CN106574239B - 生产l-色氨酸的埃希氏菌属微生物和使用其生产l-色氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生产L‑色氨酸的埃希氏菌属微生物，更具体地，涉及通过使内源性6‑磷酸葡萄糖酸脱水酶和2‑酮‑3‑脱氧‑6‑磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性减弱或失活具有改进的生产L‑色氨酸活性的埃希氏菌属微生物。此外，本申请涉及使用埃希氏菌属微生物生产L‑色氨酸的方法。

Description

生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物和使用其生产L-色氨酸的 方法

技术领域

本申请涉及生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物和使用该微生物生产L-色氨酸的方法。

背景技术

作为必需氨基酸的L-色氨酸被广泛用作饲料添加剂等，并且同样被广泛用作药物产品如输注溶液(infusion solution)和保健食品成分的原料。可以通过化学合成法、酶反应法、发酵法等生产L-色氨酸，但目前主要使用利用微生物的直接发酵法。

关于L-色氨酸生产菌株的研发方向，最初是通过选择突变(韩国专利号1987-0001813)、或通过经生物合成途径中的酶以及基因工程克服色氨酸反馈抑制的方法、或通过增强代谢过程中的酶合成——诸如增强色氨酸生物合成酶的表达来进行研发。

同时，先前公开了利用恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径提高L-氨基酸的方法(美国专利号7432085)。美国专利号7432085涉及通过增强恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径中所涉及酶的活性来提高由利用丙酮酸作为中间体的生物合成途径产生的L-氨基酸的生产的方法，并且具体地，该专利的关键特征是增强6-磷酸葡萄糖酸脱水酶或2-酮基-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性。

然而，本发明人首次证实：就L-色氨酸而言(不像其它L-氨基酸)，当恩特纳-杜德洛夫途径中的6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性均减弱或失活时，可以显著提高生产L-色氨酸的能力，从而完成本发明——关于具有提高的生产L-色氨酸能力的埃希氏菌属微生物和使用该微生物生产L-色氨酸的方法。

公开内容

技术问题

本申请的目的是提供生产L-色氨酸的微生物。

本申请的另一目的是提供使用生产L-色氨酸的微生物有效生产L-色氨酸的方法。

技术方案

为了实现上述目的，一方面，本申请提供了通过使内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(edd)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(eda)的活性减弱或失活来生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物。

如本文所使用的，术语“L-色氨酸”是指芳香族L-氨基酸，其为不在体内合成的α-氨基酸和必需氨基酸，化学式为C₁₁H₁₂N₂O₂。

如本文所使用的，术语“恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径”是指存在于埃希氏菌属微生物中的碳代谢途径，其是通过6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶经连续两步酶反应催化引入碳代谢途径的碳源转化为甘油醛-3-磷酸酯和丙酮酸酯的途径。

如本文所使用的，术语“6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd；EC4.2.1.12)”是指恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径中所涉及的酶，其催化将6-磷酸-D-葡萄糖酸酯转化为2-二氢-3-脱氧-6-磷酸-D-葡萄糖酸酯的反应。具体地，该酶可具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但是可无限制地包括具有该酶活性的任何序列。此外，在示例性实施方式中，编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因可以由SEQ ID NO:2的核苷酸序列表示，但是可无限制地包括编码该酶的任何序列。

如本文所使用的，术语“2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda；EC4.1.2.14)”是指恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径中所涉及的酶，其催化将2-二氢-3-脱氧-6-磷酸-D-葡萄糖酸酯转化为甘油醛-3-磷酸酯和丙酮酸酯的反应。具体地，该酶可具有SEQID NO:3的氨基酸序列，但是可无限制地包括具有该酶活性的任何序列。此外，在示例性实施方式中，编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因可以由SEQ ID NO:4的核苷酸序列表示，但是可无限制地包括编码该酶的任何序列。

除了由SEQ ID NO:1至3表示的氨基酸序列之外，上述每种酶可无限制地包括与上面所列氨基酸序列的每一个具有70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、甚至更具体地95％或更高、又甚至更具体地98％或更高、又甚至还更具体地99％或更高同源性的任何氨基酸序列，只要该酶呈现与每种酶基本上相同或相应的效果。此外，显而易见地，具有上述同源性的以及具有与每种酶相应的效果的任何修饰酶可以属于本申请的范围，尽管该酶可具有部分缺失、修饰、替代或添加的氨基酸序列。

此外，除了由SEQ ID NO:2或4表示的核苷酸序列之外，编码每种酶的基因也可无限制地包括编码所述酶的任何基因序列——其与上面所列核苷酸序列的每个具有80％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、甚至更具体地98％或更高、又甚至更具体地99％或更高的同源性，只要该序列编码具有与每种酶基本上相同或相应效果的酶。此外，显而易见地，具有以上同源性的任何核苷酸序列可以属于本申请的范围，尽管该序列可在其中具有部分缺失、修饰、替代或添加。

如本文所使用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比。可以通过本领域已知技术确定一个部分与另一个部分的序列对应。例如，可以通过使用容易获得并能够比对序列信息的计算机程序(例如，BLAST 2.0)直接比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子上的序列信息(例如，诸如打分、同一性和相似性的参数)来确定同源性。此外，可以通过在同源区域中形成稳定双链的条件下使多核苷酸杂交，然后通过单链特异性核酸酶使杂交链消化以确定消化片段的大小来确定同源性。

如本文所使用的，术语“内源活性”是指天然状态下或修饰之前的微生物中的酶的活性状态。

如本文所使用的，术语“使酶活性与其内源活性相比减弱”是指这样的概念，其包括微生物中的酶活性与其在天然状态下或修饰之前原始具有的酶活性相比存在降低的情况、总蛋白质表达水平低于野生型菌株或微生物修饰前的菌株的总蛋白质表达水平——由于编码其的基因的表达抑制或翻译抑制——的情况、或其组合情况。

如本文所使用的，术语“失活”是指编码微生物中的酶的基因完全不表达的情况，和与野生型菌株或微生物修饰前的菌株相比，基因被表达但不呈现活性的情况。

酶活性的减弱或失活可通过本领域熟知的多种方法实现。方法的实例可包括将在染色体上编码酶的基因用经突变以使酶活性可以降低(包括酶活性被消除的情况)的基因替代的方法；将修饰引入到染色体上编码酶的基因的表达控制序列中的方法；将编码酶的基因的表达控制序列用具有弱活性或不具有活性的序列替代的方法；使染色体上编码酶的基因的部分或全部缺失的方法；引入反义寡核苷酸(如反义RNA)的方法，所述反义寡核苷酸通过与染色体上基因的转录物互补结合来抑制mRNA翻译成酶；通过在编码酶的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列的前端上人工添加SD序列及其互补序列来形成二级结构而使核糖体不能附着的方法；反转录工程(RTE)——其在对应序列的开放阅读框(ORF)的3'末端添加将被反转录的启动子——的方法等，；并且也可包括其组合，但并不限于此。

具体地，使编码酶的部分或全部基因缺失的方法可以通过使用细菌中的染色体插入的载体将染色体中编码内源性靶蛋白的多核苷酸用具有部分缺失的核酸序列的多核苷酸或标记基因替代来进行。在使基因的部分或全部缺失的方法的示例性实施方式中，可以通过同源重组使基因缺失。

如本文所使用的，术语“部分”(尽管其可以根据多核苷酸的种类而变化)具体地可以指1个核苷酸至300个核苷酸、更具体地1个核苷酸至100个核苷酸、和甚至更具体地1个核苷酸至50个核苷酸，但并不具体限于此。

如本文所用，术语“同源重组”是指通过具有相互同源性(mutual homology)的基因链座位(genetic chain loci)处的交换而发生的基因重组。

具体地，表达控制序列可以通过以下方式进行修饰：通过表达控制序列的核酸序列中的缺失、插入、非保守性或保守性替代或其组合来诱导表达控制序列的修饰；或用较弱启动子替换等。表达控制序列可包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合区域的序列、和控制转录和翻译终止的序列。

此外，染色体上的基因序列可以通过以下方式进行修饰：通过基因序列中的缺失、插入、非保守性或保守性替代或其组合来诱导序列中的修饰以进一步使酶活性减弱；或通过用经改进以具有较弱活性的基因序列或经改进以不具有活性的基因序列替代。

在本申请的示例性实施方式中，证实了活性的减弱或失活可通过选自以下的至少一种突变方法进行：通过将至少一个碱基对插入至编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因中以及插入至编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因中而进行的插入突变；通过具有基因内至少一个碱基对的缺失而进行的缺失突变；和通过将无义密码子或不同密码子引入至基因中而进行的碱基对的转换或颠换突变。

本申请中，埃希氏菌属微生物可以具体为大肠杆菌(Escherichia coli)，但并不限于此。

具体地，通过使edd和eda活性减弱或失活来生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物的亲本菌株可以不受具体限制，只要该微生物属于埃希氏菌属。例如，生产L-色氨酸的微生物可以是这样的微生物：其中为了增强生物合成途径，使竞争途径中的基因、色氨酸操纵子定向途径中的调节子、和用于引入和分解色氨酸的基因的活性减弱或失活；和/或使色氨酸操纵子的活性过表达。使活性减弱或失活的方法与上述相同，以及无限制地包括本领域已知的方法。此外，无限制地包括本领域已知的使色氨酸操纵子的活性过表达的方法。例如，方法可包括进一步将多核苷酸(其包含从外部引入的操纵子基因或表达控制区域的核苷酸序列的本身的部分或全部)引入至染色体中的方法；通过引入至载体系统来增加拷贝数的方法；通过将控制基因表达的表达控制序列替代为另一个表达控制序列、使表达控制区域的核苷酸序列部分或全部中具有诱导突变的修饰、和引入基因本身的修饰等来增强操纵子活性的方法，但并不限于此。具体地，微生物可以是其中pheA基因、trpR基因、mtr基因和tnaAB基因的部分或全部缺失和/或色氨酸操纵子过表达的大肠杆菌(E.coli)。

在本申请中，edd基因、eda基因、pheA基因、trpR基因、mtr基因、tnaAB基因和色氨酸操纵子，以及由它们编码的蛋白质序列可以从已知数据库(例如NCBI的GenBank)获得，但并不限于此。此外，关于pheA基因、trpR基因、mtr基因和tnaAB基因具体细节可以在韩国专利号10-0792095的公开内容中找到，并且该韩国专利的整个说明书可以作为本申请的参考被包括。

由本申请的示例性实施方式证实了，对于各种亲本菌株中的6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶活性的失活，当6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶两者的活性被一起减弱或失活时，任何埃希氏菌属微生物(无论其亲本菌株如何)显著地提高了L-色氨酸的生产。

另一方面，本申请提供了制备L-色氨酸的方法，其包括培养通过使本申请的内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(edd)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(eda)的活性减弱或失活来生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物；和从培养基或培养的微生物中回收L-色氨酸。

用于培养本公开的微生物的培养基和其它培养条件不受具体限制，但可以使用用于常规培养埃希氏菌属微生物的任何培养基。具体地，本公开的微生物可以在需氧条件下同时调节温度、pH等、在含有适当的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的常规培养基中进行培养。

本申请中所使用的碳源的实例可包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等；醇类，如糖醇、甘油、丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；和氨基酸，如有机酸、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。此外，天然有机营养物，如淀粉水解物、糖蜜、黑糖蜜、米糠、木薯淀粉、甘蔗糖蜜、玉米浆等，以及具体地，碳水化合物，如葡萄糖和无菌预处理的糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)。此外，可以无限制地使用适量的各种其它碳源。这些碳源可单独使用或以两种或更多种的组合使用。

本申请中所使用的氮源的实例可包括无机化合物，如氨、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等；和有机氮源，如蛋白胨、N-Z胺、肉膏、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂大豆饼或其分解产物等。这些氮源可单独使用或以两种或更多种的组合使用。

本申请中所使用的磷源的实例可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、相应的含钠盐等，但并不限于此。无机化合物的实例可包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙等，以及此外，可包括用于培养基的氨基酸、维生素和/或合适的前体。这些培养基或前体可通过分批培养或连续培养添加至培养物将。

在本申请中，在培养期间可通过将化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸以适当的方式添加至培养物来调节培养物的pH。在培养期间，可以添加消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯，以防止泡沫生成。此外，可以将氧或含氧气体注入到培养物中以便维持培养物的有氧状态；或者可以在不注入气体的情况下注入氮、氢或二氧化碳气体，以维持培养物的无氧或微氧状态。

培养温度通常可在27℃至40℃、以及具体地30℃至37℃的范围内，但并不限于此。可以持续进行培养直至获得所需量的有用物质，以及具体为10小时至100小时，但并不限于此。

根据本申请的培养方法，可以通过本领域已知的合适方法例如分批培养、连续培养或补料分批培养等回收L-色氨酸。

回收还可以包括纯化步骤。

L-氨基酸可被释放到进行培养的培养基中或可包含在微生物中。

发明的有利效果

本申请提供了通过使内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性减弱或失活生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物，并且因此本申请提供了使用该微生物可以以更高产率以及更高效率和成本效益来生产L-色氨酸的效果。

发明的实施方式

下文中，将结合实施例对本申请进行详细描述。然而，本文所公开的实施例仅用于说明性目的，并且不应被解释为限制本申请的范围。

对照实施例1：亲本菌株(ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO)的制备

(1)其中pheA、trpR、mtr和tnaAB基因编码的蛋白质被失活的野生型菌株的制备

为了通过亲本菌株增强色氨酸的生物合成途径，pheA基因(其是竞争途径中的基因)；trpR基因(其是色氨酸操纵子和定向途径中的调节子)；mtr基因(其是用于引入色氨酸的基因)；以及tnaA和tnaB基因(其是用于引入和分解色氨酸的基因)全部被失活，从而更好地检测本申请的微生物的色氨酸生产能力。由pheA基因编码的分支酸变位酶(chorismatemutase)/预苯酸水合酶(prephenate hydratase)；由trpR基因编码的trpR转录阻抑物；由mtr基因编码的色氨酸/吲哚：H⁺同向转运体；和以操纵子形式由tnaA和tnaB基因编码的色氨酸酶和色氨酸：H⁺同向转运体，全部通过大肠杆菌W3110(39936^TM)中的基因的同源重组而失活。为此，采用利用由Datsenko KA等人研发的λRed重组酶的一步失活法，并基于韩国专利号10-0792095中所述的方法进行失活。在本文所述的对照实施例1以及下述对照实施例2和实施例1和3中使用的引物的序列显示在下面表3中。

具体地，利用pKD3基因作为模板，连同具有SEQ ID NO:6序列的pheA基因的一部分和具有pKD3基因的氯霉素抗性基因的部分核苷酸序列的引物1和2，通过的PCR来扩增约1,100对基因片段。然后，将通过PCR获得的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，洗脱，并用作第二次PCR的模板。为获得大肠杆菌中的pheA基因的5'和3'DNA片段，使用大肠杆菌W3110的染色体作为模板，连同引物3和4以及引物5和6，通过PCR来扩增约250对基因片段。然后，将通过PCR获得的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，洗脱，并用作第二次PCR的模板。

在上文中，引物1和引物4之间的18对核苷酸序列是互补的，并且引物2和引物5之间的20对核苷酸序列是互补的，并且因此通过引物1和引物2获得的片段、通过引物3和引物4获得的片段和通过引物5和引物6获得的片段可以被连接为单个片段。将因此获得的PCR片段在不使用任何引物的情况下通过PCR扩增5次、用引物3和6进行处理、并再次通过PCR扩增25次。结果，具有大小约为1,600个碱基对的基因片段被扩增。

然后，将用pKD46转化的大肠杆菌W3110根据Datsenko KA等人开发的方法制备成感受态细胞、引入通过PCR获得的大小约为1,600个碱基对的基因片段、并接种在含氯霉素(30mg/L)的LB固体培养基上。在通过PCR确认因此获得的菌株中的pheA基因被大小为1,600个碱基对失活之后，制得大肠杆菌W3110ΔpheA菌株。

同样地，使用表3中的引物使由具有SEQ ID NO:8序列的trpR基因、具有SEQ IDNO:10序列的mtr基因和具有SEQ ID NO:12和14序列的tnaA和tnaB基因编码的蛋白质失活，从而构建W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB菌株。

(2)引入显示生产色氨酸能力的基因的载体的制备

为了向上述制备的野生型菌株(W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB)提供生产色氨酸的能力，使pCL1920载体插入有Ptrc启动子和色氨酸操纵子基因，从而制备pCL1920-Ptrc-trpO。

具体地，为了将Ptrc启动子插入到pCL1920载体中，将pCL1920质粒回收，用HindⅢ和PstI进行处理，并使用pTrcHis B(Invitrogen，USA)作为模板，连同引物23和24，通过PCR来制备Ptrc启动子：在94℃变性30秒、在58℃退火30秒和在72℃聚合30秒，重复30次循环。将因此获得的Ptrc启动子片段用HindⅢ和PstI进行切割，并与pCL1920载体连接，从而构建pCL1920-Ptrc载体。

然后，为构建pCL1920_Ptrc_trpO载体，通过用PstI和碱性磷酸酶处理来制备pCL1920-Ptrc载体，并从大肠杆菌KCCM10812P(韩国专利号10-0792095)的染色体DNA扩增色氨酸操纵子基因。作为相应操纵子基因的第一基因的trpE基因具有反馈抑制形式。对于扩增，使用大肠杆菌KCCM10812P的染色体DNA作为模板，连同引物25和26，通过重复30次循环(在94℃变性30秒、在58℃退火30秒和在72℃聚合5分钟)来进行PCR。将因此获得的DNA片段用PstI进行处理，并与预先制备的pCL1920-Ptrc载体连接，并且作为结果所获得的载体被命名为pCL1920_Ptrc_trpO(SEQ ID NO:15)。

(3)插入有含色氨酸操纵子的载体的菌株的制备

在将对照实施例1(1)中制备的菌株制备成感受态细胞之后，将对照实施例1(2)中制备的载体引入菌株，从而制得生产色氨酸的野生型菌株W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO。

实施例1:从对照实施例1的亲本菌株制备ΔeddΔeda菌株

在对照实施例1制备的野生型菌株W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO中，通过同源重组使edd-eda基因组同时缺失，从而制得其中由edd基因(SEQ IDNO:2)和eda基因(SEQ ID NO:4)编码的6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸均被失活的菌株。

具体地，为了制备上述菌株，使用一步失活法——其是使用由Datsenko KA等人研发的λRay重组酶的突变生成技术。作为确认插入基因的标记物，pUCprmfmloxC的氯霉素基因被使用(韩国专利申请公开号2009-007554)。使用pUCprmfmloxC作为模板，连同具有edd-eda基因组的一部分和pUCprmfmloxC基因的氯霉素抗性基因的部分核苷酸序列的引物27和28，通过PCR重复30次循环(在94℃变性30秒、在55℃退火30秒和在72℃聚合1分钟)来扩增约1,200对基因片段。

此外，将通过PCR扩增获得的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，洗脱，并用作第二次PCR的模板。设计第二次PCR以获得在第一DNA片段的5'和3'区域中的20对互补核苷酸序列，并使用第一次PCR产物作为模板，连同添加edd-eda基因组的5'和3'区域的引物29和30，通过PCR重复30次循环(在94℃变性30秒、在55℃退火30秒和在72℃聚合1分钟)来扩增约1,300对基因片段。将因此获得的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，洗脱，并用于重组。

在感受态下制备根据Datsenko KA等人研发的方法经pKD46转化的大肠杆菌，并通过PCR获得的具有大小为1,300个碱基对的基因片段被引入于其中用于转化。在含有氯霉素的LB培养基中选择因此获得的菌株，并且使用引物31和32获得的PCR产物的大小为1,626个碱基对，因此证实edd-eda基因组被缺失。

在除去pKD46后，具有氯霉素抗性的第一重组菌株被引入有pJW168，从而将氯霉素标记基因从细菌体中除去(Gene,(2000)247,255-64)。最终得到的细菌体是PCR扩增产物，其使用引物31和32获得，大小为580对，从而证实到达了预期的缺失。此外，在制得处于感受态的菌株后，通过在其中引入对照实施例1中制备的载体使菌株转化，从而制得产生色氨酸的W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaABΔeddΔeda/pCL1920-Ptrc-trpO菌株。

实施例2:ΔeddΔeda菌株的色氨酸生产能力的确认

使用对照实施例1和实施例1中制备的菌株进行滴度评价(titer evaluation)。对于滴度评价，细菌体用铂环进行接种，在固体LB培养基中培养过夜，并用铂环接种至具有下表1中所示组分的每一个25mL烧瓶滴度培养基上。接种后，将菌株以200rpm的速率在37℃培养42小时，以及由此得到的结果显示在下表2中。所使用的所有结果表示从三个不同烧瓶中获得的结果的平均值。

[表1]

[表2]

*在22小时的时间点测量的值

**在42小时的时间点测量的值

作为上述实验的结果，如上表2所示，当缺失本申请中提出的edd-eda基因组(genegroup)时，与对照实施例1中的亲本菌株相比，葡萄糖消耗无显著差异，然而，与亲本菌株相比色氨酸产量显示增加约32％。该结果被认为是归因于以下事实：通过Entner-Doudoroff途径中的缺失，反应进行至核酮糖5-磷酸，而不损失作为底物的6-磷酸葡萄糖酸，因此不仅增加了NADPH的量还增加了5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)的量，从而提高了生产色氨酸的能力。

实施例3:由保藏的亲本菌株制备ΔeddΔeda菌株

以与实施例1相同的方式处理保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)中的生产L-色氨酸的大肠杆菌KCCM11166P(韩国专利号10-1261147)，并且从而制得其中缺失edd-eda基因组的KCCM11166PΔeddΔeda菌株。

[表3]

实施例4：ΔeddΔeda菌株的色氨酸生产能力的确认

使用保藏菌株KCCM11166P和实施例3中制备的菌株进行滴度评价。

对于滴度评价，细菌体用铂环进行接种、在固体LB培养基中培养过夜、并用铂环接种至具有下表4中所示的组分的每个25mL烧瓶滴度培养基上。接种后，将菌株以200rpm的速率在37℃培养42小时，由此得到的结果显示在下表5中。所使用的所有结果表示从三个不同烧瓶中获得的结果的平均值。

[表4]

[表5]

*在33小时的时间点测量的值

**在48小时的时间点测量的值

作为上述实验的结果，如上表5所示，当缺失本申请中提出的edd-eda基因组时，与亲本菌株相比，葡萄糖消耗无显著差异，然而，与亲本菌株相比色氨酸产量显示增加约21％。该结果被认为是由于如上述实施例2中提到的色氨酸产生能力的改进。

本发明人已经证实，其中edd-eda基因组被失活的基于KCCM11166P的菌株具有提高的色氨酸生产能力，将该菌株命名为“CA04-2800”，并于2013年11月15日将其保藏于KCCM，并且其被指定保藏编号KCCM11473P。

上述结果表明，与没有edd-eda活性失活的微生物相比，具有Entner-Doudoroff途径的埃希氏菌属微生物中的edd-eda活性同时失活可以提高色氨酸生产能力。

在本申请中，省略了本领域普通技术人员可以充分认识和获取的那些详细描述，并且各种修改(除了本文中所述的示例性实施方式之外)都可以包括在本申请的精神和范围内，而不改变本申请的技术概念或本质特征。因此，可以以其它具体形式体现本申请，并且本申请所属的本领域普通技术人员将能够对其理解。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 具有L-色氨酸生产活性的埃希氏菌属微生物和使用其生产L-色氨酸的方法

<130> OPA15164-PCT

<150> KR 10-2014-0076698

<151> 2014-06-23

<160> 47

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 603

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(603)

<223> edd

<400> 1

Met Asn Pro Gln Leu Leu Arg Val Thr Asn Arg Ile Ile Glu Arg Ser

1 5 10 15

Arg Glu Thr Arg Ser Ala Tyr Leu Ala Arg Ile Glu Gln Ala Lys Thr

20 25 30

Ser Thr Val His Arg Ser Gln Leu Ala Cys Gly Asn Leu Ala His Gly

35 40 45

Phe Ala Ala Cys Gln Pro Glu Asp Lys Ala Ser Leu Lys Ser Met Leu

50 55 60

Arg Asn Asn Ile Ala Ile Ile Thr Ser Tyr Asn Asp Met Leu Ser Ala

65 70 75 80

His Gln Pro Tyr Glu His Tyr Pro Glu Ile Ile Arg Lys Ala Leu His

85 90 95

Glu Ala Asn Ala Val Gly Gln Val Ala Gly Gly Val Pro Ala Met Cys

100 105 110

Asp Gly Val Thr Gln Gly Gln Asp Gly Met Glu Leu Ser Leu Leu Ser

115 120 125

Arg Glu Val Ile Ala Met Ser Ala Ala Val Gly Leu Ser His Asn Met

130 135 140

Phe Asp Gly Ala Leu Phe Leu Gly Val Cys Asp Lys Ile Val Pro Gly

145 150 155 160

Leu Thr Met Ala Ala Leu Ser Phe Gly His Leu Pro Ala Val Phe Val

165 170 175

Pro Ser Gly Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Asn Lys Glu Lys Val Arg

180 185 190

Ile Arg Gln Leu Tyr Ala Glu Gly Lys Val Asp Arg Met Ala Leu Leu

195 200 205

Glu Ser Glu Ala Ala Ser Tyr His Ala Pro Gly Thr Cys Thr Phe Tyr

210 215 220

Gly Thr Ala Asn Thr Asn Gln Met Val Val Glu Phe Met Gly Met Gln

225 230 235 240

Leu Pro Gly Ser Ser Phe Val His Pro Asp Ser Pro Leu Arg Asp Ala

245 250 255

Leu Thr Ala Ala Ala Ala Arg Gln Val Thr Arg Met Thr Gly Asn Gly

260 265 270

Asn Glu Trp Met Pro Ile Gly Lys Met Ile Asp Glu Lys Val Val Val

275 280 285

Asn Gly Ile Val Ala Leu Leu Ala Thr Gly Gly Ser Thr Asn His Thr

290 295 300

Met His Leu Val Ala Met Ala Arg Ala Ala Gly Ile Gln Ile Asn Trp

305 310 315 320

Asp Asp Phe Ser Asp Leu Ser Asp Val Val Pro Leu Met Ala Arg Leu

325 330 335

Tyr Pro Asn Gly Pro Ala Asp Ile Asn His Phe Gln Ala Ala Gly Gly

340 345 350

Val Pro Val Leu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Leu Leu His Glu

355 360 365

Asp Val Asn Thr Val Ala Gly Phe Gly Leu Ser Arg Tyr Thr Leu Glu

370 375 380

Pro Trp Leu Asn Asn Gly Glu Leu Asp Trp Arg Glu Gly Ala Glu Lys

385 390 395 400

Ser Leu Asp Ser Asn Val Ile Ala Ser Phe Glu Gln Pro Phe Ser His

405 410 415

His Gly Gly Thr Lys Val Leu Ser Gly Asn Leu Gly Arg Ala Val Met

420 425 430

Lys Thr Ser Ala Val Pro Val Glu Asn Gln Val Ile Glu Ala Pro Ala

435 440 445

Val Val Phe Glu Ser Gln His Asp Val Met Pro Ala Phe Glu Ala Gly

450 455 460

Leu Leu Asp Arg Asp Cys Val Val Val Val Arg His Gln Gly Pro Lys

465 470 475 480

Ala Asn Gly Met Pro Glu Leu His Lys Leu Met Pro Pro Leu Gly Val

485 490 495

Leu Leu Asp Arg Cys Phe Lys Ile Ala Leu Val Thr Asp Gly Arg Leu

500 505 510

Ser Gly Ala Ser Gly Lys Val Pro Ser Ala Ile His Val Thr Pro Glu

515 520 525

Ala Tyr Asp Gly Gly Leu Leu Ala Lys Val Arg Asp Gly Asp Ile Ile

530 535 540

Arg Val Asn Gly Gln Thr Gly Glu Leu Thr Leu Leu Val Asp Glu Ala

545 550 555 560

Glu Leu Ala Ala Arg Glu Pro His Ile Pro Asp Leu Ser Ala Ser Arg

565 570 575

Val Gly Thr Gly Arg Glu Leu Phe Ser Ala Leu Arg Glu Lys Leu Ser

580 585 590

Gly Ala Glu Gln Gly Ala Thr Cys Ile Thr Phe

595 600

<210> 2

<211> 1812

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1812)

<223> edd

<400> 2

atgaatccac aattgttacg cgtaacaaat cgaatcattg aacgttcgcg cgagactcgc 60

tctgcttatc tcgcccggat agaacaagcg aaaacttcga ccgttcatcg ttcgcagttg 120

gcatgcggta acctggcaca cggtttcgct gcctgccagc cagaagacaa agcctctttg 180

aaaagcatgt tgcgtaacaa tatcgccatc atcacctcct ataacgacat gctctccgcg 240

caccagcctt atgaacacta tccagaaatc attcgtaaag ccctgcatga agcgaatgcg 300

gttggtcagg ttgcgggcgg tgttccggcg atgtgtgatg gtgtcaccca ggggcaggat 360

ggaatggaat tgtcgctgct aagccgcgaa gtgatagcga tgtctgcggc ggtggggctg 420

tcccataaca tgtttgatgg tgctctgttc ctcggtgtgt gcgacaagat tgtcccgggt 480

ctgacgatgg cagccctgtc gtttggtcat ttgcctgcgg tgtttgtgcc gtctggaccg 540

atggcaagcg gtttgccaaa taaagaaaaa gtgcgtattc gccagcttta tgccgaaggt 600

aaagtggacc gcatggcctt actggagtca gaagccgcgt cttaccatgc gccgggaaca 660

tgtactttct acggtactgc caacaccaac cagatggtgg tggagtttat ggggatgcag 720

ttgccaggct cttcttttgt tcatccggat tctccgctgc gcgatgcttt gaccgccgca 780

gctgcgcgtc aggttacacg catgaccggt aatggtaatg aatggatgcc gatcggtaag 840

atgatcgatg agaaagtggt ggtgaacggt atcgttgcac tgctggcgac cggtggttcc 900

actaaccaca ccatgcacct ggtggcgatg gcgcgcgcgg ccggtattca gattaactgg 960

gatgacttct ctgacctttc tgatgttgta ccgctgatgg cacgtctcta cccgaacggt 1020

ccggccgata ttaaccactt ccaggcggca ggtggcgtac cggttctggt gcgtgaactg 1080

ctcaaagcag gcctgctgca tgaagatgtc aatacggtgg caggttttgg tctgtctcgt 1140

tatacccttg aaccatggct gaataatggt gaactggact ggcgggaagg ggcggaaaaa 1200

tcactcgaca gcaatgtgat cgcttccttc gaacaacctt tctctcatca tggtgggaca 1260

aaagtgttaa gcggtaacct gggccgtgcg gttatgaaaa cctctgccgt gccggttgag 1320

aaccaggtga ttgaagcgcc agcggttgtt tttgaaagcc agcatgacgt tatgccggcc 1380

tttgaagcgg gtttgctgga ccgcgattgt gtcgttgttg tccgtcatca ggggccaaaa 1440

gcgaacggaa tgccagaatt acataaactc atgccgccac ttggtgtatt attggaccgg 1500

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tcagctatcc acgtaacacc agaagcctac gatggcgggc tgctggcaaa agtgcgcgac 1620

ggggacatca ttcgtgtgaa tggacagaca ggcgaactga cgctgctggt agacgaagcg 1680

gaactggctg ctcgcgaacc gcacattcct gacctgagcg cgtcacgcgt gggaacagga 1740

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atcacttttt aa 1812

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(213)

<223> eda

<400> 3

Met Lys Asn Trp Lys Thr Ser Ala Glu Ser Ile Leu Thr Thr Gly Pro

1 5 10 15

Val Val Pro Val Ile Val Val Lys Lys Leu Glu His Ala Val Pro Met

20 25 30

Ala Lys Ala Leu Val Ala Gly Gly Val Arg Val Leu Glu Val Thr Leu

35 40 45

Arg Thr Glu Cys Ala Val Asp Ala Ile Arg Ala Ile Ala Lys Glu Val

50 55 60

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Ala Glu Val Thr Glu Ala Gly Ala Gln Phe Ala Ile Ser Pro Gly Leu

85 90 95

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115 120 125

Leu Lys Glu Phe Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Asn Gly Gly Val Lys

130 135 140

Ala Leu Gln Ala Ile Ala Gly Pro Phe Ser Gln Val Arg Phe Cys Pro

145 150 155 160

Thr Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asn Tyr Arg Asp Tyr Leu Ala Leu Lys

165 170 175

Ser Val Leu Cys Ile Gly Gly Ser Trp Leu Val Pro Ala Asp Ala Leu

180 185 190

Glu Ala Gly Asp Tyr Asp Arg Ile Thr Lys Leu Ala Arg Glu Ala Val

195 200 205

Glu Gly Ala Lys Leu

210

<210> 4

<211> 642

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(642)

<223> eda

<400> 4

atgaaaaact ggaaaacaag tgcagaatca atcctgacca ccggcccggt tgtaccggtt 60

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gcagaagtca ctgaagcggg tgcacagttc gcaattagcc cgggtctgac cgagccgctg 300

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acgggtggta tttctccggc taactaccgt gactacctgg cgctgaaaag cgtgctgtgc 540

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actaagctgg cgcgtgaagc tgtagaaggc gctaagctgt aa 642

<210> 5

<211> 386

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(386)

<223> pheA

<400> 5

Met Thr Ser Glu Asn Pro Leu Leu Ala Leu Arg Glu Lys Ile Ser Ala

1 5 10 15

Leu Asp Glu Lys Leu Leu Ala Leu Leu Ala Glu Arg Arg Glu Leu Ala

20 25 30

Val Glu Val Gly Lys Ala Lys Leu Leu Ser His Arg Pro Val Arg Asp

35 40 45

Ile Asp Arg Glu Arg Asp Leu Leu Glu Arg Leu Ile Thr Leu Gly Lys

50 55 60

Ala His His Leu Asp Ala His Tyr Ile Thr Arg Leu Phe Gln Leu Ile

65 70 75 80

Ile Glu Asp Ser Val Leu Thr Gln Gln Ala Leu Leu Gln Gln His Leu

85 90 95

Asn Lys Ile Asn Pro His Ser Ala Arg Ile Ala Phe Leu Gly Pro Lys

100 105 110

Gly Ser Tyr Ser His Leu Ala Ala Arg Gln Tyr Ala Ala Arg His Phe

115 120 125

Glu Gln Phe Ile Glu Ser Gly Cys Ala Lys Phe Ala Asp Ile Phe Asn

130 135 140

Gln Val Glu Thr Gly Gln Ala Asp Tyr Ala Val Val Pro Ile Glu Asn

145 150 155 160

Thr Ser Ser Gly Ala Ile Asn Asp Val Tyr Asp Leu Leu Gln His Thr

165 170 175

Ser Leu Ser Ile Val Gly Glu Met Thr Leu Thr Ile Asp His Cys Leu

180 185 190

Leu Val Ser Gly Thr Thr Asp Leu Ser Thr Ile Asn Thr Val Tyr Ser

195 200 205

His Pro Gln Pro Phe Gln Gln Cys Ser Lys Phe Leu Asn Arg Tyr Pro

210 215 220

His Trp Lys Ile Glu Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Ala Ala Met Glu Lys

225 230 235 240

Val Ala Gln Ala Lys Ser Pro His Val Ala Ala Leu Gly Ser Glu Ala

245 250 255

Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Leu Gln Val Leu Glu Arg Ile Glu Ala Asn

260 265 270

Gln Arg Gln Asn Phe Thr Arg Phe Val Val Leu Ala Arg Lys Ala Ile

275 280 285

Asn Val Ser Asp Gln Val Pro Ala Lys Thr Thr Leu Leu Met Ala Thr

290 295 300

Gly Gln Gln Ala Gly Ala Leu Val Glu Ala Leu Leu Val Leu Arg Asn

305 310 315 320

His Asn Leu Ile Met Thr Arg Leu Glu Ser Arg Pro Ile His Gly Asn

325 330 335

Pro Trp Glu Glu Met Phe Tyr Leu Asp Ile Gln Ala Asn Leu Glu Ser

340 345 350

Ala Glu Met Gln Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gly Glu Ile Thr Arg Ser

355 360 365

Met Lys Val Leu Gly Cys Tyr Pro Ser Glu Asn Val Val Pro Val Asp

370 375 380

Pro Thr

385

<210> 6

<211> 1161

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1161)

<223> pheA

<400> 6

atgacatcgg aaaacccgtt actggcgctg cgagagaaaa tcagcgcgct ggatgaaaaa 60

ttattagcgt tactggcaga acggcgcgaa ctggccgtcg aggtgggaaa agccaaactg 120

ctctcgcatc gcccggtacg tgatattgat cgtgaacgcg atttgctgga aagattaatt 180

acgctcggta aagcgcacca tctggacgcc cattacatta ctcgcctgtt ccagctcatc 240

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cgccagtatg ctgcccgtca ctttgagcaa ttcattgaaa gtggctgcgc caaatttgcc 420

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accagctccg gtgccataaa cgacgtttac gatctgctgc aacataccag cttgtcgatt 540

gttggcgaga tgacgttaac tatcgaccat tgtttgttgg tctccggcac tactgattta 600

tccaccatca atacggtcta cagccatccg cagccattcc agcaatgcag caaattcctt 660

aatcgttatc cgcactggaa gattgaatat accgaaagta cgtctgcggc aatggaaaag 720

gttgcacagg caaaatcacc gcatgttgct gcgttgggaa gcgaagctgg cggcactttg 780

tacggtttgc aggtactgga gcgtattgaa gcaaatcagc gacaaaactt cacccgattt 840

gtggtgttgg cgcgtaaagc cattaacgtg tctgatcagg ttccggcgaa aaccacgttg 900

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cacaatctga ttatgacccg tctggaatca cgcccgattc acggtaatcc atgggaagag 1020

atgttctatc tggatattca ggccaatctt gaatcagcgg aaatgcaaaa agcattgaaa 1080

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gtgcctgttg atccaacctg a 1161

<210> 7

<211> 108

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(108)

<223> trpR

<400> 7

Met Ala Gln Gln Ser Pro Tyr Ser Ala Ala Met Ala Glu Gln Arg His

1 5 10 15

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Glu Ala Leu Gly Thr Arg Val Arg Ile Val Glu Glu Leu Leu Arg Gly

50 55 60

Glu Met Ser Gln Arg Glu Leu Lys Asn Glu Leu Gly Ala Gly Ile Ala

65 70 75 80

Thr Ile Thr Arg Gly Ser Asn Ser Leu Lys Ala Ala Pro Val Glu Leu

85 90 95

Arg Gln Trp Leu Glu Glu Val Leu Leu Lys Ser Asp

100 105

<210> 8

<211> 327

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(327)

<223> trpR

<400> 8

atggcccaac aatcacccta ttcagcagcg atggcagaac agcgtcacca ggagtggtta 60

cgttttgtcg acctgcttaa gaatgcctac caaaacgatc tccatttacc gttgttaaac 120

ctgatgctga cgccagatga gcgcgaagcg ttggggactc gcgtgcgtat tgtcgaagag 180

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gaagaggtgt tgctgaaaag cgattga 327

<210> 9

<211> 414

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(414)

<223> mtr

<400> 9

Met Ala Thr Leu Thr Thr Thr Gln Thr Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly

1 5 10 15

Val Val Ile Ile Gly Gly Thr Ile Ile Gly Ala Gly Met Phe Ser Leu

20 25 30

Pro Val Val Met Ser Gly Ala Trp Phe Phe Trp Ser Met Ala Ala Leu

35 40 45

Ile Phe Thr Trp Phe Cys Met Leu His Ser Gly Leu Met Ile Leu Glu

50 55 60

Ala Asn Leu Asn Tyr Arg Ile Gly Ser Ser Phe Asp Thr Ile Thr Lys

65 70 75 80

Asp Leu Leu Gly Lys Gly Trp Asn Val Val Asn Gly Ile Ser Ile Ala

85 90 95

Phe Val Leu Tyr Ile Leu Thr Tyr Ala Tyr Ile Ser Ala Ser Gly Ser

100 105 110

Ile Leu His His Thr Phe Ala Glu Met Ser Leu Asn Val Pro Ala Arg

115 120 125

Ala Ala Gly Phe Gly Phe Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Val Trp Leu

130 135 140

Ser Thr Lys Ala Val Ser Arg Met Thr Ala Ile Val Leu Gly Ala Lys

145 150 155 160

Val Ile Thr Phe Phe Leu Thr Phe Gly Ser Leu Leu Gly His Val Gln

165 170 175

Pro Ala Thr Leu Phe Asn Val Ala Glu Ser Asn Ala Ser Tyr Ala Pro

180 185 190

Tyr Leu Leu Met Thr Leu Pro Phe Cys Leu Ala Ser Phe Gly Tyr His

195 200 205

Gly Asn Val Pro Ser Leu Met Lys Tyr Tyr Gly Lys Asp Pro Lys Thr

210 215 220

Ile Val Lys Cys Leu Val Tyr Gly Thr Leu Met Ala Leu Ala Leu Tyr

225 230 235 240

Thr Ile Trp Leu Leu Ala Thr Met Gly Asn Ile Pro Arg Pro Glu Phe

245 250 255

Ile Gly Ile Ala Glu Lys Gly Gly Asn Ile Asp Val Leu Val Gln Ala

260 265 270

Leu Ser Gly Val Leu Asn Ser Arg Ser Leu Asp Leu Leu Leu Val Val

275 280 285

Phe Ser Asn Phe Ala Val Ala Ser Ser Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly

290 295 300

Leu Phe Asp Tyr Leu Ala Asp Leu Phe Gly Phe Asp Asp Ser Ala Val

305 310 315 320

Gly Arg Leu Lys Thr Ala Leu Leu Thr Phe Ala Pro Pro Val Val Gly

325 330 335

Gly Leu Leu Phe Pro Asn Gly Phe Leu Tyr Ala Ile Gly Tyr Ala Gly

340 345 350

Leu Ala Ala Thr Ile Trp Ala Ala Ile Val Pro Ala Leu Leu Ala Arg

355 360 365

Ala Ser Arg Lys Arg Phe Gly Ser Pro Lys Phe Arg Val Trp Gly Gly

370 375 380

Lys Pro Met Ile Ala Leu Ile Leu Val Phe Gly Val Gly Asn Ala Leu

385 390 395 400

Val His Ile Leu Ser Ser Phe Asn Leu Leu Pro Val Tyr Gln

405 410

<210> 10

<211> 1245

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1245)

<223> mtr

<400> 10

atggcaacac taaccaccac ccaaacgtca ccgtcgctgc ttggcggcgt ggtgattatc 60

ggcggcacca ttattggcgc agggatgttt tctctgccag tggtcatgtc cggggcgtgg 120

tttttctggt caatggcggc gctgatcttt acctggttct gtatgctgca ttccggcttg 180

atgattctgg aagctaacct gaattacaga atcggttcga gttttgacac catcaccaaa 240

gatttgctgg gcaaaggctg gaacgtggtc aacggcattt ccattgcctt tgtgctctat 300

atcctgacct atgcctatat ttctgccagt ggttcgattc tgcatcacac cttcgcagag 360

atgtcactaa acgtcccggc acgggcggcg ggttttggtt ttgcattgct ggtagcgttt 420

gtggtgtggt tgagcactaa agccgtcagt cgcatgacag cgattgtgct gggggcgaaa 480

gtcattacct tcttcctcac ctttggtagc ctgctggggc atgtgcagcc tgcgacattg 540

ttcaacgtcg ccgaaagcaa tgcgtcttat gcaccgtatc tgttgatgac cctgccgttc 600

tgtctggcat cgtttggtta tcacggtaac gtgccaagcc tgatgaagta ttacggcaaa 660

gatccgaaaa ccatcgtgaa atgtctggtg tacggtacgc tgatggcgct ggcgctgtat 720

accatctggt tgctggcgac gatgggtaac atcccgcgtc cggagtttat cggtattgca 780

gagaagggcg gtaatattga tgtgctggta caggcgttaa gcggcgtact gaacagccgt 840

agtctggatc tgctgctggt cgtgttctca aactttgcgg tagcgagttc gttcctcggc 900

gtaacgctgg gtttgtttga ctatctggca gatctgtttg gtttcgacga ctcggctgtg 960

ggccgcttga aaacggcatt gctgaccttt gccccgccag ttgtgggggg gctgttgttc 1020

ccgaacggat tcctgtacgc cattggttat gctggtttag cggctaccat ctgggcggca 1080

attgttccgg cgctgttagc ccgtgcatcg cgtaaacgct ttggcagccc gaaattccgc 1140

gtctggggtg gcaagccgat gattgcgctg attctggtgt ttggcgtcgg caacgcactg 1200

gtgcatattt tatcgagctt taatttactg ccggtgtatc agtaa 1245

<210> 11

<211> 471

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(471)

<223> tnaA

<400> 11

Met Glu Asn Phe Lys His Leu Pro Glu Pro Phe Arg Ile Arg Val Ile

1 5 10 15

Glu Pro Val Lys Arg Thr Thr Arg Ala Tyr Arg Glu Glu Ala Ile Ile

20 25 30

Lys Ser Gly Met Asn Pro Phe Leu Leu Asp Ser Glu Asp Val Phe Ile

35 40 45

Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Gly Ala Val Thr Gln Ser Met Gln

50 55 60

Ala Ala Met Met Arg Gly Asp Glu Ala Tyr Ser Gly Ser Arg Ser Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Leu Ala Glu Ser Val Lys Asn Ile Phe Gly Tyr Gln Tyr Thr

85 90 95

Ile Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Gln Ile Tyr Ile Pro Val

100 105 110

Leu Ile Lys Lys Arg Glu Gln Glu Lys Gly Leu Asp Arg Ser Lys Met

115 120 125

Val Ala Phe Ser Asn Tyr Phe Phe Asp Thr Thr Gln Gly His Ser Gln

130 135 140

Ile Asn Gly Cys Thr Val Arg Asn Val Tyr Ile Lys Glu Ala Phe Asp

145 150 155 160

Thr Gly Val Arg Tyr Asp Phe Lys Gly Asn Phe Asp Leu Glu Gly Leu

165 170 175

Glu Arg Gly Ile Glu Glu Val Gly Pro Asn Asn Val Pro Tyr Ile Val

180 185 190

Ala Thr Ile Thr Ser Asn Ser Ala Gly Gly Gln Pro Val Ser Leu Ala

195 200 205

Asn Leu Lys Ala Met Tyr Ser Ile Ala Lys Lys Tyr Asp Ile Pro Val

210 215 220

Val Met Asp Ser Ala Arg Phe Ala Glu Asn Ala Tyr Phe Ile Lys Gln

225 230 235 240

Arg Glu Ala Glu Tyr Lys Asp Trp Thr Ile Glu Gln Ile Thr Arg Glu

245 250 255

Thr Tyr Lys Tyr Ala Asp Met Leu Ala Met Ser Ala Lys Lys Asp Ala

260 265 270

Met Val Pro Met Gly Gly Leu Leu Cys Met Lys Asp Asp Ser Phe Phe

275 280 285

Asp Val Tyr Thr Glu Cys Arg Thr Leu Cys Val Val Gln Glu Gly Phe

290 295 300

Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Glu Gly Gly Ala Met Glu Arg Leu Ala Val

305 310 315 320

Gly Leu Tyr Asp Gly Met Asn Leu Asp Trp Leu Ala Tyr Arg Ile Ala

325 330 335

Gln Val Gln Tyr Leu Val Asp Gly Leu Glu Glu Ile Gly Val Val Cys

340 345 350

Gln Gln Ala Gly Gly His Ala Ala Phe Val Asp Ala Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Pro His Ile Pro Ala Asp Gln Phe Pro Ala Gln Ala Leu Ala Cys Glu

370 375 380

Leu Tyr Lys Val Ala Gly Ile Arg Ala Val Glu Ile Gly Ser Phe Leu

385 390 395 400

Leu Gly Arg Asp Pro Lys Thr Gly Lys Gln Leu Pro Cys Pro Ala Glu

405 410 415

Leu Leu Arg Leu Thr Ile Pro Arg Ala Thr Tyr Thr Gln Thr His Met

420 425 430

Asp Phe Ile Ile Glu Ala Phe Lys His Val Lys Glu Asn Ala Ala Asn

435 440 445

Ile Lys Gly Leu Thr Phe Thr Tyr Glu Pro Lys Val Leu Arg His Phe

450 455 460

Thr Ala Lys Leu Lys Glu Val

465 470

<210> 12

<211> 1416

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1416)

<223> tnaA

<400> 12

atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa 60

cgtaccactc gcgcttatcg tgaagaggca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg 120

ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg 180

cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagctac 240

tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac 300

cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa 360

aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag 420

ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat 480

acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt 540

gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca 600

ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac 660

gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag 720

cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat 780

gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg 840

tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg 900

caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta 960

ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat 1020

ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca 1080

ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg 1140

ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg 1200

ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta 1260

accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa 1320

catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta 1380

ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa 1416

<210> 13

<211> 415

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(415)

<223> tnaB

<400> 13

Met Thr Asp Gln Ala Glu Lys Lys His Ser Ala Phe Trp Gly Val Met

1 5 10 15

Val Ile Ala Gly Thr Val Ile Gly Gly Gly Met Phe Ala Leu Pro Val

20 25 30

Asp Leu Ala Gly Ala Trp Phe Phe Trp Gly Ala Phe Ile Leu Ile Ile

35 40 45

Ala Trp Phe Ser Met Leu His Ser Gly Leu Leu Leu Leu Glu Ala Asn

50 55 60

Leu Asn Tyr Pro Val Gly Ser Ser Phe Asn Thr Ile Thr Lys Asp Leu

65 70 75 80

Ile Gly Asn Thr Trp Asn Ile Ile Ser Gly Ile Thr Val Ala Phe Val

85 90 95

Leu Tyr Ile Leu Thr Tyr Ala Tyr Ile Ser Ala Asn Gly Ala Ile Ile

100 105 110

Ser Glu Thr Ile Ser Met Asn Leu Gly Tyr His Ala Asn Pro Arg Ile

115 120 125

Val Gly Ile Cys Thr Ala Ile Phe Val Ala Ser Val Leu Trp Ile Ser

130 135 140

Ser Leu Ala Ala Ser Arg Ile Thr Ser Leu Phe Leu Gly Leu Lys Ile

145 150 155 160

Ile Ser Phe Val Ile Val Phe Gly Ser Phe Phe Phe His Val Asp Tyr

165 170 175

Ser Ile Leu Arg Asp Ala Thr Ser Thr Thr Ala Gly Thr Ser Tyr Phe

180 185 190

Pro Tyr Ile Phe Met Ala Leu Pro Val Cys Leu Ala Ser Phe Gly Phe

195 200 205

His Gly Asn Ile Pro Ser Leu Ile Ile Cys Tyr Gly Lys Arg Lys Asp

210 215 220

Lys Leu Ile Lys Ser Val Val Phe Gly Ser Leu Leu Ala Leu Val Ile

225 230 235 240

Tyr Leu Phe Trp Leu Tyr Cys Thr Met Gly Asn Ile Pro Arg Glu Ser

245 250 255

Phe Lys Ala Ile Ile Ser Ser Gly Gly Asn Val Asp Ser Leu Val Lys

260 265 270

Ser Phe Leu Gly Thr Lys Gln His Gly Ile Ile Glu Phe Cys Leu Leu

275 280 285

Val Phe Ser Asn Leu Ala Val Ala Ser Ser Phe Phe Gly Val Thr Leu

290 295 300

Gly Leu Phe Asp Tyr Leu Ala Asp Leu Phe Lys Ile Asp Asn Ser His

305 310 315 320

Gly Gly Arg Phe Lys Thr Val Leu Leu Thr Phe Leu Pro Pro Ala Leu

325 330 335

Leu Tyr Leu Ile Phe Pro Asn Gly Phe Ile Tyr Gly Ile Gly Gly Ala

340 345 350

Gly Leu Cys Ala Thr Ile Trp Ala Val Ile Ile Pro Ala Val Leu Ala

355 360 365

Ile Lys Ala Arg Lys Lys Phe Pro Asn Gln Met Phe Thr Val Trp Gly

370 375 380

Gly Asn Leu Ile Pro Ala Ile Val Ile Leu Phe Gly Ile Thr Val Ile

385 390 395 400

Leu Cys Trp Phe Gly Asn Val Phe Asn Val Leu Pro Lys Phe Gly

405 410 415

<210> 14

<211> 1248

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1248)

<223> tnaB

<400> 14

atgactgatc aagctgaaaa aaagcactct gcattttggg gtgttatggt tatagcaggt 60

acagtaattg gtggaggtat gtttgcttta cctgttgatc ttgccggtgc ctggtttttc 120

tggggtgcct ttatccttat cattgcctgg ttttcaatgc ttcattccgg gttattgtta 180

ttagaagcaa atttaaatta tcctgtcggc tccagtttta acaccatcac caaagattta 240

atcggtaaca cctggaacat tatcagcggt attaccgttg ccttcgttct ctatatcctc 300

acttatgcct atatctctgc taatggtgcg atcattagtg aaacgatatc aatgaatttg 360

ggctatcacg ctaatccacg tattgtcggg atctgcacag ccattttcgt tgccagcgta 420

ttgtggataa gttcgttagc cgccagtcgc attacctcat tgttcctcgg gctgaagatt 480

atctcctttg tgatcgtgtt tggttctttc ttcttccatg tcgattactc catcctgcgc 540

gatgccacca gcaccactgc gggaacgtct tacttcccgt atatctttat ggctttgccg 600

gtgtgtctgg cgtcatttgg tttccacggc aatattccca gcctgattat ttgctatgga 660

aaacgcaaag ataagttaat caaaagcgtg gtatttggtt cgctgctggc gctggtgatt 720

tatctcttct ggctctattg cacgatgggg aatattccgc gcgaaagctt taaggcgata 780

atctcctcag gcggcaacgt tgattcgctg gtgaaatcgt tcctcggcac caaacagcac 840

ggcattatcg agttttgcct gctggtgttc tctaacttag ctgttgccag ttcgttcttt 900

ggtgtcacgc tggggttgtt cgattatctg gcggacctgt ttaagattga taactcccac 960

ggcgggcgtt tcaaaaccgt gctgttaacc ttcctgccac ctgcgttgtt gtatctgatc 1020

ttcccgaacg gctttattta cgggatcggc ggtgccgggc tgtgcgccac catctgggcg 1080

gtcattattc ccgcagtgct tgcaatcaaa gctcgcaaga agtttcccaa tcagatgttc 1140

acggtctggg gcggcaatct tattccggcg attgtcattc tctttggtat aaccgtgatt 1200

ttgtgctggt tcggcaacgt ctttaacgtg ttacctaaat ttggctaa 1248

<210> 15

<211> 11155

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCL1920_Ptrc_trpO

<400> 15

cccgtcttac tgtcgggaat tcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 60

ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 120

aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg 180

gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctt gctgttgaca 240

attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 300

aacagctgca gatgcaaaca caaaaaccga ctctcgaact gctaacctgc gaaggcgctt 360

atcgcgacaa tcccaccgcg ctttttcacc agttgtgtgg ggatcgtccg gcaacgctgc 420

tgctggaatc cgcagatatc gacagcaaag atgatttaaa aagcctgctg ctggtagaca 480

gtgcgctgcg cattacagct ttaggtgaca ctgtcacaat ccaggcactt tccggcaacg 540

gcgaagccct cctggcacta ctggataacg ccctgcctgc gggtgtggaa agtgaacaat 600

caccaaactg ccgtgtgctg cgcttccccc ctgtcagtcc actgctggat gaagacgccc 660

gcttatgctc cctttcggtt tttgacgctt tccgtttatt gcagaatctg ttgaatgtac 720

cgaaggaaga acgagaagcc atgttcttcg gcggcctgtt ctcttatgac cttgtggcgg 780

gatttgaaga tttaccgcaa ctgtcagcgg aaaataactg ccctgatttc tgtttttatc 840

tcgctgaaac gctgatggtg attgaccatc agaaaaaaag cacccgtatt caggccagcc 900

tgtttgctcc gaatgaagaa gaaaaacaac gtctcactgc tcgcctgaac gaactacgtc 960

agcaactgac cgaagccgcg ccgccgctgc cagtggtttc cgtgccgcat atgcgttgtg 1020

aatgtaatca gagcgatgaa gagttcggtg gcgtagtgcg tttgttgcaa aaagcgattc 1080

gcgctggaga aattttccag gtggtgccat ctcgccgttt ctctctgccc tgcccgtcac 1140

cgctggcggc ctattacgtg ctgaaaaaga gtaatcccag cccgtacatg ttttttatgc 1200

aggataatga tttcacccta tttggcgcgt cgccggaaag ctcgctcaag tatgatgcca 1260

ccagccgcca gattgagatc tacccgattg ccggaacacg cccacgcggt cgtcgcgccg 1320

atggttcact ggacagagat ctcgacagcc gtattgaact ggaaatgcgt accgatcata 1380

aagagctgtc tgaacatctg atgctggttg atctcgcccg taatgatctg gcacgcattt 1440

gcacccccgg cagccgctac gtcgccgatc tcaccaaagt tgaccgttat tcctatgtga 1500

tgcacctcgt ctctcgcgta gtcggcgaac tgcgtcacga tcttgacgcc ctgcacgctt 1560

atcgcgcctg tatgaatatg gggacgttaa gcggtgcgcc gaaagtacgc gctatgcagt 1620

taattgccga ggcggaaggt cgtcgccgcg gcagctacgg cggcgcggta ggttatttca 1680

ccgcgcatgg cgatctcgac acctgcattg tgatccgctc ggcgctggtg gaaaacggta 1740

tcgccaccgt gcaagcgggt gctggtgtag tccttgattc tgttccgcag tcggaagccg 1800

acgaaacccg taacaaagcc cgcgctgtac tgcgcgctat tgccaccgcg catcatgcac 1860

aggagacttt ctgatggctg acattctgct gctcgataat atcgactctt ttacgtacaa 1920

cctggcagat cagttgcgca gcaatgggca taacgtggtg atttaccgca accatattcc 1980

ggcgcaaacc ttaattgaac gcctggcgac catgagcaat ccggtgctga tgctttctcc 2040

tggccccggt gtgccgagcg aagccggttg tatgccggaa ctcctcaccc gcttgcgtgg 2100

caagctgccc attattggca tttgcctcgg acatcaggcg attgtcgaag cttacggggg 2160

ctatgtcggt caggcgggcg aaattctcca cggtaaagcc tccagcattg aacatgacgg 2220

tcaggcgatg tttgccggat taacaaaccc gctgccggtg gcgcgttatc actcgctggt 2280

tggcagtaac attccggccg gtttaaccat caacgcccat tttaatggca tggtgatggc 2340

agtacgtcac gatgcggatc gcgtttgtgg attccagttc catccggaat ccattctcac 2400

cacccagggc gctcgcctgc tggaacaaac gctggcctgg gcgcagcaga aactagagcc 2460

agccaacacg ctgcaaccga ttctggaaaa actgtatcag gcgcagacgc ttagccaaca 2520

agaaagccac cagctgtttt cagcggtggt gcgtggcgag ctgaagccgg aacaactggc 2580

ggcggcgctg gtgagcatga aaattcgcgg tgagcacccg aacgagatcg ccggggcagc 2640

aaccgcgcta ctggaaaacg cagcgccgtt cccgcgcccg gattatctgt ttgctgatat 2700

cgtcggtact ggcggtgacg gcagcaacag tatcaatatt tctaccgcca gtgcgtttgt 2760

cgccgcggcc tgtgggctga aagtggcgaa acacggcaac cgtagcgtct ccagtaaatc 2820

tggttcgtcc gatctgctgg cggcgttcgg tattaatctt gatatgaacg ccgataaatc 2880

gcgccaggcg ctggatgagt taggtgtatg tttcctcttt gcgccgaagt atcacaccgg 2940

attccgccac gcgatgccgg ttcgccagca actgaaaacc cgcaccctgt tcaatgtgct 3000

ggggccattg attaacccgg cgcatccgcc gctggcgtta attggtgttt atagtccgga 3060

actggtgctg ccgattgccg aaaccttgcg cgtgctgggg tatcaacgcg cggcggtggt 3120

gcacagcggc gggatggatg aagtttcatt acacgcgccg acaatcgttg ccgaactgca 3180

tgacggcgaa attaaaagct atcagctcac cgcagaagac tttggcctga caccctacca 3240

ccaggagcaa ctggcaggcg gaacaccgga agaaaaccgt gacattttaa cacgtttgtt 3300

acaaggtaaa ggcgacgccg cccatgaagc agccgtcgct gcgaacgtcg ccatgttaat 3360

gcgcctgcat ggccatgaag atctgcaagc caatgcgcaa accgttcttg aggtactgcg 3420

cagtggttcc gcttacgaca gagtcaccgc actggcggca cgagggtaaa tgatgcaaac 3480

cgttttagcg aaaatcgtcg cagacaaggc gatttgggta gaagcccgca aacagcagca 3540

accgctggcc agttttcaga atgaggttca gccgagcacg cgacattttt atgatgcgct 3600

acagggtgcg cgcacggcgt ttattctgga gtgcaagaaa gcgtcgccgt caaaaggcgt 3660

gatccgtgat gatttcgatc cagcacgcat tgccgccatt tataaacatt acgcttcggc 3720

aatttcggtg ctgactgatg agaaatattt tcaggggagc tttaatttcc tccccatcgt 3780

cagccaaatc gccccgcagc cgattttatg taaagacttc attatcgacc cttaccagat 3840

ctatctggcg cgctattacc aggccgatgc ctgcttatta atgctttcag tactggatga 3900

cgaccaatat cgccagcttg ccgccgtcgc tcacagtctg gagatggggg tgctgaccga 3960

agtcagtaat gaagaggaac aggagcgcgc cattgcattg ggagcaaagg tcgttggcat 4020

caacaaccgc gatctgcgtg atttgtcgat tgatctcaac cgtacccgcg agcttgcgcc 4080

gaaactgggg cacaacgtga cggtaatcag cgaatccggc atcaatactt acgctcaggt 4140

gcgcgagtta agccacttcg ctaacggttt tctgattggt tcggcgttga tggcccatga 4200

cgatttgcac gccgccgtgc gccgggtgtt gctgggtgag aataaagtat gtggcctgac 4260

gcgtgggcaa gatgctaaag cagcttatga cgcgggcgcg atttacggtg ggttgatttt 4320

tgttgcgaca tcaccgcgtt gcgtcaacgt tgaacaggcg caggaagtga tggctgcggc 4380

accgttgcag tatgttggcg tgttccgcaa tcacgatatt gccgatgtgg tggacaaagc 4440

taaggtgtta tcgctggcgg cagtgcaact gcatggtaat gaagaacagc tgtatatcga 4500

tacgctgcgt gaagctctgc cagcacatgt tgccatctgg aaagcattaa gcgtcggtga 4560

aaccctgccc gcccgcgagt ttcagcacgt tgataaatat gttttagaca acggccaggg 4620

tggaagcggg caacgttttg actggtcact attaaatggt caatcgcttg gcaacgttct 4680

gctggcgggg ggcttaggcg cagataactg cgtggaagcg gcacaaaccg gctgcgccgg 4740

acttgatttt aattctgctg tagagtcgca accgggcatc aaagacgcac gtcttttggc 4800

ctcggttttc cagacgctgc gcgcatatta aggaaaggaa caatgacaac attacttaac 4860

ccctattttg gtgagtttgg cggcatgtac gtgccacaaa tcctgatgcc tgctctgcgc 4920

cagctggaag aagcttttgt cagtgcgcaa aaagatcctg aatttcaggc tcagttcaac 4980

gacctgctga aaaactatgc cgggcgtcca accgcgctga ccaaatgcca gaacattaca 5040

gccgggacga acaccacgct gtatctcaag cgtgaagatt tgctgcacgg cggcgcgcat 5100

aaaactaacc aggtgctggg gcaggcgttg ctggcgaagc ggatgggtaa aaccgaaatc 5160

atcgccgaaa ccggtgccgg tcagcatggc gtggcgtcgg cccttgccag cgccctgctc 5220

ggcctgaaat gccgtattta tatgggtgcc aaagacgttg aacgccagtc gcctaacgtt 5280

tttcgtatgc gcttaatggg tgcggaagtg atcccggtgc atagcggttc cgcgacgctg 5340

aaagatgcct gtaacgaggc gctgcgcgac tggtccggta gttacgaaac cgcgcactat 5400

atgctgggca ccgcagctgg cccgcatcct tatccgacca ttgtgcgtga gtttcagcgg 5460

atgattggcg aagaaaccaa agcgcagatt ctggaaagag aaggtcgcct gccggatgcc 5520

gttatcgcct gtgttggcgg cggttcgaat gccatcggca tgtttgctga tttcatcaat 5580

gaaaccaacg tcggcctgat tggtgtggag ccaggtggtc acggtatcga aactggcgag 5640

cacggcgcac cgctaaaaca tggtcgcgtg ggtatctatt tcggtatgaa agcgccgatg 5700

atgcaaaccg aagacgggca gattgaagaa tcttactcca tctccgccgg actggatttc 5760

ccgtctgtcg gcccacaaca cgcgtatctt aacagcactg gacgcgctga ttacgtgtct 5820

attaccgatg atgaagccct tgaagccttc aaaacgctgt gcctgcacga agggatcatc 5880

ccggcgctgg aatcctccca cgccctggcc catgcgttga aaatgatgcg cgaaaacccg 5940

gataaagagc agctactggt ggttaacctt tccggtcgcg gcgataaaga catcttcacc 6000

gttcacgata ttttgaaagc acgaggggaa atctgatgga acgctacgaa tctctgtttg 6060

cccagttgaa ggagcgcaaa gaaggcgcat tcgttccttt cgtcacgctc ggtgatccgg 6120

gcattgagca gtcattgaaa attatcgata cgctaattga agccggtgct gacgcgctgg 6180

agttaggtat ccccttctcc gacccactgg cggatggccc gacgattcaa aacgccactc 6240

tgcgcgcctt tgcggcaggt gtgactccgg cacaatgttt tgaaatgctg gcactgattc 6300

gccagaaaca cccgaccatt cccattggcc tgttgatgta tgccaatctg gtgtttaaca 6360

aaggcattga tgagttttat gcccagtgcg aaaaagtcgg cgtcgattcg gtgctggttg 6420

ccgatgtgcc agttgaagag tccgcgccct tccgccaggc cgcgttgcgt cataatgtcg 6480

cacctatctt catctgcccg ccaaatgccg atgacgacct gctgcgccag atagcctctt 6540

acggtcgtgg ttacacctat ttgctgtcac gagcaggcgt gaccggcgca gaaaaccgcg 6600

ccgcgttacc cctcaatcat ctggttgcga agctgaaaga gtacaacgct gcacctccat 6660

tgcagggatt tggtatttcc gccccggatc aggtaaaagc agcgattgat gcaggagctg 6720

cgggcgcgat ttctggttcg gccattgtta aaatcatcga gcaacatatt aatgagccag 6780

agaaaatgct ggcggcactg aaagtttttg tacaaccgat gaaagcggcg acgcgcagtt 6840

aactgcaggt cgactctaga ggatccccgg gtaccgagct cgaattcact ggccgtcgtt 6900

ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 6960

ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 7020

ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc 7080

ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta 7140

agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgagctta gtaaagccct cgctagattt 7200

taatgcggat gttgcgatta cttcgccaac tattgcgata acaagaaaaa gccagccttt 7260

catgatatat ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca 7320

gacttgacct gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta acgcttgagt 7380

taagccgcgc cgcgaagcgg cgtcggcttg aacgaattgt tagacattat ttgccgacta 7440

ccttggtgat ctcgcctttc acgtagtgga caaattcttc caactgatct gcgcgcgagg 7500

ccaagcgatc ttcttcttgt ccaagataag cctgtctagc ttcaagtatg acgggctgat 7560

actgggccgg caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac atccttcggc gcgattttgc 7620

cggttactgc gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac tacatttcgc tcatcgccag 7680

cccagtcggg cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt tagcgcctca aatagatcct 7740

gttcaggaac cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc taccaaggca acgctatgtt 7800

ctcttgcttt tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat cgtggctggc tcgaagatac 7860

ctgcaagaat gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag ttcgcgctta gctggataac 7920

gccacggaat gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc tacagcgcgg agaatctcgc 7980

tctctccagg ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat caaagctcgc cgcgttgttt 8040

catcaagcct tacggtcacc gtaaccagca aatcaatatc actgtgtggc ttcaggccgc 8100

catccactgc ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt cggttcgaga tggcgctcga 8160

tgacgccaac tacctctgat agttgagtcg atacttcggc gatcaccgct tccctcatga 8220

tgtttaactt tgttttaggg cgactgccct gctgcgtaac atcgttgctg ctccataaca 8280

tcaaacatcg acccacggcg taacgcgctt gctgcttgga tgcccgaggc atagactgta 8340

ccccaaaaaa acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc 8400

gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagcttac 8460

gaaccgaaca ggcttatgtc cactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc 8520

acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc 8580

gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca 8640

aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg aagacctcgg ccgtcgcggc 8700

gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg 8760

agcatcgttt gttcgcccag cttctgtatg gaacgggcat gcggatcagt gagggtttgc 8820

aactgcgggt caaggatctg gatttcgatc acggcacgat catcgtgcgg gagggcaagg 8880

gctccaagga tcgggccttg atgttacccg agagcttggc acccagcctg cgcgagcagg 8940

ggaattaatt cccacgggtt ttgctgcccg caaacgggct gttctggtgt tgctagtttg 9000

ttatcagaat cgcagatccg gcttcagccg gtttgccggc tgaaagcgct atttcttcca 9060

gaattgccat gattttttcc ccacgggagg cgtcactggc tcccgtgttg tcggcagctt 9120

tgattcgata agcagcatcg cctgtttcag gctgtctatg tgtgactgtt gagctgtaac 9180

aagttgtctc aggtgttcaa tttcatgttc tagttgcttt gttttactgg tttcacctgt 9240

tctattaggt gttacatgct gttcatctgt tacattgtcg atctgttcat ggtgaacagc 9300

tttgaatgca ccaaaaactc gtaaaagctc tgatgtatct atctttttta caccgttttc 9360

atctgtgcat atggacagtt ttccctttga tatgtaacgg tgaacagttg ttctactttt 9420

gtttgttagt cttgatgctt cactgataga tacaagagcc ataagaacct cagatccttc 9480

cgtatttagc cagtatgttc tctagtgtgg ttcgttgttt ttgcgtgagc catgagaacg 9540

aaccattgag atcatactta ctttgcatgt cactcaaaaa ttttgcctca aaactggtga 9600

gctgaatttt tgcagttaaa gcatcgtgta gtgtttttct tagtccgtta tgtaggtagg 9660

aatctgatgt aatggttgtt ggtattttgt caccattcat ttttatctgg ttgttctcaa 9720

gttcggttac gagatccatt tgtctatcta gttcaacttg gaaaatcaac gtatcagtcg 9780

ggcggcctcg cttatcaacc accaatttca tattgctgta agtgtttaaa tctttactta 9840

ttggtttcaa aacccattgg ttaagccttt taaactcatg gtagttattt tcaagcatta 9900

acatgaactt aaattcatca aggctaatct ctatatttgc cttgtgagtt ttcttttgtg 9960

ttagttcttt taataaccac tcataaatcc tcatagagta tttgttttca aaagacttaa 10020

catgttccag attatatttt atgaattttt ttaactggaa aagataaggc aatatctctt 10080

cactaaaaac taattctaat ttttcgcttg agaacttggc atagtttgtc cactggaaaa 10140

tctcaaagcc tttaaccaaa ggattcctga tttccacagt tctcgtcatc agctctctgg 10200

ttgctttagc taatacacca taagcatttt ccctactgat gttcatcatc tgagcgtatt 10260

ggttataagt gaacgatacc gtccgttctt tccttgtagg gttttcaatc gtggggttga 10320

gtagtgccac acagcataaa attagcttgg tttcatgctc cgttaagtca tagcgactaa 10380

tcgctagttc atttgctttg aaaacaacta attcagacat acatctcaat tggtctaggt 10440

gattttaatc actataccaa ttgagatggg ctagtcaatg ataattacta gtccttttcc 10500

tttgagttgt gggtatctgt aaattctgct agacctttgc tggaaaactt gtaaattctg 10560

ctagaccctc tgtaaattcc gctagacctt tgtgtgtttt ttttgtttat attcaagtgg 10620

ttataattta tagaataaag aaagaataaa aaaagataaa aagaatagat cccagccctg 10680

tgtataactc actactttag tcagttccgc agtattacaa aaggatgtcg caaacgctgt 10740

ttgctcctct acaaaacaga ccttaaaacc ctaaaggctt aagtagcacc ctcgcaagct 10800

cgggcaaatc gctgaatatt ccttttgtct ccgaccatca ggcacctgag tcgctgtctt 10860

tttcgtgaca ttcagttcgc tgcgctcacg gctctggcag tgaatggggg taaatggcac 10920

tacaggcgcc ttttatggat tcatgcaagg aaactaccca taatacaaga aaagcccgtc 10980

acgggcttct cagggcgttt tatggcgggt ctgctatgtg gtgctatctg actttttgct 11040

gttcagcagt tcctgccctc tgattttcca gtctgaccac ttcggattat cccgtgacag 11100

gtcattcaga ctggctaatg cacccagtaa ggcagcggta tcatcaacag gctta 11155

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 1

<400> 16

aggcaacact atgacatcgt gtaggctgga gctgcttc 38

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 2

<400> 17

ggtcgccatt aacaacgtgg catatgaata tcctccttag 40

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 3

<400> 18

tattgagtgt atcgccaac 19

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 4

<400> 19

cgatgtcata gtgttgcc 18

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 5

<400> 20

ccacgttgtt aatggcgacc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 6

<400> 21

ttcattgaac gggtgatttc 20

<210> 22

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 7

<400> 22

tccgcacgtt tatgatatgc tatcgtactc tttagcgagt acaaccgggg gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 23

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 8

<400> 23

gccacgtctt atcaggccta caaaatcaat cgcttttcag caacacctct catatgaata 60

tcctccttag 70

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 9

<400> 24

gcgccgggcg tatcgacgca 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 10

<400> 25

gcatatcata aacgtgcgga 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 11

<400> 26

tgtaggcctg ataagacgtg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 12

<400> 27

aaggggcgat cggcgtgttt 20

<210> 28

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 13

<400> 28

atggcaacac taaccaccac ccaaacgtca ccgtcgctgc ttggcggcgt gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 29

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 14

<400> 29

ttactgatac accggcagta aattaaagct cgataaaata tgcaccagtg catatgaata 60

tcctccttag 70

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 15

<400> 30

gcagccgtta cattggtaac 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 16

<400> 31

gtggtggtta gtgttgccat 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 17

<400> 32

tactgccggt gtatcagtaa 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 18

<400> 33

tcaaaccgtc agcacggctg 20

<210> 34

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 19

<400> 34

atgaaggatt atgtaatgga aaactttaaa catctccctg aaccgttccg gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 35

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 20

<400> 35

ttagccaaat ttaggtaaca cgttaaagac gttgccgaac cagcacaaaa catatgaata 60

tcctccttag 70

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 21

<400> 36

ttaagcgaaa tcaccgggga a 21

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 22

<400> 37

atgtccgagc actggcgc 18

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 23

<400> 38

cccaagcttg ctgttgacaa ttaatcat 28

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 24

<400> 39

aaaactgcag ctgtttcctg tgtgaaat 28

<210> 40

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 25

<400> 40

aaaactgcag atgcaaacac aaaaaccgac t 31

<210> 41

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 26

<400> 41

aaaactgcag ttaactgcgc gtcgccgctt tc 32

<210> 42

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 27

<400> 42

aaacgcgttg tgaatcatcc tgctctgaca actcaatttc aggagccttt gccgccagct 60

gaagctttac 70

<210> 43

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 28

<400> 43

acagcacgct tttcagcgcc aggtagtcac ggtagttagc cggagaaata tagtggatct 60

gatgggtacc 70

<210> 44

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 29

<400> 44

tgccctatga gctccggtta caggcgtttc agtcataaat cctctgaatg aaacgcgttg 60

tgaatcatcc 70

<210> 45

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 30

<400> 45

atcgcccgct tccagcgcat ctgccggaac cagccaggaa ccaccgatgc acagcacgct 60

tttcagcgcc 70

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 31

<400> 46

catgatcttg cgcagattgt a 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 32

<400> 47

catgatcttg cgcagattgt a 21

Claims (6)

1.生产L-色氨酸的埃希氏菌属的修饰的微生物，

其中所述微生物中的修饰由以下(a)和(b)组成：

(a)其中内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda)的活性被减弱或失活，

其中所述微生物具有减弱或受阻的恩特纳-杜德洛夫途径，以及

(b)其中pheA基因、trpR基因、mtr基因和tnaAB基因的全部或部分被进一步缺失；并且

其中所述微生物与包含内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda)的活性的未修饰的微生物相比具有提高的L-色氨酸生产能力。

2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述6-磷酸葡萄糖酸脱水酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述埃希氏菌属微生物是大肠杆菌。

5.制备L-色氨酸的方法，包括：

在培养基中培养生产L-色氨酸的埃希氏菌属的修饰的微生物，

其中所述微生物中的修饰由以下(a)和(b)组成：

(a)其中内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda)的活性被减弱或失活，

其中所述微生物具有减弱或受阻的恩特纳-杜德洛夫途径，

(b)其中pheA基因、trpR基因、mtr基因和tnaAB基因的全部或部分被进一步缺失；以及

其中所述微生物与包含内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda)活性的未修饰的微生物相比具有提高的L-色氨酸生产能力；和

从所述培养基或培养的微生物中回收L-色氨酸。

6.埃希氏菌属的修饰的微生物用于生产L-色氨酸的用途，

其中所述微生物中的修饰由以下(a)和(b)组成：

(a)其中内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda)的活性被减弱或失活，并且

其中所述微生物具有减弱或受阻的恩特纳-杜德洛夫途径；

(b)其中pheA基因、trpR基因、mtr基因和tnaAB基因的全部或部分被进一步缺失。