RU2678139C2 - Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, и способ продуцирования L-триптофана с использованием данного микроорганизма - Google Patents
Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, и способ продуцирования L-триптофана с использованием данного микроорганизма Download PDFInfo
- Publication number
- RU2678139C2 RU2678139C2 RU2016152662A RU2016152662A RU2678139C2 RU 2678139 C2 RU2678139 C2 RU 2678139C2 RU 2016152662 A RU2016152662 A RU 2016152662A RU 2016152662 A RU2016152662 A RU 2016152662A RU 2678139 C2 RU2678139 C2 RU 2678139C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tryptophan
- gene
- microorganism
- strain
- sequence
- Prior art date
Links
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 title claims abstract description 80
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 49
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 title claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 10
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims abstract description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 108010022393 phosphogluconate dehydratase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 71
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 12
- 101150023849 pheA gene Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 101150006320 trpR gene Proteins 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 101150012186 mtr gene Proteins 0.000 claims description 8
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 claims 2
- -1 pentose phosphate Chemical class 0.000 abstract description 4
- 108010038136 phospho-2-keto-3-deoxy-gluconate aldolase Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 abstract 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 33
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 15
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 7
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 101150090240 edd gene Proteins 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150053890 EDA gene Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 6-Phospho-D-gluconate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 4
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 101150107914 Ubr5 gene Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 101150099895 tnaA gene Proteins 0.000 description 3
- 101150037435 tnaB gene Proteins 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 2
- PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 5-O-phosphono-alpha-D-ribofuranosyl diphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N D-erythrose 4-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003673 Symporters Human genes 0.000 description 2
- 108090000088 Symporters Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- IRJCQQRDILUJAQ-VPENINKCSA-N (2r,4s,5r)-2,4,5-trihydroxy-6-phosphonooxyhexanoic acid Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@@H](O)C(O)=O IRJCQQRDILUJAQ-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010000898 Chorismate mutase Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N D-ribulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101800000628 PDH precursor-related peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N Rbl5P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 102100040653 Tryptophan 2,3-dioxygenase Human genes 0.000 description 1
- 101710136122 Tryptophan 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/227—Tryptophan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
- C12Y401/02014—2-Dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase (4.1.2.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01012—Phosphogluconate dehydratase (4.2.1.12)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, где активности эндогенных 6-фосфоглюконатдегидратазы (Edd) и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы (Eda) ослаблены или инактивированы, где микроорганизм имеет усиленный РРР (пентозофосфатный путь) посредством ослабленного или блокированного пути Энтнера-Дудорова. Предложен способ получения L-триптофана с использованием указанного микроорганизма. Группа изобретений позволяет повысить продукцию L-триптофана по сравнению с родительским немодифицированным микроорганизмом. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая заявка относится к микроорганизму рода Escherichia, продуцирующему L-триптофан, и к способу продуцирования L-триптофана с использованием данного микроорганизма.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
L-триптофан, который представляет собой незаменимую аминокислоту, широко используется в качестве пищевой добавки и т.д., и также широко используется в качестве сырья для фармацевтических продуктов, таких как инфузионные растворы и ингредиенты для лечебного питания. L-триптофан можно получать способом химического синтеза, способом на основе ферментативной реакции, способом ферментации и т.д., но в настоящее время главным образом используют способ прямой ферментации с использованием микроорганизма.
Что касается направления разработки штамма, продуцирующего L-триптофан, данная разработка исходно выполнялась посредством отбора мутаций (корейский патент №1987-0001813) или способами, преодолевающими ингибирование триптофаном по механизму обратной связи, посредством ферментов в пути биосинтеза вместе с генной инженерией, или посредством усиления ферментативного синтеза в метаболических процессах, как, например, посредством усиления экспрессии ферментов биосинтеза триптофана.
Тем временем способ улучшения синтеза L-аминокислот с использованием пути Энтнера-Дудорова был раскрыт ранее (патент США №7432085). Патент США №7432085 относится к способу улучшения продуцирования L-аминокислоты, полученной посредством биосинтетического пути с использованием пировиноградной кислоты в качестве промежуточного соединения, посредством увеличения активностей ферментов, вовлеченных в путь Энтнера-Дудорова, и конкретно, ключевой характеристикой указанного патента является увеличение активности 6-фосфоглюконатдегидратазы или 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы.
Однако авторы настоящего изобретения впервые подтвердили то, что в случае L-триптофана, в отличие от других L-аминокислот, при ослаблении или инактивации активностей и 6-фосфоглюконатдегидратазы, и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы в пути Энтнера-Дудорова, способность продуцировать L-триптофан может быть значительно улучшена, посредством этого осуществляя настоящее изобретение в том, что касается микроорганизма рода Escherichia с улучшенной способностью продуцировать L-триптофан и способа продуцирования L-триптофана с использованием данного микроорганизма.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА
Задачей настоящего изобретения является предложение микроорганизма, продуцирующего L-триптофан.
Другой задачей настоящего изобретения является предложение способа эффективного продуцирования L-триптофана с использованием микроорганизма, продуцирующего L-триптофан.
ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ
Для решения вышеуказанных задач, в одном аспекте в настоящем изобретении предложен микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан посредством ослабления или инактивации активностей эндогенной 6-фосфоглюконатдегидратазы (edd) и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы (eda).
Термин «L-триптофан» в том виде, как он здесь используется, относится к ароматической L-аминокислоте, которая представляет собой α-аминокислоту и незаменимую аминокислоту, не синтезируемую in vivo, имеющую химическую формулу C11H12N2O2.
Термин «путь Энтнера-Дудорова» в том виде, как он здесь используется, относится к пути углеродного метаболизма, присутствующему в микроорганизме рода Escherichia, который представляет собой путь, катализирующий превращение источников углерода, введенных в данный путь углеродного метаболизма, в глицеральдегид-3-фосфат и пируват через последовательную двухэтапную ферментативную реакцию посредством 6-фосфоглюконатдегидратазы и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы.
Термин «6-фосфоглюконатдегидратаза (edd; ЕС 4.2.1.12)» в том виде, как он здесь используется, относится к ферменту, участвующему в пути Энтнера-Дудорова, который катализирует реакцию превращения 6-фосфо-D-глюконата в 2-дигидро-3-дезокси-6-фосфо-D-глюконат. Конкретно, данный фермент может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, но без ограничения может быть включена любая последовательность, имеющая активность данного фермента. Кроме того, в типичном воплощении ген, кодирующий 6-фосфоглюконатдегидратазу, может быть представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, но без ограничения может быть включена любая последовательность, кодирующая фермент.
Термин «2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза (eda; ЕС 4.1.2.14)» в том виде, как он здесь используется, относится к ферменту, участвующему в пути Энтнера-Дудорова, который катализирует реакцию превращения 2-дигидро-3-дезокси-6-фосфо-D-глюконата в глицеральдегид-3-фосфат и пируват. В частности, данный фермент может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, но может быть включена любая последовательность, имеющая активность данного фермента, без ограничения. Кроме того, в типичном воплощении ген, кодирующий 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазу, может быть представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, но без ограничения может быть включена любая последовательность, кодирующая фермент.
Каждый из ферментов, описанных выше, помимо аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 1-3, может включать, без ограничения, любую аминокислотную последовательность, которая имеет гомологию 70% или выше, конкретно 80% или выше, более конкретно 90% или выше, даже более конкретно 95% или выше, еще более конкретно 98% или выше и еще более конкретно 99% или выше относительно каждой из вышеперечисленных аминокислотных последовательностей, при условии, что данный фермент демонстрирует эффект, по существу такой же или соответствующий эффекту каждого из ферментов. Кроме того, очевидно, что любой модифицированный фермент, который имеет описанную выше гомологию, и имеет эффект, соответствующий эффекту каждого фермента, может входить в объем настоящей заявки, несмотря на то, что данный фермент может иметь аминокислотную последовательность с частичной делецией, модификацией, заменой или присоединением.
Кроме того, гены, кодирующие каждый из ферментов, также могут включать, без ограничения, помимо нуклеотидных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 2 или 4, последовательность любого гена, кодирующего ферменты, которая имеет гомологию 80% или выше, конкретно 90% или выше, даже более конкретно 95% или выше, еще более конкретно 98% или выше и еще более конкретно 99% или выше с каждой из вышеперечисленных нуклеотидных последовательностей, при условии, что данная последовательность кодирует фермент, который имеет эффект, по существу такой же или соответствующий эффекту каждого из ферментов. Кроме того, очевидно, что любая нуклеотидная последовательность, которая имеет описанные выше гомологии, может принадлежать к объему настоящей заявки, несмотря на то, что данная последовательность может иметь в ней частичную делецию, модификацию, замену или присоединение.
Термин «гомология» в том виде, как он здесь используется, относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными или полипептидными группировками. Соответствие последовательностей одной и другой группировок может быть определено методикой, известной в данной области. Например, гомология может быть определена путем непосредственного выравнивания информации по последовательностям (например, такие параметры, как бальная оценка, идентичность и сходство) на двух молекулах полинуклеотидов или двух молекулах полипептидов с использованием компьютерной программы (например BLAST 2.0), которая легко доступна и способна к выравниванию информации по последовательностям. Кроме того, гомология может быть определена посредством гибридизации полинуклеотидов при условиях образования стабильной двойной цепи в гомологичных областях и последующего расщепления гибридизированной цепи посредством нуклеазы, специфичной в отношении одиночной цепи, для определения размера расщепленных фрагментов.
Термин «эндогенная активность» в том виде, как он здесь используется, относится к активному состоянию фермента в микроорганизме в природном состоянии или до модификации.
Термин «ослабление активности фермента по сравнению с его эндогенной активностью» в том виде, как он здесь используется, относится к подходу, включающему случай, когда имеется уменьшение активности фермента в микроорганизме по сравнению с активностью, которой он обладал исходно в его природном состоянии или до модификации, случай, когда уровень общей экспрессии белка ниже, чем уровень штамма дикого типа или уровень штамма до модификации микроорганизма, из-за ингибирования экспрессии или ингибирования трансляции гена, кодирующего данный фермент, или комбинацию данных случаев.
Термин «инактивация» в том виде, как он здесь используется, относится к случаю, когда ген, кодирующий фермент в микроорганизме, совсем не экспрессируется, и к случаю, когда ген экспрессируется, но не демонстрирует активность по сравнению с активностью штамма дикого типа или штамма до модификации микроорганизма.
Ослабление или инактивация ферментативной активности могут быть достигнуты разными способами, хорошо известными в данной области. Примеры данных способов могут включать способ замены на хромосоме гена, кодирующего фермент, мутировавшим геном, таким образом, что ферментативная активность уменьшается, включая случай, когда ферментативная активность устраняется; способ введения модификации в последовательность контроля экспрессии гена, кодирующего фермент, на хромосоме; способ замены последовательности контроля экспрессии гена, кодирующего фермент, последовательностью, имеющей слабую активность или не имеющей активности; способ делеции части или всего гена, кодирующего фермент, на хромосоме; способ введения антисмыслового олигонуклеотида (например антисмысловой РНК), который ингибирует трансляцию от мРНК в фермент, посредством комплементарного связывания с транскриптом гена на хромосоме; способ обеспечивающий невозможность посадки рибосомы, посредством образования вторичной структуры путем искусственного добавления последовательности Шайна-Дальгарно (SD) и комплементарной ей последовательности на переднем конце последовательности SD гена, кодирующего фермент; способ инженерии обратной транскрипции (RTE), в котором добавляется промотор, подлежащий обратной транскрипции на 3'-конце открытой рамки считывания (ORF) соответствующей последовательности и т.д., и также могут включать их комбинацию, но не ограничиваются ими.
В частности, способ делеции части или всего гена, кодирующего фермент, может осуществляться посредством замены полинуклеотида, кодирующего эндогенный белок-мишень в хромосоме, полинуклеотидом или маркерным геном, имеющим частичную делецию в последовательности нуклеиновой кислоты, с использованием вектора для хромосомной вставки в бактериях. В типичном воплощении способа делеции части или всего гена ген может быть подвергнут делеции посредством гомологичной рекомбинации.
Термин «часть» в том виде, как он здесь используется, несмотря на то, что он может варьировать, в зависимости от видов полинуклеоидов, может конкретно относиться к части от 1 нуклеотида до 300 нуклеотидов, более конкретно, к части от 1 нуклеотида до 100 нуклеотидов, и даже более конкретно к части от 1 нуклеотида до 50 нуклеотидов, но конкретно не ограничивается ими.
Термин «гомологичная рекомбинация» в том виде, как он здесь используется, относится к генетической рекомбинации, которая происходит посредством кроссинговера в локусах генетической цепи, имеющих взаимную гомологию.
В частности, последовательность контроля экспрессии может быть модифицирована путем индуцирования модификации последовательности контроля экспрессии посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены, или их комбинации в последовательности нуклеиновой кислоты последовательности контроля экспрессии; или посредством замены более слабым промотором и т.д. Последовательность контроля экспрессии может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую область связывания рибосомы, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции.
Кроме того, последовательность гена на хромосоме может быть модифицирована посредством индуцирования модификации в последовательности посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации в последовательности гена для дальнейшего ослабления ферментативной активности; или посредством замены на последовательность гена, которая была улучшена таким образом, чтобы иметь более слабую активность, или на последовательность гена, которая была улучшена таким образом, чтобы не иметь активности.
В типичном воплощении настоящей заявки было подтверждено, что ослабление или инактивация активности может осуществляться посредством по меньшей мере одного мутационного способа, выбранного из группы, состоящей из инсерционной мутации, осуществляемой посредством вставки по меньшей мере одной пары оснований в ген, кодирующий 6-фосфоглюконатдегидратазу, и в ген, кодирующий 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазу; делеционной мутации, осуществляемой посредством делеции по меньшей мере одной пары оснований в гене; и транзиционной или трансверсионной мутации пары оснований, осуществляемой посредством введения бессмысленного кодона или другого кодона в ген.
В настоящей заявке микроорганизм рода Escherichia может представлять собой конкретно Escherichia coli, но не ограничивается им.
В частности, родительский штамм микроорганизма рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан посредством ослабления или инактивации активностей edd и eda, может конкретно не ограничиваться, при условии, что микроорганизм принадлежит к роду Escherichia. Например, микроорганизм, продуцирующий L-триптофан, может представлять собой микроорганизм, в котором для усиления биосинтетического пути были ослаблены или инактивированы активности гена в конкурирующем пути, регулятора в направленном пути триптофанового оперона и гена введения и разрушения триптофана, и/или осуществлялась сверхэкспрессия активности триптофанового оперона. Способы ослабления или инактивации активности являются такими же, что и объясненные выше, и способы, известные в данной области, включены без ограничения. Кроме того, способы сверхэкспрессии активности триптофанового оперона, известные в данной области, включены без ограничения. Например, данные способы могут включать способ дополнительного введения в хромосому полинуклеотида, который включает часть или сам представляет собой полную нуклеотидную последовательность гена оперона, или области контроля экспрессии, введенной извне; способ увеличения числа копий посредством введения в векторную систему; способ увеличения активности оперона посредством замены последовательности контроля экспрессии, которая контролирует экспрессию гена, другой последовательностью контроля экспрессии, модификации, имеющей введенную мутацию в часть или во всю нуклеотидную последовательность области контроля экспрессии, и введения модификации в сам ген и т.д., но не ограничиваясь ими. Конкретно, микроорганизм может представлять собой Е. coli, в которой часть или полный ген pheA, ген trpR, ген mtr и ген tnaAB подвергаются делеции, и/или сверхэкспрессируется триптофановый оперон.
В настоящей заявке ген edd, ген eda, ген pheA, ген trpR, ген mtr, ген tnaAB, триптофановый оперон и последовательности белков, кодируемые ими, могут быть получены из известных баз данных, например, GenBank NCBI (Национальный центр биотехнологической информации), но без ограничения ими. Кроме того, конкретные подробности в отношении гена pheA, гена trpR, гена mtr и гена tnaAB можно найти в раскрытии корейского патента №10-0792095, и полное описание данного корейского патента может быть включено в качестве ссылки в настоящую заявку.
Из типичных воплощений настоящего изобретения было подтверждено, что в том, что касается инактивации активностей 6-фосфоглюконатдегидратазы и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы в разных родительских штаммах, любой микроорганизм рода Escherichia, независимо от его родительского штамма, значительно улучшает продукцию L-триптофана при совместном ослаблении или инактивации активностей как 6-фосфоглюконатдегидратазы, так и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы.
В другом аспекте в настоящей заявке предложен способ получения L-триптофана, включающий культивирование микроорганизма рода Escherichia, продуцирующего L-триптофан, посредством ослабления или инактивации активностей эндогенных 6-фосфоглюконатдегидратазы (edd) и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы (eda) по настоящей заявке; и выделение L-триптофана из культуральной среды или культивируемого микроорганизма.
Среда и другие условия культуры, используемые для культивирования микроорганизма по настоящей заявке, не являются конкретно ограниченными, но может быть использована любая среда, используемая для традиционного культивирования микроорганизма рода Escherichia. В частности, микроорганизм по настоящей заявке можно культивировать в традиционной среде, содержащей подходящие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины и т.д., в аэробных условиях при подведении температуры, рН и т.д.
Примеры источников углерода для использования в настоящем изобретении могут включать такие углеводы, как глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, маннит, сорбит и т.д.; спирты, такие как многоатомные спирты, глицерин, пируват, лактат, цитрат и т.д.; и аминокислоты, такие как органическая кислота (orgarnic acid), глутаминовая кислота, метионин, лизин и т.д. Кроме того, могут быть использованы природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, меласса, сырая меласса, рисовые отруби, крахмал маниока, меласса сахарного тростника, жидкий кукурузный экстракт и т.д., и, конкретно, углеводы, такие как глюкоза и стерильная предобработанная меласса (т.е. меласса, превращенная в восстановленный сахар) и т.д. Кроме того, могут использоваться разные другие источники углерода в подходящем количестве без ограничения. Данные источники углерода могут использоваться одни или в комбинации двух или более чем двух.
Примеры источников азота для использования в настоящем изобретении могут включать неорганические соединения, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония, нитрат аммония и т.д.; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, глутамин и т.д.; и органические источники азота, такие как пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, казеиновый гидролизат, рыба или продукты ее разложения, обезжиренный соевый жмых или продукты его разложения и т.д. Данные источники азота можно использовать одни или в комбинации двух или более чем двух.
Примеры источников фосфора для использования в настоящем изобретении могут включать одноосновный фосфат калия, двухосновный фосфат калия, соответствующие натрийсодержащие соли и т.д., но не ограничиваются ими. Примеры неорганических соединений могут включать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат марганца, карбонат кальция и т.д., и, кроме того, могут быть включены аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники для культуральной среды. Данные среду или предшественники можно добавлять в культуру согласно протоколу периодического культивирования или непрерывного культивирования.
В настоящем изобретении рН культуры может регулировать во время культивирования посредством добавления в культуру подходящим способом такого соединения, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Во время периода культивирования может быть добавлен пеногаситель, такой как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты, для предотвращения образования пены. Кроме того, в культуру можно вводить кислород или кислородсодержащий газ для того, чтобы поддерживать аэробное состояние культуры; или можно вводить газообразный азот, водород или диоксид углерода без введение газа для того, чтобы поддерживать анаэробное или микроаэробное состояние культуры.
Температура культуры обычно может находиться в интервале от 27°С до 40°С и конкретно от 30°С до 37°С, но не ограничиваясь ими. Культивирование можно продолжать, пока не будет получено желательное количество полезных веществ, и конкретно от 10 часов до 100 часов, без ограничения.
L-триптофан можно выделять подходящим способом, известным в данной области, например посредством периодической культуры, непрерывной культуры или культуры с подпиткой и т.д., согласно способу культивирования по настоящему изобретению.
Выделение также может включать стадию очистки.
L-аминокислоты могут высвобождаться в культуральную среду, в которой культивируются микроорганизмы, или могут содержаться в микроорганизмах.
Полезные эффекты изобретения
В настоящем изобретении предложен микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, посредством ослабления или инактивации активности эндогенных 6-фосфоглюконатдегидратазы и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы, и таким образом настоящее изобретение обеспечивает эффект того, что L-триптофан может продуцироваться с использованием микроорганизма с более высоким выходом и с большей эффективностью и рентабельностью.
Способы осуществления изобретения
Ниже настоящее изобретение будет подробно описано с сопровождающими примерами. Однако раскрытые здесь примеры служат лишь для иллюстративных целей и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Сравнительный пример 1: получение родительского штамма (ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO)
(1) Получение штамма дикого типа, в котором инактивированы белки, кодируемые генами pheA, trpR, mtr и tnaAB
Для усиления пути биосинтеза триптофана родительским штаммом были инактивированы все из следующих: ген pheA, который представляет собой ген конкурирующего пути; ген trpR, который является регулятором триптофанового оперона и направленного пути; ген mtr, который представляет собой ген для введения триптофана; и гены tnaA и tnaB, которые представляют собой гены для введения и разрушения триптофана, и посредством этого была лучше изучена способность микроорганизма по настоящему изобретению продуцировать триптофан. Посредством гомологичной рекомбинации генов в Е. coli W3110 (АТСС®39936™) были инактивированы все из следующих: хоризматмутаза/префенатгидратаза, кодируемая геном pheA; транскрипционный репрессор trpR, кодируемый геном trpR; триптофан/индол: Н+ симпортер, кодируемый геном mtr, триптофаназа и триптофан: Н+ симпортер, кодируемые генами tnaA и tnaB в форме оперона. Для этой цели использовали одноэтапный способ инактивации с использованием рекомбиназы lambda Red, разработанный Datsenko КА et al., и инактивацию проводили на основе способа, описанного в корейском патенте №10-0792095. Здесь описаны последовательности праймеров, использованных в Сравнительном примере 1, и Сравнительный пример 2 и Примеры 1 и 3, описанные ниже, показаны в Таблице 3 ниже.
В частности, примерно 1100 пар нуклеотидов фрагментов гена амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием гена pKD3 в качестве матрицы, вместе с частью гена pheA, имеющего последовательность SEQ ID NO: 6, и праймерами 1 и 2, имеющими частичную нуклеотидную последовательность гена устойчивости к хлорамфениколу гена pKD3. Затем фрагменты ДНК, полученные ПЦР, разделяли электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле, элюировали и использовали в качестве матрицы для второй ПЦР. Для получения 5' и 3' фрагментов ДНК гена pheA в Е. coli примерно 250 пар нуклеотидов фрагментов гена амплифицировали посредством ПЦР с использованием хромосомы Е. coli W3110 в качестве матрицы, вместе с праймерами 3 и 4, и праймерами 5 и 6. Затем фрагменты ДНК, полученные ПЦР, разделяли электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле, элюировали и использовали в качестве матрицы для второй ПЦР.
В описанном выше нуклеотидные последовательности из 18 пар оснований между праймером 1 и праймером 4 являются комплементарными, и нуклеотидные последовательности из 20 пар оснований между праймером 2 и праймером 5 являются комплементарными, и таким образом фрагменты, полученные посредством праймера 1 и праймера 2, фрагменты, полученные посредством праймера 3 и праймера 4, и фрагменты, полученные посредством праймера 5 и праймера 6, могут быть связаны в виде одного фрагмента. Полученные таким образом ПЦР-фрагменты амплифицировали 5 раз посредством ПЦР без применения какого-либо праймера, обрабатывали праймерами 3 и 6, и вновь амплифицировали 25 раз посредством ПЦР. В результате амплифицировали фрагменты гена размером примерно 1600 пар оснований.
Затем Е. coli W3110, которая была трансформирована pKD46, преобразовали в компетентные клетки согласно способу, разработанному Datsenko КА ef al., вводили в нее фрагменты гена размером примерно 1600 пар оснований, полученные посредством ПЦР, и высевали на твердую среду LB, содержащую хлорамфеникол (30 мг/л). После подтверждения посредством ПЦР того, что ген pheA в штамме, полученном таким образом, был инактивирован посредством того, что он имеет размер 1600 пар оснований, был получен штамм Е. coli W3110 ApheA.
Подобным образом, белки, кодируемые геном trpR, имеющим последовательность SEQ ID NO: 8, геном mtr, имеющим последовательность SEQ ID NO: 10, и генами tnaA и tnaB, имеющими последовательности SEQ ID NO: 12 и 14, были инактивированы с использованием праймеров в Таблице 3, с конструированием посредством этого штамма W3110 ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB.
(2) Получение векторов с введенными генами, демонстрирующими способность продуцировать триптофан
С целью придания штамму дикого типа способность продуцировать триптофан, в W3110 ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB, полученный выше, вводили вектор pCL1920 с промотором Ptrc и ген триптофанового оперона, и получали посредством этого pCL1920-Ptrc-trpO.
В частности, для вставки промотора Ptrc в вектор pCL1920 выделяли плазмиду pCL1920, обрабатывали HindIII и PstI, и получали промотор Ptrc посредством ПЦР повторением 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 58°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд с использованием pTrcHis В (Invitrogen, США) в качестве матрицы, вместе с праймерами 23 и 24. Полученные таким образом фрагменты промотора Ptrc расщепляли HindIII и PstI и лигировали с вектором pCL1920, конструируя, посредством этого, вектор pCL1920-Ptrc.
Затем для конструирования вектора pCL1920_Ptrc_trpO получали вектор pCL1920-Ptrc поседством обработки PstI и щелочной фосфатазой, и ген триптофанового оперона амплифицировали из хромосомной ДНК Е. coli КССМ10812Р (корейский патент №10-0792095). Ген trpE, который представляет собой первый ген соответствующего гена оперона, имеет форму, ингибируемую по механизму обратной связи. Для амплификации проводили ПЦР с использованием хромосомной ДНК Е. coli КССМ10812Р в качестве матрицы, вместе с праймерами 25 и 26 посредством повтора 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 58°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 5 минут. Полученные таким образом фрагменты ДНК обрабатывали PstI и лигировали с вектором pCL1920-Ptrc, полученным заранее, и полученный в результате вектор называли pCL1920_Ptrc_trpO (SEQ ID NO: 15).
(3) Получение штамма со вставленным вектором, содержащим триптофановый оперон
После преобразования штамма, полученного в Сравнительном примере 1 (1), в компетентные клетки, в данный штамм вводили вектор, полученный в Сравнительном примере 1 (2), и посредством этого получали штамм дикого типа W3110 ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO, продуцирующий триптофан.
Пример 1: получение штамма ΔeddΔeda из родительского штамма Сравнительного примера 1
В штамме дикого типа W3110 ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO, полученном в Сравнительном примере 1, группу генов edd-eda одновременно подвергали делеции посредством гомологичной рекомбинации, и посредством этого был получен штамм, в котором были инактивированы как 6-фосфоглюконатдегидратаза, так и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза, кодируемые геном edd (SEQ ID NO: 2) и геном eda (SEQ ID NO: 4).
В частности, для получения вышеописанного штамма использовали одноэтапный способ инактивации, разработанный Datsenko КА et al., который представляет собой технологию получения мутанта с использованием рекомбиназы lambda Red. В качестве маркера для подтверждения вставки в ген использовали ген устойчивости к хлорамфениколу pUCprmfmloxC (публикация заявки на корейский патент №2009-007554). Фрагменты гена из примерно 1200 пар оснований амплифицировали ПЦР посредством повтора 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 1 минуты с использованием pUCprmfmloxC в качестве матрицы, вместе с праймерами 27 и 28, содержащими часть группы генов edd-eda и частичную нуклеотидную последовательность гена устойчивости к хлорамфениколу гена pUCprmfmloxC.
Дополнительно, фрагменты ДНК, полученные ПЦР-амплификацией, разделяли электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле, элюировали и использовали в качестве матрицы для второй ПЦР. Вторая ПЦР была разработана для получения последовательностей комплементарных нуклеотидов из 20 пар оснований в областях 5' и 3' первых фрагментов ДНК, и фрагменты гена из примерно 1300 пар оснований амплифицировали ПЦР посредством повтора 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 1 минуты с использованием продукта первой ПЦР в качестве матрицы, вместе с праймерами 29 и 30, к которым были добавлены области 5' и 3' группы генов edd-eda. Полученные таким образом фрагменты ДНК разделяли электрофорезм в 0,8%-ном агарозном геле, элюировали и использовали для рекомбинации.
Е. coli, трансформированную pKD46 согласно способу, разработанному Datsenko KA et al., получали в компетентном состоянии, и фрагмент гена с размером 1300 пар оснований, полученный ПЦР, вводили в нее для трансформации. Полученный таким образом штамм отбирали в среде LB, содержащей хлорамфеникол, и ПЦР-продукт, полученный с использованием праймеров 31 и 32, имел размер 1626 пар оснований, что подтверждало таким образом, что группа генов edd-eda была подвергнута делеции.
В первый рекомбинантный штамм, имеющий устойчивость к хлорамфениколу, после удаления pKD46 вводили pJW168, удаляя посредством этого из бактериального объекта (bacterial body) маркерный ген устойчивости к хлорамфениколу (Gene, (2000) 247, 255 - 64). Полученный в результате бактериальный объект представлял собой ПЦР-амплифицированный продукт, полученный с использованием праймеров 31 и 32, имеющий размер 580 пар оснований, что таким образом подтверждало, что была сделана намеченная делеция. Дополнительно после получения штамма в компетентном состоянии данный штамм трансформировали посредством введения в него вектора, полученного в Сравнительном примере 1, получая, посредством этого, штамм W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaABΔeddΔeda/pCL1920-Ptrc-trpO, продуцирующий триптофан.
Пример 2: подтверждение триптофанпродуцирующей способности штамма ΔeddΔeda
Оценку титра проводили с использованием штамма, полученного в Сравнительном примере 1 и Примере 1. Для оценки титра бактериальный объект инокулпровали с использованием платиновой петли, культивировали в твердой среде LB в течение ночи и инокулировали платиновой петлей на каждую титровальную среду в 25 мл флаконе, имеющую состав, показанный в Таблице 1 ниже. После инокуляции штамм культивировали при 37°С при скорости 200 об./мин в течение 42 часов, и полученные результаты показаны в Таблице 2 ниже. Все использованные результаты представляют собой среднее значение результатов, полученных от трех разных флаконов.
В результате описанного выше эксперимента, как показано в Таблице 2 выше, при делеции группы генов edd-eda, предложенной в настоящей заявке, не было значимого различия в потреблении глюкозы по сравнению с потреблением глюкозы родительским штаммом в Сравнительном примере 1, однако было показано, что количество продуцируемого триптофана увеличивается примерно на 32% по сравнению с количеством триптофана, продуцируемого родительским штаммом. Предполагается, что данный результат обусловлен тем фактом, что реакция протекала до рибулозо-5-фосфата без потери 6-фосфоглюконата, который представляет собой субстрат, посредством делеции в пути Энтнера-Дудорова, и таким образом увеличивалось не только количество NADPH (восстановленный никотинамидадениндинуклеотид фосфат), но также и количество 5-фосфорибозил-1-пирофосфата (PRPP) и эритрозо-4-фосфата (E4P), посредством чего улучшалась способность продуцировать триптофан.
Пример 3: получение штамма ΔeddΔeda из депонированного родительского штамма
Продуцирующий L-триптофан штамм Е. coli КССМ11166Р (корейский патент №10-1261147), депонированный в Корейском центре культуры микроорганизмов (КССМ), обрабатывали таким же способом, что и в Примере 1, и посредством этого получали штамм KCCM11166PΔeddΔeda, в котором была подвергнута делеции группа генов edd-eda.
Пример 4: подтверждение триптофанпродуцирующей способности штамма ΔeddΔeda
Оценку титра проводили с использованием депонированного штамма КССМ11166Р и штамма, полученного в Примере 3.
Для оценки титра бактериальный организм инокулировали с использованием платиновой петли, культивировали в твердой среде LB в течение ночи и инокулировали платиновой петлей на титровальную среду каждого 25 мл флакона, имеющую состав, показанный в Таблице 4 ниже. После инокуляции штамм культивировали при 37°С при скорости 200 об./мин в течение 42 часов, и полученные результаты показаны в Таблице 5 ниже. Все использованные результаты представляют собой среднее значение результатов, полученных от трех разных флаконов.
В результате приведенного выше эксперимента, как показано в Таблице 5 выше, при делеции группы генов edd-eda, предложенной в настоящей заявке, не было значимого различия в потреблении глюкозы по сравнению с потреблением глюкозы родительским штаммом, однако, было показано, что количество продуцированного триптофана увеличивается примерно на 21% по сравнению с количеством триптофана, продуцированного родительским штаммом. Предполагается, что данный результат обусловлен улучшением триптофанпродуцирующей способности, как указано в Примере 2 выше.
Авторы настоящего изобретения подтвердили, что штамм на основе КССМ11166Р, названный штамм «СА04-2800», в котором была инактивирована группа генов edd-eda, имеет улучшенную триптофанпродуцирующую способность, и его депонировали в КССМ 15 ноября 2013 г., и ему был присвоен номер депонирования КССМ11473Р.
Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что одновременная инактивация активностей edd-eda в микроорганизме рода Escherichia, имеющем путь Энтнера-Дудорова, может улучшать триптофанпродуцирующую способность по сравнению с микроорганизмом без инактивации активностей edd-eda.
В настоящей заявке опущено подробное описание того, что может быть признано и получено обычным специалистом в данной области, и помимо типичных описанных здесь воплощений в пределы сущности и объема настоящей заявки могут быть включены разные модификации без модифицирования технических идей или существенных характеристик настоящей заявки. Соответственно, настоящая заявка может быть воплощена в других конкретных формах, и обычный специалист в области, к которой относится настоящая заявка, сможет понять их. Номер депонирования
Депозитарный орган: Корейский центр культуры микроорганизмов (заграничный)
Номер депонирования: KCCM11473P
Дата депонирования: 15.11.2013 г.
Claims (8)
1. Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, где активности эндогенных 6-фосфоглюконатдегидратазы (Edd) и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы (Eda) ослаблены или инактивированы, где микроорганизм имеет усиленный РРР (пентозофосфатный путь) посредством ослабленного или блокированного пути Энтнера-Дудорова.
2. Микроорганизм по п. 1, где 6-фосфоглюконатдегидратаза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.
3. Микроорганизм по п. 1, где 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.
4. Микроорганизм по п. 1, где микроорганизм рода Escherichia представляет собой Escherichia coli.
5. Микроорганизм по п. 1, где ген pheA, ген trpR, ген mtr и ген tnaAB дополнительно делетированы целиком или частично.
6. Способ получения L-триптофана, включающий:
культивирование микроорганизма рода Escherichia по любому из пп. 1-5 в среде; и
выделение L-триптофана из культуральной среды или культивируемого микроорганизма.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140076698A KR101835173B1 (ko) | 2014-06-23 | 2014-06-23 | L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 |
| KR10-2014-0076698 | 2014-06-23 | ||
| PCT/KR2015/006350 WO2015199406A1 (ko) | 2014-06-23 | 2015-06-23 | L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016152662A RU2016152662A (ru) | 2018-07-23 |
| RU2016152662A3 RU2016152662A3 (ru) | 2018-07-23 |
| RU2678139C2 true RU2678139C2 (ru) | 2019-01-23 |
Family
ID=54938423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016152662A RU2678139C2 (ru) | 2014-06-23 | 2015-06-23 | Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, и способ продуцирования L-триптофана с использованием данного микроорганизма |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10815510B2 (ru) |
| EP (1) | EP3159401B1 (ru) |
| JP (2) | JP6687549B2 (ru) |
| KR (1) | KR101835173B1 (ru) |
| CN (1) | CN106574239B (ru) |
| BR (1) | BR112016030467B1 (ru) |
| DK (1) | DK3159401T3 (ru) |
| ES (1) | ES2918459T3 (ru) |
| MY (1) | MY172369A (ru) |
| RU (1) | RU2678139C2 (ru) |
| WO (1) | WO2015199406A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2806731C1 (ru) * | 2019-09-03 | 2023-11-03 | Нинся Эппэнь Биотек Ко., Лтд | Применение гена транспортного переносчика, который улучшает эффективность продуцирования l-триптофана у escherichia coli |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019182413A1 (ko) | 2018-03-23 | 2019-09-26 | 씨제이제일제당 (주) | L-아미노산을 포함하는 과립 및 이의 제조방법 |
| KR101996767B1 (ko) * | 2018-11-29 | 2019-07-04 | 씨제이제일제당 (주) | cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법 |
| KR102134418B1 (ko) * | 2019-06-17 | 2020-07-16 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법 |
| WO2021007575A1 (en) * | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Bp Corporation North America Inc. | Gluconate dehydratase enzymes and recombinant cells |
| CN115261365B (zh) * | 2022-06-22 | 2024-01-30 | 南通紫琅生物医药科技有限公司 | 色氨酸合成酶突变体及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040142435A1 (en) * | 2002-11-20 | 2004-07-22 | Yoshiya Gunji | Method for producing L-amino acid using methylotroph |
| US20060115878A1 (en) * | 2002-03-27 | 2006-06-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acid |
| RU2288268C2 (ru) * | 2005-01-26 | 2006-11-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | 6-фосфоглюконолактоназа из escherichia coli, фрагмент днк, бактерия, принадлежащая к роду escherichia - продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты |
| WO2008082179A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Cj Cheiljedang Corporation | Genetically engineered recombinant escherichia coli producing l-tryptophan having originally l-phenylalanine productivity, and method for producing l-tryptophan using the microorganism |
| KR20090092373A (ko) * | 2008-02-27 | 2009-09-01 | 씨제이제일제당 (주) | 피루베이트 옥시다아제가 불활성화된 ｌ-트립토판 생산미생물 및 이를 이용한 ｌ-트립토판 생산 방법 |
| CA2860974A1 (en) * | 2012-01-10 | 2013-07-18 | Cj Cheiljedang Corporation | A microorganism of the genus escherichia having enhanced l-tryptophan productivity and a method for producing l-tryptophan using the same |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US913A (en) * | 1838-09-12 | Improved machine for removing snags and sawyers from the beds of rivers | ||
| US4371614A (en) * | 1980-08-22 | 1983-02-01 | Ajinomoto Co., Inc. | E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan |
| BRPI0507978A (pt) * | 2004-02-25 | 2007-07-24 | Ajinomoto Kk | bactéria produtora de l-aminoácido pertencente à famìlia enterobacteriaceae, e, método para produzir um l-aminoácido |
| RU2004105179A (ru) * | 2004-02-25 | 2005-08-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | 6-фосфоглюконолактоназа из escherichia coli, фрагмент днк, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, -продуцент l-аминокислоты, и способ получения l-аминокислоты |
| US20050191684A1 (en) * | 2004-02-25 | 2005-09-01 | Zimenkov Danila V. | Method for producing L-amino acids |
| BRPI0808970B1 (pt) | 2007-03-23 | 2017-02-14 | Metabolic Explorer Sa | microrganismos e métodos de produção de 1,2-propanodiol e acetol |
| JPWO2009101757A1 (ja) * | 2008-02-14 | 2011-06-09 | パナソニック株式会社 | コンデンサマイクロホン及びｍｅｍｓデバイス |
-
2014
- 2014-06-23 KR KR1020140076698A patent/KR101835173B1/ko active Active
-
2015
- 2015-06-23 RU RU2016152662A patent/RU2678139C2/ru active
- 2015-06-23 CN CN201580045207.3A patent/CN106574239B/zh active Active
- 2015-06-23 WO PCT/KR2015/006350 patent/WO2015199406A1/ko active Application Filing
- 2015-06-23 EP EP15811391.0A patent/EP3159401B1/en active Active
- 2015-06-23 US US15/321,717 patent/US10815510B2/en active Active
- 2015-06-23 ES ES15811391T patent/ES2918459T3/es active Active
- 2015-06-23 DK DK15811391.0T patent/DK3159401T3/da active
- 2015-06-23 BR BR112016030467-5A patent/BR112016030467B1/pt active IP Right Grant
- 2015-06-23 MY MYPI2016704788A patent/MY172369A/en unknown
- 2015-06-23 JP JP2016575078A patent/JP6687549B2/ja active Active
-
2018
- 2018-11-05 JP JP2018207937A patent/JP2019013256A/ja active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060115878A1 (en) * | 2002-03-27 | 2006-06-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acid |
| US20040142435A1 (en) * | 2002-11-20 | 2004-07-22 | Yoshiya Gunji | Method for producing L-amino acid using methylotroph |
| RU2288268C2 (ru) * | 2005-01-26 | 2006-11-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | 6-фосфоглюконолактоназа из escherichia coli, фрагмент днк, бактерия, принадлежащая к роду escherichia - продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты |
| WO2008082179A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Cj Cheiljedang Corporation | Genetically engineered recombinant escherichia coli producing l-tryptophan having originally l-phenylalanine productivity, and method for producing l-tryptophan using the microorganism |
| KR20090092373A (ko) * | 2008-02-27 | 2009-09-01 | 씨제이제일제당 (주) | 피루베이트 옥시다아제가 불활성화된 ｌ-트립토판 생산미생물 및 이를 이용한 ｌ-트립토판 생산 방법 |
| CA2860974A1 (en) * | 2012-01-10 | 2013-07-18 | Cj Cheiljedang Corporation | A microorganism of the genus escherichia having enhanced l-tryptophan productivity and a method for producing l-tryptophan using the same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JOSE LUIS BAEZ-VIVEROS et al., Metabolic transcription analysis of engineered Escherichia coli strains that overproduce L-phenylalanine, Microbial Cell Factories Vol. 6, No. 30, pp. 1-20, 2007. * |
| UniProtKB - B7L7Q4 (B7L7Q4_ECO55), 10.02.2009. Найдено в Интернет 31.01.2018 по адресу: www.uniprot.org/uniprot/B7L7Q4. UniProtKB - H4ISU0 (H4ISU0_ECOLX), 18.04.2012. Найдено в Интернет 31.01.2018 по адресу: www.uniprot.org/uniprot/H4ISU0. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2806731C1 (ru) * | 2019-09-03 | 2023-11-03 | Нинся Эппэнь Биотек Ко., Лтд | Применение гена транспортного переносчика, который улучшает эффективность продуцирования l-триптофана у escherichia coli |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20170137854A1 (en) | 2017-05-18 |
| US10815510B2 (en) | 2020-10-27 |
| JP2017518759A (ja) | 2017-07-13 |
| WO2015199406A1 (ko) | 2015-12-30 |
| MY172369A (en) | 2019-11-21 |
| BR112016030467B1 (pt) | 2023-11-14 |
| RU2016152662A (ru) | 2018-07-23 |
| EP3159401B1 (en) | 2022-05-18 |
| ES2918459T3 (es) | 2022-07-15 |
| CN106574239B (zh) | 2024-05-14 |
| JP6687549B2 (ja) | 2020-04-22 |
| RU2016152662A3 (ru) | 2018-07-23 |
| KR20160000082A (ko) | 2016-01-04 |
| KR101835173B1 (ko) | 2018-03-07 |
| JP2019013256A (ja) | 2019-01-31 |
| DK3159401T3 (da) | 2022-07-04 |
| BR112016030467A2 (pt) | 2018-01-16 |
| EP3159401A1 (en) | 2017-04-26 |
| CN106574239A (zh) | 2017-04-19 |
| EP3159401A4 (en) | 2018-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101261147B1 (ko) | Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 | |
| RU2584593C2 (ru) | МИКРООРГАНИЗМЫ Corynebacterium, СПОСОБНЫЕ УТИЛИЗИРОВАТЬ КСИЛОЗУ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА С ПРИМЕНЕНИЕМ ТАКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ | |
| EP3272860B1 (en) | Pyruvate dehydrogenase mutant, microorganism comprising mutant, and method for producing l-amino acid by using microorganism | |
| RU2667425C2 (ru) | Микроорганизм Corynebacterium sp. с повышенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с его помощью | |
| RU2678139C2 (ru) | Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, и способ продуцирования L-триптофана с использованием данного микроорганизма | |
| JP6870041B2 (ja) | Ｌ−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物及びそれを用いたｌ−トリプトファンの製造方法 | |
| JP6375391B2 (ja) | Ｏ−アセチル−ホモセリンを生産する微生物及びこれを用いてｏ−アセチル−ホモセリンを生産する方法 | |
| RU2668830C2 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-лизина и способ получения L-лизина с его помощью | |
| RU2692645C2 (ru) | Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, и способ получения L-триптофана с его использованием | |
| JP6177995B2 (ja) | Ｌ−トリプトファン産生能を有する微生物およびこれを用いてｌ−トリプトファンを産生する方法 | |
| JP2018529354A (ja) | Ｌ−トレオニンを生産する組み換え微生物及びそれを用いてｌ−トレオニンを生産する方法 | |
| EP3130663B1 (en) | Microorganism having l-lysine producing ability and l-lysine producing method using same | |
| TWI819552B (zh) | 用於生產高濃度左旋麩胺酸的菌株及使用其生產左旋麩胺酸的方法 | |
| JP2024528213A (ja) | ２’－フコシルラクトースの生体触媒合成のための特定のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ |