記載の塩基配列を有する、請求項2の核酸。
- 請求項2の核酸を含むベクター。
- 請求項1の変異体を発現させるL−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
- 前記発現は、配列番号17に記載のアミノ酸配列を有するRNAポリメラーゼシグマ32ファクター変異体をコードする塩基配列を含む組み換えベクターが形質導入されて行われるか、あるいは、前記塩基配列が染色体内にさらに挿入されて行われることを特徴とする、請求項5に記載のL−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
- 前記塩基配列は、配列番号15の塩基配列を有することを特徴とする、請求項6に記載のL−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
- 前記エシェリキア属微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項6に記載のL−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物。
- 請求項5から請求項8のうちのいずれか一項に記載のL−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を培養するステップおよび前記培養液からL−スレオニンを分離するステップを含むL−スレオニンの産生方法。
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