CN106574232B - 具有l-赖氨酸生产能力的微生物和使用其的l-赖氨酸生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有提高的L‑赖氨酸‑生产能力的微生物和使用其的L‑赖氨酸‑生产方法。更具体地，本发明涉及棒状杆菌属某种的微生物，其中乙酸激酶活性相对于内在活性被进一步增强，和使用其的L‑赖氨酸‑生产方法。

Description

具有L-赖氨酸生产能力的微生物和使用其的L-赖氨酸生产 方法
技术领域
本公开内容涉及产L-赖氨酸的微生物和使用该微生物生产L-赖氨酸的方法。
背景技术
棒状杆菌属(genus Corynebacterium)的微生物可以利用有机酸比如葡糖酸(gluconate)、乙酸(acetate)和丙酮酸(pyruvate)，以及葡萄糖、蔗糖和果糖作为碳源。在这些之中，当被棒状杆菌属的微生物利用时，乙酸——其是属于一元羧酸的有机酸——通过被动扩散或一元羧酸转运蛋白(MctC)被引入细胞，由乙酸激酶(ackA)磷酸化以转化为乙酰磷酸，并且通过磷酸转乙酰酶(pta)形成为乙酰CoA。如此形成的乙酰CoA被立即引入三羧酸(TCA)循环和乙醛酸循环(J.Bacteriol.2009.191:940-948)，并且从而形成为赖氨酸前体的草酰乙酸(oxaloacetate)。
然而，当使用乙酸作为单独的或混合的碳源培养棒状杆菌属的菌株时，存在可能根据其浓度发生生长抑制现象的问题。已知乙酸具有限制：其代谢速率比糖类比如葡萄糖的代谢速率低，而且也由于当乙酸以某一浓度在细胞中存在时其可以抑制细胞生长，培养基中乙酸浓度的增加可以增加滞后期，从而延缓整个培养时间(Arch.Microbiol.1991.155:505-510)。因此，对开发用于将培养基中的乙酸快速地转化为细胞中的乙酰CoA的方法存在需要。
然而，乙酸激酶和磷酸转乙酰酶——其用于乙酸激活的途径中——具有双向性(可逆反应)并且因而存在乙酰CoA可以被再次转化为乙酸的问题，并且存在如下报道：这些可能对L-赖氨酸的生产具有不利影响。因此，开发用于有效地利用乙酸的方法仍不活跃。
公开内容
技术问题
本发明人已经做出许多努力以开发用于高效利用乙酸的微生物，所述乙酸在发酵过程期间产生或被提供作为新的碳源，并且结果，他们已经确认在乙酸激活的途径上具有增强的乙酸激酶活性的微生物可以增加利用乙酸和生产L-赖氨酸的能力，从而完成本发明。
技术方案
本公开内容的目标是提供产L-赖氨酸的棒状杆菌属的微生物，其中乙酸激酶的活性与其内源活性相比被增强。
本公开内容的另一个目标是提供使用上面的微生物生产L-赖氨酸的方法。
发明的有益效果
根据本公开内容的微生物——其是由于增强的乙酸激活的途径而具有增加的乙酸-利用能力的菌株——是可以以高产率生产L-赖氨酸的微生物。如此制备的L-赖氨酸可以用于多种产品中，其不仅包括动物饲料或动物饲料添加剂而且包括人类食品或食品添加剂、药物等。
附图说明
图1a和1b显示了图解KCCM11016P(对照菌株)和修饰的KCCM11016P(引入有pta和pta-ackA的修饰菌株)在具有乙酸的培养基(图1a)和在不具有乙酸的培养基(图1b)中的乙酸-利用能力的分析的图表。
图2显示了用于通过为强启动子的LysCP1启动子过表达ackA的载体pDZTn-lysCP1-ackA的示意图。
图3显示了图解KCCM11016P(对照菌株)和修饰的KCCM11016P(引入有pta、pta-ackA和acs的修饰菌株)的乙酸-利用能力的分析的图表。
最佳模式
本公开内容的一个方面提供产L-赖氨酸的棒状杆菌属的微生物，其中乙酸激酶的活性被增强。具体地，微生物是产L-赖氨酸的棒状杆菌属的微生物，其中乙酸激酶的活性与其内源活性相比被增强。
如本文使用的，术语“L-赖氨酸”指的是具有化学式NH2(CH2)4CH(NH2)COOH的一类L-氨基酸，其是不在体内合成的碱性α-氨基酸和必需氨基酸。
乙酸是属于一元羧酸的有机酸，当被棒状杆菌属的微生物利用时，其通过被动扩散或一元羧酸转运蛋白被引入细胞，由乙酸激酶磷酸化以转化为乙酰磷酸，并且通过磷酸转乙酰酶形成为乙酰CoA。如此形成的乙酰CoA被立即引入三羧酸(TCA)循环和乙醛酸循环，并且从而形成草酰乙酸——赖氨酸前体。乙酸在棒状杆菌属的微生物中可以被用作碳源。然而，当使用乙酸作为单独的或混合的碳源培养微生物时，存在根据浓度发生生长抑制现象的问题(Arch.Microbiol.1991.155:505-510)。
概括地，存在两种途径用于激活乙酸以在细胞中将乙酸转化为乙酰CoA。如上面描述的，两种酶(即，乙酸激酶和磷酸转乙酰酶)在棒状杆菌属的菌株中顺序地作用。已知基因ackA编码乙酸激酶，并且已知基因pta编码磷酸转乙酰酶(Microbiol.1999 145:503-513)。在另一种途径中，乙酰CoA合成酶包括在埃希氏杆菌属(genus Escherichia)的菌株中，并且已知基因acs编码乙酰CoA合成酶(Appl Microbiol Biotechnol.2006.71:870-874)。然而，因为埃希氏杆菌属的菌株中的激活途径是由于可逆反应，所以没有简单地增强该途径的尝试。
然而，惊人地，本发明人已经确认乙酸激酶的增强不仅可以快速地在细胞中将乙酸转化为乙酰CoA，而且上面描述的生长抑制的缺点可以被克服以增加L-氨基酸-生产能力。因此，本发明人能够提供新型产L-赖氨酸的棒状杆菌属的微生物，其中乙酸激酶的活性与其内源活性相比被增强。
在本公开内容的示例性实施方式，确认了其中ackA基因的活性被增强的微生物在微生物的生长中显示快速的乙酸消耗速率以及滞后期的显著减小。相比之下，确认了当pta基因的活性被增强时，与对照组相比，该微生物在乙酸消耗速率中不显示任何显著的差异(图1a和1b)，并且因而确认了对通过乙酸激活增加乙酸-利用能力并且增加L-赖氨酸-生产能力而没有生长抑制重要的蛋白质是乙酸激酶。即，确认了可以基于上面的结果使用多种已知方法通过增强乙酸激酶的活性制备微生物，其可以以高产率生产L-赖氨酸并且具有增加的乙酸-利用能力而没有生长抑制。
本公开内容的棒状杆菌属的微生物——其具有增加的乙酸-利用能力和增加的L-赖氨酸-生产能力——可以是如下棒状杆菌属的微生物：其可以生产L-赖氨酸并且具有与其内源活性相比增强的乙酸激酶活性。
额外地，具有增加的乙酸-利用能力和增加的L-赖氨酸-生产能力的棒状杆菌属的微生物可以是如下棒状杆菌属的微生物：其具有与其内源活性相比增强的乙酸激酶活性，其中，额外地，(i)磷酸转乙酰酶的活性与其内源活性相比被增强；(ii)乙酰CoA合成酶的活性被引入或增强；或(iii)磷酸转乙酰酶的活性与其内源活性相比被增强并且乙酰CoA合成酶的活性被引入或增强。
本发明人已经确认，在具有与其内源活性相比增强的乙酸激酶的活性——其对增加乙酸-利用能力和L-赖氨酸-生产能力是最重要的——的微生物中，当磷酸转乙酰酶的活性与其内源活性相比被额外地增强和/或乙酰CoA合成酶的活性被额外地引入或增强时，乙酸-利用能力进一步增加，并且本发明人在本公开内容中提供了新型微生物。在本公开内容的示例性实施方式中，确认了进一步引入的acs基因——其源自埃希氏杆菌属的微生物并且编码乙酰CoA——可以增加乙酸消耗速率(图3)，并且结果表明引入或增强乙酰CoA合成酶的活性还可以增加乙酸消耗速率，从而增加L-赖氨酸-生产能力。
如本文使用的，术语“乙酸激酶(EC 2.7.2.1)”指的是具有通过磷酸化乙酸生产乙酰磷酸的功能的酶。编码乙酸激酶的基因可以统称为ackA，并且乙酸激酶的蛋白质和基因序列可以从已知的数据库(例如，NCBI的GenBank)获得，但是不限于此。乙酸激酶可以具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列但是可以非限制性地包括具有乙酸激酶活性的任何蛋白质序列。
如本文使用的，术语“磷酸转乙酰酶(EC 2.3.1.8)”指的是具有通过下面显示的反应将乙酰磷酸转化为乙酰CoA的功能的酶。
Figure GDA0001220650710000041
如本文使用的，术语“磷酸转乙酰酶”可以与酶比如磷酸乙酰转移酶和磷酸酰基酶可交换地使用。编码磷酸转乙酰酶的基因可以统称为pta，并且磷酸转乙酰酶的蛋白质和基因序列可以从已知的数据库(例如，NCBI的GenBank)获得，但是不限于此。磷酸转乙酰酶可以具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，但是可以非限制性地包括具有磷酸转乙酰酶活性的任何蛋白质序列。
如本文使用的，术语“乙酰CoA合成酶(EC 6.2.1.1)”指的是具有通过下面显示的反应将乙酸转化为乙酰CoA的功能的酶。
Figure GDA0001220650710000042
编码乙酰CoA合成酶的基因可以统称为acs，并且乙酰CoA合成酶的蛋白质和基因序列可以从已知的数据库(例如，NCBI的GenBank)获得，但是不限于此。乙酰CoA合成酶可以具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列，但是可以非限制性地包括具有乙酰CoA合成酶活性的任何蛋白质序列。
上面描述的每种蛋白质除由SEQ ID NO表示的氨基酸序列之外还可以非限制性地包括与上面列举的氨基酸序列具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，并且甚至更具体地97％或更高的同源性的任何氨基酸序列，只要该氨基酸序列编码具有与每种蛋白质基本上相同或相应的作用的蛋白质。额外地，明显的是，具有上面描述的同源性的任何修饰蛋白可以属于本公开内容的范围，尽管蛋白质可以具有在其中具有部分缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列。
额外地，编码本公开内容的每种蛋白质的基因除由SEQ ID NO描述的多核苷酸序列之外还可以非限制性地包括与上面列举的多核苷酸序列中的每个具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，甚至更具体地98％或更高，并且最具体地99％或更高的同源性的编码该蛋白质的任何基因序列，只要该基因序列编码具有与每种蛋白质基本上相同或相应的作用的蛋白质。额外地，明显的是，具有上面的同源性的任何多核苷酸序列可以属于本公开内容的范围，尽管序列在其中可以具有部分缺失、修饰、置换或添加。
如本文使用的，术语“同源性”指的是编码蛋白质的多肽序列或氨基酸序列之间的同一性程度，并且当存在足够高的同源性百分比时，对应基因的表达产物可以具有相同或相似的活性。
如本文使用的，术语“内源活性”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态——即自然状态——的活性状态。
如本文使用的，术语“与其内源活性相比增强蛋白质的活性”指的是通过修饰蛋白质增加在微生物中蛋白质的细胞内活性以与以其自然状态具备的蛋白质活性相比提高细胞内活性。额外地，如本文使用的，术语“增强蛋白质的活性”不仅指的是与其内源活性相比增强蛋白质的活性，而且指的是通过修饰微生物——其原始地不具备特定蛋白质的活性——以具有特定蛋白质的活性并且修饰以提高其细胞内活性来增加特定蛋白质的细胞内活性。
“增强”不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来比原始功能更高的效果，而且其可以通过选自如下的至少一种方法进行：用于增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数的方法、用于在编码蛋白质的基因的调控序列中引入修饰的方法、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列的方法、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质活性的方法、和用于在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质活性的方法，但是可以非限制性地包括任何已知方法，其可以增强蛋白质的活性——与其内源活性相比——或增强引入的活性。
如本文使用的，术语“引入蛋白质的活性”指的是提供特定蛋白质的活性至不具有该特定蛋白质活性的微生物。
“引入蛋白质的活性”可以以本领域已知的多种方法进行，例如：用于将包括编码蛋白质的多核苷酸序列的多核苷酸插入染色体的方法；通过方法比如经由引入载体系统将多核苷酸引入至微生物而增加多核苷酸的拷贝数的方法；用于引入能够展示提高的活性的启动子或将在启动子中具有修饰的蛋白质引入编码蛋白质的多核苷酸序列的上游区的方法；用于将修饰引入编码蛋白质的多核苷酸序列的方法；等，但是可以非限制性地包括可以引入蛋白质活性的任何已知方法。
在上面中，多核苷酸的拷贝数的增加可以以其中多核苷酸被可操作地连接至载体的形式，或通过将多核苷酸插入宿主细胞的染色体进行，但是方法不特别地限制于此。具体地，多核苷酸的拷贝数的增加可以通过引入载体——其可以独立于宿主细胞复制和起作用并且编码本公开内容的蛋白质的多核苷酸被可操作地连接至其——进行；或可以通过将载体引入宿主细胞——其可以将多核苷酸插入宿主细胞的染色体并且多核苷酸被可操作地连接至其——进行。
载体是包括编码靶蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列的DNA构建体，其被可操作地连接至合适的调控序列以使靶蛋白在宿主细胞中表达。调控序列包括能够起始转录的启动子、用于转录调控的任何操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合结构域的序列、和调控转录和翻译终止的序列。载体在被转化入合适的宿主细胞后可以独立于宿主基因组复制或起作用，或可以被整合入宿主基因组自身。
在本公开内容中使用的载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的，并且其可以使用本领域已知的任何载体构建。载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λⅨII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等；并且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。可以在本公开内容中使用的载体不特别地限制，但是可以使用任何已知的表达载体，例如，pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。
额外地，通过用于将染色体插入宿主细胞内的载体，编码内源靶蛋白的多核苷酸可以在染色体内被替换为修饰的多核苷酸。可选地，待引入染色体的编码外源靶蛋白的多核苷酸可以被替换为修饰的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，例如，通过同源重组。由于本公开内容的载体可以经由同源重组插入染色体，可以进一步包括用于确认插入染色体的选择标记。选择标记用于选择转化的细胞，即，以确认靶多核苷酸是否已经被插入，并且可以使用能够提供可选择的表型比如抗药性、营养需要、细胞毒剂抗性和表面蛋白表达的标记物。在其中处理选择剂的情况下，只有能够表达选择标记的细胞可以存活或表达其它表型性状，并且因而可以选择转化的细胞。
如本文使用的，术语“转化”指的是将包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞的过程，从而使编码该蛋白质的多核苷酸在宿主细胞中表达。对于转化的多核苷酸，其是否被插入宿主细胞的染色体并且位于其中或位于染色体外是无所谓的，只要其可以在宿主细胞中表达。额外地，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式插入，只要其可以被引入宿主细胞并且在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒——其是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体——的形式引入宿主细胞。表达盒可以常规地包括可操作地结合至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。额外地，多核苷酸可以照原样引入宿主细胞并且可操作地结合至对其在宿主细胞中表达所必需的序列。
额外地，如本文使用的，术语“可操作地结合”指的是启动子序列——其起始并且介导编码本公开内容的靶蛋白的多核苷酸的转录——和上面的基因序列之间的功能性结合。
本公开内容的用于转化载体的方法可以包括可以将多核苷酸引入细胞的任何方法，并且可以根据宿主细胞通过选择本领域已知的适合的技术进行转化。例如，方法可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、微注射、聚乙二醇(PEG)方法、DEAE-葡聚糖方法、阳离子脂质体方法和乙酸锂/DMSO方法等，但是不限于此。
使用的宿主细胞具有高效率的DNA引入和引入DNA的高表达效率将更好，并且出于本公开内容的目的，宿主细胞可以是棒状杆菌属的微生物。
然后，在表达控制序列中引入修饰以便增加多核苷酸的表达——但是不限于此，可以通过在多核苷酸序列中经由缺失、插入、保守置换或非保守置换、或其组合引入修饰进行以便进一步增强表达控制序列的活性；或可以通过用具有增强活性的多核苷酸序列替换多核苷酸序列进行。表达控制序列——但是不特别地限于此，可以包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合结构域的序列、用于调控转录和翻译终止的序列等。
强外源启动子代替原始启动子可以结合至多核苷酸的表达单元的上游区。强外源启动子的实例可以包括pcj7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA启动子、aceB启动子等，并且优选地，源自棒状杆菌的启动子比如pcj7启动子或lysCP1启动子。lysCP1启动子的序列和其制备方法在韩国专利号10-0930203中描述，并且上面的韩国专利的全部作为参考实例包括在本文中。在本公开内容的示例性实施方式中，确认了将ackA基因连接至为强启动子的lysCP1启动子导致与对照组相比提高的乙酸-利用能力(图3)，并且结果表明随着ackA基因表达量增加，乙酸利用速率增加。
此外，染色体上多核苷酸序列的修饰可以通过在表达控制序列上经由缺失、插入、非保守置换或保守置换、或其组合引入修饰进行以便进一步增强多核苷酸序列的活性；或通过用提供更强活性的改进的多核苷酸序列替换进行。
通常，相对于野生型蛋白质的活性或浓度或初始阶段下微生物菌株中的活性或浓度，引入或增强蛋白质的活性可以增加相应蛋白质的活性或浓度至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％至最大1000％或2000％，但是不限于此。
如本文使用的，术语“产L-赖氨酸的微生物”指的是出于本公开内容的目的可以生产L-赖氨酸的微生物菌株，并且其是可以高效地利用培养基中的乙酸并且积聚L-乙酸而没有生长抑制的菌株。微生物可以包括具有与其内源活性相比增强活性的乙酸激酶的所有棒状杆菌属的微生物，例如，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、黄色短杆菌、发酵短杆菌(Brevibacterium fermentum)等，但是不限于此。在示例性实施方式中，棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，并且谷氨酸棒状杆菌的实例可以包括KCCM11016P(韩国专利号10-0397322)、KCCM10770P(韩国专利号10-0924065)、KCCM11347P(韩国专利号10-0073610)和CJ3P(Binder等Genome Biology 2012,13:R40)，但是不限于此。
在本公开内容的示例性实施方式中，确认了当ackA基因在谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P——其被用作棒状杆菌属的代表性微生物的亲本菌株——中过表达时，乙酸-利用能力增加并且L-赖氨酸产量增加而没有生长抑制(实施例2至6)。此外，在多种棒状杆菌属的微生物(KCCM10770P、KCCM11347P或CJ3P)中过表达ackA基因还显示其生产L-赖氨酸能力的增加(实施例7)，并且结果表明生产L-赖氨酸的能力通过增强棒状杆菌属的微生物中的蛋白质活性而增加，其中由ackA基因编码的乙酸激酶被用于乙酸利用。额外地，确认了进一步添加磷酸转乙酰酶活性和/或引入或增强乙酰CoA活性——除增强由ackA基因编码的乙酸激酶的活性之外——还可以增加乙酸-利用能力和L-赖氨酸-生产能力。
本公开内容的另一个方面提供用于生产L-赖氨酸的方法，其包括：(i)在培养基中培养由于增加的乙酸-利用能力而具有增加的L-赖氨酸-生产能力的新型棒状杆菌属的微生物；和(ii)从培养基或培养的微生物回收L-赖氨酸。
具有增加的L-赖氨酸-生产能力的棒状杆菌属的微生物与如上面描述的相同。
如本文使用的，术语“培养”指的是在合适和人工控制环境条件下生长微生物。在本公开内容中，通过培养棒状杆菌属的微生物获得L-赖氨酸的过程可以使用本领域公知的方法进行。具体地，培养可以以分批过程(补料分批过程或反复补料分批过程)持续地进行，但是不限于此。
在培养中使用的培养基必须适当地满足特定菌株的要求。用于棒状杆菌菌株的培养基是已知的(例如，Manual of Methods for General Bacteriology.American Societyfor Bacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。培养基中使用的碳源的实例可以包括糖类和碳水化合物比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油脂比如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸比如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类比如丙三醇和乙醇；和有机酸比如葡糖酸、乙酸和丙酮酸，但是不限于此。这些碳源可以单独或组合使用。培养基中使用的氮源的实例可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和脲；或无机化合物比如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源也可以单独或组合使用。培养基中使用的磷源的实例可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐。额外地，生长所需的金属盐比如硫酸镁或硫酸铁可以包含在培养基中。最后，除上面描述的物质之外，还可以包含生长的必需物质，比如氨基酸和维生素。额外地，可以使用适于培养基的前体。这些来源可以在培养期间通过分批培养或连续培养以合适的方式添加至培养物。这些不同方法在参考文献(例如，James M.Lee的“Biochemical Engineering”,Prentice-Hall International Editions,138-176)中公开。
可以通过适当地使用化合物比如氢氧化钠、氢氧化钾和氨，或酸比如磷酸和硫酸调节培养物的pH。额外地，消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于阻止泡沫生成。额外地，为了维持培养物的需氧状态，氧或含氧气体(例如，空气)可以被注入培养物。培养温度可以正常是20℃至45℃，具体地25℃至40℃，但是可以根据条件而变化。额外地，培养可以持续直到获得最大量的期望的L-氨基酸，其可以在10小时至100小时内完成。L-赖氨酸可以分泌入培养基或可以包含在细胞中。
本公开内容的用于生产L-赖氨酸的方法可以包括从培养的微生物或培养基回收赖氨酸。用于从培养的微生物或培养基回收L-赖氨酸的方法可以使用本领域已知的方法进行，例如，离心、过滤、阴离子交换层析、结晶、HPLC等，但方法不限于此。
回收可以包括纯化过程。
发明的详细描述
其后，将参考下列实施例和实验实施例更详细地描述本发明。然而，下列实施例和实验实施例仅出于说明性目的提供，并且本发明的范围不应当以任何方式被限制于此。
实施例1：用于在染色体上插入ackA、pta、或pta和ackA的载体的制备
为了制备用于独立地或同时地在棒状杆菌的染色体上进一步插入ackA基因和pta基因的载体，由pDZ载体设计的pDZTN载体(韩国专利号10-1126041)被用作基础载体，用于将靶基因插入转座子区。由于两个基因建立了pta-ackA形式的操纵子，为了ackA基因的单独的过表达以便进一步插入，pta-ackA操纵子的启动子区被可操作地连接至ackA基因的开放阅读框(ORF)的上游区。实施例中使用的引物序列在下面的表1中显示。
为了制备用于进一步插入ackA基因的载体，基于先前报道的多核苷酸序列合成用于扩增ackA基因的引物(SEQ ID NO:1和2)，并且使用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的染色体作为模板通过PCR扩增具有大约1300bp大小的ackA基因的ORF区。具体而言，PCR在下列条件下进行：94℃下变性5min；94℃下变性30sec、56℃下退火30sec和72℃下聚合90sec的30个循环；和72℃下聚合7min。多核苷酸序列上的下划线部分表示限制性位点。
[表1]
引物 序列 SEQ ID NO
ackA引物1 atcg<u>catatg</u>gcattggcacttgttttg 1
ackA引物2 atcg<u>actagt</u>atccgtgcagtttcaccccttaaa 2
Ppta引物1 atcg<u>actagt</u>ctttgctggggtcagatttgtcac 3
Ppta引物2 atcg<u>catatg</u>tcgcctttctaatttcagcct 4
pta引物 atcg<u>actagt</u>ggcagagttttcggggttgac 5
此外，合成用于扩增pta-ackA操纵子的启动子区的引物(SEQ ID NO:3和4)，并且使用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的染色体DNA作为模板通过PCR扩增具有大约350bp大小的启动子区。具体而言，PCR在下列条件下进行：94℃下变性5min；94℃下变性30sec、56℃下退火30sec和72℃下聚合90sec的30个循环；和72℃下聚合7min。多核苷酸序列中的下划线部分表示限制性位点。
分别用限制酶SpeI和NdeI处理PCR扩增的DNA片段以获得DNA区段。由此获得的DNA区段被连接入具有SpeI末端的pDZTN载体，转化入大肠杆菌DH5α，并且平板接种在包含卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择转化有载体——其中插入靶基因——的菌落，通过常规已知的质粒提取方法获得质粒，并且由此获得的质粒被命名为pDZTN-Ppta_ackA。
为了制备用于进一步插入pta基因的载体，合成pta基因的ORF末端区处的引物(SEQ ID NO:5)，并且使用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的染色体作为模板连同引物(SEQ IDNO:3和5)——用于扩增横跨从启动子至pta基因的ORF末端的区域——通过PCR扩增具有大约1750bp大小的pta基因区。具体而言，PCR在下列条件下进行：94℃下变性5min；94℃下变性30sec、56℃下退火30sec和72℃下聚合90sec的30个循环；和72℃下聚合7min。
用限制酶SpeI处理PCR扩增的DNA片段以获得DNA区段。由此获得的DNA区段被连接入具有SpeI末端的pDZTN载体以获得质粒，并且该质粒被命名为pDZTN-pta。
为了制备用于同时插入操纵子形式的两个基因的载体，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体作为模板连同引物(SEQ ID NO:3和2)——其用于扩增横跨从pta-ackA基因操纵子(SEQ ID NO:10)的预测的启动子区至ackA基因的ORF末端的区域——通过PCR获得具有大约3000bp大小的pta-ackA基因区。具体而言，PCR在下列条件下进行：94℃下变性5min；94℃下变性30sec、56℃下退火30sec和72℃下聚合3min的30个循环；和72℃下聚合7min。用限制酶SpeI处理PCR扩增的DNA片段以获得DNA区段。由此获得的DNA区段被连接入具有SpeI末端的pDZTN载体以获得质粒，并且该质粒被命名为pDZTN-pta-ackA。
实施例2：分析在染色体上具有插入的ackA和/或pta基因的菌株的乙酸-利用能力
在实施例1中制备的三种载体，即，pDZTN-Ppta_ackA、pDZTN-pta和pDZTN-pta-ackA，通过电脉冲方法被转化入谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(该微生物原始公开为KFCC10881，再保藏至布达佩斯条约下的国际保藏机构并且给予登录号KCCM11016P；韩国专利号10-0159812和10-0397322)，并且通过PCR选择性地分离菌株——其中靶基因通过同源重组在染色体上插入——并且命名为KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)、KCCM11016P::pta(Tn)和KCCM11016P::pta-ackA(Tn)。
三种菌株和对照组被接种入包含25mL的种子培养基的250mL角挡板瓶(corner-baffle flask)，并且在200rpm的振荡下30℃培养20小时。然后，1mL的种子培养溶液被接种入包含24mL的生产培养基的250mL角挡板瓶，并且在200rpm的振荡下37℃培养96小时。在培养期间每12小时收集培养基并且分析在培养基中保留的葡萄糖和乙酸的量和在562nm下的吸光度，并且结果显示在图1a和1b中。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖(20g)、(NH4)2SO4(10g)、蛋白胨(10g)、酵母提取物(5g)、脲(1.5g)、KH2PO4(4g)、K2HPO4(8g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、硫胺素HCl(1000μg)、钙-泛酸(2000μg)和烟酰胺(2000μg)(基于1L的蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖(100g)、乙酸铵(7.1g)(添加或不添加)、(NH4)2SO4(40g)、大豆蛋白(2.5g)、玉米浆固体(5g)、脲(3g)、KH2PO4(1g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、硫胺素HCl(1000μg)、钙-泛酸(2000μg)、烟酰胺(3000μg)和CaCO3(30g)(基于1L的蒸馏水)
如图1a中所示，与亲本菌株KCCM11016P不同，KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)菌株在不含乙酸的培养基中产生乙酸同时消耗葡萄糖，并且在消耗所有葡萄糖后消耗乙酸。由此结果确认了乙酸激酶参与乙酸的生产。额外地，观察到培养速率在产生乙酸之后延迟。
然而，如图1b中所示，与KCCM11016P菌株(对照组)相比，当在含有乙酸的培养基中培养时，KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)菌株显示出在培养的初始阶段更快速的乙酸消耗的特征，并且结果，菌株生长中的滞后期与对照组相比显著地减小。KCCM11016P::pta(Tn)菌株没有显示与对照组相比乙酸消耗速率的显著差异。然而，确认了与KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)菌株——其中仅ackA基因被引入——相比，KCCM11016P::pta-ackA(Tn)菌株——其中两个基因以操纵子的形式均被引入——显示出乙酸消耗速率的轻微增加。
由上面的结果确认了由ackA基因编码的乙酸激酶是乙酸的生产或激活中的主要酶，并且当乙酸在培养基中不存在时其参与乙酸的生产，然而当乙酸在培养基中存在时，其用于乙酸激活途径。额外地，确认了ackA的过表达可以由于激活途径的增强显著地增加乙酸-利用能力同时减少生长抑制，从而可能减小滞后期。
实施例3：通过强启动子过表达ackA基因的菌株的制备和其效果的确认
为了通过过表达ackA基因再确认乙酸-利用能力和其效果，做出尝试来诱导使用lysCP1启动子(韩国专利号10-0930203)——其是先前报道的强启动子——进一步插入的ackA基因的表达。在本公开内容的实施例中使用的引物在下面的表2中显示。
使用在实施例1中描述的pDZTn载体作为基础载体制备用于插入染色体的载体。基于先前报道的多核苷酸序列合成用于扩增lysCP1启动子区的引物(SEQ ID NO:6和7)，并且使用谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P-lysCP1(韩国专利号10-0930203)的染色体DNA作为模板通过PCR获得具有大约450bp大小的DNA区段。具体而言，PCR在下列条件下进行：94℃下变性5min；94℃下变性30sec、56℃下退火30sec和72℃下聚合30sec的30个循环；和72℃下聚合7min。
[表2]
引物 序列 SEQ ID NO
lysCP1引物1 gttc<u>ctcgag</u>tactgtttgtaagaaatatg 6
lysCP1引物2 atgc<u>catatgctttgtgcacctttcgatct</u> 7
分别用限制酶XhoI和NdeI处理PCR扩增的DNA片段以获得DNA区段。由此获得的DNA片段，连同在实施例1中制备的具有NdeI和SpeI末端的在ackA基因的ORF区周围的DNA片段，被连接入具有XhoI和SpeI末端的pDZTN载体，转化入大肠杆菌DH5α，并且平板接种在包含卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择转化有载体——其中插入靶基因——的菌落，通过常规已知的质粒提取方法获得质粒，并且由此获得的质粒被命名为pDZTN-lysCP1_ackA(图2)。
由此制备的载体pDZTN-lysCP1_ackA通过同源重组被转化入谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P，其产生L-赖氨酸。然后，选择性地分离菌落——其中pDZTN-lysCP1_ackA通过PCR被整合入染色体——并且命名为KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)。
KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)菌株、KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)菌株和KCCM11016P菌株(对照组)以与实施例2中相同的方式培养，并且每12小时分析在培养基中保留的乙酸的量。结果显示在图3中。
结果，如实施例2的结果中所示，与对照组相比，KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)菌株显示出提高的乙酸-利用能力。额外地，确认了与KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)菌株相比，KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)菌株显示出增加的乙酸消耗速率。
上面的结果指示乙酸-利用速率随着ackA基因表达量增加而增加，并且由该结果再确认ackA基因的过表达是增加乙酸-利用能力的主要原因。
实施例4：分析过表达ackA基因的菌株的赖氨酸-生产能力
为了确认在实施例3中制备的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)菌株的赖氨酸-生产能力，谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)菌株连同KCCM11016P菌株(对照组)以与实施例2中相同的方式培养。在完成培养之后，通过HPLC分析L-赖氨酸浓度并且结果显示在下面的表3中。
[表3]
Figure GDA0001220650710000151
Figure GDA0001220650710000161
结果，如表3中所示，当使用葡萄糖作为唯一的碳源而不添加乙酸培养菌株时，KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)菌株显示出与对照组相同水平的赖氨酸-生产能力。然而，确认了当菌株在含乙酸的培养基中培养时，KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)菌株显示出与对照组相比赖氨酸产率(总碳源产率＝赖氨酸浓度/((葡萄糖+乙酸)的增加量)的12％的平均增加。
上面的结果支持乙酸激活途径的增强不仅增加乙酸-利用能力而且增加L-赖氨酸-生产能力。额外地，这些结果表明当乙酸被用作碳源时，使用本公开内容的具有增强的ackA基因的菌株可以以高产率生产赖氨酸，同时减少培养时间而不抑制细胞生长。
在这些情况下，本发明人将具有增加的乙酸-利用能力和L-赖氨酸-生产能力的KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)菌株命名为谷氨酸棒状杆菌“CA01-2278”，其以保藏号KCCM11480P保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)中。
实施例5：引入有acs基因的菌株的制备和该菌株效果的分析
为了将源自埃希氏杆菌的乙酸激活途径插入棒状杆菌的染色体，在获得acs基因(SEQ ID NO:11)——其被称为源自埃希氏杆菌的乙酸激活途径——后，使用在实施例1中提及的pDZTn载体作为基础载体制备用于插入染色体的载体。通过将源自棒状杆菌的pta-ackA基因的启动子可操作地连接入acs基因的起始密码子的上游区来诱导表达。在本公开内容中使用的引物显示在下面的表4中。
基于先前报道的多核苷酸序列合成用于扩增acs基因区的引物(SEQ ID NO:8和9)，并且使用大肠杆菌W(ATCC9637)菌株的染色体作为模板通过PCR扩增具有大约2000bp大小的acs基因的ORF区。具体而言，PCR在下列条件下进行：94℃下变性5min；94℃下变性30sec、56℃下退火30sec和72℃下聚合2min的30个循环；和72℃下聚合7min。
[表4]
引物 序列 SEQ ID NO
acs引物1 atcg<u>catatgagccaaattcacaaacac</u> 8
acs引物2 atcg<u>actagtttatgggagaaggttaacgctcgg</u> 9
用限制酶SpeI和NdeI处理PCR扩增的DNA片段，连同在实施例5中获得的pta_ackA操纵子的启动子的DNA片段，以获得每个DNA区段。由此获得的DNA区段被连接入具有SpeI末端的pDZTN载体，转化入大肠杆菌DH5α，并且平板接种在包含卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择转化有载体——其中插入靶基因——的菌落，通过常规已知的质粒提取方法获得质粒，并且由此获得的质粒被命名为pDZTN-Ppta-acs。
由此制备的载体通过电脉冲方法被转化入在实施例2中制备的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)，并且选择其中acs基因通过同源重组被插入染色体的菌株。具体而言，通过PCR选择性地分离那些菌落——其中acs基因被插入转座子，该转座子不同于其中Ppta_ackA基因先前被插入的转座子——并且命名为KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn)。
KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn)菌株和KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)菌株(对照组)以与实施例2中相同的方式培养，并且每12小时分析在培养基中保留的乙酸的量。
结果，确认了KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn)菌株显示出与对照组相比乙酸消耗速率的轻微增加(图3)。
结果表明在棒状杆菌属的微生物中，不仅ackA基因的过表达而且acs基因——其是源自埃希氏杆菌的外源基因——的引入，可以增加乙酸消耗速率和L-赖氨酸-生产能力。
实施例7：比较菌株的L-赖氨酸-生产能力，所述菌株过表达源自产L-赖氨酸菌株 的ackA基因
为了确认通过ackA-过表达菌株增强赖氨酸生产的效果，比较源自棒状杆菌的多种产赖氨酸菌株的L-赖氨酸-生产能力。
ackA基因被引入三种代表性产赖氨酸菌株——谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P(韩国专利号10-0924065)、KCCM11347P(该微生物原始公开为KFCC10750并且再保藏至布达佩斯条约下的国际保藏机构并且给予登录号KCCM11347P；韩国专利号10-0073610)和CJ3P(Binder等Genome Biology 2012,13:R40)，并且比较它们的L-赖氨酸生产能力。
在实施例3中制备的载体pDZTN-lysCP1_ackA在染色体上通过同源重组被分别转化入谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P、KCCM11347P和CJ3P。然后，通过PCR选择性地分离菌落，并且每个菌株被分别命名为KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn)、KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn)和CJ3P::lysCP1_ackA(Tn)。
对于上面的菌株的赖氨酸-生产能力的比较，以与实施例2中相同的方式培养菌株连同每个对照组。在完成培养之后，通过HPLC分析L-赖氨酸浓度并且结果显示在下面的表5中。
[表5]
Figure GDA0001220650710000181
Figure GDA0001220650710000191
结果，如表5中所示，源自产赖氨酸菌株的所有ackA-过表达菌株显示出L-赖氨酸-生产能力的增加。KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn)菌株显示出与KCCM10770P菌株(对照组)相比赖氨酸浓度的大约11％的增加。KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn)菌株显示出与KCCM11347P菌株(对照组)相比赖氨酸浓度的大约10％的增加。CJ3P::lysCP1_ackA(Tn)菌株显示出与CJ3P菌株(对照组)相比赖氨酸浓度的大约11％的增加。
因此，由上面的结果确认了源自谷氨酸棒状杆菌的多种类型的产L-赖氨酸菌株中的乙酸激酶的活性的增加具有增加L-赖氨酸-生产能力的效果。
根据上文，本发明所属技术领域的技术人员将能够理解本发明可以以其它具体的形式呈现，而不修改本发明的技术概念或基本特性。在这一点上，本文公开的示例性实施方式仅出于说明性目的并且不应当解释为限制本发明的范围。相反，本发明意欲不仅覆盖示例性实施方式，而且覆盖可以包括在如通过所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的多种替代选择、修改、等价物和其它实施方式。
Figure GDA0001220650710000201
Figure IPA0000233845360000011
Figure IPA0000233845360000021
Figure IPA0000233845360000031
Figure IPA0000233845360000041
Figure IPA0000233845360000051
Figure IPA0000233845360000061
Figure IPA0000233845360000071
Figure IPA0000233845360000081
Figure IPA0000233845360000091
Figure IPA0000233845360000101
Figure IPA0000233845360000111
Figure IPA0000233845360000121

Claims (6)

1.具有增强的产L-赖氨酸能力的棒状杆菌属的重组微生物，其中乙酸激酶的活性与其内源活性相比被增强，其中所述乙酸激酶以SEQ ID NO:12的氨基酸序列陈述。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中，额外地，
(i)磷酸转乙酰酶的活性与其内源活性相比被增强；
(ii)乙酰CoA合成酶的活性被引入或增强；或
(iii)磷酸转乙酰酶的活性与其内源活性相比被增强并且乙酰CoA合成酶的活性被引入或增强。
3.根据权利要求2所述的微生物，其中所述磷酸转乙酰酶以SEQ ID NO:13的氨基酸序列陈述。
4.根据权利要求2所述的微生物，其中所述乙酰CoA合成酶以SEQ ID NO:14的氨基酸序列陈述。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌。
6.用于生产L-赖氨酸的方法，其包括：
(i)在培养基中培养产L-赖氨酸的棒状杆菌属的重组微生物，其中乙酸激酶的活性与其内源活性相比被增强；和
(ii)从培养的微生物或培养基中回收L-赖氨酸。
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