BR112016023337B1

BR112016023337B1 - Microrganismo tendo capacidade de produção de l-lisina e método de produção de l-lisina utilizando o mesmo

Info

Publication number: BR112016023337B1
Application number: BR112016023337-9A
Authority: BR
Inventors: Hyun Won Bae; Jun Ok Moon; Sung Ki Song; Hyung Joon Kim; Hyo Jin Kim; Sang Jo Lim
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2014-04-09
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2023-10-17
Also published as: CN106574232A; MY195658A; ES2855048T3; CN106574232B; BR112016023337A2; JP6495940B2; JP2017510280A; US20180135031A1; JP2019030316A; PL3130663T3; RU2016141594A3; KR20150117337A; EP3130663A4; RU2694729C2; EP3130663B1; WO2015156583A1; US10179903B2; RU2016141594A; EP3130663A1; HUE053437T2

Abstract

microrganismo tendo capacidade de produção de l-lisina e método de produção de l-lisina utilizando o mesmo. a presente invenção se refere a um microrganismo com capacidade melhorada de produção de l-lisina e a um método de produção de l-lisina utilizando o mesmo. mais especificamente, a presente invenção se refere a um microrganismo do gênero corynebacterium, no qual a atividade do acetato quinase é adicionalmente amplificada em relação à atividade inerente e a um método de produção de l-lisina produtoras utilizando o mesmo.

Description

[001] Campo Técnico

[002] A presente divulgação se refere a um microrganismo que produz L- lisina e a um método para a produção de L-lisina utilizando o microrganismo.

[003] Estado da Técnica

[004] Um microrganismo do gênero Corynebacterium pode utilizar ácidos orgânicos tais como o gluconato, acetato e piruvato, bem como glicose, sacarose e frutose, como fonte de carbono. Entre estes, o acetato, que é um ácido orgânico pertencente aos ácidos monocarboxílicos, é introduzido nas células por difusão passiva ou pelo transportador de ácido monocarboxílico (MctC), quando utilizado por um microrganismo do gênero Corynebacterium, fosforilado pelo acetato quinase (ackA) para ser convertido em fosfato de acetila e, em seguida, convertido em acetil-CoA pela fosfotransacetilase (pta). O acetil-CoA formado desta maneira é imediatamente introduzido no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e no ciclo do glioxilato (J. Bacteriol. 2009. 191: 940 - 948) sendo produzido, assim, o oxaloacetato, que é um precursor da lisina.

[005] No entanto, quando uma cepa do gênero Corynebacteriumé cultivada usando acetato como uma fonte de carbono única ou mista, existe um problema, visto que pode ocorrer um fenômeno de inibição do crescimento de acordo com a sua concentração. O acetato é conhecido por ter limitações, já que a sua taxa metabólica é baixa em comparação com a de sacarídeos tais como a glicose e também, uma vez que o acetato pode inibir o crescimento celular quando presente em uma determinada concentração em uma célula, o aumento da concentração de acetato no meio de cultura pode aumentar a fase lag, atrasando assim todo o tempo de cultura (Arch. Microbiol. 1991. 155: 505 - 510). Por conseguinte, há a necessidade do desenvolvimento de um método para converter rapidamente o acetato presente em um meio de cultura em acetil-CoA em uma célula.

[006] No entanto, a acetato quinase e a fosfotransacetilase, que são usadas na via de ativação do acetato, possuem uma bidirecionalidade (uma reação reversível) e, portanto, existe um problema de o acetil-CoA poder ser convertido novamente em acetato, e também foi reportado que estes podem ter um efeito negativo sobre a produção de L-lisina. Portanto, o desenvolvimento de um método para o uso eficaz de acetato ainda permanece inativo.

[007] Divulgação

[008] Problema Técnico

[009] Os presentes inventores realizaram muitos esforços para desenvolver um microrganismo para o uso eficiente do acetato, que é produzido durante o processo de fermentação ou fornecido como uma nova fonte de carbono e, como resultado, confirmaram que um microrganismo com a atividade do acetato quinase amplificada na via de ativação do acetato pode aumentar a capacidade de uso do acetato para a produção de L-lisina, completando assim a presente invenção.

[010] Solução Técnica

[011] Um objeto da presente divulgação consiste em proporcionar um microrganismo do gênero Corynebacterium produtor de L-lisina, no qual a atividade do acetato quinase é amplificada em comparação com a sua atividade endógena.

[012] Outro objeto da presente divulgação consiste em proporcionar um método para a produção de L-lisina usando o microrganismo acima.

[013] Efeitos Vantajosos da Invenção

[014] O microrganismo de acordo com a presente divulgação, sendo uma cepa que tem uma capacidade de uso de acetato aumentada devido a uma via de ativação do acetato amplificada, é um microrganismo que pode produzir L- lisina com um rendimento elevado. A L-lisina assim preparada pode ser utilizada em vários produtos incluindo, entre outros, alimentos para animais ou aditivos de alimentos para animais, mas também em alimentos humanos ou aditivos alimentares, medicamentos, etc.

[015] Breve Descrição dos Desenhos

[016] As Figuras 1a e 1a mostram gráficos que ilustram a análise da capacidade de uso do acetato da cepa KCCM11016P (uma cepa de controle) e uma KCCM11016P modificada (uma cepa modificada com a introdução de pta e pta-ackA), em um meio com acetato (Fig. 1a) e em um meio sem acetato (Fig. 1b).

[017] A Figura 2 mostra um diagrama esquemático de pDZTn-lysCP1-ackA, um vetor para a superexpressão de ackA pelo promotor LysCP1, que é um promotor forte.

[018] A Figura 3 mostra um gráfico que ilustra a análise da capacidade de uso do acetato pela cepa KCCM11016P (uma cepa de controle) e pela KCCM11016P modificada (uma cepa modificada com a introdução de pta, pta- ackA e acs).

[019] Melhor modo

[020] Um aspecto da presente divulgação proporciona um microrganismo do gênero Corynebacterium produtor de L-lisina, no qual a atividade do acetato quinase é amplificada. Especificamente, o microrganismo é um microrganismo do gênero Corynebacterium produtor de L-lisina, no qual a atividade do acetato quinase é amplificada em comparação com a sua atividade endógena.

[021] Conforme utilizado aqui, o termo “L-lisina” se refere a um tipo de L- aminoácido que é um a-aminoácido básico e um aminoácido essencial não sintetizado in vivo, tendo a fórmula química NH2(CH2)4CH(NH2)COOH.

[022] O acetato é um ácido orgânico pertencente aos ácidos monocarboxílicos, que é introduzido nas células por difusão passiva ou pelo transportador de ácido monocarboxílico, quando utilizado por um microrganismo do gênero Corynebacterium, fosforilado pelo acetato quinase para ser convertido em acetil-fosfato e convertido em acetil-CoA pela fosfotransacetilase. O acetil- CoA formado desta maneira é imediatamente introduzido no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e no ciclo do glioxilato sendo produzido, assim, o oxaloacetato, que é um precursor da lisina. O acetato pode ser utilizado como uma fonte de carbono em um microrganismo do gênero Corynebacterium. No entanto, quando o microrganismo é cultivado usando acetato como uma fonte de carbono única ou mista, existe o problema de ocorrência do fenômeno de inibição do crescimento de acordo com a concentração (Arch. Microbiol. 1991, 155:505-510).

[023] Em termos gerais, há duas vias para a ativação do acetato para convertê-lo em acetil-CoA em uma célula. Conforme descrito acima, duas enzimas (isto é, a acetato quinase e a fosfotransacetilase) agem sequencialmente em uma cepa do gênero Corynebacterium. Um gene, ackA, é conhecido por codificar a acetato quinase e um gene, pta, é conhecido por codificar a fosfotransacetilase (Microbiol. 1999 145: 503 - 513). Em outra via, a acetil-CoA-sintetase está envolvida em uma cepa do gênero Escherichia e um gene, acs, é conhecido por codificar a acetil-CoA-sintetase (Appl Microbiol Biotechnol. 2006. 71: 870 - 874). No entanto, uma vez que a via de ativação na cepa do gênero Escherichiaé devida a uma reação reversível, não houve qualquer tentativa para simplesmente aprimorar a via.

[024] Surpreendentemente, no entanto, os presentes inventores confirmaram que não só a amplificação do acetato quinase pode converter acetato em acetil-CoA rapidamente em uma célula, mas também que a desvantagem da inibição do crescimento descrita acima pode ser superada, para aumentar a capacidade de produção do L-aminoácido. Portanto, os presentes inventores foram capazes de proporcionar um novo microrganismo do gênero Corynebacterium produtor de L-lisina, no qual a atividade do acetato quinase é amplificada em comparação com a sua atividade endógena.

[025] Em uma forma de realização exemplar da presente divulgação, foi confirmado que um microrganismo, no qual a atividade do gene ackA foi amplificada, apresentou uma taxa de consumo de acetato rápida e também uma redução significativa da fase lag no crescimento do microrganismo. Em contraste, foi confirmado que quando a atividade do gene pta foi amplificada, o microrganismo não apresentou qualquer diferença significativa na taxa de consumo de acetato em comparação com o grupo de controle (Figs. 1a e 1b) confirmando, assim, que a proteína importante para aumentar a capacidade de uso de acetato pela ativação do acetato e aumentar a capacidade de produção de L-lisina, sem inibição de crescimento, é a acetato quinase. Ou seja, foi confirmado que um microrganismo que pode produzir L-lisina com rendimento elevado e que tem uma capacidade de uso de acetato aumentada, sem a inibição do crescimento, pode ser preparado pela amplificação da atividade do acetato quinase utilizando vários métodos conhecidos, com base nos resultados acima.

[026] O microrganismo do gênero Corynebacterium da presente divulgação, que tem capacidade de uso de acetato aumentada e capacidade de produção de L-lisina aumentada, pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium que pode produzir L-lisina e possui uma atividade do acetato quinase amplificada em comparação com a sua atividade endógena.

[027] Adicionalmente, o microrganismo do gênero Corynebacterium que tem capacidade de uso de acetato aumentada e capacidade de produção de L- lisina aumentada pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium possuindo uma atividade da acetato quinase amplificada em comparação com a sua atividade endógena, em que, adicionalmente (i) uma atividade da fosfotransacetilase é amplificada em comparação com a sua atividade endógena; (ii) uma atividade da acetil-CoA-sintetase é introduzida ou amplificada; ou (iii) uma atividade da fosfotransacetilase é amplificada em comparação com a sua atividade endógena e uma atividade da acetil-CoA- sintetase é introduzida ou amplificada.

[028] Os presentes inventores confirmaram que, em um microrganismo possuindo uma atividade de acetato quinase amplificada em relação à sua atividade endógena, que é o mais importante para aumentar a capacidade de uso de acetato e a capacidade de produção de L-lisina, quando uma atividade da fosfotransacetilase é adicionalmente amplificada em comparação com a sua atividade endógena e/ou uma atividade da acetil-CoA-sintetase é adicionalmente introduzida ou amplificada, a capacidade de uso de acetato é ainda mais aumentada, e os presentes inventores proporcionam o novo microrganismo na presente divulgação. Em uma forma de realização exemplar da presente divulgação, foi confirmado que a introdução adicional do gene acs, que é derivado de um microrganismo do gênero Escherichia e codifica a acetil-CoA, pode aumentar a taxa de consumo de acetato (Fig. 3) e o resultado sugere que a introdução ou a amplificação da atividade da acetil-CoA sintetase também pode aumentar a taxa de consumo de acetato, aumentando assim a capacidade de produção de L-lisina.

[029] Conforme utilizado aqui, o termo "acetato quinase"(EC 2.7.2.1) se refere uma enzima que tem a função de produção de acetil-fosfato pela fosforilação do acetato. Os genes que codificam a acetato quinase podem ser referidos coletivamente como ackA e as sequências proteicas e genéticas do gene do acetato quinase podem ser obtidas, sem limitação, de um banco de dados conhecido (por exemplo, GenBank de NCBI). A acetato quinase pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, mas qualquer sequência de proteína tendo a atividade do acetato quinase pode ser incluída, sem limitações.

[030] Conforme utilizado aqui, o termo "fosfotransacetilase (EC 2.3.1.8)" se refere uma enzima que tem a função de converter acetil-fosfato em acetil-CoA pela reação apresentada abaixo:

[031] Conforme utilizado aqui, o termo "fosfotransacetilase" pode ser utilizado alternadamente com enzimas tais como fosfato acetiltransferase e fosfoacilase. Os genes que codificam a fosfotransacetilase podem ser referidos coletivamente como pta e as sequências proteicas e genéticas do gene da fosfotransacetilase podem ser obtidas, sem limitação, de um banco de dados conhecido (por exemplo, GenBank de NCBI). A fosfotransacetilase pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, mas qualquer sequência de proteína tendo a atividade da fosfotransacetilase pode ser incluída, sem limitações.

[032] Conforme utilizado aqui, o termo "acetil-CoA sintetase (EC 6.2.1.1)" se refere uma enzima que tem a função de converter o acetato em acetil-CoA pela reação apresentada abaixo:

[033] Os genes que codificam a acetil-Coa sintetase podem ser referidos coletivamente como acs e as sequências proteicas e genéticas do gene da acetil- Coa sintetase podem ser obtidas, sem limitação, de um banco de dados conhecido (por exemplo, GenBank de NCBI). A acetil-CoA sintetase pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, mas qualquer sequência de proteína tendo a atividade da acetil-CoA sintetase pode ser incluída sem limitações.

[034] Cada uma das proteínas descritas acima pode incluir, sem limitação, além das sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NO, qualquer sequência de aminoácidos que tem uma homologia de 80 % ou mais, especificamente de 90 % ou mais, mais especificamente de 95 % ou mais, e ainda mais especificamente de 97 % ou mais, com as sequências de aminoácidos listadas acima, desde que as sequências de aminoácidos codifiquem proteínas que têm um efeito substancialmente igual ou correspondente a cada uma das proteínas. Adicionalmente, é óbvio que qualquer proteína modificada, tendo a homologia descrita acima, pode pertencer ao escopo da presente divulgação, embora a proteína possa ter uma sequência de aminoácido com uma supressão (deleção) parcial, modificação, substituição ou adição à mesma.

[035] Além disso, os genes que codificam cada uma das proteínas da presente divulgação também podem incluir, sem limitação, além das sequências de polinucleotídeos descritas pelas SEQ ID NO, qualquer sequência genética que codifica as proteínas, que tem uma homologia de 80 % ou mais, especificamente de 90 % ou mais, mais especificamente de 95 % ou mais, ainda mais especificamente de 98 % ou mais, e mais especificamente de 99 % ou mais, com cada uma das sequências de polinucleotídeos listadas acima, desde que a sequência genética codifique uma proteína que tem um efeito substancialmente igual ou correspondente a cada uma das proteínas. Além disso, é óbvio que qualquer sequência de polinucleotídeo tendo as homologias descritas acima, pode pertencer ao escopo da presente divulgação, embora a sequência possa ter uma supressão parcial, modificação, substituição ou adição à mesma.

[036] Conforme utilizado aqui, o termo "homologia" se refere ao grau de identidade entre as sequências polipeptídicas ou sequências de aminoácidos que codificam as proteínas e, quando existe uma percentagem de homologia suficientemente elevada, os produtos de expressão dos genes correspondentes podem ter atividades iguais ou semelhantes.

[037] Conforme utilizado aqui, o termo "atividade endógena" se refere a um estado ativo de um polipeptídeo em um microrganismo em um estado não modificado, isto é, em um estado natural.

[038] Conforme utilizado aqui, o termo "amplificação da atividade de uma proteína em comparação com a sua atividade endógena" se refere ao aumento da atividade intracelular de uma proteína em um microrganismo pela modificação da proteína, para melhorar a atividade intracelular em comparação com a atividade que a proteína possuía em seu estado natural. Adicionalmente, conforme utilizado aqui, o termo "amplificação de uma atividade de uma proteína" se refere não só à amplificação da atividade de uma proteína em comparação com a sua atividade endógena, mas também ao aumento da atividade intracelular de uma proteína particular, pela modificação de um microrganismo que, originalmente, não possuía a atividade da proteína particular, para que o mesmo tenha a atividade da proteína particular e modificação para melhorar a sua atividade intracelular.

[039] A "amplificação" não só inclui a concepção de um efeito maior do que a função original, devido ao aumento da atividade da própria proteína, mas pode ser alcançada por, pelo menos, um método selecionado do grupo que consiste em um método para aumentar o número de cópias de um polinucleotídeo que codifica a proteína, um método para a introdução de uma modificação na sequência reguladora de um gene que codifica a proteína, um método para a substituição da sequência reguladora de um gene que codifica para a proteína no cromossomo com uma sequência tendo atividade forte, um método para a substituição do gene que codifica a proteína por um gene mutante para aumentar a atividade da proteína e um método para a introdução de uma modificação no gene que codifica para a proteína no cromossomo, para amplificar a atividade da proteína, mas pode ser incluído qualquer método conhecido que pode amplificar a atividade da proteína em comparação com a sua atividade endógena ou amplificar a atividade introduzida, sem limitações.

[040] Conforme utilizado aqui, o termo "introdução de uma atividade de uma proteína"se refere a proporcionar uma atividade de uma proteína particular a um microrganismo que não tenha tal atividade da proteína particular.

[041] A "introdução de uma atividade de uma proteína"pode ser realizada por vários métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo: um método para a inserção de um polinucleotídeo, incluindo uma sequência polinucleotídica que codifica a proteína, no cromossomo; um método para aumentar o número de cópias de um polinucleotídeo, por um método tal como a introdução do polinucleotídeo em um microrganismo via a introdução em um sistema vetor; um método para a introdução de um promotor capaz de exibir uma atividade melhorada ou introduzir a proteína com uma modificação no promotor em uma região a montante da sequência polinucleotídica que codifica a proteína; um método para a introdução de uma modificação na sequência polinucleotídica que codifica a proteína, etc., mas qualquer método conhecido que pode introduzir uma atividade de uma proteína pode ser incluído, sem limitações.

[042] No exemplo acima, o aumento do número de cópias de um polinucleotídeo pode ser realizado de maneira que o polinucleotídeo seja operativamente ligado a um vetor, ou por inserção do polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira, embora o método não seja particularmente limitado a esses. Especificamente, o aumento do número de cópias de um polinucleotídeo pode ser realizado pela introdução de um vetor que pode se replicar e que funciona independentemente de uma célula hospedeira, e ao qual o polinucleotídeo que codifica a proteína da presente divulgação está operativamente ligado; ou pode ser realizado pela introdução de um vetor em uma célula hospedeira, que pode inserir o polinucleotídeo no cromossomo da célula hospedeira e ao qual o polinucleotídeo está operativamente ligado.

[043] O vetor é um construto de ADN incluindo a sequência polinucleotídica de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo, que está operativamente ligado a uma sequência reguladora apropriada, para permitir a expressão da proteína alvo em uma célula hospedeira. A sequência reguladora inclui um promotor capaz de iniciar a transcrição, qualquer sequência operadora para a regulação da transcrição, uma sequência que codifica um domínio mARN de ligação ao ribossoma apropriado e uma sequência de regulação da terminação da transcrição e tradução. O vetor, depois de ser transformado em uma célula hospedeira apropriada, pode ser replicado ou pode funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode ser integrado no próprio genoma do hospedeiro.

[044] O vetor utilizado na presente divulgação pode não ser particularmente limitado, desde que o vetor seja replicável na célula hospedeira e possa ser construído utilizando qualquer vetor conhecido no estado da técnica. Exemplos do vetor podem incluir plasmídeos, cosmídeos, vírus e bacteriófagos naturais ou recombinantes. Por exemplo, como um vetor fago ou um vetor cosmídeo, podem ser utilizados pWE15, M13, ÁMBL3, ÁMBL4, ÁKII, ÁASHII, ÁAPII, Át10, Át11, Charon4A, Charon21A, etc.; e como um vetor plasmídeo, podem ser utilizados aqueles à base de pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. Os vetores que podem ser utilizados na presente divulgação não são particularmente limitados, mas pode ser utilizado qualquer vetor de expressão conhecido, por exemplo, vetores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, etc.

[045] Além disso, o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo endógena pode ser substituído com um polinucleotídeo modificado dentro do cromossomo por um vetor, para a inserção de um cromossomo dentro da célula hospedeira. Alternativamente, o polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo estranha a ser introduzido no cromossomo pode ser substituído com um polinucleotídeo modificado. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada utilizando qualquer método conhecido no estado da técnica, por exemplo, por recombinação homóloga. Uma vez que o vetor da presente divulgação pode ser inserido no cromossomo por recombinação homóloga, pode ser incluído adicionalmente um marcador de seleção para a confirmação da inserção no cromossomo. O marcador de seleção é utilizado para a seleção de uma célula transformada, ou seja, para confirmar se o polinucleotídeo alvo foi inserido, e podem ser utilizados marcadores capazes de proporcionar fenótipos selecionáveis, tais como resistência a fármacos, necessidades de nutrientes, resistência a agentes citotóxicos e expressão de proteínas de superfície. Nas circunstâncias em que os agentes seletivos são tratados, apenas as células capazes de expressar os marcadores de seleção podem sobreviver ou expressar outras características fenotípicas e, assim, as células transformadas podem ser selecionadas.

[046] Conforme utilizado aqui, o termo "transformação"se refere a um processo de introdução de um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira, permitindo assim a expressão do polinucleotídeo codificado pela proteína na célula hospedeira. Para o polinucleotídeo transformado, não importa se este é inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e localizado neste ou localizado fora do cromossomo, desde que possa ser expresso na célula hospedeira. Além disso, o polinucleotídeo inclui ADN e ARN que codificam a proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser inserido de qualquer forma, desde que possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso nesta. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é um construto genético incluindo todos os elementos essenciais necessários para a autoexpressão. O cassete de expressão pode, convencionalmente, incluir um promotor operativamente ligado ao polinucleotídeo, um sinal de terminação da transcrição, um domínio de ligação ao ribossoma e um sinal de terminação da tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão capaz de autorreplicação. Além disso, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira, já que este é operativamente ligado a uma sequência essencial para a sua expressão na célula hospedeira.

[047] Adicionalmente, conforme utilizado aqui, o termo "operativamente ligado" se refere a uma ligação funcional entre uma sequência promotora, que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína alvo da presente divulgação e a sequência genética acima.

[048] O método para a transformação de um vetor da presente divulgação pode incluir qualquer método que pode introduzir um polinucleotídeo em uma célula, e a transformação pode ser realizada por seleção de uma técnica apropriada conhecida no estado da técnica, de acordo com a célula hospedeira. Por exemplo, o método pode incluir, sem limitação, a eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, o método de polietileno glicol (PEG), o método de DEAE-dextrano, o método do lipossoma catiônico e o método do acetato de lítio/DMSO, etc.

[049] Seria melhor se a célula hospedeira a ser utilizada tivesse alta eficiência de introdução de ADN e alta eficiência de expressão do ADN introduzido e, para os fins da presente divulgação, a célula hospedeira pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium.

[050] Em seguida, embora não seja particularmente limitado a isso, pode ser realizada a introdução de uma modificação na sequência de controle de expressão para aumentar a expressão de um polinucleotídeo, pela indução de uma modificação na sequência polinucleotídica por supressão, inserção, substituição conservativa ou substituição não conservativa, ou uma combinação destes, de modo a amplificar ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão; ou pela substituição da sequência polinucleotídica por uma sequência polinucleotídica com atividade amplificada. Embora não seja particularmente limitado a isso, a sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência operadora, uma sequência que codifica um domínio de ligação ao ribossoma, uma sequência de regulação da terminação da transcrição e tradução, etc.

[051] Um promotor exógeno forte, em vez do promotor original, pode ser ligado à região a montante da unidade de expressão do polinucleotídeo. Exemplos de promotores exógenos fortes podem incluir o promotor pcj7, promotor lysCP1, promotor EF-Tu, promotor groEL, promotor aceA, promotor aceB, etc. e, de preferência, um promotor derivado de Corynebacterium, tal como um promotor pcj7 ou promotor lysCP1. A sequência do promotor lysCP1 e um método para a sua preparação são descritos na Patente Coreana N° 10-0930203 e a totalidade da dita patente coreana é incluída aqui como um exemplo de referência. Em uma forma de realização exemplar da presente divulgação, foi confirmado que a ligação do gene ackA ao promotor lysCP1, que é um promotor forte, resultou em melhor capacidade de uso de acetato em comparação com o grupo de controle (Fig. 3) e o resultado sugere que, à medida que a quantidade da expressão do gene ackA aumenta, a taxa de uso de acetato aumenta.

[052] Além disso, a modificação de uma sequência polinucleotídica no cromossomo pode ser realizada pela indução de uma modificação na sequência de controle de expressão através de supressão, inserção, substituição conservadora ou não conservadora, ou uma combinação destes, para amplificar ainda mais a atividade da sequência polinucleotídica; ou pela substituição com uma sequência polinucleotídica melhorada para proporcionar uma atividade mais forte.

[053] Geralmente, a introdução ou a amplificação da atividade de uma proteína pode aumentar a atividade ou concentração da proteína correspondente em relação à atividade ou concentração de uma proteína de tipo selvagem em uma cepa de microrganismo na fase inicial em, pelo menos, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, ou 500 %, até um máximo de 1000 % ou 2000 %, sem limitação.

[054] Conforme utilizado aqui, o termo "um microrganismo produtor de L- lisina" se refere a uma cepa de microrganismo que pode produzir L-lisina para fins da presente divulgação e que é uma cepa que pode eficientemente utilizar acetato no meio de cultura e acumular L-acetato sem inibição do crescimento. O microrganismo pode incluir todos os microrganismos do gênero Corynebacterium que têm uma atividade amplificada do acetato quinase em comparação com a sua atividade endógena, por exemplo, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium fermentum, etc., sem limitação. Em uma forma de realização exemplar, o microrganismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum e exemplos de Corynebacterium glutamicum podem incluir, sem limitação, KCCM11016P (Patente Coreana N° 10-0397322), KCCM10770P (Patente Coreana N° 10-0924065),KCCM11347P (Patente Coreana N° 10-0073610) e CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40).

[055] Em uma forma de realização exemplar da presente divulgação, foi confirmado que quando o gene ackA é superexpresso em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, utilizada como cepa-mãe do microrganismo representativo do gênero Corynebacterium, a capacidade de uso de acetato foi aumentada e a quantidade de L-lisina produzida foi aumentada, sem inibição do crescimento (Exemplos 2 a 6). Além disso, a superexpressão do gene ackA em vários microrganismos do gênero Corynebacterium (KCCM10770P, KCCM11347P, ou CJ3P) também apresentou um aumento na sua capacidade de produzir L-lisina (Exemplo 7) e o resultado sugere que a capacidade de produzir L-lisina é aumentada pela amplificação da atividade da proteína no microrganismo do gênero Corynebacterium, no qual a acetato quinase codificada pelo gene ackA é utilizada no uso do acetato. Adicionalmente, foi confirmado que adição adicional da atividade da fosfotransacetilase e/ou a introdução ou amplificação da atividade da acetil-CoA, além da amplificação da atividade do acetato quinase codificada pelo gene ackA, também pode aumentar a capacidade de uso do acetato e a capacidade de produção de L-lisina.

[056] Outro aspecto da presente divulgação proporciona um método para a produção de L-lisina, incluindo: (i) cultura do novo microrganismo do gênero Corynebacterium tendo capacidade de produção de L-lisina aumentada devido ao aumento da capacidade de uso do acetato em um meio; e (ii) recuperação de L-lisina do meio de cultura ou do microrganismo da cultura.

[057] O microrganismo do gênero Corynebacterium tendo capacidade de produção de L-lisina aumentada é o mesmo conforme descrito acima.

[058] Conforme utilizado aqui, o termo "cultura" se refere ao crescimento de um microrganismo em condições ambientais adequadamente e artificialmente controladas. Na presente divulgação, o processo de obtenção de L-lisina por cultura do microrganismo do gênero Corynebacterium pode ser realizado usando os métodos bem conhecidos no estado da técnica. Especificamente, a cultura pode ser realizada continuamente em um processo em batelada (batelada alimentada ou batelada alimentada repetida), mas não está limitado a estes.

[059] O meio utilizado na cultura deve satisfazer adequadamente os requisitos das cepas específicas. O meio de cultura para as cepas de Corynebacteriumjá é conhecido (por exemplo, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). Exemplos de fonte de carbono a serem utilizadas no meio podem incluir açúcares e carboidratos, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico; alcoóis, tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido glucônico, ácido acético e ácido pirúvico, mas não estão limitados a estes. Estas fontes de carbono podem ser utilizadas sozinhas ou em combinação. Exemplos de fonte de nitrogênio a serem utilizadas no meio podem incluir peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, milhocina, farinha de soja e ureia; ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. Estas fontes de nitrogênio podem ser utilizadas sozinhas ou em combinação. Exemplos de fontes de fósforo a serem utilizadas no meio podem incluir dihidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico ou os sais contendo sódio correspondentes. Adicionalmente, sais metálicos, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro necessários para o crescimento, podem estar contidos no meio. Finalmente, materiais essenciais para o crescimento, tais como aminoácidos e vitaminas, também podem estar contidos, além dos materiais descritos acima. Adicionalmente, podem ser utilizados precursores adequados para um meio de cultura. Estas fontes podem ser adicionadas a uma cultura de um modo apropriado, durante a cultura pelo método de cultura em bateladas ou de cultura contínua. Estes vários métodos são descritos nas referências (por exemplo, “Biochemical Engineering” por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, págs. 138 - 176).

[060] O pH da cultura pode ser ajustado adequadamente utilizando um composto tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e amônia, ou um ácido tal como ácido fosfórico e ácido sulfúrico. Adicionalmente, pode ser utilizado um agente antiespumante tal como um éster poliglicólico de ácido graxo, para evitar a produção de espuma. Além disso, para manter o estado aeróbico da cultura, oxigênio ou um gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado na nesta. A temperatura da cultura pode ser, normalmente, de 20 °C a 45 °C, especificamente, entre 25 °C a 40 °C, mas pode variar de acordo com as condições. Adicionalmente, a cultura pode ser continuada até se obter a quantidade máxima do L-aminoácido desejado, o que pode ser alcançado em 10 horas a 100 horas. A L-lisina pode ser secretada no meio de cultura ou pode estar contida nas células.

[061] O método para a produção de L-lisina da presente divulgação pode incluir a recuperação da lisina do microrganismo cultivado ou do meio de cultura. O método para a recuperação de L-lisina a partir do microrganismo cultivado ou do meio de cultura pode ser realizado utilizando um método conhecido no estado da técnica, por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC, etc., mas o método não está limitado a estes.

[062] A recuperação pode incluir um processo de purificação.

[063] Descrição Detalhada da Invenção

[064] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos seguintes exemplos e exemplos experimentais. No entanto, os exemplos e exemplos experimentais seguintes são fornecidos apenas para fins ilustrativos e o escopo da presente invenção não deve ser limitado aos mesmos, de qualquer maneira.

[065] Exemplo 1: Preparação de um vetor para inserção de ackA, pta, ou pta e ackA no cromossomo

[066] Para preparar um vetor para inserção adicional independente ou simultânea do gene ackA ou pta no cromossomo de Corynebacterium, o vetor pDZTN (Patente Coreana N° 10-1126041) concebido a partir do vetor pDZ foi utilizado como vetor básico para a inserção dos genes alvo na região do transpóson. Visto que os dois genes estabelecem um óperon na forma de pta- ackA, para a única superexpressão do gene ackA para inserção adicional, a região promotora do óperon pta-ackA foi operativamente ligada à região a montante do quadro de leitura aberta (ORF) do gene ackA. As sequências de primers utilizadas nos Exemplos são apresentadas na Tabela 1 abaixo.

[067] Para a preparação de um vetor para inserção adicional do gene ackA, os primers (SEQ ID NO: 1 e 2) para amplificação do gene ackA foram sintetizados com base nas sequências polinucleotídicas relatadas anteriormente, e a região do ORF do gene ackA, com um tamanho de cerca de 1300 pb, foi amplificada por PCR utilizando o cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como modelo. Em particular, a PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, annealing a 56 °C durante 30 s e polimerização a 72 °C durante 90 s; e polimerização a 72 °C durante 7 min. As partes sublinhadas nas sequências polinucleotídicas representam os sítios de restrição. Tabela 1

[068] Além disso, os primers (SEQ ID NO: 3 e 4) para amplificar a região promotora do óperon pta-ackA foram sintetizados e uma região promotora com um tamanho de cerca de 350 pb foi amplificada por PCR utilizando o ADN cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como modelo. Em particular, a PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, annealing a 56 °C durante 30 s e polimerização a 72 °C durante 90 s; e polimerização a 72 °C durante 7 min. As partes sublinhadas nas sequências polinucleotídicas representam os sítios de restrição.

[069] Os fragmentos de ADN amplificados por PCR foram tratados com enzimas de restrição, Spel e Ndel, para obter segmentos de ADN, respectivamente. Os segmentos de ADN assim obtidos foram ligados no vetor pDZTN tendo uma extremidade Spel, transformados em E. coli DH5a e plaqueados em meio LB sólido contendo canamicina (25 mg/l). Foram selecionadas as colônias transformadas com o vetor, no qual foi inserido um gene alvo, o plasmídeo foi obtido pelo método de extração de plasmídeo convencionalmente conhecido e o plasmídeo assim obtido foi denominado como pDZTN-Ppta_ackA.

[070] Para a preparação de um vetor para inserção adicional do gene pta, foi sintetizado um primer (SEQ ID NO: 5) na região da extremidade do ORF do gene pta e a região do gene pta com um tamanho de cerca de 1750 pb foi amplificada por PCR utilizando o cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como modelo, juntamente com os primers (SEQ ID NO: 3 e 5) para a amplificação da região que abrange do promotor até a extremidade do ORF do gene pta. Em particular, a PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, annealing a 56 °C durante 30 s e polimerização a 72 °C durante 90 s; e polimerização a 72 °C durante 7 min.

[071] Os fragmentos de ADN amplificados por PCR foram tratados com enzimas de restrição, Spel, para obter segmentos de ADN. Os segmentos de ADN assim obtidos foram ligados no vetor pDZTN tendo uma extremidade Spel para obter um plasmídeo e o plasmídeo foi denominado como pDZTN-pta.

[072] Para a preparação de um vetor para a inserção simultânea dos dois genes na forma de um óperon, a região do gene pta-ackA, com um tamanho de cerca de 3000 pb, foi obtida por PCR utilizando o cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como modelo, juntamente com primers (SEQ ID NO: 3 e 2), que são para amplificar a região que abrange a região promotora prevista do óperon do gene pta-ackA (SEQ ID NO: 10) até a extremidade do ORF do gene ackA. Em particular, a PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, annealing a 56 °C durante 30 s e polimerização a 72 °C durante 3 min; e polimerização a 72 °C durante 7 min. Os fragmentos de ADN amplificados por PCR forma tratados com uma enzima de restrição, Spel, para obter segmentos de ADN. Os segmentos de ADN assim obtidos foram ligados no vetor pDZTN tendo uma extremidade SpeI, para obter um plasmídeo e o plasmídeo foi denominado como pDZTN-pta-ackA.

[073] Exemplo 2: Análise da capacidade de uso de acetato da cepa com inserção do gene ackA e/ou pta no cromossomo

[074] Os três tipos de vetores preparados no Exemplo 1, ou seja, pDZTN- Ppta_ackA, pDZTN-pta, e pDZTN-pta-ackA, foram transformados em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (o microrganismo foi originalmente divulgado como KFCC10881, redepositado em uma autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste e atribuído com o N° de Registro KCCM110116P; Patente coreana N° 10-0159812 e 10-0397322) pelo método de pulso elétrico e as cepas, nas quais os genes alvos foram inseridos no cromossomo por recombinação homóloga, foram isoladas seletivamente por PCR e denominadas como KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn), KCCM11016P::pta(Tn) e KCCM11016P::pta-ackA(Tn).

[075] Os três tipos de cepas e o grupo de controle foram inoculados em um balão Erlenmeyer com saliências no fundo de 250 ml contendo 25 ml de um meio de cultura de sementes e cultivadas com agitação a 200 rpm a 30 °C durante 20 horas. E seguida, 1 ml da solução de cultura de sementes foi inoculado em um balão Erlenmeyer com saliências no fundo de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivada com agitação a 200 rpm a 37 °C durante 96 horas. O meio de cultura foi coletado a cada 12 horas durante a cultura e a quantidade de glicose e de acetato remanescente no meio de cultura e a absorbância a 562 nm foram analisadas. Os resultados são mostrados nas Figs. 1a e 1b.

[076] Meio de cultura de sementes (pH 7,0)

[077] Glicose (20 g), (NH4)2SO4 (10 g), peptona (10 g), extrato de levedura (5 g), ureia (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO4-7H2O (0,5 g), biotina (100 µg), tiamina HCl (1000 µg), ácido cálcio-pantotênico (2000 µg) e nicotinamida (2000 µg) (com base em 1 l de água destilada).

[078] Meio de produção (pH 7,0)

[079] Glicose (100 g), acetato de amônio (7,1 g) (com ou sem adição), (NH4)2SO4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), milhocina sólida (5 g), ureia (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4^7H2O (0,5 g), biotina (100 µg), tiamina HCl (1000 µg), ácido cálcio-pantotênico (2000 µg), nicotinamida (3000 µg) e CaCO3 (30 g) (com base em 1 l de água destilada).

[080] Conforme mostrado na Fig. 1a, a cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) produziu acetato em um meio sem acetato enquanto consumiu a glicose, e consumiu acetato após o consumo de toda a glicose, ao contrário da cepa-mãe KCCM11016P. A partir deste resultado, foi confirmado que a acetato quinase está envolvida na produção de acetato. Adicionalmente, foi observado que a taxa de cultura foi atrasada pela produção de acetato.

[081] No entanto, conforme mostrado na Fig. 1b, a cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) apresentou uma característica de consumo mais rápido de acetato na fase inicial de cultura, quando cultivada em um meio com acetato, em comparação como a cepa KCCM11016P (grupo de controle) e, como resultado, a fase lag de crescimento da cepa foi significativamente reduzida em comparação com o grupo de controle. A cepa KCCM11016P::pta(Tn)não apresentou uma diferença significativa na taxa de consumo de acetato em comparação com o grupo de controle. No entanto, foi confirmado que a cepa KCCM11016P::pta-ackA(Tn), na qual foram introduzidos os dois genes na forma de um óperon, apresentou um ligeiro aumento na taxa de consumo de acetato em comparação com a cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn), na qual foi introduzido apenas o gene ackA.

[082] A partir dos resultados acima, foi confirmado que a acetato quinase, que é codificada pelo gene ackA, é a enzima principal na produção ou ativação do acetato e está envolvida na produção de acetato quando não há acetato presente no meio, ao passo que quando o acetato está presente no meio, este é utilizado na via de ativação do acetato. Adicionalmente, foi confirmado que a superexpressão do gene ackA pode aumentar significativamente a capacidade uso de acetato devido ao aumento da via de ativação, ao mesmo tempo em que reduz a inibição do crescimento, possivelmente reduzindo desse modo a fase lag.

[083] Exemplo 3: Preparação de uma cepa com superexpressão do gene ackA pelo promotor forte e confirmação do efeito deste

[084] De modo a confirmar a capacidade de uso do acetato e o seu efeito pela superexpressão do gene ackA, foi feita uma tentativa de induzir a expressão do gene ackA sendo adicionalmente inserido utilizando o promotor lysCP1 (Patente Coreana N° 10-0930203), que é um promotor forte relatado anteriormente. Os primers utilizados nos Exemplos da presente divulgação são mostrados na Tabela 2 abaixo.

[085] Um vetor para a inserção de um cromossomo foi preparado utilizando o vetor pDZTn descrito no Exemplo 1 como o vetor básico. Os primers (SEQ ID NO: 6 e 7) para amplificar a região promotora lysCP1 foram sintetizados com base nas sequências polinucleotídicas relatadas anteriormente, e um segmento de ADN com um tamanho de cerca de 450 pb foi obtido por PCR utilizando o ADN cromossômico da Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-lysCP1 (Patente Coreana N° 10-0930203) como modelo. Em particular, a PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, annealing a 56 °C durante 30 s e polimerização a 72 °C durante 30 s; e polimerização a 72 °C durante 7 min. Tabela 2

[086] Os fragmentos de ADN amplificados por PCR foram tratados com enzimas de restrição, Xhol e Ndel, para obter segmentos de ADN, respectivamente. Os fragmentos de ADN assim obtidos foram ligados no vetor pDZTN tendo extremidades XhoI e SpeI juntamente com os fragmentos de ADN em torno da região do ORF do gene ackA tendo extremidades Ndel e Spel preparado no Exemplo 1, transformado em E. coli DH5a e plaqueado em meio LB sólido contendo canamicina (25 mg/l). Foram selecionadas as colônias transformadas com o vetor, no qual o gene alvo foi inserido, o plasmídeo foi obtido pelo método de extração de plasmídeo convencionalmente conhecido e o plasmídeo assim obtido foi denominado como pDZTN-lysCP1_ackA (Fig. 2).

[087] O vetor pDZTN-lysCP1_ackA assim preparado foi transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, que produz L-lisina, por recombinação homóloga. Em seguida, as colônias, nas quais o pDZTN- lysCP1_ackA foi integrado no cromossomo por PCR, foram isoladas seletivamente e denominadas como KCCM11016P::lysCP1_ackA (Tn).

[088] A cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA (Tn), a cepa KCCM11016P::Ppta_ackA (Tn) e a cepa KCCM11016P (grupo de controle) foram cultivadas da mesma forma que no Exemplo 2 e a quantidade de acetato remanescente no meio de cultura foi analisada a cada 12 horas. Os resultados são mostrados na Fig. 3.

[089] Como resultado, a cepa KCCM11016P::Ppta_ackA (Tn) apresentou uma capacidade de uso de acetato melhorada em comparação com o grupo de controle, conforme mostrado no resultado do Exemplo 2. Além disso, foi confirmado que a cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA (Tn) apresentou um aumento na taxa de consumo de acetato em comparação com a cepa KCCM11016P::Ppta_ackA (Tn).

[090] O resultado acima indica que a taxa de uso de acetato aumenta à medida que a quantidade da expressão do gene ackA aumenta e, a partir do resultado, foi confirmado que a superexpressão do gene ackAé a principal causa do aumento da capacidade de uso do acetato.

[091 ] Exemplo 4: Análise da capacidade de produção de lisina da cepa com superexpressão do gene ackA

[092] De modo a confirmar a capacidade de produção de lisina da cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA (Tn) de Corynebacterium glutamicum preparada no Exemplo 3, a cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA (Tn) de Corynebacterium glutamicum foi cultivada juntamente com a cepa KCCM11016P (grupo de controle) do mesmo modo que no Exemplo 2. Depois de concluída a cultura, a concentração de L-lisina foi analisada por HPLC e os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo. Tabela 3

[093] Como resultado, quando as cepas foram cultivadas utilizando glicose como a única fonte de carbono sem a adição de acetato, a cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA (Tn) apresentou o mesmo nível de capacidade de produção de lisina da do grupo de controle, conforme mostrado na Tabela 3 . No entanto, foi confirmado que quando as cepas foram cultivadas em meio contendo acetato, a cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA (Tn) apresentou um aumento médio de 12 % no rendimento de lisina (rendimento total de fonte de carbono = concentração de lisina/(quant. adicionada de glicose + acetato)) em comparação com o grupo de controle.

[094] Os resultados acima suportam que a amplificação da via de ativação de acetato não só aumenta a capacidade de uso de acetato, mas também a capacidade de produção de L-lisina. Além disso, estes resultados sugerem que, quando o acetato é utilizado como uma fonte de carbono, a uso da cepa com o gene ackA amplificado da presente divulgação pode produzir lisina com rendimento elevado, reduzindo, ao mesmo tempo, o tempo de cultura sem inibição do crescimento celular.

[095] Nestas circunstâncias, os presentes inventores nomearam a cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA (Tn) com maior capacidade de uso de acetato e maior capacidade de produção de L-lisina como Corynebacterium glutamicum "CA01-2278", depositada no Centro de Cultura de Microrganismos Coreano (Korean Culture Center of Microorganisms - KCCM), com o número de depósito KCCM11480P.

[096] Exemplo 5: Preparação de uma cepa com o gene acs introduzido e análise do efeito na cepa

[097] Para inserir a via de ativação de acetato derivada de Escherichia no cromossomo de Corynebacterium, foi preparado um vetor para a inserção do cromossomo utilizando o vetor pDZTn mencionado no Exemplo 1 como o vetor básico, após a obtenção do gene acs (SEQ ID NO: 11), que é conhecido como a via de ativação de acetato derivada de Escherichia. A expressão foi induzida pela ligação operativa do promotor do gene pta-ackA derivado de Corynebacterium na região a montante do códon de iniciação do gene acs. Os primers utilizados da presente divulgação são mostrados na Tabela 4 abaixo.

[098] Os primers (SEQ ID NO: 8 e 9) para amplificação da região do gene acs foram sintetizados com base nas sequências polinucleotídicas relatadas anteriormente, e a região do ORF do gene acs, com um tamanho de cerca de 2000 pb, foi amplificada por PCR utilizando o cromossomo da cepa E. coli W (ATCC9637) como modelo. Em particular, a PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, annealing a 56 °C durante 30 s e polimerização a 72 °C durante 2 min; e polimerização a 72 °C durante 7 min. Tabela 4

[099] Os fragmentos de ADN amplificados por PCR foram tratados com enzimas de restrição, Spel e Ndel, juntamente com os fragmentos de ADN do promotor do óperon pta_ackA, que foram obtidos no Exemplo 5, para a obtenção de cada um dos segmentos de ADN. Os segmentos de ADN assim obtidos foram ligados no vetor pDZTN tendo uma extremidade Spel, transformados em E. coli DH5a e plaqueados em meio LB sólido contendo canamicina (25 mg/l). Foram selecionadas as colônias transformadas com o vetor, no qual foi inserido um gene alvo, o plasmídeo foi obtido pelo método de extração de plasmídeo convencionalmente conhecido, e o plasmídeo assim obtido foi denominado como pDZTN-Ppta_acs.

[100] O vetor preparado desta forma foi transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::Ppta_ackA (Tn) preparada no Exemplo 2 pelo método de pulso elétrico e foram selecionadas as cepas em que o gene acs foi inserido no cromossomo por recombinação homóloga. Em particular, essas colônias nas quais o gene acs foi inserido em um transpóson diferente do transpóson no qual o gene Ppta_ackA foi previamente inserido, foram isoladas seletivamente por PCR e denominadas de KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)- Ppta_acs(Tn).

[101] A cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn) e a cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) (grupo de controle) foram cultivadas da mesma forma que no Exemplo 2 e a quantidade de acetato remanescente no meio de cultura foi analisada a cada 12 horas.

[102] Como resultado, foi confirmado que a cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn) apresentou um ligeiro aumento na taxa de consumo de acetato em comparação o grupo de controle (Fig. 3).

[103] O resultado sugere que não só a superexpressão do gene ackA, mas também a introdução do gene acs, que é um gene estranho derivado de Escherichia, em um microrganismo do gênero Corynebacterium pode aumentar a taxa de consumo de acetato e a capacidade de produção de L-lisina.

[104] Exemplo 7: Comparação da capacidade de produção de L-lisina de cepas com superexpressão do gene ackA derivadas de cepa produtora de L-lisina

[105] De modo a confirmar o efeito de amplificação da produção de lisina pelas cepas com superexpressão de ackA, foi comparada a capacidade de produção de L-lisina de várias cepas produtoras de lisina derivadas de Corynebacterium.

[106] O gene ackA foi introduzido em três cepas produtoras de lisina representativas, Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente Coreana N° 10-0924065), KCCM11347P (o microrganismo foi originalmente descrito como KFCC10750 e redepositado em uma autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste e atribuído com o N° de Registro KCCM11347P; Patente coreana N° 10-0073610) e CJ3P(Binder et al. Genome Biology2012, 13: R40) e as suas capacidades de produção de L-lisina-foram comparadas.

[107] O vetor pDZTN-lysCP1_ackA, preparado no Exemplo 3, foi transformado no cromossomo das cepas de Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, KCCM11347P e CJ3P, respectivamente, por recombinação homóloga. Em seguida, as colônias foram isoladas seletivamente por PCR e cada uma das cepas foi denominada como KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn), KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn) e CJ3P::lysCP1_ackA(Tn), respectivamente.

[108] Para a comparação da capacidade de produção de lisina das cepas acima, estas foram cultivadas juntamente com cada um dos grupos de controle, da mesma maneira que no Exemplo 2. Depois de concluída a cultura, a concentração de L-lisina foi analisada por HPLC e os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. Tabela 5

[109] Como resultado, conforme mostrado na Tabela 5, todas as cepas que superexpressam ackA derivadas de uma cepa produtora de lisina apresentaram um aumento na capacidade de produção de L-lisina. A cepa KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn) apresentou um aumento de cerca de 11 % na concentração de lisina em comparação com a cepa KCCM10770P (grupo de controle). A cepa KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn) apresentou um aumento de cerca de 10 % na concentração de lisina em comparação com a cepa KCCM11347P (grupo de controle). A cepa CJ3P::lysCP1_ackA(Tn) apresentou um aumento de cerca de 11 % na concentração de lisina em comparação com a cepa CJP3 (grupo de controle).

[110] Consequentemente, a partir dos resultados acima, foi confirmado que o aumento na atividade do acetato quinase em vários tipos de cepas produtoras de L-lisina derivadas de Corynebacterium glutamicum tem o efeito de aumentar a capacidade de produção de L-lisina.

[111] A partir do exposto acima, um técnico no assunto ao qual pertence a presente invenção será capaz de compreender que a esta pode ser realizada em outras formas específicas, sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente invenção. Com relação a isso, as formas de realização exemplares, descritas aqui são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitando o escopo da presente invenção. Pelo contrário, a presente invenção se destina a abranger não só as formas de realização exemplares, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras formas de realização que podem ser incluídas dentro do espírito e escopo da presente invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Método para a produção de L-lisina caracterizado por compreender: (i) cultura de um microrganismo do gênero Corynebacterium com produtividade aumentada de L-lisina em comparação com um microrganismo não modificado, em que a atividade do acetato quinase é amplificada em comparação com a sua atividade endógena; e (ii) recuperação de L-lisina a partir do microrganismo cultivado ou do meio de cultura, em que a atividade da proteína é amplificada por pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em um método para aumentar o número de cópias de um gene que codifica a proteína, um método para introduzir uma modificação na sequência reguladora de um gene que codifica a proteína, um método para substituir a sequência reguladora de um gene que codifica a proteína no cromossomo por uma sequência com forte atividade, um método para substituir o gene que codifica a proteína por um gene mutado para aumentar a atividade da proteína e um método para introduzir uma modificação no gene que codifica a proteína no cromossomo para amplificar a atividade da proteína, e em que o gene que codifica a acetato quinase consiste em uma sequência de nucleotídeos nas posições 1726 a 2916 da SEQ ID NO: 10.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, adicionalmente, (i) uma atividade da fosfotransacetilase ser amplificada em comparação com a sua atividade endógena; (ii) uma atividade da acetil-CoA-sintetase ser introduzida ou amplificada; ou (iii) uma atividade da fosfotransacetilase ser amplificada em comparação com a sua atividade endógena e uma atividade da acetil-CoA- sintetase ser introduzida ou amplificada, em que o gene que codifica a fosfotransacetilase consiste em uma sequência de nucleotídeos nas posições 341 a 1723 da SEQ ID NO: 10, e em que o gene que codifica a acetil-CoA-sintetase consiste em uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 11.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pora acetato quinase consistir em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pora fosfotransacetilase consistir em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pora acetil-CoA sintetase consistir em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro microrganismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium glutamicum.