KR20150117337A - Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 - Google Patents

Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아세트산 키나아제 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-라이신 생산 방법 {A microorganism having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same}
본 발명은 L-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 속 균주는 탄소원으로서 글루코즈 (glucose), 수크로즈 (sucrose), 프락토즈 (fructose) 뿐만 아니라 글루콘산 (gluconate), 아세트산 (acetate), 피루브산 (pyruvate)과 같은 유기산을 이용할 수 있다. 이 중 아세트산은 모노카르복실산에 속하는 유기산으로서 코리네박테리움 속 미생물이 이용시 수동 확산 (passive difusion) 또는 모노카르복실산 트랜스포터 (MctC, monocarboxylic acid transporter)에 의해 세포 내로 유입되고 아세트산 키나아제 (acetate kinase, ackA)에 의해 인산화되어, 인산아세틸(acetyl phosphate)로 전환된 후 포스포트랜스아세틸라아제 (phosphotransacetylase, pta)에 의해 아세틸-CoA (acetyl coenzymeA)를 생성한다. 생성된 아세틸-CoA는 바로 TCA (tricarboxylic acid) 회로와 글리옥실산 (glyoxylate) 회로에 유입되고 (J. Bacteriol. 2009. 191:940-948), 라이신의 전구체인 옥살로아세트산 (oxaloacetate)을 생성하게 된다.
하지만 코리네박테리움 속 균주에서 아세트산을 단독 혹은 혼합 탄소원으로 사용하여 배양할 경우 그 농도에 따라 생장 저해 현상이 나타날 수 있는 문제점이 있다. 아세트산의 대사 속도가 글루코즈와 같은 당류와 비교하여 느린 것뿐만 아니라 세포 내에서 일정 농도 이상 존재시 세포의 생장을 저해할 수 있으므로, 배양액 내 아세트산 농도가 증가할수록 유도기 (lag phase)가 길어짐에 따라 전체적인 배양 시간이 지연된다는 한계점이 있어 왔다 (Arch. Microbiol. 1991. 155:505-510). 이에, 배양액 내의 아세트산을 빠르게 세포 내 아세틸-CoA로 전환시키는 방법의 필요성이 대두되고 있다.
그러나, 아세트산 활성화 경로에 이용되는 아세트산 키나아제 및 포스포트랜스아세틸라아제는 양 방향성을 갖고 있어서 (가역반응), 아세틸-CoA가 다시 아세트산으로 전환될 수 있는 문제점이 있으며, L-라이신의 생성에 부정적인 영향이 있을 수 있음이 보고되고 있는바, 효과적인 아세트산 이용 방법의 개발은 여전히 미진한 상태이다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 발효 과정 중에 생성되는 아세트산 또는 새로운 탄소원으로 제공되는 아세트산의 효율적인 이용을 위한 미생물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 아세트산 활성화 경로상의 아세트산 키나아제 활성을 강화시킨 미생물이 아세트산 이용능과 L-라이신 생산능이 증가한 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 아세트산 키나아제 (Acetate kinase) 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 미생물을 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 아세트산 이용능이 증가된, L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다. 구체적으로, 상기 미생물은 아세트산 키나아제 (Acetate kinase) 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물이다.
본 발명에서 용어, "L-라이신"이란 염기성 α-아미노산의 하나로 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며, 화학식은 NH2(CH2)4CH(NH2)COOH인 L-아미노산의 일종을 의미한다.
아세트산은 모노카르복실산에 속하는 유기산으로서 코리네박테리움 속 미생물이 이용시 수동 확산 또는 모노카르복실산 트랜스포터에 의해 세포 내로 유입되고 아세트산 키나아제에 의해 인산화되어, 인산아세틸로 전환된 후 포스포트랜스아세틸라아제에 의해 아세틸-CoA를 생성한다. 생성된 아세틸-CoA는 바로 TCA (tricarboxylic acid) 회로와 글리옥실산 (glyoxylate) 회로에 유입되고, 라이신의 전구체인 옥살로아세트산 (oxaloacetate)을 생성하게 된다. 한편, 아세트산은 코리네박테리움 속 미생물에서 탄소원으로 이용될 수 있지만, 아세트산을 단독 혹은 혼합 탄소원으로 사용하여 배양할 경우, 그 농도에 따라 생장 저해 현상이 나타나는 단점이 있었다(Arch. Microbiol. 1991. 155:505-510).
세포 내에서의 아세트산을 아세틸-CoA로 전환시키는 아세트산 활성화 (activation) 경로로는 크게 두가지 경로가 있는데, 앞서 언급한 바와 같이 코리네박테리움 속 균주에서는 아세트산 키나아제와 포스포트랜스아세틸라아제의 두 효소가 순차적으로 작동한다. 아세트산 키나아제를 코딩하는 유전자로는 ackA, 포스포트랜스아세틸라아제를 코딩하는 유전자로서 pta가 밝혀져 있다 (Microbiol. 1999 145:503-513). 또 다른 경로로는 에세리키아 속 균주에서 아세틸-CoA 신테타아제 (acetyl-coA synthetase)가 관여하는데 이를 코딩하는 유전자로서 acs가 밝혀져 있다 (Appl Microbiol Biotechnol. 2006 71:870-4). 그러나, 코리네박테리움 속의 활성화 경로의 경우 가역적인 반응에 의한 것이므로, 이의 경로를 단순히 강화시키고자 하는 시도는 없었다.
그러나, 놀랍게도 본 발명자들은 아세트산 키나아제의 활성 강화 시, 세포 내에서의 아세트산이 빠르게 아세틸-CoA로 전환될 뿐 아니라, 상기와 같은 생장 저해 단점이 극복되고, L-아미노산 생산능이 증가되는 것을 확인하였으며, 이에 따라 아세트산 키나아제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, L-라이신 생산능을 갖는 신규한 코리네박테리움 속 미생물을 제공할 수 있었다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, ackA 유전자의 활성이 강화된 미생물의 아세트산 소모 속도가 빠르며, 균주의 생장에 있어서도 유도기가 대폭 줄어든 것을 확인하였다. 반면, pta 유전자의 활성이 강화된 경우에는 아세트산 소모 속도가 대조구와 큰 차이가 없는 것을 확인하여 (도 1), 아세트산 활성화에 의해 아세트산 이용능 증가 및 생장 저해 없이 L-라이신 생산능 증가에 중요한 단백질은 아세트산 키나아제임을 확인하였다. 즉, 상기와 같은 결과로부터 다양한 공지의 방법에 의해 아세트산 키나아제의 활성을 강화시키면 아세트산 이용능 증가 및 생장 저해 없는, L-라이신을 고수율로 생성할 수 있는 미생물을 제조할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 상기 아세트산 이용능이 증가하고, L-라이신 생산능이 증가된, 코리네박테리움 속 미생물은 아세트산 키나아제 (Acetate kinase) 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
또한, 상기 아세트산 이용능이 증가하고, L-라이신 생산능이 증가된, 코리네박테리움 속 미생물은 아세트산 키나아제 (Acetate kinase) 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, 미생물에 추가적으로 (i) 포스포트랜스아세틸라아제 (Phosphotrasnacetylase) 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화; (ii) 아세틸-CoA 신테타아제 (Acetyl-CoA synthetase) 단백질 활성이 도입 또는 강화; 또는 (iii) 포스포트랜스아세틸라아제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화, 및 아세틸-CoA 신테타아제 단백질 활성이 도입 또는 강화된 미생물일 수 있다.
본 발명자들은 아세트산 이용능 증가 및 L-라이신 생산능 증가에 가장 중요한 아세트산 키나아제 (Acetate kinase) 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 미생물에 추가적으로 포스포트랜스아세틸라아제를 내재적 활성에 비하여 강화시키거나, 및/또는 아세틸-CoA 신테타아제 (Acetyl-CoA synthetase) 단백질 활성이 도입 또는 강화된 경우 아세트산 이용능이 보다 증가되는 것을 확인하였으며, 이에 신규한 상기 미생물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 에세리키아 속 균주 유래의 아세틸-CoA를 코딩하는 유전자인 acs를 추가적으로 도입할 경우 아세트산 소모 속도가 증가하는 것을 확인하였으며 (도 3), 이와 같은 결과는 아세틸-CoA 신테타아제 단백질 활성의 도입 또는 강화 역시 아세트산 소모 속도를 증가시켜 L-라이신 생산능을 증가시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명에서 용어, "아세트산 키나아제 (acetate kinase, EC 2.7.2.1)"는 아세트산을 인산화하여 인산아세틸 (acetyl phosphate)을 생성하는 기능을 가진 효소를 의미한다. 상기 아세트산 키나아제를 코딩하는 유전자는 ackA로 통칭될 수 있으며, 상기 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 아세트산 키나아제 단백질은 그 예로 서열번호 12의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 아세트산 키나아제 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "포스포트랜스아세틸라아제 (phosphotransacetylase, EC 2.3.1.8)"는 하기 반응식에 의해 인산아세틸을 아세틸-CoA로 전환하는 기능을 가진 효소를 의미한다.
CoA + 인산아세틸 (acetyl phosphate) ↔ 아세틸-CoA + 인산 (Phosphate)
상기 포스포트랜스아세틸라아제는 포스페이트 아세틸트랜스퍼라아제 (phophate acetyltransferase), 또는 포스포아실레이즈(phosphoacylase) 등과 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 포스포트랜스아세틸라아제를 코딩하는 유전자는 pta로 통칭될 수 있으며, 상기 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 포스포트랜스아세틸라아제 단백질은 그 예로 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 포스포트랜스아세틸라아제 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "아세틸-CoA 신테타아제 (acetyl-CoA synthetase, EC 6.2.1.1)"는 하기 반응식에 의해 아세테이트를 아세틸-CoA로 합성하는 활성을 가진 효소를 의미한다.
아세테이트 + CoA ↔ 아세틸-CoA
상기 아세틸-CoA 신테타아제를 코딩하는 유전자는 acs로 통칭될 수 있으며, 상기 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 아세틸-CoA 신테타아제 단백질은 그 예로 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 아세틸-CoA 신테타아제 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 각 단백질은 상기 각 서열번호로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
아울러, 본 발명의 상기 각 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 각 서열번호로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 본래 미생물이 비변형 상태, 즉 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성 상태를 의미한다.
본 발명에서 용어, "단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화"한다는 것은, 미생물이 그 단백질의 활성을 보유하고 있는 상태에 비하여 세포 내 활성을 향상시키도록 변형시킴으로써 상기 단백질의 세포 내 활성을 증가시키는 것을 의미한다. 또한, 본 발명에서 용어, "단백질 활성의 강화"는 내재적 활성에 비하여 강화되는 것 뿐만 아니라, 특정 단백질 활성을 가지고 있지 않은 미생물에 그 단백질 활성이 부여된 후, 이의 세포 내 활성을 더욱 향상시키도록 변형시킴으로써, 상기 단백질의 세포 내 활성을 증가시키는 것을 의미한다.
이와 같은 "강화"는 단백질 자체의 활성이 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐 아니라, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 단백질의 활성이 증가하도록 돌연변이된 유전자로 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 단백질의 활성이 강화되도록 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있으나, 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화시킬 수 있거나, 도입된 활성을 강화시킬 수 있는 공지의 방법은 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어, "단백질 활성을 도입 "한다는 것은, 특정 단백질 활성을 가지고 있지 않은 미생물에 그 단백질의 활성을 부여하는 것을 의미한다.
이러한 "단백질 활성을 도입"한다는 것은, 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있는데, 예를 들어 상기 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법 등으로 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가 방법, 상기 단백질을 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나, 프로모터에 변이를 준 상기 단백질을 도입하는 방법, 상기 단백질을 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법 등을 사용할 수 있으나, 단백질 활성을 도입시킬 수 있는 공지의 방법은 제한 없이 포함된다.
상기에서 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λⅨII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 그 예로 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
또한, 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 또는 염색체 내에 도입시키고자 하는 외래 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 본 발명의 목적상 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열에 변이를 도입하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상류에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있다. 이종 프로모터의 예로는 pcj7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 프로모터, aceB 프로모터 등이 있으며, 코리네박테리움 유래의 프로모터인 pcj7 프로모터 또는 lysCP1 프로모터를 사용함이 바람직할 수 있다. 이와 같은 lysCP1 프로모터의 서열 및 제조 방법은 대한민국 등록특허 제10-0930203호에 기재되어 있으며, 상기 특허는 그 전체가 본 발명의 참조예로 포함된다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 강력한 프로모터인 lysCP1 프로모터에 ackA 유전자 연결시 대조구 대비 향상된 아세트산 이용능을 확인하였으며 (도 3), 이와 같은 결과는 ackA 유전자의 발현량이 증가할수록 아세트산 이용 속도가 증가하는 것을 시사하는 것이다.
이에, lysCP1 프로모터에 의해 ackA 유전자가 과발현되어, 아세트산 이용능 증가 및 L-라이신 생산능이 증가한 KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 "CA01-2278"로 명명하고, 2013년 11월 22일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 기탁하여, 기탁번호 KCCM11480P를 부여받았다. 따라서, 본 발명의 상기 아세트산 이용능이 증가하고 L-라이신 생산능이 증가한 코리네박테리움 속 미생물은 기탁번호 KCCM11480P의 미생물을 포함할 수 있다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 도입 또는 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "L-라이신 생산능을 갖는 미생물"은 본 발명의 목적상 L-라이신을 생산할 수 있는 미생물 균주로서, 본 발명에 따른 조작에 의해 배지 내의 아세트산을 효율적으로 이용하여 생장 속도의 저해 없이 L-아세트산을 축적할 수 있는 균주를 의미한다. 상기 미생물은 본 발명의 아세트산 키나아제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있으며, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 또는 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium fermentum) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그 한 예로, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 사용할 수 있고, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰의 구체적인 예로는 KCCM11016P (대한민국 등록특허 제10-0397322호), KCCM10770P (대한민국 등록특허 제10-0924065호), KCCM11347P (대한민국 등록특허 제10-0073610호) 또는 CJ3P　(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)를 사용할 수 있지만, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 대표적인 코리네박테리움 속 미생물로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P를 모균주로 하여, ackA 유전자의 과발현시 아세트산 이용능이 증가되고, 생장 저해 현상 없이, L-라이신 생산량이 증가되는 것을 확인하였다 (실시예 2 내지 실시예 6). 아울러, 다양한 코리네박테리움 속 미생물인 KCCM10770P, KCCM11347P 또는 CJ3P에서 ackA 유전자의 과발현시에도 역시 L-라이신 생산능이 증가한 것을 확인하였으며 (실시예 7), 이와 같은 결과는 ackA 유전자가 코딩하는 아세트산 키나아제가 아세트산 이용에 사용되는 코리네박테리움 속 미생물에서는 상기 단백질 활성 강화에 의해서 L-라이신 생산능이 증가되는 것을 시사하는 것이다. 또한, ackA 유전자가 코딩하는 아세트산 키나아제 활성 강화에 추가적으로 포스포트랜스아세틸라아제 활성의 강화, 또는/및 아세틸-CoA 활성의 도입 또는 강화 역시 아세트산 이용능 및 L-라이신 생산능을 증가시킴을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 상기 신규한 아세트산 이용능이 증가되어, L-라이신 생산능이 증가된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (ii) 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 생산 방법을 제공한다.
상기 L-라이신 생산능이 증가된 코리네박테리움 속 미생물은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 코리네박테리아 속 미생물을 이용하여 L-라이신을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 글루콘산, 아세트산, 피루브산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌 ("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃일 수 있으나, 조건에 따라 변경이 가능하다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속할 수 있다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성될 수 있다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 L-라이신을 생산하는 방법은, 미생물 또는 배양물로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 미생물 또는 배양물로부터 L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 미생물은 아세트산 활성화 경로가 강화되어 아세트산 이용능이 증가한 균주로서, 탄소원으로 아세트산 사용시 높은 수율로 L-라이신을 생산할 수 있는 미생물로, 제조된 L-라이신은 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제, 의약품 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.
도 1은 대조구인 KCCM11016P와 pta, pta - ack 가 도입된 KCCM11016P 변이주의 아세트산 이용능을 분석한 도이다.
도 2는 강력한 프로모터인 LysCP1 프로모터에 의해 ackA를 과발현시키기 위한 벡터인 pDZTn-lysCP1-ackA를 나타낸 도이다.
도 3는 대조구인 KCCM11016P와 pta, pta - ack , acs가 도입된 KCCM11016P 변이주의 아세트산 이용능을 분석한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: ackA , pta 또는 pta 및 ackA 염색체 추가 삽입용 벡터 제작
코리네박테리움 염색체 상에 ackA 유전자와 pta 유전자를 각각 또는 동시에 추가 삽입하기 위한 벡터를 제작하기 위하여 트랜스포존 유전자 위치에 목적 유전자를 삽입할 수 있도록 pDZ 벡터로부터 고안된 pDZTN 벡터(대한민국 등록특허 제10-1126041호)를 기본 벡터로 사용하였다. 두 유전자는 염색체상에서 pta-ackA 형태의 오페론을 이루고 있으므로, 추가 삽입할 ackA 유전자의 단독 과발현을 위하여 pta-ackA 오페론의 프로모터 부위를 ackA 유전자 ORF (open-reading frame)상단에 작동 가능하도록 연결하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타냈다.
ackA 유전자 추가 삽입용 벡터를 제작하기 위하여, 기 보고된 염기서열에 근거하여 ackA 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 1 및 2)를 합성하고 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 한 PCR을 통하여 약 1300 bp의 ackA 유전자 ORF 부위를 증폭하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다. 염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한 효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.
Figure pat00001
더불어 pta-ackA 오페론의 프로모터 부위를 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 3 및 4)를 합성하고 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 약 350 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다.
PCR로 증폭된 DNA 단편을 제한효소 SpeI과 NdeI으로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SpeI 말단을 가지는 pDZTN 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZTN-Ppta_ackA라 명명하였다.
pta 유전자 추가 삽입용 벡터를 제작하기 위하여, pta 유전자의 ORF 말단 부위의 프라이머 (서열번호 5)를 합성하고, pta 유전자 프로모터로부터 ORF 말단까지 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 3 및 5)를 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 한 PCR을 통하여 약 1750 bp의 pta 유전자 부위를 증폭하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다.
PCR로 증폭된 DNA 단편을 제한효소 SpeI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SpeI 말단을 가지는 pDZTN 벡터에 연결하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZTN-pta라 명명하였다.
두 유전자를 오페론 형태로 동시에 추가 삽입하기 위한 벡터로는 pta-ackA 유전자 오페론 (서열번호 10)의 프로모터 예상구간으로부터 ackA 유전자의 ORF 말단까지 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 3 및 2)를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체를 주형으로 한 PCR을 통하여 약 3000 bp의 pta-ackA 유전자 부위를 증폭하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 3분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다. DNA 단편을 제한효소 SpeI로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SpeI 말단을 가지는 pDZTN 벡터에 연결하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZTN-pta-ackA라 명명하였다.
실시예 2: ackA , pta 유전자 염색체 삽입 균주의 아세트산 이용능 분석
상기 실시예 1에서 제작한 3종의 벡터인 pDZTN-Ppta_ackA, pDZTN-pta, pDZTN-pta-ackA를 전기펄스법을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P (상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11016P로 기탁번호를 부여받았음, 대한민국 등록특허 제10-0159812호, 대한민국 등록특허 제10-0397322호)에 형질전환시키고, 상동 재조합에 의해 염색체상에 목적 유전자가 삽입된 균주를 PCR 방법으로 선택적으로 분리하고, KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn), KCCM11016P::pta(Tn), KCCM11016P::pta-ackA(Tn)이라고 명명하였다.
상기 3종의 균주와 대조구를 하기의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후, 1 ㎖의 종배양액을 하기의 생산배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 37℃에서 96시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 중 12시간마다 배양액을 채취하여 배양액 내 글루코즈, 아세트산의 잔량 및 562nm에서의 흡광도를 분석하여 도 1에 나타내었다.
< 종배지 ( pH 7.0)>
포도당 20 g, (NH4)2SO4 10 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1리터 기준)
< 생산배지 ( pH 7.0)>
포도당 100 g, 암모늄 아세트산 7.1g(첨가 혹은 비첨가), (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (cornsteep solid) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
도 1의 (A)에 나타내었듯이 KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) 균주는 아세트산을 첨가하지 않은 배지에서 모균주 KCCM11016P와 달리 글루코즈를 소모하는 중에 아세트산을 생성하였다가 글루코즈를 모두 소모한 후 아세트산을 소모하였다. 이로부터 아세트산 키나아제가 아세트산 생성에 관여하고 있음을 확인하였다. 또한 아세트산을 생성함과 동시에 배양 속도가 지연되는 현상을 관찰하였다.
그러나 도 1의 (B)에 나타내었듯이 아세트산을 첨가한 배지에서 배양하였을 때 KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) 균주는 배양 초반, 대조구인 KCCM11016P와 비교하여 아세트산을 오히려 빠르게 소모하는 양상을 나타내었고 이로 인해 균주의 생장에 있어 대조구 대비 유도기가 대폭 줄어들었다. KCCM11016P::pta(Tn) 균주는 아세트산 소모 속도에 있어 대조구와 큰 차이를 나타내지 않았다. 다만 두 유전자가 오페론 형태로 모두 도입된 KCCM11016P::pta-ackA(Tn) 균주는 ackA만 도입한 KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) 균주보다 아세트산 소모 속도가 소폭 증가함을 확인하였다.
상기 결과로부터 아세트산 생성 혹은 활성화에 있어서 ackA 유전자가 코딩하는 아세트산 키나아제가 주요 효소이며, 배지 내 아세트산이 없는 경우에는 아세트산 생성에 관여하지만, 배지 내 아세트산이 존재할 경우 아세트산 활성화 경로로 사용됨을 확인하였다. 또한 ackA 과발현시 활성화 경로 강화로 인해 아세트산 이용능이 크게 증가하고 아세트산에 의한 생장 저해가 감소하여 유도기가 줄어들 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 강력한 프로모터에 의한 ackA 유전자 과발현 균주 제작 및 효과 확인
ackA 유전자의 과발현시 아세트산 이용능 및 그 효과를 재확인하기 위하여 기 보고된 강력한 프로모터인 lysCP1 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0930203호)를 이용하여 추가 삽입하는 ackA 유전자의 발현을 유도하고자 하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머는 하기 표 2에 기재하였다.
실시예 1에서 기재한 pDZTn 벡터를 기본 벡터로 염색체 삽입용 벡터를 제작하였다. 기 보고된 염기서열에 근거하여 lysCP1 프로모터 부위를 증폭하기 위한 프라이머 (서열번호 6 및 7)를 합성하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-lysCP1 (대한민국 등록특허 제10-0930203호)의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 약 450 bp의 DNA 절편을 획득하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다.
Figure pat00002
PCR로 증폭된 DNA 단편을 제한효소 XhoI 과 NdeI으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후, 실시예 1에서 제작한 NdeI과 SpeI 말단을 가지는 ackA 유전자 ORF 부위의 DNA 절편과 함께 제한효소 XhoI과 SpeI 말단을 가지는 pDZTN 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZTN-lysCP1_ackA라 명명하였다 (도 2).
제작한 벡터 pDZTN-lysCP1_ackA를 염색체상에서의 상동 재조합에 의해 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시켰다. 그 후 PCR 방법으로 pDZTN-lysCP1_ackA가 염색체 상에 상동 재조합으로 삽입된 콜로니를 선택적으로 분리하고, KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)이라고 명명하였다.
KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) 균주와 KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) 및 대조구 KCCM11016P 균주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 12 시간마다 배양액 내 아세트산 잔량을 분석하여 도 3에 나타내었다.
그 결과, KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) 균주는 실시예 2에서 보여준 결과와 마찬가지로 대조구 대비 향상된 아세트산 이용능을 나타내었다. 또한 KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) 균주는 KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) 균주와 비교하여 아세트산 소모속도가 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과는, ackA 유전자의 발현량이 증가할수록 아세트산 이용 속도가 증가하는 결과로, 이로부터 ackA 유전자의 과발현이 아세트산 이용능 증가에 주요한 원인임을 다시 한번 확인하였다.
실시예 4: ackA 유전자 과발현 균주의 라이신 생산능 분석
상기 실시예 3에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) 균주의 라이신 생산능을 확인하기 위하여 대조구 KCCM11016P와 함께 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후 HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure pat00003
그 결과, 표 3에서 나타낸 바와 같이 아세트산을 첨가하지 않고 글루코즈만 탄소원으로 이용하여 배양한 경우, KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn)는 대조구와 동등 수준의 라이신 생산능을 나타내었다. 하지만 아세트산이 포함된 배지에서 배양하였을 경우, KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) 균주가 대조구 대비, 라이신 수율(총 탄소원 수율=라이신 농도/(글루코즈+아세트산 첨가량))이 평균 12%가 증가하는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 아세트산 활성화 경로가 강화될 경우 아세트산 이용능의 증가뿐만 아니라 L-라이신 생산능도 증가하는 것을 뒷받침하는 것이다. 또한, 이와 같은 결과는 탄소원으로 아세트산을 이용할 경우, 본 발명의 ack 유전자가 강화된 균주를 이용하면 세포의 생장 저해 없이 배양 시간을 단축함과 동시에 라이신을 고 수율로 생산할 수 있음을 시사하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 상기 아세트산 이용능 증가 및 L-라이신 생산능이 증가한 KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 "CA01-2278"로 명명하고, 2013년 11월 22일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여, 기탁번호 KCCM11480P를 부여받았다.
실시예 5: acs 유전자 도입 균주 제작 및 효과 분석
에세리키아 유래의 아세트산 활성화 경로를 코리네박테리움의 염색체상에 삽입하기 위하여 에세리키아 유래의 아세트산 활성화 경로로 알려진 acs 유전자 (서열번호 11)를 획득하여 실시예 1에서 언급한 pDZTn 벡터를 기본 벡터로 염색체 삽입용 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 유래 pta-ackA 유전자의 프로모터를 acs 유전자 개시코돈 상단에 작동가능하게 연결하여 발현을 유도하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머는 하기 표 4에 기재하였다.
기 보고된 염기서열에 근거하여 acs 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 8 및 9)를 합성하고 E.coli W 균주(ATCC9637)의 염색체를 주형으로 한 PCR을 통하여 약 2000 bp의 acs 유전자 ORF 부위를 증폭하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다.
Figure pat00004
실시예 1에서 사용한 pta-ackA 오페론의 프로모터 DNA 단편과 함께 제한효소 SpeI과 NdeI을 처리하여 각 DNA 절편을 획득한 후, 제한효소 SpeI 말단을 가지는 염색체 도입용 pDZTN 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 25 mg/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZTN-Ppta-acs라 명명하였다.
상기 제작한 벡터를 전기펄스법을 이용하여 실시예 2에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)에 형질전환시키고 상동 재조합에 의해 염색체 상에 acs 유전자가 삽입된 균주를 선별하였는데, 이 때 Ppta_ackA 유전자가 기 삽입된 트랜스포존과는 상이한 트랜스포존에 삽입된 콜로니를 PCR 방법으로 선택적으로 분리하고 KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn)이라고 명명하였다.
KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn) 균주 및 대조구 KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) 균주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 12 시간 마다 배양액 내 아세트산 잔량을 분석하였다.
그 결과, KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn) 균주가 대조구와 비교하여 아세트산 소모 속도가 소폭 증가함을 확인하였다 (도 3).
이와 같은 결과는, 코리네박테리움 속 미생물에 ackA 유전자 과발현 뿐 아니라, 에세리키아 속 유래의 외래 유전자인 acs 유전자 도입 역시 아세트산 소모 속도를 증가시키고, L-라이신의 생산능을 증가시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 7: L-라이신 생산 균주 유래의 ackA 유전자 과발현 균주의 L-라이신 생산능 비교
ackA 과발현 균주의 라이신 생산능 증가 효과를 확인하기 위하여, 코리네박테리움 속 유래의 다양한 라이신 생산 균주에 대하여 L-라이신 생산능을 비교하였다.
대표적인, 라이신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P (대한민국 등록특허 제10-0924065호), KCCM11347P (상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11347P를 부여 받았음. 대한민국 등록특허 제10-0073610호), CJ3P　(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40) 3종에 도입한 후 L-라이신 생산능을 비교하였다.
실시예 3에서 제작한 벡터 pDZTN-lysCP1_ackA를 염색체상에서의 상동 재조합에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P, KCCM11347P, CJ3P에 각각 형질전환시켰다. 그 후 PCR 방법으로 콜로니를 선택적으로 분리하고, 각 균주를 KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn), KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn), CJ3P::lysCP1_ackA(Tn)이라고 명명하였다.
상기 균주들의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 각 대조구와 함께 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후 HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도를 하기 표 5에 나타내었다.
Figure pat00005
그 결과, 표 5에서 나타낸 바와 같이 라이신 생산 균주 유래 ackA 과발현 균주는 모두 L-라이신 생산능이 증가하였다. KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn) 균주는 대조구 KCCM10770P와 비교하여 약 11% 가량 라이신 농도가 증가하였다. KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn) 균주는 대조구 KCCM11347P와 비교하여 약 10% 가량 라이신 농도가 증가하였다. CJ3P::lysCP1_ackA(Tn) 균주는 대조구 CJ3P와 비교하여 약 11% 가량 라이신 농도가 증가하였다.
따라서 상기의 결과들로부터 글루타미쿰 속 유래의 다양한 계열의 L-라이신 생산 균주들에서 아세트산 키나아제의 활성 증가는 L-라이신 생산능을 증가시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11480P 20131122
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same <130> PA131283/KR <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ackA primer 1 <400> 1 atcgcatatg gcattggcac ttgttttg 28 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ackA primer 2 <400> 2 atcgactagt atccgtgcag tttcacccct taaa 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppta primer 1 <400> 3 atcgactagt ctttgctggg gtcagatttg tcac 34 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppta primer 2 <400> 4 atcgcatatg tcgcctttct aatttcagcc t 31 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pta primer <400> 5 atcgactagt ggcagagttt tcggggttga c 31 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysCP1 primer 1 <400> 6 gttcctcgag tactgtttgt aagaaatatg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysCP1 primer 2 <400> 7 atgccatatg ctttgtgcac ctttcgatct 30 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acs primer 1 <400> 8 atcgcatatg agccaaattc acaaacac 28 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acs primer 2 <400> 9 atcgactagt ttatgggaga aggttaacgc tcgg 34 <210> 10 <211> 3007 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTA-ACKA <400> 10 ctttgctggg gtcagatttg tcacgctgcg cgctttcata gaccccatta atggggggtg 60 aagagctgta aagtaccgct aaaaactttg caaagggtgc ttcgcaactt gtaaccgctc 120 cgtattgttt tctacggcaa taagcatttg tgctgctcaa agcgtggaat tgagatcggt 180 ttgaaaatta caaaataaaa ctttgcaaac cgggctgtac gcaaggcgga cgaacgctaa 240 actatgtaag aaatcacaac ctcccctcat tagtgccagg aggcacaagc ctgaagtgtc 300 atcaatgaga aggttcaggc tgaaattaga aaggcgatgt atgtctgaca caccgacctc 360 agctctgatc accacggtca accgcagctt cgatggattc gatttggaag aagtagcagc 420 agaccttgga gttcggctca cctacctgcc cgacgaagaa ctagaagtat ccaaagttct 480 cgcggcggac ctcctcgctg aggggccagc 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tgctgcatac taccggcggt 840 tatctggtgt acgcggcgct gacctttaaa tatgtctttg attatcatcc gggtgatatc 900 tactggtgca ccgccgatgt gggctgggtg accggacaca gttacttgct gtacggcccg 960 ctggcctgcg gtgcgaccac gctgatgttt gaaggcgtac ccaactggcc gacgcctgcc 1020 cgtatggcgc aggtggtgga caagcatcag gtcaatattc tctataccgc acccacggcg 1080 atccgcgcgc tgatggcgga aggcgataaa gcgatcgaag gcaccgaccg ttcgtcgctg 1140 cgcattctcg gttccgtggg cgagccaatt aacccggaag cgtgggagtg gtactggaaa 1200 aaaatcggca acgagaaatg tccggtggtc gatacctggt ggcagaccga aaccggcggt 1260 ttcatgatca ccccgctgcc tggcgctacc gagctgaaag ccggttcggc aacacgtccg 1320 ttcttcggcg tgcaaccggc gctggtcgat aacgaaggta acccgctgga gggggccacc 1380 gaaggtagcc tggtaatcac cgactcctgg ccgggtcagg cgcgtacgct gtttggcgat 1440 cacgaacgtt ttgaacagac ctacttctcc accttcaaaa atatgtattt cagcggcgac 1500 ggcgcgcgtc gcgatgaaga tggctattac tggataaccg ggcgtgtgga cgacgtgctg 1560 aacgtctccg gtcaccgtct ggggacggca gagattgagt cggcgctggt ggcgcatccg 1620 aagattgccg aagccgccgt agtaggtatt ccgcacaata ttaaaggtca ggcgatctac 1680 gcctacgtca cgcttaatca cggggaggaa ccgtcaccag aactgtacgc agaagtccgc 1740 aactgggtgc gtaaagagat tggcccgctg gcgacgccag acgtgctgca ctggaccgac 1800 tccctgccta aaacccgctc cggcaaaatt atgcgccgta ttctgcgcaa aattgcggcg 1860 ggcgatacca gcaacctggg cgatacctcg acgcttgccg atcctggcgt agtcgagaag 1920 ctgcttgaag agaagcaggc tatcgcgatg ccatcgtaac ccacaattgc ccgatgcgag 1980 tcggtaacgg tttgtaggcc tgataagacg cgacagcgtc gcatcaggca ttgattgccg 2040 gatgcggcgt aaacgcctta tccggcctac attcggcaag ggttacccga gcgttaacct 2100 tctcccataa 2110 <210> 12 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetate kinase <400> 12 Met Ala Leu Ala Leu Val Leu Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Phe 1 5 10 15 Gln Leu Val Asn Pro Glu Asn Ser Ala Ile Asp Glu Pro Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Leu Val Glu Gln Ile Gly Glu Pro Asn Gly Arg Ile Val Leu Lys 35 40 45 Ile Glu Gly Glu Lys Tyr Thr Leu Glu Thr Pro Ile Ala Asp His Ser 50 55 60 Glu Gly Leu Asn Leu Ala Phe Asp Leu Met Asp Gln His Asn Cys Gly 65 70 75 80 Pro Ser Gln Leu Glu Ile Thr Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly 85 90 95 Gly Ile Leu Phe Ser Ala Pro Glu Leu Ile Thr Asp Glu Ile Val Glu 100 105 110 Met Ile Arg Asp Leu Ile Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn 115 120 125 Val Asp Gly Ile Asp Val Ala Arg Lys Ile Leu Pro Asp Val Pro His 130 135 140 Val Ala Val Phe Asp Thr Gly Phe Phe His Ser Leu Pro Pro Ala Ala 145 150 155 160 Ala Leu Tyr Ala Ile Asn Lys Asp Val Ala Ala Glu His Gly Ile Arg 165 170 175 Arg Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Glu Phe Val Ser Lys Arg Val 180 185 190 Val Glu Ile Leu Glu Lys Pro Thr Glu Asp Ile Asn Thr Ile Thr Phe 195 200 205 His Leu Gly Asn Gly Ala Ser Met Ala Ala Val Gln Gly Gly Arg Ala 210 215 220 Val Asp Thr Ser Met Gly Met Thr Pro Leu Ala Gly Leu Val Met Gly 225 230 235 240 Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Gly Ile Val Phe His Leu Ser Arg 245 250 255 Thr Ala Gly Met Ser Ile Asp Glu Ile Asp Asn Leu Leu Asn Lys Lys 260 265 270 Ser Gly Val Lys Gly Leu Ser Gly Val Asn Asp Phe Arg Glu Leu Arg 275 280 285 Glu Met Ile Asp Asn Asn Asp Gln Asp Ala Trp Ser Ala Tyr Asn Ile 290 295 300 Tyr Ile His Gln Leu Arg Arg Tyr Leu Gly Ser Tyr Met Val Ala Leu 305 310 315 320 Gly Arg Val Asp Thr Ile Val Phe Thr Ala Gly Val Gly Glu Asn Ala 325 330 335 Gln Phe Val Arg Glu Asp Ala Leu Ala Gly Leu Glu Met Tyr Gly Ile 340 345 350 Glu Ile Asp Pro Glu Arg Asn Ala Leu Pro Asn Asp Gly Pro Arg Leu 355 360 365 Ile Ser Thr Asp Ala Ser Lys Val Lys Val Phe Val Ile Pro Thr Asn 370 375 380 Glu Glu Leu Ala Ile Ala Arg Tyr Ala Val Lys Phe Ala 385 390 395 <210> 13 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphotrasnacetylase <400> 13 Met Ser Asp Thr Pro Thr Ser Ala Leu Ile Thr Thr Val Asn Arg Ser 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Asp Leu Glu Glu Val Ala Ala Asp Leu Gly Val Arg 20 25 30 Leu Thr Tyr Leu Pro Asp Glu Glu Leu Glu Val Ser Lys Val Leu Ala 35 40 45 Ala Asp Leu Leu Ala Glu Gly Pro Ala Leu Ile Ile Gly Val Gly Asn 50 55 60 Thr Phe Phe Asp Ala Gln Val Ala Ala Ala Leu Gly Val Pro Val Leu 65 70 75 80 Leu Leu Val Asp Lys Gln Gly Lys His Val Ala Leu Ala Arg Thr Gln 85 90 95 Val Asn Asn Ala Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Phe Thr Ala Glu Gln 100 105 110 Glu Pro Met Pro Asp Lys Leu Arg Lys Ala Val Arg Asn His Ser Asn 115 120 125 Leu Glu Pro Val Met Ser Ala Glu Leu Phe Glu Asn Trp Leu Leu Lys 130 135 140 Arg Ala Arg Ala Glu His Ser His Ile Val Leu Pro Glu Gly Asp Asp 145 150 155 160 Asp Arg Ile Leu Met Ala Ala His Gln Leu Leu Asp Gln Asp Ile Cys 165 170 175 Asp Ile Thr Ile Leu Gly Asp Pro Val Lys Ile Lys Glu Arg Ala Thr 180 185 190 Glu Leu Gly Leu His Leu Asn Thr Ala Tyr Leu Val Asn Pro Leu Thr 195 200 205 Asp Pro Arg Leu Glu Glu Phe Ala Glu Gln Phe Ala Glu Leu Arg Lys 210 215 220 Ser Lys Ser Val Thr Ile Asp Glu Ala Arg Glu Ile Met Lys Asp Ile 225 230 235 240 Ser Tyr Phe Gly Thr Met Met Val His Asn Gly Asp Ala Asp Gly Met 245 250 255 Val Ser Gly Ala Ala Asn Thr Thr Ala His Thr Ile Lys Pro Ser Phe 260 265 270 Gln Ile Ile Lys Thr Val Pro Glu Ala Ser Val Val Ser Ser Ile Phe 275 280 285 Leu Met Val Leu Arg Gly Arg Leu Trp Ala Phe Gly Asp Cys Ala Val 290 295 300 Asn Pro Asn Pro Thr Ala Glu Gln Leu Gly Glu Ile Ala Val Val Ser 305 310 315 320 Ala Lys Thr Ala Ala Gln Phe Gly Ile Asp Pro Arg Val Ala Ile Leu 325 330 335 Ser Tyr Ser Thr Gly Asn Ser Gly Gly Gly Ser Asp Val Asp Arg Ala 340 345 350 Ile Asp Ala Leu Ala Glu Ala Arg Arg Leu Asn Pro Glu Leu Cys Val 355 360 365 Asp Gly Pro Leu Gln Phe Asp Ala Ala Val Asp Pro Gly Val Ala Arg 370 375 380 Lys Lys Met Pro Asp Ser Asp Val Ala Gly Gln Ala Asn Val Phe Ile 385 390 395 400 Phe Pro Asp Leu Glu Ala Gly Asn Ile Gly Tyr Lys Thr Ala Gln Arg 405 410 415 Thr Gly His Ala Leu Ala Val Gly Pro Ile Leu Gln Gly Leu Asn Lys 420 425 430 Pro Val Asn Asp Leu Ser Arg Gly Ala Thr Val Pro Asp Ile Val Asn 435 440 445 Thr Val Ala Ile Thr Ala Ile Gln Ala Gly Gly Arg Ser 450 455 460 <210> 14 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetyl-CoA synthetase <400> 14 Met Ser Gln Ile His Lys His Thr Ile Pro Ala Asn Ile Ala Asp Arg 1 5 10 15 Cys Leu Ile Asn Pro Gln Gln Tyr Glu Ala Met Tyr Gln Gln Ser Ile 20 25 30 Asn Val Pro Asp Thr Phe Trp Gly Glu Gln Gly Lys Ile Leu Asp Trp 35 40 45 Ile Lys Pro Tyr Gln Lys Val Lys Asn Thr Ser Phe Ala Pro Gly Asn 50 55 60 Val Ser Ile Lys Trp Tyr Glu Asp Gly Thr Leu Asn Leu Ala Ala Asn 65 70 75 80 Cys Leu Asp Arg His Leu Gln Glu Asn Gly Asp Arg Thr Ala Ile Ile 85 90 95 Trp Glu Gly Asp Asp Ala Ser Gln Ser Lys His Ile Ser Tyr Lys Glu 100 105 110 Leu His Arg Asp Val Cys Arg Phe Ala Asn Thr Leu Leu Glu Leu Gly 115 120 125 Ile Lys Lys Gly Asp Val Val Ala Ile Tyr Met Pro Met Val Pro Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Met Leu Ala Cys Ala Arg Ile Gly Ala Val His Ser 145 150 155 160 Val Ile Phe Gly Gly Phe Ser Pro Glu Ala Val Ala Gly Arg Ile Ile 165 170 175 Asp Ser Asn Ser Arg Leu Val Ile Thr Ser Asp Glu Gly Val Arg Ala 180 185 190 Gly Arg Ser Ile Pro Leu Lys Lys Asn Val Asp Asp Ala Leu Lys Asn 195 200 205 Pro Asn Val Thr Ser Val Glu His Val Val Val Leu Lys Arg Thr Gly 210 215 220 Gly Lys Ile Asp Trp Gln Glu Gly Arg Asp Leu Trp Trp His Asp Leu 225 230 235 240 Val Glu Gln Ala Ser Asp Gln His Gln Ala Glu Glu Met Asn Ala Glu 245 250 255 Asp Pro Leu Phe Ile Leu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys Pro Lys 260 265 270 Gly Val Leu His Thr Thr Gly Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Ala Leu Thr 275 280 285 Phe Lys Tyr Val Phe Asp Tyr His Pro Gly Asp Ile Tyr Trp Cys Thr 290 295 300 Ala Asp Val Gly Trp Val Thr Gly His Ser Tyr Leu Leu Tyr Gly Pro 305 310 315 320 Leu Ala Cys Gly Ala Thr Thr Leu Met Phe Glu Gly Val Pro Asn Trp 325 330 335 Pro Thr Pro Ala Arg Met Ala Gln Val Val Asp Lys His Gln Val Asn 340 345 350 Ile Leu Tyr Thr Ala Pro Thr Ala Ile Arg Ala Leu Met Ala Glu Gly 355 360 365 Asp Lys Ala Ile Glu Gly Thr Asp Arg Ser Ser Leu Arg Ile Leu Gly 370 375 380 Ser Val Gly Glu Pro Ile Asn Pro Glu Ala Trp Glu Trp Tyr Trp Lys 385 390 395 400 Lys Ile Gly Asn Glu Lys Cys Pro Val Val Asp Thr Trp Trp Gln Thr 405 410 415 Glu Thr Gly Gly Phe Met Ile Thr Pro Leu Pro Gly Ala Thr Glu Leu 420 425 430 Lys Ala Gly Ser Ala Thr Arg Pro Phe Phe Gly Val Gln Pro Ala Leu 435 440 445 Val Asp Asn Glu Gly Asn Pro Leu Glu Gly Ala Thr Glu Gly Ser Leu 450 455 460 Val Ile Thr Asp Ser Trp Pro Gly Gln Ala Arg Thr Leu Phe Gly Asp 465 470 475 480 His Glu Arg Phe Glu Gln Thr Tyr Phe Ser Thr Phe Lys Asn Met Tyr 485 490 495 Phe Ser Gly Asp Gly Ala Arg Arg Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Trp Ile 500 505 510 Thr Gly Arg Val Asp Asp Val Leu Asn Val Ser Gly His Arg Leu Gly 515 520 525 Thr Ala Glu Ile Glu Ser Ala Leu Val Ala His Pro Lys Ile Ala Glu 530 535 540 Ala Ala Val Val Gly Ile Pro His Asn Ile Lys Gly Gln Ala Ile Tyr 545 550 555 560 Ala Tyr Val Thr Leu Asn His Gly Glu Glu Pro Ser Pro Glu Leu Tyr 565 570 575 Ala Glu Val Arg Asn Trp Val Arg Lys Glu Ile Gly Pro Leu Ala Thr 580 585 590 Pro Asp Val Leu His Trp Thr Asp Ser Leu Pro Lys Thr Arg Ser Gly 595 600 605 Lys Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg Lys Ile Ala Ala Gly Asp Thr Ser 610 615 620 Asn Leu Gly Asp Thr Ser Thr Leu Ala Asp Pro Gly Val Val Glu Lys 625 630 635 640 Leu Leu Glu Glu Lys Gln Ala Ile Ala Met Pro Ser 645 650

Claims (7)

  1. 아세트산 키나아제 (Acetate kinase) 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로
    (i) 포스포트랜스아세틸라아제 (Phosphotrasnacetylase) 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화;
    (ii) 아세틸-CoA 신테타아제 (Acetyl-CoA synthetase) 단백질 활성이 도입 또는 강화; 또는
    (iii) 포스포트랜스아세틸라아제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화, 및 아세틸-CoA 신테타아제 단백질 활성이 도입 또는 강화된 것인, 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아세트산 키나아제는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 것인, 미생물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 포스포트랜스아세틸라아제는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 것인, 미생물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 아세틸-CoA 신테타아제는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 것인, 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인 미생물.
  7. (i) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
    (ii) 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 생산 방법.
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