BR112014016751B1 - Cepa de e. coli recombinante produtora de l-treonina ou ltriptofano e método para a produção de l-treonina ou l-triptofano - Google Patents
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Abstract
microrganismo capaz de produzir l-aminoácido, e um método para a produção de l-aminoácido, usando o mesmo. a presente invenção refere-se a um microrganismo capaz de produzir a l-treonina ou l-triptofano, e a um método para a produção de l-treonina ou l-triptofano, usando o mesmo. mais especificamente, a presente invenção refere-se a: escherichia coli recombinante que é mais eficiente na produção de l-treonina ou l-triptofano, aumentando a capacidade de produzir atp que é utilizada como a fonte de energia mais abundante em células quando produzindo de l-treonina ou l-triptofano; e um método para a produção de l-treonina ou l-triptofano, usando o mesmo.
Description
[001] A presente invenção se refere a um microrganismo capazde produzir a L-treonina ou L-triptofano e a um método para a produção de L-treonina ou L-triptofano, usando o mesmo.
[002] Sabe-se que os microrganismos que produzem produtosúteis por meio de fermentação requerem grandes quantidades de energia, tais como ATP, quando a via biossintética é reforçada.
[003] Como é conhecido na técnica, é muito importante que oequilíbrio intracelular entre dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NAD (H)), que é produzido por meio das reações catabólicas e fosfato dinucleotídeo de nicotinamida adenina NADP (H) que é utilizado em reações anabólicas em processos metabólicos microbianos. NAD (H) é um intermediário nas reações catabólicas que geram ATP por meio da oxidação de alimentos e funciona como uma fonte de energia. E NADP (H) desempenha um papel no fornecimento de um poder redutor no processo metabólico in vivo, que está a fornecer os elétrons de alta energia, necessários para sintetizar as moléculas por meio da reação com as enzimas que catalisam um modo geral as reações anabólicas. O equilíbrio entre os mesmos é regulado quer por meio da fosforilação de NAD como mostrado na seguinte equação 1) ou por meio da des- fosforilação de NADP como mostrado na seguinte equação 2).Equação 1)NAD + + ATP ⇔ NADP + + ADPEquação 2)NADP + ⇔ NAD + + fosfato
[004] Dessa maneira, a fim de produzir de forma eficaz a reduçãoda potência, tais como NADPH, uma fonte de fosfato, como o ATP deve ser aumentada em conjunto.
[005] ATP (adenosina-5'-trifosfato) tem uma ligação de fosfato dealta energia, e gera energia quando é hidrolisado em ADP e fosfato. ATP é produzido principalmente por meio da fosforilação quimiosmóti- ca através do sistema de transporte de elétrons em microrganismos ou por meio do nível de substrato de fosforilação. O ATP produzido é degradado para fornecer a energia necessária para as células e é reutilizado por meio da regeneração pela via da glicólise ou da fosforilação oxidativa.
[006] Com base neste fato, os estudos têm sido realizados paraaplicar processo de regeneração de energia ATP das bactérias para a produção em massa de produtos úteis a fim de facilitar o fornecimento de energia (Biosci Biotechnol Biochem, (1997) 61: 840 a 845). Em estudos sobre a regeneração de ATP, em E. coli, doi observado que o nível de ATP em um microrganismo é de cerca de 150 % maior do que a da cepa-mãe quando alguns genes, incluindo os genes ysaA (NCBI Gene ID: 948085), ydaS (NCBI Gene ID: 945923) e ybiX (NCBI Gene ID: 947502) eram deficientes, respectivamente, e esta constatação foi aplicada para a produção de glutationa (FEMS Microbiol Lett, (2009) 297 : 217 a 224.). No entanto, não houve relato direto que explica diretamente o aumento da produção de aminoácidos causado pelo efeito de atenuação das atividades das proteínas que são codificadas por meio dos genes.
[007] Os presentes inventores verificaram que o aumento do nível intracelular de ATP, o que é utilizado como a fonte de energia mais abundante nas células produtoras de ácido L-amino, é eficaz para au- mentar a produção de L-treonina ou L-triptofano, completando dessa maneira a presente invenção .
[008] Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma cepade E. coli recombinante, que tem um aumento de produtividade de L- treonina ou L-triptofano, aumentando a produtividade do ATP.
[009] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método de produção de L-treonina ou L-triptofano usando a cepa de E. coli recombinante.
[0010] A fim de alcançar os objetivos acima, uma modalidade dapresente invenção proporciona uma cepa de E. coli recombinante, a produção de L-treonina ou L-triptofano, em que a cepa é modificada para atenuar (enfraquecer) a atividade de pelo menos uma proteína selecionada entre o grupo que consiste em uma proteína YsaA tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, um proteína YdaS possuindo uma sequência de aminoácidos representada por meio daSEQ ID NO: 4, e uma proteína YbiX tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6 .
[0011] Uma modalidade da presente invenção também fornece ummétodo para a produção de L-treonina ou L-triptofano, o qual compreende a cultura da cepa de E. coli recombinante.
[0012] A presente invenção fornece um microrganismo recombi-nante, cuja a produtividade de L-treonina ou L-triptofano é melhorada através do aumento do nível de ATP intracelular em um microrganismo tendo a produtividade de L-treonina ou L-triptofano. De acordo com a presente invenção, é proporcionado um método para aumentar a produção de L-treonina ou L-triptofano, recuperando o equilíbrio do metabolismo de energia para aumentar a atividade celular e reduzir o tempo de cultura.
[0013] A Figura 1 mostra o nível de ATP relativa (%) da cepa produzindo L-treonina em relação àquela da cepa-mãe.
[0014] A Figura 2 mostra o nível de ATP relativa (%) da cepa produzindo L-triptofano em relação àquela da cepa-mãe.
[0015] Daqui em diante, a presente invenção será descrita emdetalhe.
[0016] Uma modalidade da presente invenção proporciona umacepa de E. coli recombinante, a produção de L-treonina ou L- triptofano, em que a cepa é modificada para atenuar a atividade de, pelo menos, um selecionado do grupo que consiste em uma proteína YsaA tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, uma proteína YdaS possuindo uma sequência de ami- noácidos representada por meio da SEQ ID NO: 4, e uma proteína YbiX tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6.
[0017] Um microrganismo que produz a L-treonina ou L-triptofanoque pode ser utilizado na presente invenção pode ser qualquer microrganismo capaz de produzir a L-treonina ou L-triptofano, tais como Bactéria Escherichia sp., E. coli, bactéria Coryneform, bactéria Serratia sp., bactéria Providencia sp., ou similares. Especificamente, pode ser utilizado um microrganismo pertencente ao gênero Escherichia.
[0018] Em uma modalidade específica da presente invenção, acepa de E. coli recombinante CJ600 (CCCM 10812P) (Registro de Patente Coreana N ° 10-0.792.095) tendo a produtividade de L-triptofano é usada, a qual é obtida por engenharia genética de uma cepa de E. coli recombinante (KFCC 10066) tendo a produtividade L-fenilalanina, de modo a dessensibilizar a auxotrofia de triptofano, bloqueio da bios- síntese de L-fenilalanina e aprimorar os genes relacionados com a bi- ossíntese de triptofano.
[0019] Em uma outra modalidade específica da presente invenção,a cepa de E. coli recombinante FTR2533 (KCCM-10541) (Registro de Patente Coreana N ° 10-0.576.342) tendo produtividade L-treonina é usada, a qual é obtida por engenharia genética de uma cepa de E. coli mutante (KFCC 10718) tendo a produtividade L-treonina, de modo a inativar o gene galR de tipo selvagem.
[0020] YsaA, uma proteína tendo uma sequência de aminoácidosrepresentada por meio da SEQ ID NO: 2, está prevista em uma hidro- genase de componente do tipo 4Fe-4S ferredoxina, mas a sua função exata ainda não foi encontrada.
[0021] YdaS, uma proteína tendo uma sequência de aminoácidosrepresentada por meio da SEQ ID NO: 4, está prevista em uma ligação do regulador da transcrição do DNA, mas a sua função exata ainda não foi encontrada.
[0022] YbiX, uma proteína tendo uma sequência de aminoácidosrepresentada por meio da SEQ ID NO: 6, é uma da superfamília oxi- genase dependente de Fe (II), que funciona como uma oxidorredutase que oxida o substrato usando oxigênio.
[0023] Os polipeptídeos YsaA, YdaS e YbiX da presente invençãotêm as sequências de aminoácidos representadas por meio das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6, respectivamente, mas não estão limitadas a eles, porque as sequências de aminoácidos das proteínas podem depen- derda espécie ou cepas de microrganismos.
[0024] Em outras palavras, as proteínas da presente invenção podem ser mutantes ou variantes artificiais que codificam uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos incluindo uma substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos em um ou mais posições das sequências de aminoácidos representadas por meio da SEQ ID NO: 2, 4 ou 6, desde que os mutantes ou va- riantes artificiais posam ser úteis para aumentar a produção de amino- ácidos por meio da atenuação das atividades descritas na presente invenção. Aqui, o número de "vários" aminoácidos difere dependendo da posição ou do tipo de resíduos de aminoácidos na estrutura tridimensional da proteína, mas é particularmente 2 a 20, especificamente 2 a 10, e mais especificamente 2 a 5. Além disso, esta substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de aminoácidos também inclui aquelas alterações provocadas por meio de uma mutação de ocorrência natural ou variação artificial baseada na diferença de indivíduos ou de espécies de microrganismos tendo a atividade dos polipeptídeos.
[0025] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "atenuação" significa que a atividade de uma proteína é enfraquecida, quer por exclusão de parte ou a totalidade do gene que codifica para a proteína, ou através da modificação de uma sequência reguladora de expressão para reduzir a expressão do gene, ou modificando a sequência do gene cromossômico para enfraquecer a atividade da proteína, ou por meio das combinações dos mesmos.
[0026] Na presente invenção, a atenuação da atividade pode serconseguida por meio de um método selecionado a partir do grupo que consiste em: 1) eliminação de uma parte ou totalidade de um polinu- cleotídeo que codifica a proteína; 2) modificação de uma sequência reguladora da expressão para reduzir a expressão do polinucleotídeo; 3) modificação da sequência cromossômica polinucleotídeo para enfraquecer a atividade da proteína; e 4) as combinações dos mesmos.
[0027] O método para a supressão de todo ou parte do polinucleo-tídeo que codifica a proteína pode ser realizada por meio da substituição de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo endógena no cromossoma, ou com um polinucleotídeo que uma parte da sequência de ácido nucleico é suprimido ou um gene marcador, através do cromossoma vetor de inserção.
[0028] Na presente invenção, o termo "uma parte da" sequênciade ácido nucleico difere dependendo do tipo de gene, mas é independente da posição do mesmo, e que é especificamente 1-200, mais especificamente 1-100, e ainda mais especificamente 1-50.
[0029] Além disso, o método da modificação da sequência reguladora de expressão para reduzir a expressão do polinucleotídeo pode ser realizado tanto através da indução de uma mutação na sequência reguladora da expressão da deleção, inserção, substituição não con- servativa ou conservativa, ou combinações dos mesmos, de um ou mais nucleotídeos para atenuar a atividade da sequência reguladora de expressão, ou substituindo a sequência reguladora de expressão com uma atividade mais fraca. A sequência reguladora de expressão inclui um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um local de ligação ao ribossoma, uma sequência de regulação da terminação da transcrição e tradução.
[0030] Além disso, o método da modificação da sequência cro-mossômica polinucleotídeo que codifica a proteína da presente invenção pode ser realizada tanto através da indução de uma mutação na sequência pela eliminação, inserção, substituição não conservativa ou conservador, ou combinações dos mesmos, de um ou mais nucleotí- deos para atenuar a atividade da sequência, ou através da substituição da sequência com uma sequência de nucleotídeos modificada possuindo uma atividade mais fraca.
[0031] O polinucleotídeo que codifica a proteína da presente invenção pode ser introduzido em uma célula hospedeira e pode ser substituído com um códon que dificulta a expressação no hospedeiro. Além disso, o N-terminal ou C-terminal dos mesmos, podem ser estendidos ou eliminados, e o códon de iniciação pode ser modificado para regular o nível de expressão.
[0032] Cada um dos polinucleotídeos da presente invenção podem ter uma sequência de polinucleotídeo que codifica para uma proteína com uma homologia de pelo menos 80 %, especialmente pelo menos 90 %, mais especificamente pelo menos 95 %, e ainda mais especificamente, pelo menos, 97 % para a sequência de aminoácido de cada uma representada por SEQ ID NOS: 2, 4 e 6, contanto que o polinucleo- tídeo possa atenuar a atividade de proteína da variante. Mais especificamente, os polinucleotídeos têm uma sequência de polinucleotídeo, representada por meio da SEQ ID NOs: 1, 3 e 5, respectivamente.
[0033] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "homolo-gia" se refere a identidade entre duas sequências de aminoácidos. A homologia pode ser determinada utilizando s métodos bem conhecidos, por exemplo, o programa de computador BLAST 2.0, que calcula os parâmetros como a pontuação, identidade e similaridade.
[0034] Além disso, as sequências de polinucleotídeos da presenteinvenção podem ser hibridadas com as sequências polinucleotídicas representadas por meio das SEQ ID NOS: 1, 3 e 5 e as sondas produzidas a partir das sequências de nucleotídeos acima descritas, sob condições rigorosas, e podem ser sequências de codificação de proteínas modificadas que funcionam normalmente.
[0035] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "condições rigorosas" se refere a condições que permitam a hibridação específica entre os polinucleotídeos. Alternativamente, o termo está relacionado com polipeptídeos ou proteínas, incluindo os seus derivados (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989;.Ou Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque).
[0036] Especificamente, as "condições rigorosas" se refere a hibri-dização a 65 °C em tampão de hibridação (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02 % de polivinilpirrolidona, 0,02% de albumina de soro bovino, NaH2PO42,5 a mM pH 7), 0,5% de SDS , EDTA a 2 mM). SSC é o cloret de sódio a 0.15 M / citrato de sódio a 0,15 M a pH 7. Após a hi- bridação, a membrana para a qual o DNA foi transferido é lavada em 2 x SSC à temperatura ambiente e, em seguida, em 0,1 a 0,5 x SSC / 0.1 x SDS a 68 °C.
[0037] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "vetor" serefere a um constructo de DNA contendo a sequência de nucleotídeos de um gene que codifica a proteína-alvo operativamente ligado a uma sequência reguladora adequada de modo a ser capaz de expressar o gene-alvo em uma célula hospedeira adequada. A sequência reguladora inclui um promotor capaz de iniciar a transcrição, um operador para regular esta transcrição, uma sequência que codifica para um local de ligação ao ribossoma mRNA adequado, e uma sequência de regulação da terminação da transcrição e tradução. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar e funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode, em alguns casos, integrar-se no próprio genoma.
[0038] O vetor, que é utilizado na presente invenção não está especificamente limitado e pode ser qualquer vetor conhecido na técnica, desde que possa replicar em um hospedeiro. Exemplos dos vetores vulgarmente utilizados podem incluir os plasmídeos naturais ou re- combinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, os vetores fago ou vetores de cosmídeo incluem pWE15, M13, ÀBL3, ÀBL4, ÀXII, ÀSHII, ÀPII, À10, A11, Charon4A e Charon21A, e os vetores de plasmídeos incluem pBR da PUC, pBluescriptII, pGEM, PTZ, pCL1920 e plasmídeos do tipo pET. Os vetores que podem ser utilizados não são particularmente limitados, e quaisquer vetores de expressão conhecidos podem ser utilizados. Especificamente, podem ser utilizados os vetores pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322, ou pMW118 pCC1BAC. Mais especificamente, podem ser usados os vetores pACYC177, pCL1920 e pCC1BAC.
[0039] Além disso, o vetor, que é utilizado na presente invenção éum vetor capaz de transformar as células hospedeiras, para inserir o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo no cromossoma da célula hospedeira. Os exemplos específicos do vetor incluem, mas não estão limitados a, o vetor de troca que pode pECCG112 autorreplicar em ambos os sentidos, em E. coli e bactérias do tipo Coryne (Kap-Soo, nô, Kor. Jour. Microbiol. Julho de 1991 P.149-154).
[0040] Além disso, o polinucleotídeo que codifica a proteína alvoendógena no cromossoma pode ser substituído com um novo polinu- cleotídeo por meio de um vetor para a inserção no cromossoma bacte- riano. A inserção do polinucleotídeo no cromossoma pode ser realizada por meio de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, a re- combinação homóloga. Uma vez que o vetor da presente invenção pode ser inserido no cromossoma por meio da recombinação homóloga, o mesmo pode compreender ainda um marcador de seleção para confirmar a sua inserção no cromossoma. O marcador de seleção é utilizado para selecionar uma célula transformada com o vetor, ou seja, confirmar a inserção do polinucleotídeo alvo. O marcador de seleção que é utilizado na presente invenção pode ser selecionado a partir de marcadores que proporcionam fenótipos selecionáveis, tais como resistência aos fármacos, auxotrofia, resistência a fármacos citotóxicos, ou a expressão da proteína de superfície. Apenas as células que expressam o marcador de seleção são capazes de sobreviver ou mostrar diferentes fenóti- pos sob o meio ambiente tratado com o agente selctivo e, dessa maneira, as células transformadas podem ser selecionadas.
[0041] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "transformação" significa introduzir um vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo em uma célula hospedeira, de modo a ser capaz de expressar a proteína codificada por meio do polinucleotídeo na célula hospedeira. Os polinucleotídeos transformados incluem todos os genes inseridos no cromossoma da célula hospedeira ou localizados fora do cromossoma, desde que possam ser expressos na célula hospedeira. Além disso, os polinucleotídeos incluem DNA e RNA, que codificam a proteína alvo. Contanto que o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira e aí expresso, o gene pode ser introduzido em qualquer forma.
[0042] Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira sob a forma de um cassete de expressão, que é um constructo de polinucleotídeo, incluindo todos os elementos para expressar o gene. O cassete de expressão inclui um promotor que está operativamente ligado ao gene, um sinal de terminação da transcrição, um local de ligação ao ribossoma, e um sinal de terminação da tradução. O cassete de expressão pode ser na forma de um vetor de expressão capaz de autorreplicação. O polinucleotídeo pode também ser introduzido na célula hospedeira, por si só, e estar operativamente ligado à sequência necessária para a expressão na célula hospedeira.
[0043] Especificamente, a atenuação da atividade da proteína queé codificada pelo gene ysaA, ydaS ou ybiX pode ser alcançada através de deleção do gene. Especificamente, uma mutação no gene pode ser induzida usando os produtos químicos ou a luz, tal como luz UV, obtendo-se assim uma variante que tem o gene eliminado. Alternativamente, uma variante que falta a atividade da proteína pode ser obtida por meio da substituição do gene cromossômico para o nucleotídeo que falta a atividade de uma técnica de recombinação genética, por meio de um método de gene de substituição através da recombinação homóloga.
[0044] Além disso, uma modalidade da presente invenção tambémfornece um método para a produção de L-treonina ou L-triptofano, o método compreendendo a cultura de uma cepa produtora de E. coli L- treonina ou L-triptofano recombinante, em que a cepa é modificada para atenuar a atividade de pelo menos, um selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína YsaA tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, um proteína YdaS possuindo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 4, e uma proteína YbiX tendo uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6.
[0045] O processo de cultura da presente invenção pode ser realizado em meios adequados e condições de cultura conhecidos na técnica. Este processo de cultura pode ser facilmente modificado por qualquer pessoa que seja versada técnica, dependendo do tipo de cepa selecionada. Exemplos do processo de cultura incluem, mas não estão limitados a, cultura em batelada, cultura contínua, e cultura de batelada alimentada.
[0046] Os meios e condições de cultura que são utilizados na cultura do microrganismo da presente invenção podem ser tão longos quanto os que são utilizados na cultura de microrganismos pertencentes ao gênero Escherichia, mas estes devem satisfazer adequadamente os requisitos do microrganismo da presente invenção.
[0047] Em uma modalidade específica da presente invenção, omicrorganismo pode ser cultivado em um meio convencional contendo fontes adequadas de carbono, fontes de nitrogênio, aminoácidos, vitaminas e semelhantes, sob condições aeróbicas, enquanto o ajuste de temperatura, pH e semelhantes.
[0048] As fontes de carbono que podem ser utilizadas na presenteinvenção incluem os hidratos de carbono, tais como glicose, frutose, sacarose, maltose, manitol, sorbitol; álcoois tais como álcool de açúcar, glicerol, ácido pirúvico, ácido láctico e ácido cítrico; e aminoácidos tais como o ácido orgânico, ácido glutâmico, a metionina e lisina. Além disso, podem ser usadas fontes de nutrientes orgânicos naturais, tais como os hidrolisados de amido, melaços, melaço, farelo de arroz, mandioca, bagaço e maceração de milho. Especificamente, as fontes de nutrientes orgânicos incluem glicose e melaços pré-tratados estéreis (isto é, melaços convertidos em açúcares reduzidos), e quantidades adequadas de fontes de carbono podem ser usadas sem qualquer limitação.
[0049] As fontes de nitrogênio que podem ser usadas na presenteinvenção incluem fontes de nitrogênio inorgânicas, tais como amoníaco, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio; aminoácidos tais como ácido glutâmico, a metionina e glutamina; e fontes orgânicas de nitrogênio, tais como peptona, NZ-amina, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, licor de milho, hidrolisado de caseína, farinha de peixe, ou o seu produto digerido, bolo de soja desengordurada ou o seu produto digerido, etc Estas fontes de nitrogênio podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação. O meio pode conter fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico e sais correspondentes contendo sódio, como fonte de fósforo.
[0050] Os compostos inorgânicos que podem ser utilizados napresente invenção incluem cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês e carbonato de cálcio. Além disso, o meio pode conter aminoácidos, vitaminas e precursores adequados. Estes meios de comunicação ou de precursores podem ser adicionados ao meio de uma batelada ou de modo contínuo.
[0051] Os compostos tais como o hidróxido de amônio, hidróxidode potássio, amoníaco, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser adicionados ao meio de uma forma adequada durante a cultura para ajustar o pH do meio de cultura.
[0052] Além disso, durante a cultura, um agente anti-espuma tal como o éster poliglicólico de ácidos graxos pode ser utilizado para suprimir a formação de bolhas. Além disso, a fim de manter o meio de cultura em um estado aeróbio, o oxigênio ou gás contendo oxigênio pode ser injetado para o meio de cultura. Além disso, a fim de manter o meio de cultura em um estado anaeróbio ou não aeróbio, nenhum gás é injetado, ou nitrogênio, hidrogênio ou dióxido de carbono gasoso pode ser injetado no meio de cultura. O meio de cultura é normalmente mantido a uma temperatura que varia de 27 °C a 37 °C e, especificamente, a partir de 30 °C a 35 °C. A cultura do microrganismo pode ser continuada até que o nível desejado de a substância útil seja obtido. Especificamente, o período de cultura é de 10 a 100 horas.
[0053] O método da presente invenção pode compreender ainda apurificação ou a recuperação do ácido L-aminoácido produzido na etapa de cultura. O processo de purificação ou de recuperação pode ser realizado por meio de purificação, ou a recuperação do ácido L- aminoácido desejado a partir do meio de cultura utilizando um método adequado, selecionado de acordo com o método utilizado para a cultura do microrganismo, por exemplo, uma batelada contínua ou método de cultura de batelada alimentada.
[0054] Daqui em diante, a presente invenção irá ser descrita emmaior detalhe com referência a exemplos. É para ser entendido, no entanto, que estes exemplos são para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção.ExemplosExemplo 1: Construção de cepas produzindo L-treonina e L- triptofano possuindo a atividade atenuada de proteína que é codificada por meio do gene ysaA, ydaS ou ybiX
[0055] Neste exemplo, cada um dos genes ysaA, ydaS e ybiX nacepa produtora de L-triptofano KCCM10812P (Registro de Patente Coreana N ° 10-0.792.095) e a cepa L-treonina produzindo KCCM10541 (Registro de Patente Coreana N ° 10-0.576.342) foram eliminados por meio da recombinação homóloga.
[0056] A cepa-mãe produtora de L-triptofano KCCM10812P é umacepa derivada de uma variante de E. coli KFCC 10066 tendo a produtividade de L-fenilalanina. É uma cepa de E. coli recombinante com produtividade de L-triptofano, caracterizada pelo fato de a auxotrofia de triptofano cromossômico ter sido dessensibilizada, os genes PHEA, trpR, mtr e tnaAB foram atenuados e os genes trpE e AROG foram modificados.
[0057] Além disso, a cepa-mãe produtora de L-triptofanoKCCM10541 é uma cepa derivada de E. coli KFCC10718 (Patente Coreana Aberta No. de publicação 1992-0008365). Ela tem uma resistência à L-metionina análoga, um fenótipo metionina auxotrofo, a resistência ao análogo da L-treonina, um fenótipo mal vedado isoleucina auxotrofo, a resistência ao análogo de L-lisina, e a resistência ao ácido α-aminobutirico, e é capaz de produzir a L-treonina .
[0058] Os genes ysaA, ydaS e ybiX a serem eliminados têm assequências polinucleotídicas representadas por meio das SEQ ID NOS: 1, 2 e 3, respectivamente.
[0059] Para esta finalidade, o método de inativação de uma etapa(. Desenvolvido por Datsenko KA et al.), que é uma técnica de muta- gênese usando lambda recombinase vermelha foi usado (Proc Natl Acad Sci EUA, (2000) 97:. 6640-6645). Como um marcador para confirmar a inserção dos genes, o gene resistente a cloranfenicol de pUCprmfmloxC foi usado (Patente Coreana de Publicação Aberta No. 2009-0075549).
[0060] Os fragmentos de genes de cerca de 1200 pb foram amplificados por meio da reação em cadeia da polimerase (daqui em diante referido como PCR) usando pUCprmfmloxC como um molde e um par de iniciadores 1 e 2, um par de iniciadores 7 e 8 e um par de iniciado- res 13 e 14, que têm uma porção de cada um dos três genes e uma porção do gene resistente a cloranfenicol de pUCprmfmloxC. A PCR foi realizada durante 30 ciclos, cada um consistindo na desnaturação a 94 °C durante 30 seg, emparelhamento a 55 °C durante 30 seg e extensão a 72 °C durante 1 min.
[0061] Além disso, os fragmentos de ADN, obtidos por meio daamplificação de PCR foram submetidos a eletroforese em 0,8% de gel de agarose, e em seguida, eluídos e utilizados como moldes em PCR secundário. PCR secundário foi realizada de modo a que os terminais 5 'e 3' dos fragmentos de DNA primário apresentam 20 pares de bases de nucleotídeos complementares. Os fragmentos de genes de cerca de 1300 pb foram amplificados por PCR utilizando os produtos de PCR primários eluidos como modelos e um par de iniciadores 3 e 4, um par de iniciadores 9 e 10 e um par de iniciadores 15 e 16, que têm incluem a 5 'e 3 'regiões dos genes. A PCR foi realizada durante 30 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94 °C durante 30 seg, empare- lhamento a 55 °C durante 30 seg e extensão a 72 °C durante 1 min. Os fragmentos de DNA, obtidos por meio da amplificação de PCR foram submetidos a eletroforese em 0,8% de gel de agarose, e em se-guida, eluidos e utilizados na recombinação.
[0062] De acordo com o método desenvolvido por Datsenko KA etal. (Proc Natl Acad Sci EUA., (2000) 97:6640 6645), uma cepa de E. coli transformada com um pKD46 foi tornada competente, e, em seguida, transformada com os fragmentos do gene de 1300-pb obtidos por PCR. As cepas resultantes foram selecionadas em meio LB com resistência a cloranfenicol. A PCR foi realizada utilizando um par de iniciadores 5 e 6, um par de iniciadores de 11 e 12 e um par de iniciadores 17 e 18, e os produtos de amplificação tinham tamanhos de 1450, 1530 e 1640 pb, respectivamente, e foi confirmado que os genes foram excluídos.
[0063] pKD46 foi removido a partir das cepas recombinantesprimárias com resistência ao cloranfenicol, e em seguida, um vetor de pJW168 foi introduzido nas cepas, e o gene marcador de cloran- fenicol foi removido a partir das células bacterianas (Gene, (2000) 247,255-264). As células bacterianas resultantes eram de cerca de 400 pb, 500 pb e produtos de amplificação de 600 pb obtidos por um par de iniciadores 5 e 6, um par de iniciadores 11 e 12 e um par de iniciadores 17 e 18, e foram confirmou que a deleção do gene desejado foi alcançado.
[0064] De acordo com o método acima descrito, as cepas produtoras de L-treonina KCCM10541 ΔysaA, KCCM10541 ΔydaS eKCCM10541 ΔybiX foram construídos. Além disso, as cepas produtoras de L-triptofano KCCM10812P ΔysaA, KCCM10812P ΔydaS eKCCM10812P ΔybiX foram construídas.Exemplo 2: Construção de cepas recombinantes produtoras de L- treonina e L-triptofano com deleção de dois ou mais dos genes ysaA, ydaS e ybiX
[0065] De acordo com o método descrito no Exemplo, as cepasrecombinantes que possuem uma deleção de dois ou mais dos genes foram construídas.
[0066] Um vetor pKD46 para utilização de lambda recombinasevermelha foi introduzdo nas cepas que têm uma deleção de qualquer um dos genes e, em seguida, as amostras foram tornadas competentes. Além disso, os fragmentos de genes amplificados por PCR para incluir uma porção de um dos três genes e o gene resistente a cloran- fenicol de pUCprmfmloxC foram transformados em diferentes cepas que têm uma deleção de um dos genes. As cepas resultantes foram rastreadas em meio LB com resistência ao cloranfenicol, e supressão de uma combinação dos genes foi confirmada através da utilização dos pares de iniciadores descritos no Exemplo 1.
[0067] De acordo com o método acima descrito, as cepas produtoras de L-treonina KCCM10541 ΔysaA ΔydaS, KCCM10541 ΔydaS ΔybiX, KCCM10541 ΔybiX ΔysaA e KCCM10541 ΔysaA ΔydaS ΔybiX foram construídos. Além disso, as cepas produtoras de L-triptofano KCCM10812P ΔysaA ΔydaS, KCCM10812P ΔydaS ΔybiX, KCCM10812P ΔybiX ΔysaA e KCCM10812P ΔysaA ΔydaS ΔybiX foram construídas.
[0068] Entre as cepas recombinantes obtidas como descrito acima, KCCM10541 ΔysaA ΔydaS ΔybiX e KCCM10812P ΔysaA ΔydaS ΔybiX foram denominados "E. coli CA03-4257P "e" E. coli CA04-2002 ", respectivamente, e depositado no Centro de Cultura Coreana de Mi-crorganismos (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seul, Coreia), uma autoridade internacional de depósito, em 29 de dezembro de 2011 sob os números de acesso KCCM11243P e KCCM11245P, respectivamente.Exemplo 3: A medição dos níveis de ATP em cepas produtoras de L-treonina e cepas produtoras de L-triptofano
[0069] Neste Exemplo, os níveis de ATP nas cepas construídasnos Exemplos 1 e 2 foram medidos quantitativamente.
[0070] Para esta finalidade, foi utilizado o método desenvolvido porKiyotaka Hara Y. et al., que utiliza a luciferase, ("um método eficiente para a determinação quantitativa da atividade celular de ATP Sintéti- co", J Biom Scre, (2006) V11: No.3: PP310 a 17).
[0071] Especificamente, as cepas com diferentes característicasgenéticas foram cultivadas durante a noite em meio LB contendo glicose líquida. O sobrenadante foi removido por meio a centrifugação, as células bacterianas foram lavadas com Tris-Cl a 100 mM (pH 7,5), e depois tratadas com tampão de PB (tampão permeável: 40 % [v / v] de glicose, 0,8% [v / v] Triton X-100) durante 30 minutos para libertar o ATP intracelular. Em seguida, o sobrenadante foi removido por meio da centrifugação, e a luciferina como um substrato para a luciferase foi adicionada às células. As células foram deixadas a repousar durante 10 minutos, e, em seguida, a atividade de luciferase nas células foi medida com um luminômetro para determinar quantitativamente os níveis de ATP. Os resultados da medição são mostrados na Figuras 1 e 2. Todos os resultados foram registrados como a média de três experiências repetidas.
[0072] Como pode ser visto nas Figuras 1 e 2, os níveis de ATPnas cepas construídas a partir da cepa produtora de L-treonina e a cepa produtora de L-triptofano nos Exemplos 1 e 2, todos aumentaram. Além disso, o nível de ATP foi superior nas cepas que têm uma dele- ção de uma combinação de genes do que nas cepas que têm uma de- leção de um gene.Exemplo 4: Exame de titulação da cepa produtora de L-treonina, que tem atividade atenuada por si só ou uma combinação de enzimas que são codificadas por ysaA, ydaS e gene ybiX, em um meio contendo glicose
[0073] De acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 e 2,por si só, ou uma combinação dos genes ysaA, ydaS e ybiX foi excluído da cepa L-treonina produzindo KCCM10541 (Registro de Patente Coreana N ° 10-0576342) para aumentar o nível de ATP intracelular. Os títulos das cepas resultantes foram avaliados usando a glicose co- mo fonte de carbono.
[0074] Especificamente, as cepas tendo diferentes característicasgenéticas foram cultivadas durante a noite em meio LB sólido em uma incubadora a 33 °C e inoculadas por um loopde platina em 25 mL de meio contendo glicose com a composição mostrada na Tabela 2 abaixo. Em seguida, as amostras foram incubadas em um incubador a 33 °C e a 200 rpm durante 50 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo. Todos os resultados foram registrados como a média de três resultados balão.
[0075] Como pode ser visto na Tabela 3 acima, foi demonstradoque a utilização de glicose da produção de cepas de E. coli recombi- nantes construídas de acordo com a presente invenção aumentou até cerca de 22 % em comparação com a da cepa-mãe de L-treonina, e a produção das cepas recombinantes de treonina aumentou até cerca de 7 % em relação à da cepa original. Tendo em vista o nível de ATP mostrado na Figura 1, estes resultados indicam que a taxa de consumo de glicose ou produtividade de aminoácidos das cepas recombi- nantes foi aumentada por meio do aumento do nível de ATP.Exemplo 5: Análise de titulação da cepa produtora de L-treonina, a qual tem atividade atenuada por si só ou uma combinação de enzimas que são codificadas por ysaA, ydaS e gene ybiX, em um meio contendo sacarose
[0076] De acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 e 2,por si só, ou uma combinação dos genes ysaA, ydaS e ybiX foi excluída da cepa L-treonina produzindo KCCM10541 (Registro de Patente Coreana N ° 10-0576342) para aumentar o nível de ATP intracelular. Os títulos das cepas resultantes foram avaliados utilizando sacarose como fonte de carbono.
[0077] Especificamente, as cepas tendo diferentes característicasgenéticas foram cultivadas durante a noite em meio LB sólido em uma incubadora a 33 °C e inoculadas por um loopde platina em 25 mL de meio contendo sacarose tendo a composição indicada na Tabela 4 abaixo. Em seguida, as amostras foram incubadas em um incubador a 33 °C e a 200 rpm durante 48 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. Todos os resultados foram registrados como a média de três resultados em balão.
Medido às 24 horas** Medido às 48 horas
[0078] Como pode ser visto na Tabela 5 acima, os presentes inventores demonstraram que a utilização de sacarose da cepa de E.coli produtora recombinante construída de acordo com a presente invenção aumentou até cerca de 10 % em comparação com a da cepa-mãe de L-treonina, e a produção das cepas recombinantes de treonina aumentada até cerca de 5 % em relação à da cepa original. Tendo em vista o nível de ATP mostrado na Figura 1, estes resultados indicam que a atividade e a taxa de consumo de sacarose ou a produtividade de aminoácidos das cepas recombinantes foram aumentadas por meio do aumento do nível de ATP.Exemplo 6: Análise de titulação da cepa produtora de L- triptofano, que tem atividade atenuada por si só ou uma combinação de enzimas que são codificadas por ysaA, ydaS e gene ybiX, em um meio contendo glicose
[0079] De acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 e 2,por si só, ou uma combinação dos genes ysaA, ydaS e ybiX foi excluída da cepa produtora de L-triptofano KCCM10812P (Registro de Patente Coreana N ° 10-0792095) para aumentar o nível de ATP intracelular. Os títulos das cepas resultantes foram avaliados usando a glicose como fonte de carbono.
[0080] A fim de examinar o título, as amostras foram inoculadascom um loop de platina em um meio LB sólido e, em seguida, cultivadas durante a noite em uma incubadora. E, foi inoculada por um loop de platina em 25 mL de meio de titulação balão que possui a composição indicada na Tabela 6 abaixo. Em seguida, as amostras foram incubadas em um incubador a 37 °C e a 200 rpm durante 48 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo. Todos os resultados foram registrados como a média de três resultados balão.
[0081] Como pode ser visto na Tabela 7, acima, os presentes in- ventores demonstraram que a utilização de sacarose da cepa de E.coli produtora recombinante construída de acordo com a presente invenção aumentou até cerca de 10 % em comparação com a da cepa-mãe de L-treonina, e a produção das cepas recombinantes de treonina aumentada até cerca de 38 % comparada com a da cepa-mãe. Tendo em vista o nível de ATP mostrado na Figura 2, estes resultados indicam que a atividade e a taxa de consumo de glicose ou produtividade de aminoácidos das cepas recombinantes foram aumentadas por meio do aumento do nível de ATP.
[0082] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às modalidades ilustrativas em particular, as pessoas as quais são versadas na técnica à qual pertence a presente invenção podem compreender que a presente invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou das características es-senciais técnica da presente invenção. Portanto, as modalidades descri-tas acima são consideradas como ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Além disso, o âmbito da presente invenção é definido por meio das reivindicações anexas em vez da descrição detalhada, e deve ser entendido que todas as modificações ou variações decorrentes dos significados e escopo da presente invenção e os seus equivalentes sejam incluídos no âmbito das reivindicações anexas.Número de AcessoAutoridade Depositária: Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Internacional)Número de acesso: KCCM11243PData da Deposição: 29 de dezembro de 2011Autoridade Depositária: Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Internacional)Número de acesso: KCCM11245PData da Deposição: 29 de dezembro de 2011
Claims (7)
1. Cepa de E. coli recombinante produtora de L-treonina ou L-triptofano, caracterizada pelo fato de que a cepa é modificada para atenuar a atividade de, pelo menos, dois selecionados a partir do grupo que consiste em uma proteína YsaA apresentando uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, uma proteína YdaS apresentando uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 4, e uma proteína YbiX apresentando uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6, em que YsaA, YdaS e YbiX são codificadas pelos genes ysaA, ydaS e ybiX, respectivamente,em que a atividade é atenuada pela deleção de parte ou da totalidade de pelo menos um gene que codifica a proteína YsaA, a pro-teína YdaS e/ou a proteína YbiX.
2. Cepa de E. coli recombinante produtora de L-treonina ou L-triptofano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína YsaA é codificada por meio de uma sequência poli- nucleotídica, representada por meio da SEQ ID NO: 1, a proteína YdaS é codificada por meio de uma sequência de polinucleotídeos representada por meio da SEQ ID NO: 3, e a proteína YbiX é codificada por meio de uma sequência polinucleotídica, representada por meio da SEQ ID NO: 5.
3. Cepa de E. coli recombinante produtora de L-treonina ou L-triptofano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de E. coli recombinante é Escherichia coli produtora de L-treonina CA03-4257 (KCCM11243P).
4. Cepa de E. coli recombinante produtora de L-treonina ou L-triptofano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de E. coli recombinante é Escherichia coli produtora de L-triptofano CA04-2002 (KCCM11245P).
5. Método para a produção de L-treonina ou L-triptofano, caracterizado pelo fato de que o método compreende o cultivo de uma cepa de E. coli recombinante produtora de L-treonina ou L-triptofano, em que a cepa é modificada para atenuar a atividade de, pelo menos, dois selecionados a partir do grupo consistindo em uma proteína (YsaA) apresentando uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 2, uma proteína (YdaS) apresentando uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 4, e uma proteína (YbiX) apresentando uma sequência de aminoácidos representada por meio da SEQ ID NO: 6, em que YsaA, YdaS e YbiX são codificadas pelos genes ysaA, ydaS e ybiX, respectivamente,em que a atividade é atenuada pela deleção de parte ou na totalidade de pelo menos um gene que codifica a proteína YsaA, a pro-teína YdaS e/ou a proteína YbiX.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cepa de E. coli recombinante é Escherichia coli pro-dutora de L-treonina CA03-4257 (KCCM11243P).
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cepa de E. coli recombinante é Escherichia coli pro-dutora de L-triptofano CA04-2002 (KCCM11245P).
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