BR112016030467B1 - Microrganismo do gênero escherichia produtor de l-triptofano e método para produzir l-triptofano usando o mesmo - Google Patents
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Abstract
MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA PRODUTOR DE L-TRIPTOFANO E MÉTODO PARA PRODUZIR L-TRIPTOFANO USANDO O MESMO. O presente pedido se refere a um microrganismo do gênero Escherichia produtor de L-triptofano e, mais especificamente, a um microrganismo do gênero Escherichia com atividade melhorada de produção de L-triptofano por enfraquecimento ou inativação da atividade de 6-fosfogluconato desidratase endógena e 2- ceto-3- desoxi-6-fosfogluconato aldolase. Além disso, o presente pedido se refere a um método para a produção de L-triptofano usando o microrganismo do gênero Escherichia.
Description
[001] [Campo Técnico]
[002] O presente pedido se refere a um microrganismo do gênero Escherichia produtor de L-triptofano e a um método para a produção de L- triptofano usando o microrganismo.
[003] [Antecedentes da Técnica]
[004] O L-triptofano, que é um aminoácido essencial, tem sido amplamente usado como um aditivo de alimentos, etc., e também tem sido amplamente usado como uma matéria-prima para produtos farmacêuticos, tais como soluções de infusão e ingredientes de alimentos saudáveis. O L- triptofano pode ser produzido por um método de síntese química, um método de reação enzimática, um método de fermentação, etc., mas o método de fermentação direta que usa um microrganismo é principalmente usado atualmente.
[005] Em relação à direção do desenvolvimento de uma cepa produtora de L-triptofano, o desenvolvimento foi inicialmente prosseguido por seleção de mutações (Patente Coreana n° 1987-0001813), ou por métodos de superação da inibição do feedback de triptofano pelas enzimas nas vias de biossíntese juntamente com a engenharia genética, ou melhorando a síntese enzimática em processos metabólicos, tal como melhorando a expressão de enzimas de biossíntese de triptofano.
[006] Entretanto, um método para aprimorar os L-aminoácidos que utilizam a via Entner-Doudoroff foi anteriormente divulgado (Patente US n° 7432085). A Patente US n° 7432085 se refere a um método para melhorar a produção de L-aminoácido produzido por uma via de biossíntese que utiliza o ácido pirúvico como um intermediário, através da melhora das atividades das enzimas envolvidas na via Entner-Doudoroff, e especificamente, uma característica principal da patente é a de melhorar a atividade da 6- fosfogluconato desidratase ou da 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase.
[007] No entanto, os presentes inventores confirmaram pela primeira vez que, no caso de L-triptofano, ao contrário de outros L-aminoácidos, quando as atividades de 6-fosfogluconato desidrogenase e de 2-ceto-3-desoxi-6- fosfogluconato aldolase na via Entner-Doudoroffsão ambas enfraquecidas ou inativadas, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser significativamente aprimorada, completando assim a presente invenção sobre o microrganismo do gênero Escherichia com uma capacidade aprimorada de produção de L- triptofano e um método para a produção de L-triptofano com o uso do microrganismo.
[008] [Divulgação]
[009] [Problema técnico]
[010] Um objetivo do presente pedido consiste em fornecer um microrganismo produtor de L-triptofano.
[011] Outro objetivo do presente pedido é fornecer um método para produzir de forma eficaz o L-triptofano com o uso do microrganismo produtor de L-triptofano.
[012] [Solução técnica]
[013] A fim de obter os objetivos acima, em um aspecto, o presente pedido fornece um microrganismo do gênero Escherichia produtor de L-triptofano por enfraquecimento ou inativação da atividade da 6-fosfogluconato desidratase endógena (edd) e 2-ceto-3-desoxi 6-fosfogluconato aldolase (eda).
[014] Como usado na presente invenção, o termo "L-triptofano" se refere a um L-- aminoácido aromático, que é um a-aminoácido e um aminoácido essencial não sintetizado in vivo, tendo uma fórmula química de C11H12N2O2.
[015] Como usado na presente invenção, o termo "via Entner-Doudoroff" se refere a uma via metabólica do carbono presente em um microrganismo do gênero Escherichia, que é uma via que catalisa a conversão de fontes de carbono introduzidas na via metabólica do carbono em gliceraldeído-3-fosfato e piruvato através de uma reação enzimática de duas etapas em série por 6- fosfogluconato desidratase e 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase.
[016] Como usado na presente invenção, o termo "6-fosfogluconato desidratase (Edd; EC 4.2.1.12)" se refere a uma enzima envolvida na via Entner-Doudoroff, que catalisa a reação de conversão de 6-fosfo-D-gluconato em 2-di-hidro-3-desoxi-6-fosfo-D-gluconato. Especificamente, a enzima pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, mas qualquer sequência tendo a atividade da enzima pode ser incluída sem limitação. Adicionalmente, em uma modalidade exemplificadora, o gene que codifica a 6-fosfogluconato desidratase pode ser representado pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, mas qualquer sequência que codifica a enzima pode ser incluída sem limitação.
[017] Como usado na presente invenção, o termo "2-ceto-3-desoxi-6- fosfogluconato aldolase (Eda; EC 4.1.2.14)" se refere a uma enzima envolvida na via Entner-Doudoroff, que catalisa a reação de conversão de 2-di-hidro-3- desoxi-6-fosfo-D-gluconato para gliceraldeído-3-fosfato e piruvato. Especificamente, a enzima pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, mas qualquer sequência tendo a atividade da enzima pode ser incluída sem limitação. Adicionalmente, em uma modalidade exemplificadora, o gene que codifica a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase pode ser representado pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4, mas qualquer sequência que codifica a enzima pode ser incluída sem limitação.
[018] Cada uma das enzimas descritas acima pode incluir, sem limitação, além das sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 1 a 3, qualquer sequência de aminoácidos que tem uma homologia de 70% ou mais, mais especificamente, de 80% ou mais, mais especificamente, de 90% ou mais, ainda mais especificamente, de 95% ou mais, ainda mais especificamente, de 98% ou mais, e mesmo ainda mais especificamente, de 99% ou mais, a cada uma das sequências de aminoácidos listadas acima, desde que a enzima apresente um efeito substancialmente igual a, ou correspondente a, cada uma das enzimas. Adicionalmente, é óbvio que qualquer enzima modificada que tenha a homologia descrita acima e tenha o efeito correspondente a cada enzima pode pertencer ao escopo do presente pedido, embora a enzima possa ter uma sequência de aminoácidos com uma deleção, modificação, substituição ou adição parcial.
[019] Além disso, os genes que codificam cada uma das enzimas também podem incluir, sem limitação, além das sequências de nucleotídeos representadas pela SEQ ID NO: 2 ou 4, qualquer sequência de genes que codifica as enzimas, que tenha uma homologia de 80% ou mais, especificamente, de 90 % ou mais, mais especificamente, de 95% ou mais, ainda mais especificamente, de 98% ou mais, e ainda mais especificamente, de 99% ou mais, para cada uma das sequências de nucleotídeos listadas acima, desde que a sequência codifique uma enzima que tenha um efeito substancialmente igual ou correspondente a cada uma das enzimas. Adicionalmente, é óbvio que qualquer sequência de nucleotídeos que tenha as homologias acima pode pertencer ao escopo do presente pedido, embora a sequência possa ter uma deleção, modificação, substituição ou adição parcial na mesma.
[020] Como usado na presente invenção, o termo "homologia" se refere a uma porcentagem de identidade entre duas porções de polinucleotídeos ou polipeptídeos. A correspondência de sequências de uma porção para outra pode ser determinada por uma técnica conhecida na técnica. Por exemplo, a homologia pode ser determinada alinhando diretamente a informação de sequência (por exemplo, parâmetros tais como pontuação, identidade e similaridade) em duas moléculas de polinucleotídeos ou duas moléculas de polipeptídeos com o uso de um programa de computador (por exemplo, BLAST 2.0) que é prontamente disponível e capaz de alinhar informações de sequências. Adicionalmente, a homologia pode ser determinada por hibridação dos polinucleotídeos sob a condição de formar um filamento duplo estável nas regiões homólogas e, em seguida, digerir o filamento hibridizado por uma nuclease específica de filamento simples para determinar o tamanho dos fragmentos digeridos.
[021] Como usado na presente invenção, o termo "atividade endógena"se refere a um estado ativo de uma enzima em um microrganismo em um estado natural ou antes da modificação.
[022] Como usado na presente invenção, o termo "enfraquecimento da atividade de uma enzima em comparação com a sua atividade endógena"se refere a um conceito que inclui um caso em que há uma diminuição na atividade de uma enzima em um microrganismo em comparação com a que ele possuía originalmente no seu estado natural ou antes da modificação, um caso em que o nível de expressão de proteína total é menor que o da cepa do tipo selvagem ou que o da cepa antes da modificação do microrganismo devido a inibição da expressão ou inibição da tradução do gene que codifica a mesma, ou um caso combinado dentre estes.
[023] Como usado na presente invenção, o termo "inativação"se refere a um caso em que o gene que codifica uma enzima em um microrganismo não é expresso no todo e um caso em que o gene é expresso, mas não exibe atividade em comparação com o da cepa do tipo selvagem ou com a cepa antes da modificação do microrganismo.
[024] O enfraquecimento ou a inativação de uma atividade enzimática pode ser obtido por vários métodos bem conhecidos na técnica. Exemplos de métodos podem incluir um método de substituição do gene que codifica a enzima no cromossoma com um gene mutado de modo que a atividade enzimática pode ser reduzida, incluindo o caso em que a atividade enzimática é eliminada; um método de introdução de uma modificação na sequência de controle de expressão do gene no cromossoma que codifica a enzima; um método de substituição da sequência de controle de expressão do gene que codifica a enzima com uma sequência tendo fraca atividade ou nenhuma atividade; um método de deleção de parte ou da totalidade de um gene que codifica a enzima no cromossoma; um método de introdução de um oligonucleotídeo antissentido (antisense) (por exemplo, RNA antissentido), que inibe a tradução do mRNA para uma enzima através de uma ligação complementar ao transcrito do gene no cromossoma; um método para tornar a fixação do ribossoma impossível através da formação de uma estrutura secundária por adição de modo artificial de uma sequência de Shine-Dalgarno (SD) e a sua sequência complementar na extremidade frontal da sequência de SD do gene que codifica a enzima; um método de engenharia de transcrição reversa (RTE), que adiciona um promotor para ser inversamente transcrito no terminal 3' da estrutura de leitura aberta (ORF) da sequência correspondente, etc., e pode também incluir uma combinação dos mesmos, mas não são limitados aos mesmos.
[025] Especificamente, o método de deleção de parte ou da totalidade de um gene que codifica a enzima pode ser realizado substituindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo endógena dentro do cromossoma por um polinucleotídeo ou um gene marcador tendo uma deleção parcial na sequência de ácido nucleico, utilizando um vetor para inserção cromossômica em bactérias. Em uma modalidade exemplificadora do método para deleção de parte ou da totalidade de um gene, o gene pode ser eliminado por recombinação homóloga.
[026] Como usado na presente invenção, o termo "parte", embora possa variar dependendo dos tipos de polinucleotídeos, pode se referir especificamente de 1 nucleotídeo a 300 nucleotídeos, mais especificamente, 1 nucleotídeo a 100 nucleotídeos e, ainda mais especificamente, 1 nucleotídeo a 50 nucleotídeos, mas não está particularmente limitado a isso.
[027] Como usado na presente invenção, o termo "recombinação homóloga"se refere à recombinação genética que ocorre através de cruzamento no loci da cadeia genética tendo homologia mutua.
[028] Especificamente, a sequência de controle de expressão pode ser modificada por indução de uma modificação da sequência de controle de expressão através da deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou uma combinação dos mesmos na sequência de ácidos nucleicos da sequência de controle de expressão; ou através da substituição por um promotor mais fraco, etc. A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica uma região de ligação ao ribossoma e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução.
[029] Além disso, a sequência de genes no cromossoma pode ser modificada por introdução de uma modificação na sequência por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou uma sua combinação dos mesmos na sequência de genes para enfraquecimento adicional da atividade enzimática; ou através da substituição com uma sequência de genes que foi aprimorada para ter atividade mais fraca ou uma sequência de genes que foi aprimorada para não ter nenhuma atividade.
[030] Em uma modalidade exemplificadora do presente pedido, confirmou- se que o enfraquecimento ou inativação da atividade pode ser realizado por pelo menos um método de mutação selecionado do grupo que consiste em uma mutação de inserção realizada inserindo pelo menos um par de bases no gene que codifica a 6-fosfogluconato desidratase e no gene que codifica a 2- ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase; uma mutação de deleção realizada tendo uma deleção em pelo menos um par de bases dentro do gene; e uma mutação de transição ou de transversão de um par de bases realizada pela introdução de um códon sem sentido (non-sense) ou de um códon diferente no gene.
[031] No presente pedido, o microrganismo do gênero Escherichia pode ser especificamente Escherichia coli, mas não está limitado à mesma.
[032] Especificamente, a cepa de origem do microrganismo do gênero Escherichia produtor de L-triptofano por enfraquecimento ou inativação das atividades de edd e eda pode não ser particularmente limitada, desde que o microrganismo pertença ao gênero de Escherichia. Por exemplo, o microrganismo produtor de L-triptofano pode ser um microrganismo em que, para melhorar a via biossintética, as atividades do gene na via competitiva, o regulador na via direcional do operon triptofano, e o gene para a introdução e decomposição do triptofano foram enfraquecidos ou inativados, e/ou a atividade do operon triptofano foi superexpressa. Os métodos de enfraquecimento ou inativação da atividade são os mesmos que os explicados acima, e os métodos conhecidos na técnica estão incluídos sem limitação. Adicionalmente, os métodos para superexpressar a atividade do operon triptofano conhecidos na técnica estão incluídos sem limitação. Por exemplo, os métodos podem incluir um método para introduzir adicionalmente um polinucleotídeo, que inclui parte ou a totalidade em si da sequência de nucleotídeos do gene do operon ou uma região de controle de expressão introduzida a partir do exterior, no cromossoma; um método para aumentar o número de cópias através da introdução em um sistema de vetor; um método para aumentar a atividade do operon através da substituição da sequência de controle de expressão que controla a expressão do gene com uma outra sequência de controle de expressão, uma modificação tendo uma mutação induzida em parte ou a totalidade da sequência de nucleotídeos da região de controle de expressão e uma introdução de uma modificação do gene em si, etc., mas não se limitam a estes. Especificamente, o microrganismo pode ser E. coli, em que parte ou a totalidade do gene pheA, gene trpR, gene mtr e gene tnaABsão deletados e/ou o operon triptofano é superexpresso.
[033] No presente pedido, o gene edd, gene eda, gene pheA, gene trpR, gene mtr, gene tnaAB, e o operon triptofano, e as sequências de proteínas codificadas por eles podem ser obtidos a partir de um banco de dados conhecido, por exemplo, GenBank de NCBI, mas não estão limitados ao mesmo. Além disso, os detalhes específicos no que diz respeito ao gene pheA, gene trpR, gene mtr, e gene tnaAB podem ser encontrados na divulgação da Patente Coreana n° 10-0792095, e todo o relatório descritivo desta Patente Coreana pode ser incluído como uma referência do presente pedido.
[034] A partir das modalidades exemplificadoras do presente pedido, foi confirmado que, em relação à inativação das atividades de 6-fosfogluconato desidratase e 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase em várias cepas de origem, qualquer microrganismo do gênero Escherichia, independentemente da sua cepa de origem, aprimorou significativamente a produção de L-triptofano quando as atividades tanto da 6-fosfogluconato desidratase como da 2-ceto-3- desoxi-6-fosfogluconato aldolase foram enfraquecidas ou inativadas juntas.
[035] Em um outro aspecto, o presente pedido fornece um método para a preparação de L-triptofano, incluindo a cultura de um microrganismo do gênero Escherichia produtor de L-triptofano por enfraquecimento ou inativação da atividade de 6-fosfogluconato desidratase endógena (edd) e 2-ceto-3-desoxi-6- fosfogluconato aldolase (eda) do presente pedido; e recuperação do L- triptofano a partir do meio cultivado ou do microrganismo cultivado.
[036] O meio e outras condições de culturas usados para a cultura do microrganismo do presente pedido não estão particularmente limitados, mas qualquer meio usado para a cultura convencional do microrganismo do gênero Escherichia pode ser usado. Especificamente, o microrganismo do presente pedido pode ser cultivado em um meio convencional contendo fontes de carbono apropriadas, fontes de nitrogênio, fontes de fósforo, compostos inorgânicos, aminoácidos e/ou vitaminas, etc., em uma condição aeróbica enquanto se ajusta a temperatura, o pH, etc..
[037] Exemplos de fontes de carbono a serem usadas no presente pedido podem incluir carboidratos tais como glicose, frutose, sacarose, maltose, manitol, sorbitol, etc.; álcoois tais como álcoois de açúcar, glicerol, piruvato, lactato, citrato, etc.; e os aminoácidos tais como o ácido orgânico, ácido glutâmico, metionina, lisina, etc.. Adicionalmente, os nutrientes orgânicos naturais tais como o hidrolisado de amido, melaços, melaços blackstrap, farelo de arroz, amido de mandioca, melaços de cana-de-açúcar, licor de maceração de milho, etc., especificamente, carboidratos tais como glicose e melaços pré- tratados estéreis (isto é, melaços convertidos em um açúcar redutor), etc.. Além disso, várias outras fontes de carbono em uma quantidade adequada podem ser usadas sem limitação. Estas fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou em uma combinação de duas ou mais.
[038] Exemplos das fontes de nitrogênio a serem usadas no presente pedido podem incluir compostos inorgânicos tais como amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, etc.; aminoácidos tais como ácido glutâmico, metionina, glutamina, etc.; e fontes de nitrogênio orgânico tais como peptona, NZ-amina, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, licor de maceração de milho, hidrolisado de caseína, peixe ou produtos de decomposição do mesmo, bagaço de feijão-soja desengordurado ou produtos de decomposição do mesmo, etc.. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em uma combinação de duas ou mais.
[039] Exemplos das fontes de fósforo a serem usadas no presente pedido podem incluir fosfato de potássio monobásico, fosfato de dipotássio dibásico, sais contendo sódio correspondentes, etc., mas não se limitam a estes. Exemplos de compostos inorgânicos podem incluir cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de manganês, carbonato de cálcio, etc. e, adicionalmente, aminoácidos, vitaminas e/ou precursores adequados para um meio de cultura podem ser incluídos. Estes meios ou precursores podem ser adicionados a uma cultura por meio de uma cultura em lotes ou cultura contínua.
[040] No presente pedido, o pH de uma cultura pode ser ajustado durante a cultura por adição de um composto tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico à cultura de uma maneira apropriada. Durante o período de cultura, um agente antiespuma, tal como éster poliglicólico de ácido graxo pode ser adicionado para evitar a produção de espuma. Adicionalmente, oxigênio ou um gás contendo oxigênio pode ser injetado na cultura de modo a manter um estado aeróbico da cultura; ou nitrogênio, hidrogênio ou gás dióxido de carbono podem ser injetados sem a injeção de um gás de modo a manter um estado anaeróbico ou microaeróbico da cultura.
[041] A temperatura da cultura pode estar geralmente em uma faixa de 27°C a 40°C, e especificamente, de 30°C a 37°C, mas não se limita às mesmas. A cultura pode ser continuada até se obter a quantidade desejada de materiais úteis, e especificamente durante de 10 horas a 100 horas, mas não se limita a isso.
[042] O L-triptofano pode ser recuperado através de um método adequado conhecido na técnica, por exemplo, cultura em lote, cultura contínua ou cultura de batelada alimentada, etc., de acordo com o método de cultivo do presente pedido.
[043] A recuperação pode também incluir uma etapa de purificação.
[044] Os L-aminoácidos podem ser liberados para o meio de cultura a ser cultivado, ou podem estar contidos nos microrganismos.
[045] [Efeitos Vantajosos da Invenção]
[046] O presente pedido fornece um microrganismo do gênero Escherichia produtor de L-triptofano por enfraquecimento ou inativação da atividade de 6- fosfogluconato desidratase endógena e 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase e, assim, o presente pedido fornece um efeito de que o L-triptofano pode ser produzido com maior rendimento e com maior eficiência e eficácia de custos com o uso do microrganismo.
[047] [Modos para Realizar a Invenção]
[048] Em seguida, o presente pedido será descrito em detalhe através dos exemplos anexos. Contudo, os exemplos aqui divulgados são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo do presente pedido.
[049] Exemplo Comparativo 1: Preparação de uma cepa de origem (?pheA?trpR?mtr?tnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO) a. Preparação de uma cepa do tipo selvagem em que as proteínas codificadas pelos genes pheA, trpR, mtr e tnaABsão inativadas
[050] Para melhorar a via de biossíntese do triptofano através da cepa de origem, o gene pheA, que é um gene na via de competidor; o gene trpR, que é um regulador do operon triptofano e a via direcional; o gene mtr, que é um gene para a introdução de triptofano; e os genes tnaA e tnaB, que são os genes para a introdução e decomposição de triptofano, foram todos inativados, e, assim, a capacidade de produção de triptofano do microrganismo do presente pedido foi melhor examinada. A corismato mutase/prefenato hidratase codificada pelo gene pheA; repressor da transcrição trpR codificado pelo gene trpR; triptofano/indol: simportador H+ codificado pelo gene mtr; e triptofanase e triptofano: simportador H+ codificado pelos genes tnaA e tnaB na forma de um operon foram todos inativados por recombinação homóloga dos genes em E. coli W3110 (ATCC®39936TM). Para esta finalidade, o método de inativação de uma etapa usando lambda Red recombinase desenvolvido por Datsenko KA et al. Foi usado, e a inativação foi realizada com base no método descrito na Patente Coreana n° 10-0792095. As sequências dos iniciadores usados no Exemplo Comparativo 1 aqui descrito e no Exemplo Comparativo 2 e Exemplos 1 e 3 descritos abaixo estão apresentadas na Tabela 3 abaixo.
[051] Especificamente, cerca de 1.100 pares de fragmentos de genes foram amplificados por PCR usando o gene pKD3 como molde, juntamente com uma parte do gene pheA tendo uma sequência de SEQ ID NO: 6 e iniciadores 1 e 2 tendo uma sequência de nucleotídeos parcial do gene resistente a cloranfenicol do gene pKD3. Em seguida, os fragmentos de DNA obtidos por PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8%, eluídos e usados como molde para a segunda PCR. Para obter os fragmentos de DNA 5' e 3' do gene pheA em E. coli, cerca de 250 pares de fragmentos de genes foram amplificados por PCR utilizando o cromossoma de E. coli W3110 como molde, juntamente com os iniciadores 3 e 4 e os iniciadores 5 e 6. Em seguida, os fragmentos de DNA obtidos por PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8%, eluídos e usados como molde para a segunda PCR.
[052] No anterior, as sequências de nucleotídeos de 18 pares entre o iniciador 1 e o iniciador 4 são complementares e as sequências de nucleotídeos de 20 pares entre o iniciador 2 e o iniciador 5 são complementares e, assim, os fragmentos obtidos pelo iniciador 1 e o iniciador 2, os obtidos pelo iniciador 3 e o iniciador 4, e os obtidos pelo iniciador 5 e o iniciador 6 podem ser ligados como um único fragmento. Os fragmentos de PCR assim obtidos foram amplificados 5 vezes por PCR sem usar qualquer iniciador, tratados com os iniciadores 3 e 6 e novamente amplificados 25 vezes por PCR. Como resultado, os fragmentos de gene com um tamanho de cerca de 1600 pares de bases foram amplificados.
[053] Em seguida, E. coli W3110, que foi transformada com pKD46, foi preparada em células competentes de acordo com o método desenvolvido por Datsenko KA et al., introduzida com fragmentos de genes com um tamanho de cerca de 1600 pares de bases obtidos por PCR, e plaqueados em meio sólido LB contendo cloranfenicol (30 mg/L). Após a confirmação por PCR que o gene pheA na cepa assim obtida foi inativado por ter um tamanho de 1.600 pares de bases, a cepa ?pheA de E. coli W3110 foi preparada.
[054] Da mesma forma, as proteínas codificadas pelo gene trpR tendo a sequência de SEQ ID NO: 8, o gene mtr tendo a sequência de SEQ ID NO: 10, e pelos genes tnaA e tnaB tendo as sequências de SEQ ID NOs: 12 e 14 foram inativadas utilizando os iniciadores da Tabela 3, construindo assim uma cepa W3110?pheA?trpR?mtr?tnaAB.
[055] (2) Preparação de vetores introduzidos com genes que exibem a capacidade de produzir triptofano
[056] A fim de fornecer uma capacidade de produção de triptofano com a cepa do tipo selvagem, W3110?pheA?trpR?mtr?tnaAB, preparada acima, o vetor pLC1920 foi inserido com o promotor Ptrc e o gene do operon triptofano e assim pCL1920-Ptrc-trpO foi preparada.
[057] Especificamente, para a inserção do promotor Ptrc no vetor pLC1920, oplasmídeo pCL1920 foi recuperado, tratado com HindM e PstI, e o promotor Ptrc foi preparado por PCR através da repetição de 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, recozimento a 58°C durante 30 segundos, e a polimerização a 72°C durante 30 segundos usando pTrcHis B (Invitrogen, EUA) como um molde, juntamente com os iniciadores 23 e 24. Os fragmentos de promotor Ptrc assim obtidos foram clivados com Hind ff e PstI, e ligados com o vetor de pCL1920, construindo assim um vetor pCL1920-Ptrc.
[058] Em seguida, para a construção do vetor pCL1920_Ptrc_trpO, o vetor pCL1920-Ptrc foi preparado por tratamento com PstI e fosfatase alcalina, e o gene do operon triptofano foi amplificado a partir do DNA cromossômico de E. coli KCCM10812P (Patente Coreana n° 10-0792095). O gene trpE, que é o primeiro gene do gene operon correspondente, tem uma forma retroinibição. Para a amplificação, PCR foi realizada usando o DNA cromossômico de E. coli KCCM10812P como molde, juntamente com os iniciadores 25 e 26 através da repetição de 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, recozimento a 58°C durante 30 segundos, e polimerização a 72°C durante 5 minutos. Os fragmentos de DNA assim obtidos foram tratados com Pst I e ligados com o vetor de pCL1920-Ptrc preparado antecipadamente, e o vetor obtido como resultado foi nomeado como pCL1920_Ptrc_trpO (SEQ ID NO: 15).
[059] (3) Preparação de uma cepa inserida com um vetor contendo operon triptofano
[060] Após a preparação da cepa preparada no Exemplo Comparativo 1 (1) em células competentes, a cepa foi introduzida com o vetor preparado no Exemplo Comparativo 1 (2), e, assim, uma cepa do tipo selvagem W3110 ?pheA?trpR?mtr?tnaAB/pCL1920-Ptrc-trpOprodutora de triptofano foi preparada.
[061] Exemplo 1: Preparação de uma cepa ?edd?eda da cepa de origem do Exemplo Comparativo 1
[062] Na cepa do tipo selvagem W3110 ?pheA?trpR?mtr?tnaAB/pCL1920-Ptrc-trpOpreparada no Exemplo Comparativo 1, o grupo de gene edd-eda foi deletado simultaneamente por recombinação homóloga, e deste modo uma cepa, em que tanto a 6- fosfogluconato desidratase quanto a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, codificadas pelo gene edd (SEQ ID NO: 2) e pelo gene eda (SEQ ID NO: 4) foram ambas inativadas, foi preparada.
[063] Especificamente, para a preparação da cepa acima, o método de inativação de uma etapa, que é uma tecnologia geradora de mutante usando lambda Red recombinase desenvolvido por Datsenko KA et al., foi usado. Como o marcador para confirmar a inserção em um gene, o gene resistente a cloranfenicol de pUCprmfmloxC foi usado (Publicação do Pedido de Patente Coreana n° 2009-007554). Cerca de 1.200 pares de fragmentos de genes foram amplificados por PCR através da repetição de 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, recozimento a 55°C durante 30 segundos, e polimerização a 72°C durante 1 minuto, usando pUCprmfmloxC como molde, juntamente com os iniciadores 27 e 28 tendo uma parte do grupo do gene edd- eda e uma sequência de nucleotídeos parcial do gene resistente a cloranfenicol do gene pUCprmfmloxC.
[064] Adicionalmente, os fragmentos de DNA obtidos por amplificação de PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8%, eluídos e usados como molde para a segunda PCR. A segunda PCR foi projetada para obter 20 pares de sequências de nucleotídeos complementares nas regiões 5' e 3' dos primeiros fragmentos de DNA, e cerca de 1.300 pares de fragmentos de gene foram amplificados por PCR através da repetição de 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, recozimento a 55°C durante 30 segundos, e polimerização a 72°C durante 1 minuto, utilizando o primeiro produto de PCR como molde, juntamente com os iniciadores 29 e 30, para os quais as regiões 5' e 3' do grupo de gene edd-eda foram adicionadas. Os fragmentos de DNA assim obtidos foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8%, eluídos e usados para a recombinação.
[065] A E. coli transformada com pKD46 de acordo com o método desenvolvido por Datsenko KA et al. foi preparada em um estado competente, e o fragmento de gene com um tamanho de 1.300 pares de bases obtidos por PCR foi introduzido no mesmo para transformação. A cepa assim obtida foi selecionada em meio LB contendo cloranfenicol, e o produto de PCR obtido utilizando os iniciadores 31 e 32 tinha um tamanho de 1.626 pares de bases, confirmando, assim, que o grupo de gene edd-eda foi deletado.
[066] A primeira cepa recombinante tendo resistência a cloranfenicol, após a remoção de pKD46, foi introduzida com pJW168, removendo, assim, o gene marcador de cloranfenicol a partir do corpo bacteriano (Gene, (2000) 247, 25564). O corpo bacteriano finalmente obtido foi um produto amplificado por PCR, obtido utilizando os iniciadores 31 e 32, tendo um tamanho de 580 pares, confirmando, assim, que a deleção pretendida foi feita. Além disso, depois de preparar a cepa em um estado competente, a cepa foi transformada pela introdução do vetor preparado no Exemplo Comparativo 1 no mesmo, preparando-se assim uma cepa W3110?pheA?trpR?mtr?tnaAB?edd?eda/pCL1920-Ptrc-trpO produtora de triptofano.
[067] Exemplo 2: Confirmação da capacidade de produção de triptofano da cepa ?edd?eda
[068] A avaliação da titulação foi realizada com o uso da cepa preparada no Exemplo Comparativo 1 e no Exemplo 1. Para a avaliação da titulação, o corpo bacteriano foi inoculado com um anel de platina, cultivado em meio LB sólido de um dia para o outro e inoculado com um anel de platina em cada meio de titulação do frasco de 25 mL tendo a composição mostrada na Tabela 1 abaixo. Após a inoculação, a cultura foi cultivada a 37°C a uma taxa de 200 rpm durante 42 horas, e os resultados obtidos a partir daí são mostrados na Tabela 2 abaixo. Todos os resultados usados representam o valor médio dos resultados obtidos a partir de três frascos diferentes. [Tabela 1]
[Tabela 2] * Valor medido no ponto de tempo de 22 horas ** valor medido no ponto de tempo de 42 horas
[069] Como resultado do experimento acima, como mostrado na Tabela 2 acima, quando o grupo de gene edd-eda sugerido no presente pedido foi deletado, não houve diferença significativa no consumo de glicose em comparação com o da cepa de origem no Exemplo Comparativo 1, no entanto, a quantidade de produção de triptofano aumentou cerca de 32% em comparação com a da cepa de origem. Este resultado é provavelmente devido ao fato de que a reação prosseguiu para 5-fosfato ribulose sem a perda de 6- fosfogluconato, que é um substrato, pela deleção na via de Entner Doudoroff e, assim, não apenas a quantidade de NADPH, mas também a quantidade de 5- fosforribosil-1-pirofosfato (PRPP) e 4-fosfato eritrose (E4P) foi aumentada, aprimorando desse modo a capacidade para produzir triptofano.
[070] Exemplo 3: Preparação de uma cepa ?edd?eda a partir da cepa depositada
[071] A E. coli KCCM11166P produtora de L-triptofano (Patente Coreana n° 10-1261147) depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM) foi tratada do mesmo modo que no Exemplo 1 e, assim, uma cepa KCCM11166P?edd?eda, na qual o grupo de gene edd-eda foi deletado, foi preparada. [Tabela 3 ]
Exemplo 4: Confirmação da capacidade de produção de triptofano da cepa ?edd?eda
[072] A avaliação da titulação foi realizada com o uso da cepa KCCM11166P depositada e a cepa preparada no Exemplo 3.
[073] Para a avaliação da titulação, o corpo de bactérias foi inoculado com um anel de platina, cultivado em meio LB sólido de um dia para o outro, e inoculado com um anel de platina para cada meio de titulação de frasco de 25 mL tendo a composição mostrada na Tabela 4 abaixo. Após a inoculação, a cepa foi cultivada a 37°C a uma taxa de 200 rpm durante 42 horas, e os resultados daí obtidos são mostrados na Tabela 5 abaixo. Todos os resultados usados representam o valor médio dos resultados obtidos a partir de três frascos diferentes. [Tabela 4 ]
[Tabela 5 ] * Valor medido no ponto de tempo de 33 horas ** Valor medido no ponto de tempo de 48 horas
[074] Como resultado do experimento acima, como mostrado na Tabela 5 acima, quando o grupo de gene edd-eda sugerido no presente pedido foi deletado, não houve diferença significativa no consumo de glicose em comparação com o da cepa de origem, no entanto, a quantidade de produção de triptofano mostrou um aumento em cerca de 21% em comparação com a da cepa de origem. Este resultado é provavelmente devido à melhoria na capacidade de produção de triptofano, tal como mencionado no Exemplo 2 acima.
[075] Os presentes inventores confirmaram que a cepa à base de KCCM11166P, na qual o grupo de gene edd-eda foi inativado, tem uma capacidade de produção de triptofano melhorada, e denominaram a cepa como "CA04-2800", e depositaram-na no KCCM em 15 de novembro de 2013, e foi atribuído o número de depósito KCCM11473P.
[076] Os resultados acima sugerem que a inativação simultânea das atividades de edd-eda em um microrganismo do gênero Escherichia tendo a via de Entner-Doudoroff pode aprimorar a capacidade de produção de triptofano, em comparação com o microrganismo sem a inativação das atividades de edd- eda.
[077] No presente pedido, a descrição detalhada das que podem ser suficientemente reconhecidas e desenhadas por uma pessoa versada na técnica é omitida, e várias modificações, além das modalidades exemplificadoras aqui descritas, podem ser incluídas dentro do espírito e escopo do presente pedido, sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais do presente pedido. Portanto, a presente invenção pode ser concretizada em outras formas específicas e uma pessoa versada na técnica à qual pertence o presente pedido será capaz de compreender a mesma.
[078] [Número de Depósito]
[079] Autoridade Depósito: Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (estrangeira)
[080] Número de Depósito: KCCM11473P
[081] Data de Depósito: 15-11-2013
Claims (6)
1. Microrganismo do gênero Escherichia que possui maior produtividade de L-triptofano, caracterizado poruma atividade de 6- fosfogluconato desidratase (Edd) e 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase (Eda) ser enfraquecida em comparação com a atividade endógena das mesmas ou inativada, em que o microorganismo aumenta a PPP (via de pentose fosfato) através de uma via de Entner-Doudoroff enfraquecida ou bloqueada, em que os genes edd e eda são deletados, em que os genes edd e eda são representados por sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, respectivamente, em que um gene pheA é representado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6, um gene trpR é representado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8, um gene mtr é representado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10, um gene tnaA é representado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 e um gene tnaB é representado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14 são ainda deletados.
2. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pora 6-fosfogluconato desidratase ter uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
3. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pora 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolase ter uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3.
4. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro microrganismo do gênero Escherichiaser Escherichia coli.
5. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado porum vetor recombinante contendo o promotor Ptrc e o gene do operon triptofano serem introduzidos, em que o vetor recombinante é representado pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 15
6. Método de preparação de L-triptofano caracterizado por compreender: cultivar o microrganismo do gênero Escherichia, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em um meio; e recuperar o L-triptofano a partir do meio cultivado ou do microrganismo cultivado.
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