BR112015032332B1

BR112015032332B1 - Variante de fator sigma-32 de rna polimerase, sequência de nucleotídeos, vetor, microrganismo recombinante do gênero escherichia que tem produtividade de l-treonina e método para produzir ltreonina

Info

Publication number: BR112015032332B1
Application number: BR112015032332-4A
Authority: BR
Inventors: Ji Sun Lee; Kwang Ho Lee; Eun Sung Koh; Hyung Joon Kim; Keun Cheol Lee; Young Bin Hwang
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2023-01-03
Also published as: MY169693A; KR20150000145A; BR112015032332A2; EP3015547A1; US20160281070A1; EP3015547A4; EP3015547B1; CN105431531A; CN105431531B; JP6192824B2; ES2693522T3; US9758772B2; JP2016521763A; KR101646310B1; WO2014208884A1

Abstract

MICRO-ORGANISMO PRODUTOR DE L-TREONINA E MÉTODO DE PRODUÇÃO PARA L-TREONINA COM O USO DO MESMO. A presente invenção refere-se a um micro-organismo produtor de L-treonina e a um método de produção para L-treonina com o uso do mesmo e, mais especificamente, a um micro-organismo que tem produtividade de L-treonina intensificada e um método para produzir L-treonina em alto rendimento com o uso do mesmo.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] O presente pedido refere-se a uma variante de fator sigma- 32 de RNA polimerase e um método para produzir L-treonina com o uso da mesma.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] L-treonina, um tipo de aminoácido essencial, é amplamente usada como um aditivo a rações e alimentos de animais e é também eficazmente usada como soluções de reidratação e materiais sintéticos para uso médico e farmacêutico.

[003] A L-treonina é principalmente produzida por fermentação com o uso de Escherichia coli ou Corynebacterium, desenvolvidas por métodos de mutação artificial ou métodos de recombinação de gene. As cepas mutantes artificiais derivadas de cepas do tipo selvagem, incluindo Escherichia coli, Serratia, Providencia ou Corynebacterium, são amplamente usadas para a produção de L-treonina.

[004] Com o desenvolvimento da tecnologia de recombinação de gene, tecnologias de manipulação para cepas que têm produtividade de L-treonina por mutação aleatória foram relatadas como substituição de gene específica para sítio, deleção e amplificação de gene, etc. para a produtividade de L-treonina melhorada. Os genes relacionados à biossíntese de treonina e vários métodos para aumentar a expressão desses genes foram desenvolvidos, mas a demanda por um método que tem a capacidade de produzir L-treonina em rendimento maior ainda existe.

[005] O maquinário de transcrição global funciona para controlar os transcritos em todos os sistemas celulares (procarióticos e eucarióticos). A engenharia de maquinário de transcrição global fornece células recombinantes que compreendem um regulador global que tem caracteres melhorados pela mutação de um ácido nucleico que codifica o regulador global ou um promotor que controla a expressão do mesmo, e células que têm fenótipos melhorados podem ser produzidas por esse método.

[006] Um fator sigma é um tipo de regulador global que desempenha um papel importante na regulação da transcrição global com base na preferência de promotor da holoenzima RNA polimerase. Um fator sigma é um fator de iniciação de transcrição procariótica que permite a ligação específica da RNA polimerase a promotores de gene. Cada fator sigma é ativado em resposta a uma condição ambiental diferente, e cada molécula de RNA polimerase contém uma subunidade de fator sigma. Sabe-se que a E. coli tem pelo menos oito fatores sigma e que o número de fatores sigma varia dependendo da espécie bacteriana.

[007] Os presentes inventores conduziram estudos para modificar o gene rpoH que codifica sigma-32 conhecido por controlar a resposta de choque térmico para o propósito de intensificar adicionalmente a resistência ao estresse de alta temperatura de uma cepa de E. coli que tem produtividade de L-treonina. Como resultado, os presentes inventores desenvolveram uma variante de fator sigma-32 de RNA polimerase que regula o mecanismo transcricional de modo que a produtividade de treonina não diminua significativamente mesmo em altas temperaturas e introduziram a variante de fator sigma-32 de RNA polimerase em uma cepa que produz treonina, concluindo assim o presente pedido.

REVELAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[008] É um objetivo do presente pedido fornecer uma variante de fator sigma-32 de RNA polimerase.

[009] Outro objetivo do presente pedido é fornecer uma sequência de nucleotídeos que codifica a variante de fator sigma-32 de RNA polimerase.

[0010] Ainda outro objetivo do presente pedido é fornecer um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos.

[0011] Ainda outro objetivo do presente pedido é fornecer um microrganismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L-treonina, que expressa a variante.

[0012] Ainda outro objetivo do presente pedido é fornecer um método para produzir L-treonina com o uso do microrganismo do gênero Escherichia.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[0013] A fim de se alcançar os objetivos acima, o presente pedido fornece uma variante de fator sigma-32 de RNA polimerase que tem uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17.

[0014] O presente pedido também fornece uma sequência de nucleotídeos que codifica a variante de fator sigma-32 de RNA polimerase.

[0015] O presente pedido também fornece um microrganismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L- treonina, que expressa a variante.

[0016] O presente pedido também fornece um método para produzir L-treonina com o uso do microrganismo do gênero Escherichia.

EFEITOS VANTAJOSOS

[0017] De acordo com o presente pedido, uma cepa transformada com um vetor que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma variante de fator sigma-32 de RNA polimerase que tem resistência ao estresse de alta temperatura tem resistência à temperatura e pode também produzir L-treonina em um rendimento aumentado. Assim, a mesma pode produzir treonina com produtividade significativamente alta em comparação às cepas convencionais, mesmo quando a mesma é cultivada em altas temperaturas. Consequentemente, a mesma pode ser efetivamente usada para produzir treonina em alto rendimento.

MODO PARA A INVENÇÃO

[0018] Doravante, o presente pedido será descrito em detalhes.

[0019] O presente pedido fornece uma variante de fator sigma-32 de RNA polimerase que tem uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17.

[0020] Conforme usado no presente documento, o termo "fator sigma-32 (a32)" refere-se ao fator sigma regulador global conhecido como um fator sigma principal que controla a resposta de choque térmico na fase logarítmica e que é codificado pelo gene rpoH.

[0021] Adicionalmente, as variantes que têm uma homologia de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, mais especificamente pelo menos 95% e particular e especificamente pelo menos 99% às sequências de aminoácidos da variante do presente pedido são também incluídas no escopo do presente pedido. A homologia da sequência de aminoácidos pode ser determinada com o uso, por exemplo, do algoritmo BLAST de Karlin e Altschul (consulte Pro. Natl. Acad. Sci. EUA, 90, 5873 (1993)) ou FASTA (consulte Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Os programas chamados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos com base nesse algoritmo BLAST (referir-se a www.ncbi.nlm.nih.gov). O escopo da variante do presente pedido inclui mutantes que têm uma deleção, inserção, substituição de aminoácido e similares em comparação à sequência de aminoácidos da variante também inclui mutantes que têm substituição de códon.

[0022] Em uma modalidade do presente pedido, uma variante foi selecionada a partir de um agrupamento de DNA de rpoH mutado obtido introduzindo-se mutações aleatórias na cepa de E. coli do tipo selvagem W3110, e a variante selecionada foi chamada de rpoH2-G6. A sequência de nucleotídeos da variante extraída foi analisada e, como resultado, poderia ser visto que uma mutação na sequência de aminoácidos da variante em comparação à sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de um fator sigma-32 de RNA polimerase do tipo selvagem ocorreu (Exemplo 3).

[0023] O presente pedido também fornece uma sequência de nucleotídeos que codifica a variante.

[0024] Em uma modalidade do presente pedido, a variante de fator sigma-32 de RNA polimerase pode ter especificamente uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 15.

[0025] Em uma modalidade do presente pedido, o código genético da sequência de nucleotídeos que codifica a variante pode ser degenerado. No presente documento, a degeneração do código genético é um fenômeno no qual a última letra no código genético é insignificante. Se as primeiras duas bases forem iguais, as mesmas codificam igualmente, mesmo quando os códigos nas posições são diferentes.

[0026] Consequentemente, a sequência de nucleotídeos da variante de acordo com o presente pedido pode ter uma homologia de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, mais especificamente pelo menos 95%, mais especificamente 99% a uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 15.

[0027] O presente pedido também fornece um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos.

[0028] O vetor usado no presente pedido não é especificamente limitado e pode ser qualquer vetor conhecido na técnica, contanto que o mesmo possa se replicar em um hospedeiro. Os exemplos dos vetores que são comumente usados incluem plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, o vetor de fago ou vetor de cosmídeo usado no presente pedido pode ser pWE15, M13, ÀMBL3, ÀMBL4, ÀIXII, ÀASHII, ÀAPII, At10, Àt11, Charon4A, Charon21A ou similares, e o vetor de plasmídeo usado no presente pedido pode ser tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET ou similares. Um vetor que pode ser usado no presente pedido não é especificamente limitado e pode ser qualquer vetor de expressão conhecido na técnica. Especificamente, um vetor pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 ou pCC1BAC pode ser usado. Mais especificamente, um vetor pACYC177, pCL ou pCC1BAC pode ser usado.

[0029] O presente pedido fornece um microrganismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L-treonina, que expressa a variante.

[0030] No presente pedido, a expressão da variante pode ser alcançada pela transformação com um vetor recombinante que compreende operacionalmente um gene que codifica a variante ou pela inserção de um polinucleotídeo que codifica a variante no cromossomo do microrganismo, mas não é especificamente limitada ao mesmo.

[0031] Conforme usado no presente documento, o termo "transformação" significa introduzir um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira de modo a ter a capacidade de expressar uma proteína codificada pelo polinucleotídeo na célula hospedeira. O polinucleotídeo introduzido pode ser inserido e localizado no cromossomo da célula hospedeira ou localizado fora do cromossomo, contanto que o mesmo possa ser expresso na célula hospedeira. Adicionalmente, os polinucleotídeos incluem DNA e RNA, que codificam a proteína-alvo. Contanto que o polinucleotídeo possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso na mesma, o mesmo pode ser introduzido de qualquer forma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão que é um construto de polinucleotídeo incluindo todos os elementos exigidos para a autoexpressão. O cassete de expressão geralmente inclui um promotor que é operacionalmente ligado ao quadro de leitura aberto (doravante abreviado como "ORF") do gene, um sinal de terminação de transcrição, sítio de ligação de ribossomo e um sinal de terminação de tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira por si próprio e operacionalmente ligado à sequência necessária para a expressão na célula hospedeira.

[0032] No presente pedido, a transformação pode ser alcançada ou pela transdução de um vetor que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a variante de fator sigma-32 de RNA polimerase ou pela inserção da sequência de nucleotídeos no cromossomo do microrganismo, mas não é especificamente limitada ao mesmo.

[0033] O microrganismo do presente pedido inclui qualquer microrganismo procariótico, contanto que o mesmo possa produzir L- treonina. Por exemplo, o mesmo pode incluir um microrganismo que pertence ao gênero Escherichia, ao gênero Erwinia, ao gênero Serratia, ao gênero Providencia, ao gênero Corynebacterium ou ao gênero Brevibacterium. Especificamente, o microrganismo usado no presente pedido é o gênero Escherichia. Mais especificamente, o mesmo é Escherichia coli.

[0034] Em uma modalidade do presente pedido, uma cepa que produz treonina pode ser usada como uma cepa progenitora. A cepa que produz treonina pode ser uma cepa de E. coli que tem um fenótipo auxotrófico de metionina, resistência a um análogo de treonina, resistência a um análogo de lisina, resistência a um análogo de isoleucina e resistência a um análogo de metionina. Adicionalmente, a cepa que produz treonina pode ser uma cepa de E. coli recombinante obtida pela manipulação do gene de biossíntese de treonina ou similares. Por exemplo, a mesma pode ser uma cepa de E. coli recombinante que tem introduzida na mesma uma cópia de cada um dentre o gene de fosfoenol piruvato carboxilase (ppc) e um operon que compreende aspartoquinase L-homosserina desidrogenase (thrA), homosserina quinase (thrB) e treonina sintase (thrC). Alternativamente, a mesma pode ser uma cepa de E. coli recombinante obtida inativando- se tanto um gene de operon (tdcBC), que está envolvido na degradação de L-treonina, quanto fosfoenol piruvato carboxilase (pckA).

[0035] Especificamente, uma cepa usada no presente pedido pode ser uma cepa selecionada a partir do grupo que consiste em E. coli KCCM10541P (Patente coreana n° 10-0576342), E. coli ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB (Patente coreana n° 10-1145943) e E. coli KCCM11167P (Publicação de Patente coreana aberta à inspeção pública n° 10-2012-0083795).

[0036] Em uma modalidade do presente pedido, o microrganismo transformado pode ser E. coli FTR2700.

[0037] Em uma modalidade do presente pedido, o microrganismo do presente pedido pode ser uma cepa de E. coli que tem um ou mais fenótipos desejados para intensificar a produtividade de L-treonina. Especificamente, os um ou mais fenótipos desejados são fenótipos resistentes à temperatura.

[0038] O presente pedido também fornece um método para produzir L-treonina com o uso da cepa transformada.

[0039] O método de cultura no presente pedido pode ser realizado em condições de cultura e meio adequadas conhecidas na técnica. Esse método de cultura pode ser facilmente modificado por qualquer versado na técnica dependendo do tipo de cepa selecionado. Os exemplos do método de cultura incluem, porém, sem limitação, cultura em batelada, cultura contínua e cultura em batelada alimentada.

[0040] As condições de cultura e meio que são usadas na cultura do microrganismo do presente pedido podem ser qualquer uma daquelas que são geralmente usadas na cultura de microrganismos do gênero Escherichia, mas as mesmas devem satisfazer apropriadamente as exigências do microrganismo do presente pedido.

[0041] Em uma modalidade específica, o microrganismo do presente pedido pode ser cultivado em um meio convencional que contém fontes de carbono, fontes de nitrogênio, aminoácidos, vitaminas e similares adequados sob condições aeróbicas enquanto ajusta a temperatura, pH e similares.

[0042] As fontes de carbono que podem ser usadas no presente pedido incluem carboidratos tais como glicose, frutose, sacarose, maltose, manitol, sorbitol; álcoois tais como álcool de açúcar, glicerol, ácido pirúvico, ácido lático e ácido cítrico; e aminoácidos tais como ácido orgânico, ácido glutâmico, metionina e lisina. Adicionalmente, as fontes de nutrientes orgânicas naturais tais como hidrolisatos de amido, melaço, melaço residual, farelo de arroz, mandioca, bagaço e licor de maceração de milho podem ser usadas. Especificamente, os carboidratos tais como glicose e melaço pré-tratado estéril (isto é, melaço convertido em açúcares reduzidos) podem ser usados. Adicionalmente, quantidades adequadas de outras fontes de carbono podem ser usadas sem limitação. As fontes de nitrogênio que podem ser usadas na presente pedido incluem fontes de nitrogênio inorgânico tais como amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio; aminoácidos tais como ácido glutâmico, metionina e glutamina; e fontes de nitrogênio orgânico tais como peptona, NZ-amina, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, licor de maceração de milho, hidrolisato de caseína, farinha de peixe ou seu produto digerido, torta de soja desengordurada ou seu produto digerido, etc. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em combinação. O meio pode conter, como fontes de fósforo, fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico e sais que contêm sódio correspondentes. Os compostos inorgânicos que podem ser usados no presente pedido incluem cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês e carbonato de cálcio. Adicionalmente, o meio pode conter aminoácidos, vitaminas e precursores adequados. Essas fontes ou precursores podem ser adicionados ao meio de uma maneira em batelada ou contínua.

[0043] Os compostos tais como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser adicionados ao meio de uma maneira adequada durante a cultura para ajustar o pH do meio de cultura. Adicionalmente, durante a cultura, um agente antiespumante tal como éster de poliglicol de ácido graxo pode ser usado para suprimir a formação de bolhas. Ademais, a fim de manter o meio de cultura em um estado aeróbico, gás oxigênio ou que contém oxigênio pode ser injetado no meio de cultura. Adicionalmente, a fim de manter o meio de cultura em um estado anaeróbico ou não aeróbico, nenhum gás é injetado, ou gás nitrogênio, hidrogênio ou dióxido de carbono pode ser injetado no meio de cultura. O meio de cultura pode ser tipicamente mantido a uma temperatura na faixa de 27 °C a 37 °C e, especificamente, de 30 °C a 37 °C. A cultura do microrganismo pode ser continuada até o nível desejado da substância útil ser obtido. Especificamente, o período de cultura pode ser 10 a 100 horas.

[0044] O método do presente pedido pode compreender adicionalmente uma etapa de purificar ou recuperar a L-treonina produzida na etapa de cultura. O método de purificação ou recuperação pode ser realizado purificando ou recuperando a L-treonina desejada do meio de cultura com o uso de um método adequado dependendo do método usado para a cultura do microrganismo no presente pedido, por exemplo, um método de cultura em batelada, contínuo ou em batelada alimentada.

[0045] Doravante, o presente pedido será descrito em detalhes adicionais em referência aos exemplos. Deve ser entendido, entretanto, que esses exemplos são para propósitos ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo do presente pedido.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DO VETOR RECOMBINANTE pCC1BAC-rpoH (1) PREPARAÇÃO DO FRAGMENTO DE GENE rpoH

[0046] A fim de obter um fragmento de DNA de cerca de 1,0 kb que compreende o gene rpoH (sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14 e sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16), o DNA genômico (gDNA) da cepa de E. coli do tipo selvagem W3110 foi isolado com um sistema Genomic-tip (Qiagen). Como o uso do gDNA como um modelo, a reação em cadeia de polimerase (doravante abreviada como "PCR") foi realizada com o uso de um kit PCR HL premix (BIONEER, doravante o mesmo).

[0047] A reação PCR para amplificar o gene rpoH foi realizada com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 1 e 2 por 27 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 1 min.

[0048] O produto de PCR foi digerido com EcoRI, e o fragmento de DNA de 1,0 kb (doravante referido como "fragmento de rpoH") foi submetido à eletroforese em gel de agarose 0,8% e, então, coletado por eluição.

(2) CONSTRUÇÃO DO VETOR RECOMBINANTE pCC1BAC-rpoH

[0049] Um vetor pronto para clonagem pCC1BAC EcoRI de controle de cópia (EPICENTRE (USA)) e o rpoH obtido no Exemplo 1-(1) foram tratados, cada um, com a enzima de restrição EcoRI e foram ligados um ao outro, construindo, assim, um plasmídeo de pCC1BAC-rpoH.

EXEMPLO 2: BIBLIOTECA DE CONSTRUÇÃO DO VETOR RECOMBINANTE pCC1BAC-rpoH (3) PREPARAÇÃO DE VARIANTES DE rpoH POR PCR PROPENSA A ERRO

[0050] A fim de se obter um agrupamento de DNA que consiste em fragmentos de variante de rpoH que têm mutações aleatórias introduzidas nos mesmos, PCR foi realizada com o uso do gDNA W3110 (extraído no Exemplo 1-(1)) como um modelo sob as condições de reações de mutagênese 4 mostradas na Tabela III do manual de usuário de um kit diversify PCR random mutagenesis (n° de catálogo K1830-1; Clonetech). A PCR foi realizada com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 1 e 2 por 25 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C por 30 segundos e alongamento a 68 °C por 1 min.

[0051] O produto de PCR foi digerido com EcoRI, e o fragmento de DNA de 1,0 kb (doravante referido como "fragmento de rpoHm") foi submetido à eletroforese em gel de agarose 0,8% e, então, coletado por eluição.

(4) BIBLIOTECA DE CONSTRUÇÃO DO VETOR RECOMBINANTE pCC1BAC-rpoH

[0052] Um vetor pronto para clonagem pCC1BAC EcoRI de controle de cópia foi ligado ao fragmento de rpoHm obtido no Exemplo 2-(1), construindo, assim, um vetor pCC1BAC-rpoHm.

[0053] O vetor construído foi transformado em E.coli TransforMax EPI300 Electrocompetent (EPICENTRE) e, então, a seleção de colônias na placa LB + 15 μg/ml de cloranfenicol + 40 μg/ml de X-Gal + IPTG a 0,4 mM foi realizada. Confirmou-se que nenhuma colônia azul foi detectada. As colônias selecionadas foram coletadas e submetidas à preparação de plasmídeo, construindo, assim, uma biblioteca de variantes de pCC1BAC-rpoH.

(5) INTRODUÇÃO DAS VARIANTES DE pCC1BAC-rpoH NA CEPA QUE PRODUZ TREONINA

[0054] Cada um dentre pCC1BAC-rpoH, obtido no Exemplo 1-(2), e a biblioteca de variante de pCC1BAC-rpoH obtida no Exemplo 2-(2), foi introduzido pela transformação na cepa de E. coli que produz treonina KCCM 10541 preparada de uma maneira competente, e as cepas resultantes foram chamadas de "KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH" e "biblioteca de mutantes de KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH", respectivamente.

[0055] A cepa de E. coli KCCM10541 usada como a cepa progenitora nesse Exemplo é uma cepa que tem produtividade de L- treonina intensificada como resultado da inativação do gene tyrR e do gene galR presentes no cromossomo da cepa progenitora Escherichia coli KCCM 10236 que tem características, incluindo um fenótipo auxotrófico de metionina, um fenótipo auxotrófico de metionina gotejante, resistência a um análogo de L-treonina (por exemplo, ácido α-amino-β-hidr0xi valérico (AHV)), resistência a um análogo de L-lisina (por exemplo, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC)), resistência a um análogo de isoleucina (por exemplo, ácido a-aminobutírico) e resistência a um análogo de metionina (por exemplo, etionina) (Patente coreana registrada n° 10-0576342).

EXEMPLO 3: SELEÇÃO DA VARIANTE DE FATOR SIGMA-32 DE RNA POLIMERASE QUE TEM RESISTÊNCIA À TEMPERATURA

[0056] Nesse Exemplo, um experimento foi realizado para selecionar uma variante de fator sigma-32 de RNA polimerase que tem resistência à temperatura.

[0057] Cada um dentre o KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH de E. coli e a biblioteca de mutante de KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH de E. coli preparados no Exemplo 2-(3) foi cultivado de um dia para o outro no meio sólido LB em um incubador a 37 °C e 33 °C. Um ciclo de platina de cada cepa cultivada foi inoculado em 25 ml do meio de titulação mostrados na Tabela 1 abaixo e, então, cultivado em um incubador de agitação a 37 °C, 33 °C e 200 rpm por 48 horas. TABELA 1

[0058] Cada uma das colônias que têm a biblioteca de variante de rpoH introduzida nas mesmas foi cultivada a 37 °C, e as variantes que mostram um aumento na concentração de treonina em comparação a KCCM10541/pCC1BAC-rpoH foram selecionadas e cultivadas a 33 °C. Desse modo, a avaliação da biblioteca de mutante de rpoH foi realizada repetindo-se o método de cultura e seleção. Através desse método, um clone melhorado tanto na resistência à temperatura quanto no rendimento foi selecionado. Um vetor foi extraído do clone selecionado e chamado de pCC1BAC-rpoH2-G6.

[0059] A fim de detectar uma mutação em pCC1BAC-rpoH2-G6, pCC1BAC-rpoH2-G6 foi amplificado por PCR com o uso de iniciadores de pIB FP (SEQ ID NO: 3) e pIB RP (SEQ ID NO: 4) fornecidos como iniciadores para a detecção no vetor pronto para clonagem pCC1BAC EcoRI de controle de cópia, e o produto de PCR foi sequenciado. Os resultados do sequenciamento indicaram que rpoH2-G6 (SEQ ID NO: 15), uma variante de rpoH, tinha uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

EXEMPLO 4: COMPARAÇÃO DA PRODUTIVIDADE DE L-TREONINA DA CEPA RECOMBINANTE

[0060] O vetor pCC1BAC-rpoH2-G6 obtido no Exemplo 3 foi transformado em E. coli KCCM 10541 para preparar, assim, KCCM 10541/ pCC1BAC-rpoH2-G6 de E. coli.

[0061] Cada uma dentre a cepa progenitora KCCM 10541 de E. coli, a cepa KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH de E. coli e a cepa KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH2-G6 de E. coli foi cultivada em um frasco de Erlenmeyer com o uso do meio de titulação de treonina mostrado na Tabela 1 acima, e as produtividades de L-treonina das mesmas foram analisadas. Os resultados da análise são mostrados na Tabela 2 abaixo. TABELA 2

[0062] Conforme mostrado na Tabela 2 acima, a cepa progenitora KCCM10541 de E. coli e a cepa de controle KCCM10541/pCC1BAC- rpoH produziram 30,6 g/l e 30,5 g/l de L-treonina, respectivamente, quando as mesmas foram cultivadas por 48 horas, mas a cepa KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH2-G6 de E. coli produziu 31,1 g/l de L-treonina e mostrou, assim, um aumento na produtividade de L-treonina de cerca de 1%P em comparação à cepa progenitora.

[0063] A 37 °C, a cepa progenitora (KCCM 10541) e a cepa de controle (KCCM10541/pCC1BAC-rpoH) mostraram uma diminuição no rendimento, enquanto a cepa KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH2-G6 não mostrou nenhuma diminuição dependente de temperatura na concentração da produtividade de L-treonina e produziu 31,8 g/l de L- treonina, sugerindo que a mesma mostra um aumento na produtividade de treonina de cerca de 8%P em comparação ao grupo de controle quando a mesma é cultivada a altas temperaturas.

EXEMPLO 5: COMPARAÇÃO DE EFEITOS DA VARIANTE DE rpoH SELECIONADA (rpoH2-G6) COM O USO DE OUTRAS CEPAS QUE PRODUZEM TREONINA (6) ANÁLISE DE EFEITOS DA VARIANTE DE rpoH (rpoH2-G6) NA CEPA ABA5G/ pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB

[0064] Os efeitos do vetor pCC1BAC-rpoH2-G6 confirmados no Exemplo 4, o vetor foi introduzido na cepa que produz treonina ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB (Patente coreana n° 10-1145943) para construir, assim, ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pCC1BAC- rpoH2-G6. Então, a avaliação de titulação foi realizada com o uso do meio de titulação preparado conforme mostrado na Tabela 3 abaixo. Os resultados da avaliação são mostrados na Tabela abaixo.

[0065] A cepa progenitora ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB usada nesse Exemplo é uma cepa de E. coli que tem produtividade de L-treonina, obtida transformando-se a cepa que produz treonina ABA5G (que é uma cepa construída induzindo-se uma mutação de NTG na cepa progenitora W3110 de E. coli e que tem um fenótipo auxotrófico de metionina, um fenótipo auxotrófico de isoleucina gotejante, resistência a ácido α-amino-β-hidr0xi valérico, resistência à 2-aminoetil)-L-cisteína e resistência a ácido 1-azetidina-2-carboxílico) com um vetor que compreende um grupo de gene pAcscBAR'-M e um grupo de gene pC- Ptrc-scrAB. TABELA 3

TABELA 4

[0066] Conforme pode ser visto na Tabela 4 acima, quando o vetor pCC1BAC-rpoH2-G6 foi introduzido em cepas que produz treonina diferentes da KCCM10541 de E. coli, o rendimento de treonina a 33 °C foi mantido a um nível similar a este mostrado na Tabela 2 acima, e o rendimento de treonina a 37 °C foi mantido a um nível similar ao rendimento de treonina observado a 33 °C.

(7) ANÁLISE DE EFEITOS DA VARIANTE DE rpoH (rpoH2-G6) NA CEPA KCCM11167P DE E. COLI

[0067] O vetor pCC1BAC-rpoH2-G6 foi introduzido em outra cepa que produz treonina E. coli KCCM11167P (Pedido de Patente coreano n° 2011-0005136) para construir, assim, KCCM11167P/pCC1BAC-rpoH2- G6 de E. coli, e a produtividade de treonina da cepa construída foi avaliada com o uso do meio de titulação preparado conforme mostrado na Tabela 1 acima. Os resultados da avaliação são mostrados na Tabela 5 abaixo.

[0068] A cepa progenitora KCCM11167P de E. coli usada nesse Exemplo é uma cepa obtida inativando-se tdcB em uma cepa KCCM10541 (Patente coreana n° 10-0576342) e intensificando nadK a duas cópias para intensificar a atividade de NAD quinase. TABELA 5

[0069] Conforme pode ser visto nos resultados de avaliação de titulação na Tabela 5 acima, quando pCC1BAC-rpoH2-G6 foi introduzido na cepa que tem produtividade de treonina, o rendimento de treonina a 33 °C foi mantido, e o rendimento de treonina a 37 °C foi mantido a um nível similar ao rendimento de treonina a 33 °C, como quando pCC1BAC-rpoH2-G6 foi introduzido na cepa que produz treonina diferente conforme descrito no Exemplo 5-(1).

EXEMPLO 6: INSERÇÃO ADICIONAL DA VARIANTE DE rpoH SELECIONADA (rpoH2-G6) EM CROMOSSOMOS (8) PREPARAÇÃO DO FRAGMENTO DE CASSETE DE INTEGRAÇÃO DE rpoH2-G6

[0070] A fim de inserir adicionalmente a variante rpoH2-G6, selecionada no Exemplo 3, em um cromossomo, um cassete de integração linear foi construído. O assete de integração linear foi construído das maneiras a seguir.

[0071] PCR foi realizada com o uso do gDNA W3110 de E. coli como um modelo e dos iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 6. A PCR foi realizada por 27 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 30 segundos. O fragmento de DNA resultante foi chamado de "região homóloga 1".

[0072] Com o uso de pMloxCmt como um modelo e dos iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8, a PCR para amplificar um cassete loxP-Cmr- loxP mutante foi realizada por 27 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 1 min. No presente documento, o pMloxCmt usado como o modelo é um vetor construído por um versado na técnica com base em um relatório de um método de deleção de gene melhorado que usa loxP mutante, chamado de lox71 e lox66 por Suzuki et al. (Suzuki N. et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:8472, 2005).

[0073] A região homóloga obtida 1 e o fragmento de cassete loxP- Cmr-loxP mutante foram submetidos à PCR de extensão de sobreposição com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 8, obtendo, assim, a "região homóloga 1-loxP-Cmr-loxP mutante". No presente documento, a PCR foi realizada na ausência de iniciadores por 5 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 90 segundos e, então, realizada na presença de iniciadores por 23 ciclos.

[0074] Com o uso de pCC1BAC-rpoH2-G6 como um modelo e dos iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10, PCR foi realizada por 27 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 1 min.

[0075] Com o uso do gDNA W3110 de E. coli como um modelo e dos iniciadores de SEQ ID NOS: 11 e 12, PCR foi realizada por 27 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 30 segundos. O fragmento de DNA resultante foi chamado de "região homóloga 2".

[0076] rpoH2-G6 e a região homóloga 2 foram submetidos à PCR de extensão de sobreposição com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 12, obtendo, assim, "rpoH2-G6-região homóloga 2". No presente documento, a PCR foi realizada na ausência de iniciadores por 5 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 90 segundos e, então, realizada na presença de iniciadores por 23 ciclos.

[0077] Com o uso da "região homóloga 1-loxP-Cmr-loxP mutante", "rpoH2-G6-região homóloga 2" como um modelo e os iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 12, a PCR de extensão de sobreposição foi realizada, construindo, assim, um cassete de integração rpoH2-G6. No presente documento, a PCR foi realizada na ausência de iniciadores por 5 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 3 min e, então, realizada na presença de iniciadores por 23 ciclos. Como resultado, um cassete de integração rpoH2-G6 representado pela SEQ ID NO: 13 foi construído.

(9) INSERÇÃO ADICIONAL DA VARIANTE rpoH2-G6 EM CROMOSSOMOS DA CEPA RECOMBINANTE

[0078] A fim de inserir a variante de rpoH2-G6 selecionada em um cromossomo, o cassete de integração rpoH2-G6 construído no Exemplo 6-(1) foi purificado, e a variante de rpoH2-G6 foi adicionalmente inserida em uma região cromossômica seguindo o rpoH já existente da KCCM10541 de E. coli da mesma maneira que um método de inativação de uma etapa conhecido (Warner et al., PNAS, 6; 97(12):6640, 2000). A seguir, o gene marcador de resistência a antibióticos foi removido, construindo, assim, uma cepa que tem a variante de rpoH2-G6 adicionalmente inserida na mesma, e o construído foi sequenciado para garantir que nenhum erro de PCR tenha sido introduzido. A cepa construída que tem rpoH2-G6 adicionalmente inserido na mesma foi chamada de "FTR2700", e a FTR2700 de E. coli transformada foi depositada com o Korean Culture Center of Microorganisms (doravante abreviado como KCCM) em 5 de fevereiro de 2013 sob o número de acesso KCCM11368P.

(10) PRODUTIVIDADE DA ANÁLISE DE L-TREONINA

[0079] O microrganismo recombinante construído no Exemplo 6-(2) foi cultivado em um frasco de Erlenmeyer com o uso do meio de titulação de treonina mostrado na Tabela 1 acima, e a produtividade de L-treonina do microrganismo foi analisada.

[0080] Um ciclo de platina de cada uma dentre KCCM 10541 de E. coli e KCCM11368P de E. coli , cultivadas de um dia para o outro em meio sólido LB em um incubador a 33 °C e 37 °C, foi inoculado em 25 ml do meio de titulação mostrado na Tabela 1 acima e, então, cada uma dentre as cepas de E. coli foi cultivada em um incubador com agitação a 33 °C, 37 °C e 200 rpm por 48 horas.

[0081] Conforme pode ser visto na Tabela 6 abaixo, quando a cepa progenitora KCCM10541 de E. coli foi cultivada por 48 horas, a mesma produziu 30,3 g/l de L-treonina, e a cepa de KCCM 11368P de E. coli construída no Exemplo 6-(2) do presente pedido produziu 30,0 g/l de L- treonina e mostrou, assim, uma produtividade de L-treonina similar a esta da cepa progenitora. A cepa progenitora (KCCM 10541) mostrou uma diminuição no rendimento de L-treonina a 37 °C, enquanto a cepa KCCM 11368P não mostrou nenhuma diminuição dependente de temperatura na concentração de L-treonina e mostrou um aumento na concentração de L-treonina.

[0082] Assim, pode ser visto que, como a cepa transformada com o vetor, a cepa construída no Exemplo 6-(2), quando cultivada a 37 °C, mostra produtividade de treonina similar ou maior do que está obtida quando a mesma é cultivada a 33 °C. TABELA 6

[0083] Embora o presente pedido tenha sido descrito em referência às modalidades ilustrativas particulares, será entendido por aqueles versados na técnica aos quais o presente pedido pertence que o presente pedido pode ser incorporado em outras formas específicas sem se afastar do espírito técnico ou características essenciais do presente pedido. Portanto, as modalidades e os exemplos experimentais no presente documento são considerados ilustrativos em todos os aspectos e não restritivos. Ademais, o escopo do presente pedido é definido pelas reivindicações anexas em vez da descrição detalhada, e deve ser entendido que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo do presente pedido e equivalentes dos mesmos são incluídas no escopo das reivindicações anexas.

NÚMERO DE ACESSO

[0084] Autoridade depositária: Korean Culture Center of Microorganisms;

[0085] Número de acesso: KCCM11368P;

[0086] Data de depósito: 5 de fevereiro de 2013.

Claims

1. Variante de fator sigma-32 de RNA polimerase, caracterizada pelo fato de que tem uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17.

2. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que codifica a variante do fator sigma-32 de RNA polimerase como definida na reivindicação 1, em que a sequência de nucleotídeos é representada pela SEQ ID NO: 15 ou sequências degeneradas da mesma.

3. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos, como definida na reivindicação 2.

4. Microrganismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L-treonina, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos, como definida na reivindicação 2.

5. Microrganismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L-treonina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é transformado ou pelo vetor recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma variante de fator sigma-32 de RNA polimerase que tem uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 17 ou pela inserção adicional da sequência de nucleotídeos em um cromossomo.

6. Microrganismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L-treonina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos é representada pela SEQ ID NO: 15.

7. Microrganismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L-treonina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o microrganismo do gênero Escherichia é Escherichia coli.

8. Método para produzir L-treonina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar um microrganismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L-treonina, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 7; e recuperar a L-treonina do microrganismo ou da cultura.