JP2024528213A - ２’－フコシルラクトースの生体触媒合成のための特定のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
本発明は、融合タンパク質であることを特徴とする酵素であって、（ｉ）フコシルトランスフェラーゼのＮ末端ドメインを含み、（ｉｉ）配列番号５の少なくともアミノ酸１５５～２８６、又はそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列をＣ末端ドメインとして含み、フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、Ｎ末端ドメイン及び前記Ｃ末端ドメインは、２つの異なるフコシルトランスフェラーゼに由来する、酵素に関する。本発明はさらに、この酵素と反応するグルコース、グリセロール、スクロース、フコース並びにＧＤＰ－、ＡＤＰ－、ＣＤＰ－及びＴＤＰ－フコースからなる物質の群より選択される少なくとも１つの物質の存在下、反応混合物にラクトースが存在することを特徴とする、２’－フコシルラクトースの製造方法に関する。
Description
本発明は、融合タンパク質であることを特徴とする酵素であって、（ｉ）フコシルトランスフェラーゼのＮ末端ドメインを含み、及び、（ｉｉ）配列番号５の少なくともアミノ酸１５５～２８６、又はそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列をＣ末端ドメインとして含み、フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、Ｎ末端ドメイン及び前記Ｃ末端ドメインは、２つの異なるフコシルトランスフェラーゼに由来する、酵素に関する。本発明はさらに、グルコース、グリセロール、スクロース、フコース並びにＧＤＰ－、ＡＤＰ－、ＣＤＰ－及びＴＤＰ－フコースからなる物質の群より選択される少なくとも１つの物質の存在下、反応混合物中にラクトースが存在することを特徴とする、２’－フコシルラクトースの製造方法に関する。
これまでに、ヒトミルクオリゴ糖、又は略してＨＭＯ（複数）又はＨＭＯ（単数）と呼ばれる約２００の異なる複合オリゴ糖が、ヒトミルクにおいて同定されている。高い多様性は、５つの単糖Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｌ－フコース、及びＮ－アセチルノイラミン酸の様々な組み合わせから生じて、単純で時には非常に複雑なオリゴ糖になる。ＨＭＯがどの単糖から形成されるかに応じて、フコシル化中性ＨＭＯ、非フコシル化中性ＨＭＯ及びシアリル化酸性ＨＭＯが区別される（Ｐｅｔｓｃｈａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｎｉｄｅｔｚｋｙ ２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３５，ｐｐ．６１－８３）。
ヒトミルクの他の重要な成分、すなわちラクトース、脂質、及びタンパク質などの糖とは異なり、ＨＭＯは乳児によって代謝されない。むしろ、それらは、健常な腸内微生物叢の発達、感染症の予防、及び健常な免疫系の発達において重要な役割を果たす。ＨＭＯは、ＨＭＯを代謝することができる良性細菌を与えることによってこれらの効果を成し、ＨＭＯを代謝することができない病原体に対して成長の利点がある。さらに、それらは、病原体が結合する上皮細胞の糖の構造を模倣し、それによって病原体の表面を飽和させ、最終的にその排泄をもたらすことによって、腸壁への病原体の付着を防止する。最後になるが、腸から吸収された後のＨＭＯはまた、腸上皮細胞及び免疫細胞の遺伝子調節に直接的な影響を及ぼし、それによってとりわけサイトカイン発現を介して全身性抗炎症効果を及ぼす（Ｆａｉｊｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３７，ｐｐ．６６７－６９７；Ｐｅｔｓｃｈａｃｈｅｒ ２０１８，Ｄｉｅ Ｈｅｂａｍｍｅ ３１，ｐｐ．４０９－４１４）。
ヒトミルクは、その高含有量のＨＭＯ及びその複合組成によって特徴づけられる。場合によっては、特定のＨＭＯは、ヒトミルクにのみ、かなりの量で存在する。したがって、ＨＭＯは他の哺乳動物においても検出されるが、それらは非常に低い濃度でのみ見出される。したがって、上述の有益な特性を達成するために、ヒトミルク代用にＨＭＯを補充している。別の新たなの使用分野は、成人向けの栄養補助食品としての使用である（Ｅｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１１６，ｐｐ．１３５６－１３６８）。
ヒトミルクの最も一般的なＨＭＯは、三糖２’－フコシルラクトース、又は略して２’－ＦＬ（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０２０，Ｓｙｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｂｉｏｍａｎｕｆ．１，ｐｐ．１－１４）である。２’－ＦＬは、単糖Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース及びＬ－フコースからなり、Ｄ－ガラクトースは、β－１，４－グリコシド結合によってＤ－グルコースに、α－１，２－グリコシド結合によってＬ－フコースに共有結合（Ｆｕｃ－α１，２－Ｇａｌ－β１，４－Ｇｌｃ）している。
酵素的プロセスは、必要な選択的結合形成が化学合成を不経済にするので、例えば２’－ＦＬのようなＨＭＯの合成にとって魅力的な選択肢である。酵素の位置選択性及び立体選択性は、保護基を使用しない合成を可能にし、これは、特により複雑な構造に対して経済的に有利である。
フコシル化ＨＭＯの酵素触媒合成では、フコシルトランスフェラーゼが一般に使用される。後者は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素ファミリー（ＧＴ；ＥＣ ２．４．）に属し、ドナー、通常はグアノシン二リン酸フコース、又は略してＧＤＰ－フコースからアクセプターへのフコース単位の転移を触媒し、後者はオリゴ糖、糖タンパク質／タンパク質又は糖脂質／脂質であり得る。フコシルトランスフェラーゼがフコースを転移するアクセプターの反応基は、フコシルトランスフェラーゼのクラスを決定する。α－１，２－、α－１，３／４－及びα－１，６－フコシルトランスフェラーゼが区別されている。２’－ＦＬの酵素的合成は、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼを使用し、これはＧＤＰ－フコースのフコースをラクトース、より正確にはガラクトース単位の２’－ヒドロキシル基に転移させ、α－１，２－グリコシド結合の形成をもたらす。この目的のために非特異的な１，２－フコシルトランスフェラーゼを使用する場合、以下のスキーム（１）に従って２’－ＦＬが形成され、グルコース単位の３’－ヒドロキシル基に加えて、非特異的な様式でもフコシル化を受けることが可能であり、その結果、副産生物２，３－ジフコシルラクトース、より正確にはＦｕｃ－α１，２－Ｇａｌ－β１，４－（Ｆｕｃ－α１，３－）Ｇｌｃが形成される：
（１）ラクトース＋ＧＤＰ－フコース→２’－ＦＬ＋ジフコシルラクトース。
これに対して、特異的な１，２－フコシルトランスフェラーゼでは、望ましくない副産生物を形成することなく、２’－ＦＬがスキーム（２）に従って形成される。
（２）ラクトース＋ＧＤＰ－フコース→２’－ＦＬ
（１）ラクトース＋ＧＤＰ－フコース→２’－ＦＬ＋ジフコシルラクトース。
これに対して、特異的な１，２－フコシルトランスフェラーゼでは、望ましくない副産生物を形成することなく、２’－ＦＬがスキーム（２）に従って形成される。
（２）ラクトース＋ＧＤＰ－フコース→２’－ＦＬ
フコシルトランスフェラーゼはグリコシルトランスフェラーゼクラス（ＥＣ ２．４．）に属するが、これらはこのクラスの酵素の一例に過ぎない。一般に、グリコシルトランスフェラーゼは、ドナーからアクセプターへの糖分子の転移を触媒する。異なるＧＴ間の配列相同性は低いが、ＧＴの大部分は、２つの構造スーパーファミリー、すなわちＧＴ－Ａ及びＧＴ－Ｂのうちの１つに割り当てることができる。２つのスーパーファミリーが共通して有することは、酵素が、リンカー構造／配列によって互いに連結された２つのドメインからなることである。酵素の活性中心は、ここでは２つのドメインの領域から形成され、それらの間に位置する。
ＧＴ－Ａファミリーの酵素は、各々の場合で、αヘリックス（ロスマンフォールドとして知られている）に囲まれたβプリーツシートからなるＮ末端ドメインを有し、これはドナーを認識するこのドメインであるが、Ｃ末端ドメインは主に混合βプリーツシートからなり、アクセプターに結合する。
対照的に、ＧＴ－Ｂファミリーの酵素は、２つのロスマンフォールド型折り畳み構造を有する。Ｎ末端ドメインはアクセプター結合部位を形成するが、Ｃ末端構造はドナーの結合を担う。おそらく、広範囲のアクセプターの糖と比較してドナーの糖の変動性が低いために、ＧＴ－Ｂファミリーの異なるグリコシルトランスフェラーゼのＣ末端ドメインは、Ｎ末端ドメインよりも高度に保存されている（Ａｌｂｅｓａ－Ｊｏｖｅ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４，ｐｐ．１０８－１２４）。
ＧＴ－Ｂファミリーなどの構造スーパーファミリー内の保存されたフォールディングのために、構造スーパーファミリーの２つの異なるグリコシルトランスフェラーゼのドメインを互いに組み合わせることが可能である。ドメインスワッピングとしても知られる、異なる起源の同様に折り畳まれたタンパク質ドメインの交換は、酵素の特性評価及び代謝エンジニアリングにおいて一般的に使用される方法であり、新規な特性（例えば、変化した活性又は基質特異性など）を有するハイブリッド酵素の産生を可能にする（Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７，１８２，ｐｐ．１－７；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７０，ｐｐ．４７３－４８２；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０２，ｐｐ．９８８－９９４；Ｔｒｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１６，ｐｐ．６７６－６８５）。しかしながら、グリコシルトランスフェラーゼにおける先行するドメインスワッピング実験の結果は一貫性がない。一方で、グリコシルトランスフェラーゼのアクセプター又はドナー特異性は、対応するドメインの交換によって変化した（Ｔｒｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１６，ｐｐ．６７６－６８５）。一方、Ｃ末端ドメイン及びＮ末端ドメインの両方がアクセプターに対する特異性に影響を及ぼし、その結果、基質特異性の予測は通常不可能である（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７０，ｐｐ．４７３－４８２）これはまた、確実に、この酵素クラスの活性中心が２つのドメインを互いに隣接して配置することによって形成され、その結果、三次元構造のわずかな違いが不活性酵素又は少なくとも歪んだ結合部位をもたらすことが多いためである。したがって、そのような実験は、原則として、不活性であるか、又は所望の特異性及び反応性を有さない酵素を得ることが期待され得る。
特異性及び活性に加えて、タンパク質の安定性及び溶解性がフコシルトランスフェラーゼにおいて主要な役割を果たす。例えば、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるフコシルトランスフェラーゼの発現では、封入体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３，ｐｐ．２１２－２１８）の形成及び低いタンパク質安定性（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｅａｄｉｎｇ）１４５，ｐｐ．３２４５－３２５３）が頻繁に観察されている。したがって、フコシルトランスフェラーゼの溶解性／安定性及びフォールディングを増加させるための試みが繰り返されてきた。シャペロン（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３，ｐｐ．２１２－２１８）の同時発現と同様に、フコシルトランスフェラーゼと、クイックフォールディング及び高可溶性タンパク質、例えばグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Ａｌｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３４，ｐｐ．９７－１０３）との翻訳融合の選択肢がある。別法として、負に荷電したアスパラギン酸タグ（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１０，ｐｐ．１０７－１１５）などの荷電アミノ酸を付加することによって溶解性を高めることができる。複数の相同タンパク質から形成されたアミノ酸コンセンサス配列を使用することによってタンパク質安定性を改善することを目的としたアプローチもある（Ｐｏｒｅｂｓｋｉ ａｎｄ Ｂｕｃｋｌｅ ２０１６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２９，ｐｐ．２４５－２５１）。このアプローチは、相同配列によって表される進化の情報を鑑み、保存されたアミノ酸が保存されていないアミノ酸よりも安定性に寄与するという仮説に基づいている（Ｓｔｅｉｐｅ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４０，ｐｐ．１８８－１９２）。
本明細書に記載の本発明に先立ち、工業的に実施される時点までに様々なα－１，２－フコシルトランスフェラーゼを使用した２’－ＦＬの合成は、既に実証されていた。これらには、とりわけ、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｔＣ、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０７６７７９；欧州特許第１２４３６７４号明細書、協和発酵、１９９０）、ヘリコバクタームステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＮＣＴＣ１２１９８／ＡＴＣＣ４３７７２由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｔＬ，ＧｅｎＢａｎｋ ＣＢＧ４０４６０．１；欧州特許第１４２６４４１号明細書、協和発酵、２００１）、血清型Ｏ１２６のイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ｗｂｇＬ，Ｅｎｇｅｌｓ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇ ２０１４，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４，ｐｐ．１７０－１７８）、及びバクテロイデスフラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ｗｃｆＢ，Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５７，ｐｐ．１９２－１９８）が含まれる。２’－ＦＬを産生するためのイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のバッチ発酵における２’－ＦＬ収率に関して上記の酵素を比較すると、最も高い収率はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２由来のｆｕｔＣであり、したがってこの酵素の高い活性を示唆するものであった（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．４１，ｐｐ．２３－３８）。
酵素のより正確な特性評価及び最適化のために、いくつかの配列改変も行った。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２由来のｆｕｔＣの分析は、２つの代替開始コドン（Δａａ１－１５、すなわちアミノ酸Ｍ１６から出発、又はΔａａ１－４６、すなわちアミノ酸Ｍ４７から出発）を使用することによってＮ末端を短縮すると、活性が完全に失われることを示した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｅａｄｉｎｇ）１４５，ｐｐ．３２４５－３２５３）。同様に、保存領域ａａ１６３～１７３の上流、より正確にはｆｕｔＣ遺伝子のａａ１５２の下流に耐性遺伝子を挿入すると、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２におけるフコシル化ルイスＹ抗原の産生に関する機能が失われた（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１，１２６５－１２７４）。これらの実験は、コード配列全体がフコシルトランスフェラーゼ活性に必要であり、アミノ酸配列の小さな操作でさえ酵素の完全な不活性化をもたらし得ることを示した。
Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２由来のｆｕｔＣはラクトースだけでなくモノフコシル化糖も基質として受け入れるので（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒｅａｄｉｎｇ）１４５，ｐｐ．３２４５－３２５３）、２’－ＦＬの合成は、グルコース単位の３’－ヒドロキシル基のさらなるフコシル化の結果として、副産生物ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）又はラクトジフコテトラオース（ＬＤＦＴ）、より正確にはＦｕｃ－α１，２－Ｇａｌ－β１，４－（Ｆｕｃ－α１，３－）Ｇｌｃ，（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ．Ｆａｃｔ．１７，１０１，ｐｐ．１－１０）の形成を伴う。これは、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）２６６９５株由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼについても実証された（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５７，ｐｐ．１９２－１９８）。
このような製造バッチにおけるＤＦＬ形成は、ＤＦＬへの変換の結果として２’－ＦＬが失われるだけでなく、必要とされる活性化フコース（ＧＤＰ－フコース）がまた消費されるので、２’－ＦＬの合成の効率に、二重にマイナスの影響を及ぼす。その後、後者はもはや２’－ＦＬの合成に利用できない。さらに、２’－ＦＬ及びＤＦＬの物理的及び化学的特性が非常に類似しているため、形成されたＤＦＬは、発酵培養物を純粋な２’－ＦＬに加工することを困難にする。
したがって、好ましい実施形態では、ラクトースのガラクトース単位の２’－ヒドロキシル基の特異的フコシル化のために位置及び基質特異的α－１，２－フコシルトランスフェラーゼを使用することが好ましい。同定されている例は、Ｈ．ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＮＣＴＣ１２１９８／ＡＴＣＣ４３７７２由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼｆｕｔＬであり、これは、副産生物ＤＦＬの合成の顕著な減少と共に、特異的に２’－ＦＬを形成する（欧州特許第２８７７５７４号明細書、Ｇｌｙｃｏｓｙｎ、２０１５）。Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２由来のｆｕｔＣと比較して、ラクトースに対する記載された高い活性及び特異性の結果として、それは同様に、２’－ＦＬの合成に既に使用されている（欧州特許第１４２６４４１号明細書、協和発酵、２００１）。一方、同じバッチ発酵条件での２’－ＦＬ収率に関して、ｆｕｔＬとＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ１２１０と同様のｆｕｔＣを直接比較したところ（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．４１，ｐｐ．２３－３８）、ｆｕｔＬはｆｕｔＣで得られた収率の約７５％しか達成しなかったことを示した。
ＣＡＺＹデータベース（ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／ＧＴ１１＿ｂａｃｔｅｒｉａ．ｈｔｍｌ）で、両方の１，２－フコシルトランスフェラーゼ、すなわちＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２由来のｆｕｔＣ及びＨ．ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＮＣＴＣ１２１９８／ＡＴＣＣ４３７７２由来のｆｕｔＬは、グリコシルトランスフェラーゼファミリー１１（ＧＴ－１１）に割り当てられている（Ｍａ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １６，ｐｐ．１５８－１８４）。ＧＴ－１１ファミリーについては、以前、Ｂｒｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２２，ｐｐ．５４０－５４９により、その中で分類された酵素はＧＴ－Ｂフォールディングを示すことができ、これは仮定のままとしておくべきであると予測されてきたが（Ｐｅｔｓｃｈａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｎｉｄｅｔｚｋｙ ２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３５，ｐｐ．６１－８３）、現在まで、ＧＴ１１ファミリーのメンバーをＧＴ－Ｂ又はＧＴ－Ａフォールドファミリーのいずれかに明確に割り当てることは不可能であり（Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７，１８２，ｐｐ．１－７）、これにより、ドメインスワッピング実験のドナー／アクセプター特異性の正確な予測がさらに不可能になっている。
提示された先行技術によれば、（特定のものの定義についてはスキーム２参照）Ｈ．ムステラエ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＮＣＴＣ１２１９８／ＡＴＣＣ４３７７２由来の特定のｆｕｔＬのＮ末端ドメインは、ＧＴ－Ｂスーパーファミリーへの推定される割り当てを考えると、アクセプターの結合に関与し、したがって副産生物ＤＦＬを形成することなくラクトースの２’－ＦＬへのフコシル化に関与すると予想される。
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本発明の目的は、２’－ＦＬの生体触媒合成の効率を高めること、すなわち２’－ＦＬの収率の増加を達成し、同時に非常に類似した副産生物ＤＦＬの形成を回避して、２’－ＦＬの後処理を容易にし、したがって経済的な工業プロセスを確立することを可能にすることであった。
この目的は、融合タンパク質であることを特徴とする酵素であって、（ｉ）フコシルトランスフェラーゼのＮ末端ドメインを含み、（ｉｉ）配列番号５の少なくともアミノ酸１５５～２８６、又はそれに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列をＣ末端ドメインとして含み、フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、Ｎ末端ドメイン及び前記Ｃ末端ドメインは、２つの異なるフコシルトランスフェラーゼに由来する、酵素を提供することにより成し遂げられる。この融合タンパク質は、驚くべきことに、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼｆｕｔＬの基質特異性及び位置特異性を、酵素ｆｕｔＣの潜在的により高い活性と結合させることに成功した。これは、現先行技術からは予測することができなかった、なぜなら、２’－ＦＬがＤＦＬにさらにフコシル化されるのを妨げる基質ラクトースの融合タンパク質への特異的結合に関与するのは、配列番号５のＮ末端ドメインであり、配列番号５のＣ末端ドメインではないと予想されたからである。これにより、ラクトースを２’－フコシルラクトースに特異的にフコシル化するための経済的に有効な方法に使用することができる酵素が得られる。
本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端ドメイン（タンパク質ｉ）及びＣ末端ドメイン（タンパク質ｉｉ）のアミノ酸配列の融合を構成し、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインは、２つの異なるフコシルトランスフェラーゼに由来する。例として使用される野生型タンパク質ｆｕｔＬ（配列番号５のヘリコバクタームステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＮＣＴＣ１２１９８由来のｆｕｔＬ）又はｆｕｔＣ（例えば、配列番号３のＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２由来のｆｕｔＣ）は、２つの異なるフコシルトランスフェラーゼ由来の融合タンパク質ではないので、特許請求の範囲に包含されない。
融合タンパク質という用語は、対応するアミノ酸配列及び／又はコードＤＮＡ配列が実験室で融合されており、したがって自然界では起こらないことを意味する。融合タンパク質は、ハイブリッド又はハイブリッド酵素とも呼ばれる。これは、例えば、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２のｆｕｔＣ配列に基づくコンセンサス配列ｆｕｔＣ＊に由来するα－１，２－フコシルトランスフェラーゼのＮ末端ドメイン及びヘリコバクタームステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＮＣＴＣ１２１９８のｆｕｔＬ配列のＣ末端ドメインから構成され得る。ハイブリッド酵素は、高い活性及び特異性を有し、フコースのみをラクトースに、例えば、アクセプターのラクトースのガラクトース単位の２’－ヒドロキシル基に効率的に転移させるが、ラクトースのグルコース単位の３’－ヒドロキシル基には転移させない。それによって、望ましくない副産生物ジフコシルラクトースの形成が顕著に減少することが重要である。これにより、ＤＦＬを除去するための面倒な精製工程を大部分又は完全に省くことができるので、２’－フコシルラクトースの単離がはるかに容易になり、経済的により効率的になる。
融合タンパク質を使用することのさらなる利点は、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの選択により、ドナー及びアクセプターの受け入れを変えることが可能であり、そうすることで、より複雑なＨＭＯをより効率的に産生することがまた可能になるということである。さらに、ｆｕｔＣなどのより高い酵素活性を、ｆｕｔＬなどのアクセプター基質に対するより良好な選択性と組み合わせることができる。
おそらくより高いｆｕｔＣの活性と、アクセプター基質に対するｆｕｔＬのより良好な選択性とを組み合わせるために、ｆｕｔＣ＊のＮ末端ドメイン（配列番号７のａａ１～１４８）をｆｕｔＬのＣ末端ドメイン（配列番号５のａａ１４２～２８６）と融合したか、又は逆の組み合わせで、ｆｕｔＬのＮ末端ドメイン（配列番号５のａａ１～１４３）をｆｕｔＣ＊のＣ末端ドメイン（配列番号７のａａ１５１～３００）と融合した。このために、ＳｃａＩ－（ＡＧＴＡＣＴ）切断部位を、ｆｕｔＬについてコードされるプラスミドのｆｕｔＬ遺伝子（配列番号４）の核酸配列における塩基４２６～４２７（ＴＡ～ＣＴ）を交換することによって２つの酵素ドメイン間のリンカー配列に導入したが、この交換によってアミノ酸配列は変化しなかった。この切断部位の導入により、このプラスミド構築物の助けを借りて、末端で切断する適切な制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ）又はドメイン間で切断する適切な制限酵素（ＳｃａＩ）による制限消化によって、ｆｕｔＬのＮ末端／Ｃ末端ドメインと別の適切なＰＣＲ増幅ドメイン、例えばｆｕｔＣ＊との交換を実行することが可能であった（実施例２参照）。得られた低コピー発現プラスミド上のｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（配列番号８）又はｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊（配列番号１０）ハイブリッド用のｃｄｓは、ｒｃｓＡ（配列番号１８）用のｃｄｓと最適化されたＲＢＳを有するオペロンにおいて、転写で組み合わされた。
本発明の酵素は、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）活性を有する、すなわち、グリセロール、スクロース、グルコース又はフコースから出発して形成され得る、ＧＤＰ－、ＡＤＰ－、ＣＤＰ－又はＴＤＰ－フコース、好ましくはグアノシン二リン酸フコース（ＧＤＰ－フコース）などのドナーからのフコース単位のアクセプターへの転移を触媒し、後者はオリゴ糖、例えば好ましくはラクトース、又は糖タンパク質、タンパク質、糖脂質又は脂質である。
フコシルトランスフェラーゼ活性の検出のために、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に最適化されたコドン使用頻度の試験タンパク質のｃｄｓを、適切なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅し、プロモーター、好ましくは誘導性プロモーター（図１の実施例２を参照されたい）の下流の低コピー発現プラスミドｐＷＣ１などの発現プラスミドに、付加切断部位によって、クローニングする。
適切なプロモーターは、当業者に公知のすべてのプロモーター、例えば構成的プロモーター、例えばＧＡＰＤＨプロモーター、又は誘導性プロモーター、例えばｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７、ラムダＰＬ、ａｒａ、クメート若しくはｔｅｔプロモーター、又はそれらに由来する配列である。好ましくは、本発明の酵素の発現を制御するプロモーターは誘導性プロモーターであり、より好ましくはＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド）によって誘導されるプロモーターである。
宿主細胞がイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である場合、最適化されたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有するＧＤＰ－フコースのデノボの経路のイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）内因性転写活性化因子ｒｃｓＡ（配列番号１８（ＤＮＡ）／配列番号１９（ＰＲＴ））のｃｄｓは、デノボの経路でのＧＤＰ－フコースの細胞内内因性産生を増加させるために、フコシルトランスフェラーゼのそれぞれのｃｄｓの下流の完成した発現プラスミドに、ポリシストロニックに挿入されることが好ましい。
ＧＤＰ－フコース又は別の活性化フコース（例えば、ＡＤＰ－、ＧＤＰ－、ＣＤＰ－又はＴＤＰ－フコース）をドナーとして細胞内に与えることができる微生物株、例えば好ましくは適切なイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えばイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎΔｓｕｌＡ－ｌａｃ－ｍｏｄ（実施例１及び図２参照）を、発現プラスミドで形質転換することによって、当業者は、発現されるフコシルトランスフェラーゼｆｕｔＣ（配列番号３）、ｆｕｔＣ＊（配列番号７）、ｆｕｔＬ（配列番号５）、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬハイブリッド（配列番号９）又はｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊ハイブリッド（配列番号１１）のみが異なり、したがってＦＴ活性の分析に使用することができる株を得る。このために、ドナーを細胞内に与えることができる得られた株は、グリセロール、スクロース、グルコース又はフコースなどのドナー前駆体、株はこれを細胞内でＧＤＰ－フコースに変換することができる、及び培地のラクトースなどのアクセプターの存在下で培養される。誘導性プロモーターが選択された場合、ｃｄｓは構成的に又は誘導後に発現される。株のＦＴ活性の実証として、フコシル化産生物２’－ＦＬの濃度をＨＰＬＣによって判定する。このために、少なくとも約１６０の細胞密度ＯＤ６００を有する対応する細胞培養物から１ｍｌのアリコートを採取し、次いで、例えばベンチ型遠心分離機で最大速度で５分間遠心分離することによってすべての固体成分を除去し、得られた上清の産生物含有量を、例えば実施例４に記載のＨＰＬＣによって定量する（図３も参照）。
出発配列として使用される異なるフコシルトランスフェラーゼのコード配列（ｃｄｓ）は、先行技術及びデータベースで公知であり、任意選択で、宿主生物、例えばイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して最適化されたコドン使用で合成的に作製され得、又は適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって元の生物のゲノムから増幅され得る。
コード配列（ｃｄｓ）と呼ばれるものは、開始コドンと終止コドンとの間にあり、タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの領域である。
ｃｄｓは非コード領域に囲まれている。遺伝子と呼ばれるものは、生物学的に活性なＲＮＡを産生するための全情報を含むＤＮＡの部分である。したがって、遺伝子は、転写によって一本鎖ＲＮＡのコピーが産生されるＤＮＡの部分だけでなく、このコピーの過程の調節に関与するＤＮＡのさらなる部分も含む。
本発明の酵素についてのｃｄｓの発現を調節する好ましい発現シグナルには、少なくとも１つのプロモーター、転写開始、翻訳開始、リボソーム結合部位及びターミネーターが含まれる。これらは、使用される細菌株において、特に好ましくはイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、特に好ましく機能的である。したがって、機能的なプロモーターの場合、このプロモーターの調節下にあるコード配列がＲＮＡに転写される場合がある。
野生型（ｗｔ）ｃｄｓと呼ばれるものは、進化によって自然に発生し、自然界に存在する生物の野生型ゲノムに存在するｃｄｓの形態である。
ドメイン又はフォールディングのクラスは、タンパク質の中の安定的に折り畳まれた、通常はコンパクトな三次構造を有する領域を指す。先行技術に詳細に記載され、上記で明示したように、ＧＴ－Ａ又はＧＴ－Ｂフォールドを有するすべてのＧＴは、リンカー構造／配列によって互いに接続されたＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインからなり、活性の中心は、両方のドメインの領域から形成される。例として、３Ｄｅｅデータベース（ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ）を使用してタンパク質ドメインを定めることができる。
ｆｕｔＬ及びｆｕｔＣという名称は、それぞれＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインからなる、それぞれ配列番号５及び／又は配列番号３を有する対応する野生型フコシルトランスフェラーゼを指す。
ｆｕｔＣ＊という用語は、配列番号７を有するｆｕｔＣに由来する配列を指す。同様に、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの２つのドメインからなる。ｆｕｔＬ、ｆｕｔＣ及びｆｕｔＣ＊は融合タンパク質ではない。
一方、Ｎ／Ｃという名称は、１つのＦＴのＮ末端ドメイン及び別のＦＴのＣ末端ドメインを含むＦＴを指す。したがって、例えば、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬは、フコシルトランスフェラーゼｆｕｔＣ＊のＮ末端ドメイン（配列番号７の少なくともアミノ酸１～１２９又は少なくとも８０％の同一のアミノ酸配列）及びフコシルトランスフェラーゼｆｕｔＬのＣ末端ドメイン（配列番号５の少なくともアミノ酸１５５～２８６又は少なくとも８０％の同一のアミノ酸配列）を含む。同様に、ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊では、ｆｕｔＬのＮ末端ドメインとｆｕｔＣ＊のＣ末端ドメインとが融合されている。
ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ８ａａ）及びｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ１５ａａ）は、ｆｕｔＣ＊のＮ末端ドメイン及びｆｕｔＬのＣ末端ドメインを含み、Ｃ末端ドメインは、それぞれ８アミノ酸及び１５アミノ酸短縮されている。
相同アミノ酸配列は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一である配列を意味すると理解されるべきであり、相同配列の各変化は、１つ又は複数のアミノ酸の挿入、付加、欠失及び置換から選択される。
アミノ酸配列の同一性は、公開されてアクセス可能なウェブページｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のプログラム「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌａｓｔ」によって判定される。このプログラムはｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用する。以下の一般的なパラメータは、２つ以上のタンパク質配列のアラインメントのアルゴリズムパラメータとして使用される：最大標的配列＝１００；ショートクエリ＝「ショート入力シーケンスのパラメータを自動的に調整する」；期待閾値＝１０；ワードサイズ＝３；クエリ範囲の最大の一致＝０。デフォルトのスコアリングパラメータは、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト＝存在：１１拡張：１；組成調整＝「条件付き組成スコアマトリックス調整」。相同配列の同定のために、上記のパラメータを「非冗長タンパク質配列（ｎｒ）」データベースでの検索に使用したが、相同性＞８０％の高いデータ密度のために、生物ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ｔａｘｉｄ：２１０）由来の配列は除外されていた。
α－１，２－、α－１，３／４－及びα－１，６－フコシルトランスフェラーゼが区別されている。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。
好ましくは、酵素は、融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端ドメインのアミノ酸配列が、微生物の配列、より好ましくはグラム陰性菌の配列、特に好ましくはヘリコバクター属細菌株の配列又はそれに対して相同な配列であることを特徴とする。
好ましい実施形態では、酵素は、融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端ドメインのアミノ酸配列がグリコシルトランスフェラーゼファミリー１１（ＧＴ－１１）の配列であることを特徴とする。
さらに好ましくは、酵素は、融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端ドメインのアミノ酸配列が、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）又はヘリコバクタームステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）の種の配列又はそれらに対して相同な配列であることを特徴とする。特に好ましくは、融合タンパク質は、生物ヘリコバクタームステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）ＮＣＴＣ１２１９８／ＡＴＣＣ４３７７２（配列番号５）のｆｕｔＬ由来のＣ末端ドメインを含む。融合タンパク質の他方のＮ末端ドメインは、好ましくは、生物ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）ＵＡ８０２（配列番号３）のｆｕｔＣに由来する。
好ましい実施形態では、酵素は、Ｎ末端ドメインが、配列番号７の少なくともアミノ酸１～１２９、より好ましくは少なくともアミノ酸１～１３２、特に好ましくは少なくともアミノ酸１～１４８、又は各々の場合でそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。特に好ましい実施形態では、酵素は、融合タンパク質のＮ末端ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸１～１２９、さらに好ましくはそのアミノ酸１～１３２、さらにいっそう好ましくはそのアミノ酸１～１４８、又はそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列であることを特徴とする。
好ましい実施形態では、酵素は、Ｃ末端ドメインが、配列番号５の少なくともアミノ酸１５５～２８６、より好ましくは少なくともアミノ酸１４９～２８６、特に好ましくは少なくともアミノ酸１４２～２８６、又はそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。特に好ましくは、酵素は、融合タンパク質のＣ末端ドメインのアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸１５５～２８６、さらに好ましくはそのアミノ酸１４９～２８６、さらにいっそう好ましくはそのアミノ酸１４２～２８６、又は各々の場合に、それに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列であることを特徴とする。
融合タンパク質は、配列番号９、配列番号１３、配列番号１５、又はそれらに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列であることが好ましい。特に好ましくは、融合タンパク質は、配列番号９を有するｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬである。
誘導及び６５ｇ／ｌの総ラクトース投入量（バッチ及び連続）からの２５℃で６５時間の発酵後の２’－ＦＬ収率は、ｆｕｔＣ及びｆｕｔＣ＊の両方が２’－ＦＬ及びＤＦＬを形成し、ｆｕｔＣの２’－ＦＬ収率がｆｕｔＣ＊より７０％高いことを示した（実施例３、表１を参照）。文献に記載されているように、ｆｕｔＬは２’－ＦＬのみを形成した。ｆｕｔＬの２’－ＦＬ収率は、ｆｕｔＣ＊の収率を１２５％、ｆｕｔＣの収率を３２％上回った。
融合タンパク質の発現における２’－ＦＬ及びＤＦＬの収率の分析は、驚くべきことに、先行技術とは対照的に、融合タンパク質ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬが、変異体ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊ではなく、ラクトース及びＧＤＰ－フコース１００％を特異的に２’－ＦＬに変換したことを示した。さらに、表１は、特異的融合タンパク質ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬが、非特異的ｆｕｔＣと比較して５６％、ｆｕｔＣ＊と比較して１６５％、特異的ｆｕｔＬと比較して１８％、２’－ＦＬ収率を増加させたことを示す。これは、第１に、ｆｕｔＣ又はｆｕｔＬのいずれにも利用可能な３Ｄ構造がこれまで存在しなかったこと、また第２に、Ｎ末端ドメインがアクセプター基質の結合を担うＧＴ－Ｂフォールドを仮定して、ラクトース及びＧＤＰ－フコースのみを特異的に２’－ＦＬに変換する、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬではなくラクトース特異的ｆｕｔＬのＮ末端ドメインを含有する融合タンパク質ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊があると予想されたことから、予測することができなかった。さらに、ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊の２’－ＦＬ収率は、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬと比較して７０％低下した。
融合タンパク質に使用したｆｕｔＣ＊（配列番号７）での収率は、ｆｕｔＣ（配列番号３）と比較して４１％低下していたので、先に記載したように、ｆｕｔＣ（配列番号３のａａ１～１４８）のＮ末端ドメインを最終的にｆｕｔＬ（配列番号５のａａ１４２～２８６）のＣ末端ドメインと融合させて、ｆｕｔＣ／ｆｕｔＬ（配列番号１２（ＤＮＡ）／配列番号１３（ＰＲＴ））を得て、得られた発現プラスミドを２’－ＦＬの産生に適した株の形質転換に使用した（イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎΔｓｕｌＡ－ｌａｃ－ｍｏｄ）（実施例１及び２参照）。最適化された発酵条件下（２５℃の代わりに２７℃、６５ｇ／ｌのラクトースの代わりに８６ｇ／ｌのラクトース）でのｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ及びｆｕｔＣ／ｆｕｔＬの２’－ＦＬ及びＤＦＬ収率は、この場合もＤＦＬが形成されなかったことを示した。しかしながら、融合タンパク質ｆｕｔＣ／ｆｕｔＬでの２’－ＦＬ収率は、融合タンパク質ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬと比較して、１５％低下した（表１）。
それにもかかわらず、両方の場合において、ｆｕｔＣ＊及びｆｕｔＣのＮ末端ドメインとｆｕｔＬのＣ末端ドメインとの融合は、非常に類似した副産生物ＤＦＬの形成を伴わずに、２’－ＦＬの選択的産生をもたらした。
さらに、ハイブリッド酵素ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬのＣ末端をそれぞれ８ａａ（配列番号９のａａ１～２８５）及び１５ａａ（配列番号９のａａ１～２７８）短縮し（実施例２を参照のこと）、これを最適化された条件下（誘導から２７℃、８６ｇ／ｌラクトース）で６５時間発酵させた後の２’－ＦＬ収率に関して同様に調べた。８ａａの短縮は２’－ＦＬ収率を８％低下させたが、１５ａａの短縮は２’－ＦＬもＤＦＬも検出しない結果となった（表１）。これは、融合タンパク質ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬの少なくともａａ１～２８５がその活性を担うことを示した。
本発明はさらに、本発明の酵素と反応するグルコース、グリセロール、スクロース、フコース並びにＧＤＰ－、ＡＤＰ－、ＣＤＰ－及びＴＤＰ－フコースからなる物質の群より選択される少なくとも１つの物質の存在下、反応混合物にラクトースが存在することを特徴とする、２’－フコシルラクトースの製造方法を提供する。細胞内でＧＤＰ－フコースに変換される物質は、グルコースであることが好ましい。本発明の酵素は、好ましくは、配列番号９を有するｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬである。特に好ましくは、酵素はｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬであり、細胞内でＧＤＰ－フコースに変換される物質はグルコースである。本発明の方法では、ラクトースは、ジフコシルラクトースが形成されることなく完全に変換することができる。
好ましくは、２’－フコシルラクトースの産生方法は、２’－フコシルラクトースが、反応混合物から単離されることを特徴とする。２’－フコシルラクトースを単離するために、固体成分が第１の工程において遠心分離又は濾過によって反応混合物から除去される場合が好ましい。後続の工程では、例えば、クロマトグラフィー法及び濾過によって、及び蒸発によって得られた２’－フコシルラクトースによって、さらなる不純物を続いて分離することができる。
好ましい実施形態では、方法は、ラクトースが、５％、より好ましくは２．５％、特に好ましくは１．５％を超えるＤＦＬが形成されることなく完全に変換されることを特徴とする。特に好ましい実施形態では、ラクトースは、ＤＦＬの形成を伴わずに完全に変換される。したがって、本発明の方法は、２’－ＦＬの特異的形成が、結晶化又はナノ濾過又は酵素での後処理によって、ＤＦＬ又はラクトースなどの他の糖を除去する必要性を排除するという主要な利点を有する。したがって、２’－ＦＬの選択的産生は、後処理を著しく容易にする。
したがって、特に好ましい実施形態では、この方法は、２’－フコシルラクトースが、グルコース、ラクトース又はジフコシルラクトースなどの他の糖を除去するための結晶化、ナノ濾過及び／又は酵素での後処理なしに単離されることを特徴とする。
好ましい実施形態において、２’－フコシルラクトースの産生方法は、反応混合物が、本発明の酵素を組換え発現する微生物の培養物であることを特徴とする。
微生物の培養は、先行技術において公知であり、例として、実施例３に記載されるように実施することができる。
微生物株は、特に好ましくは遺伝子組換えイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株である。同様に、本発明の組換え発現酵素は、融合タンパク質ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ又はそれに対して相同なアミノ酸配列であることが好ましい。したがって、特に好ましい実施形態では、微生物株は遺伝子組換えイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株であり、本発明の組換え発現酵素は融合タンパク質ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬであり、より好ましくはｒｃｓＡの共発現である。
反応混合物が微生物の培養物である場合、２’－フコシルラクトースが、培養上清から単離されることが好ましい。既に上に記載したように、宿主細胞などの固体成分は、最初に濾過によって、又はより好ましくは遠心分離によって分離される。その後、さらなる不純物をクロマトグラフィーで除去し、富化によって産生物を結晶の形態で得ることができる。
既に上に記載したように、この方法は、好ましくは、ラクトースが、５％、より好ましくは２．５％、特に好ましくは１．５％を超えるＤＦＬが形成されることなく完全に変換することを特徴とする。特に好ましい実施形態では、ラクトースは、ＤＦＬの形成を伴わずに完全に変換される。特に好ましくは、２’－フコシルラクトースが、培養上清からグルコース、ラクトース及びジフコシルラクトースなどの他の糖を除去するための発酵ブロスの結晶化、ナノ濾過及び／又は酵素での後処理なしに、培養上清から単離される。
実施例５は、例として、ラクトースの完全な変換を伴う発酵を示す（図４も参照されたい）。
２’－フコシルラクトースの産生方法は、融合タンパク質に１つのドメインが含まれる融合されていない野生型酵素よりも、融合タンパク質と少なくとも４％、より好ましくは少なくとも１０％、特に好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、より多い２’－フコシルラクトースが形成されることを特徴とすることが好ましい。
好ましい実施形態では、２’－フコシルラクトースの産生方法は、反応中に少なくとも４７ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも５３ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも６０ｇ／ｌの２’－フコシルラクトースが形成されることを特徴とする。
好ましくは、２’－フコシルラクトースの産生方法は、反応中に１ｇ／ｌ未満、より好ましくは０ｇ／ｌのジフコシルラクトースが形成されることを特徴とする。これは、ＤＦＬの形成が防止されることが特に好ましいことを意味し、その理由は、この場合、ＤＦＬを除去するための面倒な精製工程を省くことができるので、２’－フコシルラクトースの単離がはるかに容易であり、したがって経済的により効率的であるからである。
好ましい実施形態において、２’－フコシルラクトースの産生方法は、酵素の発現が誘導されることを特徴とする。
この場合、本発明の酵素の発現を制御するプロモーターは誘導性プロモーターであり、より好ましくはＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド）により誘導可能なプロモーターである。
この場合、本発明の方法は、産生物の合成が誘導の瞬間まで開始されないという利点を有し、これは高い細胞密度が最初に達成され、それによって収率が増加することを意味する。
本発明は、それによって限定されることなく、例示的な実施形態を参照して以下により詳細に説明される。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素及びリガーゼによるＤＮＡ修飾、形質転換などの使用されるすべての分子生物学的方法は、当業者に公知の方法、文献に記載された方法、又はそれぞれの産生業者によって推奨された方法で行われた。
［実施例１］
２－フコシルラクトースを産生するためのイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に基づく株の発達
２’－ＦＬなどのフコシル化ＨＭＯの細胞内合成のために、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に基づく株を発達させた。まず、ウンデカプレニルホスフェートグルコースホスホトランスフェラーゼｗｃａＪのためのｃｄｓをゲノムから欠失させた。次いで、ｌｏｎプロテアーゼのためのｃｄｓを除去した。ｌａｃオペロンは、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）及びβ－ガラクトシドトランスアセチラーゼ（ｌａｃＡ）のｃｄｓを削除し、β－ガラクトシドパーミアーゼ（ｌａｃＹ）のｃｄｓを保存した。最後に、細胞分裂阻害剤ｓｕｌＡに対するｃｄｓを欠失させた。
２－フコシルラクトースを産生するためのイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に基づく株の発達
２’－ＦＬなどのフコシル化ＨＭＯの細胞内合成のために、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２に基づく株を発達させた。まず、ウンデカプレニルホスフェートグルコースホスホトランスフェラーゼｗｃａＪのためのｃｄｓをゲノムから欠失させた。次いで、ｌｏｎプロテアーゼのためのｃｄｓを除去した。ｌａｃオペロンは、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）及びβ－ガラクトシドトランスアセチラーゼ（ｌａｃＡ）のｃｄｓを削除し、β－ガラクトシドパーミアーゼ（ｌａｃＹ）のｃｄｓを保存した。最後に、細胞分裂阻害剤ｓｕｌＡに対するｃｄｓを欠失させた。
Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒによるλ－リコンビナーゼを用いたｗｃａＪ、ｌｏｎ及びｓｕｌＡのためのｃｄｓの欠失（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０－５）
使用したイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株のゲノムからのｗｃａＪの欠失のために、オリゴヌクレオチドｗｃａＪ－ｄｅｌ－ｆｗ（配列番号２６）及びｗｃａＪ－ｄｅｌ－ｒｖ（配列番号２７）並びにマトリックスとして市販のプラスミドｐＫＤ３（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，ＣＧＳＣ：７６３１）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を最初に使用して、クロラムフェニコール耐性カセットを含み、ｗｃａＪ ｃｄｓの上流領域及び下流領域のそれぞれ約５０塩基対が隣接する線状ＤＮＡ断片を産生した。
使用したイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株のゲノムからのｗｃａＪの欠失のために、オリゴヌクレオチドｗｃａＪ－ｄｅｌ－ｆｗ（配列番号２６）及びｗｃａＪ－ｄｅｌ－ｒｖ（配列番号２７）並びにマトリックスとして市販のプラスミドｐＫＤ３（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，ＣＧＳＣ：７６３１）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を最初に使用して、クロラムフェニコール耐性カセットを含み、ｗｃａＪ ｃｄｓの上流領域及び下流領域のそれぞれ約５０塩基対が隣接する線状ＤＮＡ断片を産生した。
さらに、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を市販のプラスミドｐＫＤ４６（ＣＧＳＣ：７７３９）で形質転換し、次いでＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの詳細に従ってコンピテント細胞を産生した。ＰＣＲで産生した線状ＤＮＡ断片で、これらを形質転換した。クロラムフェニコール耐性カセット（ｃａｔ＝クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株の染色体に組み込むための選択を、２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレートで行った。染色体の正しい位置での組込みを、オリゴヌクレオチドｗｃａＪ－ｃｈｅｃｋ－ｆｗ（配列番号２８）及びｗｃａＪ－ｃｈｅｃｋ－ｒｖ（配列番号２９）並びにクロラムフェニコール耐性細胞の染色体ＤＮＡをマトリックスとして使用するＰＣＲによって検証した。このプロセスにより、ｗｃａＪ ｃｄｓがクロラムフェニコール耐性カセットに置き換えられたイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が得られた。
次いで、記載された手順（Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ）に従ってプラスミドｐＫＤ４６を細胞から再び除去し、このようにして産生した株をイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ｗｃａＪ：：ｃａｔと命名した。
イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ｗｃａＪ：：ｃａｔ株の染色体からのクロラムフェニコール耐性カセットの除去を、ＦＬＰリコンビナーゼｃｄｓをコードするプラスミドｐＣＰ ２０（ＣＧＳＣ：７６２９）を用いてＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの手順に従って行った。この方法で最終的に得られたクロラムフェニコール感受性ｗｃａＪ欠失変異体をイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪと命名した。
イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪ株からのｌｏｎ ｃｄｓの欠失は、ｗｃａＪ ｃｄｓの欠失用に先に使用されたのと同じ方法を使用して行った。しかし、マトリックスとしてｐＫＤ３（ＣＧＳＧ：７６３１）を用いた線状ＤＮＡ断片の産生には、オリゴヌクレオチドｌｏｎ－ｄｅｌ－ｆｗ（配列番号３０）及びｌｏｎ－ｄｅｌ－ｒｖ（配列番号３１）を用いた。
クロラムフェニコール耐性カセットのイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪ株の染色体へのｌｏｎ ｃｄｓの組込みを、オリゴヌクレオチドｌｏｎ－ｃｈｅｃｋ－ｆｗ（配列番号３２）及びｌｏｎ－ｃｈｅｃｋ－ｒｖ（配列番号３３）及びクロラムフェニコール耐性細胞の染色体ＤＮＡでのＰＣＲによって検証した。
染色体からのクロラムフェニコール耐性カセットの除去を、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒによって記載されているように再度行った。クロラムフェニコール耐性カセットを含まず、ｗｃａＪ ｃｄｓ及びｌｏｎ ｃｄｓのゲノム欠失を特徴とする得られた株をイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎと命名した。
イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎ－ｌａｃ－ｍｏｄ株（後述する「ｌａｃオペロンの改変」の項で説明するように作製）からのｓｕｌＡ ｃｄｓの欠失は、ｗｃａＪ ｃｄｓの欠失用に先に使用したのと同じ方法を使用して行った。しかしながら、カナマイシン耐性遺伝子を含み、ｓｕｌＡのゲノムｃｄｓの上流及び下流の領域のそれぞれ５０個の相同塩基対が隣接する線状ＤＮＡ断片の生成のために、オリゴヌクレオチドｓｕｌＡ－ｄｅｌ－ｆｗ（配列番号３４）及びｓｕｌＡ－ｄｅｌ－ｒｖ（配列番号３５）及びｐＫＤ１３（ＣＧＳＣ：７６３３ ＧｅｎＢａｎｋ ｓｅｑ．ＡＹ０４８７４４）をマトリックスとして使用した。
ｓｕｌＡ ｃｄｓの位置でのイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎ－ｌａｃ－ｍｏｄ株の染色体へカナマイシン耐性カセット（ｋａｎＲ）を組み込むための選択を、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレートにおいて最初に行った。次いで、組込みを、オリゴヌクレオチドｓｕｌＡ－ｃｈｅｃｋ－ｆｗ（配列番号３６）及びｓｕｌＡ－ｃｈｅｃｋ－ｒｖ（配列番号３７）並びにカナマイシン耐性細胞の染色体ＤＮＡでのＰＣＲによって検証した。
染色体からのカナマイシン耐性カセットの除去は、同様に、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの手順に従って、クロラムフェニコール耐性カセットと同じ方法で行った。カナマイシン耐性カセットを除去した後に得られた株をイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎΔｓｕｌＡ－ｌａｃ－ｍｏｄと命名した。
２’－ＦＬの産生のために、株を適切な発現プラスミドで形質転換した（実施例２参照）。
Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１（９９：４６１７－４６２２））のプラスミド組込み法によるｌａｃオペロンの改変
プロモーター、ＲＢＳ及び開始コドン並びにｌａｃＹ ｃｄｓを有するオペロン構造が保存されているｌａｃオペロンｌａｃＺＹＡからのｌａｃＺ及びｌａｃＡの並行欠失のために、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９８９）によって記載された相同組換え法を使用した。
プロモーター、ＲＢＳ及び開始コドン並びにｌａｃＹ ｃｄｓを有するオペロン構造が保存されているｌａｃオペロンｌａｃＺＹＡからのｌａｃＺ及びｌａｃＡの並行欠失のために、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９８９）によって記載された相同組換え法を使用した。
これは、重複オリゴヌクレオチド及びｗｔイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のゲノムＤＮＡをマトリックスとして使用して複数のＰＣＲを使用して、３つの線状ＤＮＡ断片（ＰＣＲ１：ｌａｃ－１－ｆｗ＋ｌａｃ－２－ｒｖ（配列番号３８、３９）、ＰＣＲ２：ｌａｃ－３－ｆｗ＋ｌａｃ－４－ｒｖ（配列番号４０、４１）、ＰＣＲ３：ｌａｃ－５－ｆｗ＋ｌａｃ－６－ｒｖ（配列番号４２、４３））を生成し、次いでそれらを２つのさらなるポリメラーゼ連鎖反応によって重複領域に基づいて融合することによって行った。このために、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２由来の線状ＤＮＡ断片を最初にプライマーｌａｃ－１－ｆｗ（配列番号３８）及びｌａｃ－４－ｒｖ（配列番号４１）を用いて融合し（ＰＣＲ４）、次いで、得られたＤＮＡ断片をＰＣＲ３由来のＤＮＡ断片及びオリゴヌクレオチドｌａｃ－７－ｆｗ（配列番号４４）及びｌａｃ－８－ｒｖ（配列番号４５）（ＰＣＲ５）に連結した。最終的な線状ＤＮＡ断片は、ｌａｃＡ ｃｄｓ、ｌａｃＹ ｃｄｓの下流に５１５ｂｐの相同領域、及びｌａｃＺの上流に５３５ｂｐの相同領域を含み、断片は各末端でＢａｍＨＩ切断部位に隣接していた。
このようにして得られたＤＮＡ断片を温度感受性ベクターｐＭＡＫ７００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１（９９：４６１７－４６２２））にクローニングするために、ベクター及び線状断片の両方を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ベクターの断片をアルカリホスファターゼ（ｒＡＰｉｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｒｏｃｈｅ）で脱リン酸化し、ゲル電気泳動によって精製し、次いでライゲーションし、コンピテントＳｔｅｌｌａｒイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｔａｋａｒａ、滋賀、日本）の形質転換のために使用した。プラスミド含有細胞のための選択は、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天におけるプラスミドコード化クロラムフェニコール耐性遺伝子に基づいて行った。プラスミドはまた、３０℃でのみ可能であるが４２℃では不可能なプラスミドの複製をもたらす温度感受性（ｔｓ）複製の起点（ｏｒｉ）を含有するので、細胞を３０℃でインキュベートした。
ｌａｃオペロンを改変するために、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎ株（上記参照）を、ベクターｐＭＡＫ７００－ｌａｃ－ｍｏｄで、３０℃で形質転換した。クロラムフェニコール耐性クローンをクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で３０℃で培養した後、培養物をクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天に蒔き、４２℃で一晩インキュベートした。これにより、ｌａｃＡの下流及びｌａｃＺの上流の隣接する相同領域の結果として、完全なｔｓプラスミドを染色体に組み込んだクローンの選択が可能になり、したがって高温でクロラムフェニコール耐性を発達させることもできる。そのようなクローンを単離し、オリゴマーｐＭＡＫ－ｆｗ（配列番号４６）及びｌａｃ－９－ｒｖ（配列番号４７）で、又はｌａｃ－１０－ｆｗ（配列番号４８）及びｐＭＡＫ－ｒｖ（配列番号４９）で、コントロールＰＣＲによる正しいプラスミド組込みについて確認した。プラスミドの一方のプライマー（ｐＭＡＫ－ｆｗ／ｐＭＡＫ－ｒｖ）及び染色体の他方のプライマー（ｌａｃ－９－ｒｖ／ｌａｃ－１０－ｆｗ）は相同結合を受けることができるので、対応する線状ＤＮＡ断片は正しいプラスミドの組込みの場合にのみ形成された。組込んだ株をイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎ：：ｐＭＡＫ７００－ｌａｃ－ｍｏｄと命名した。
ゲノムからプラスミドを除去するためには、２回目の組換えを行う必要があった。これをどのように行ったかに応じて、株の２つのゲノム変異体が得られた。第１の場合、プラスミドは「ｉｎ」の組換えと同じ方法で組み換えられ、再び野生型をもたらした。別法として、改変された遺伝子座がゲノムに残り、野生型遺伝子座を有するプラスミドが放出されるようにプラスミドを組み換えた。ゲノムからプラスミドを分解するために、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎ：：ｐＭＡＫ７００－ｌａｃ－ｍｏｄを、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で４２℃で４時間、次いでクロラムフェニコールを含まないＬＢ培地で３０℃でインキュベートし、複数回継代した。このプロセスの結果、一部の細胞は、順次ゲノムからのプラスミドの「アウト」の組換えをもたらし、選択圧の欠如のためにプラスミドを失うことが可能であった。
個々のクローンを単離するために、培養物の希釈物をＬＢ寒天に蒔き、３０℃でインキュベートした。プラスミドがクローン中で失われたかどうかを確認するために、これらをクロラムフェニコールでＬＢ寒天に画線接種した。最終的に、クロラムフェニコール感受性クローンを、プライマーｌａｃ－１１－ｆｗ（配列番号５０）及びｌａｃ－１２－ｒｖ（配列番号５１）でのＰＣＲ及び配列決定によって、所望の遺伝子改変について確認した。得られた株をイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎ－ｌａｃ－ｍｏｄと命名した。
［実施例２］
２－フコシルラクトースの発酵での産生のためのフコシルトランスフェラーゼｆｕｔＣ、ｆｕｔＣ＊、ｆｕｔＬ、ハイブリッド、及び短縮型変異体のｃｄｓのクローニング
発現ベクターの調製：
使用した発現ベクターはｐＷＣ１であった。これは低コピープラスミドである。ｐＷＣ１は、ｐＡＣＹＣの複製の起点に基づいて、細胞あたり約１０コピーで、細胞に存在する。プラスミドのマップを図１に示し、配列番号１に示されている配列を示し、慣用的な制限酵素（６塩基認識配列を有する）の位置を、プラスミドマップに示す。
２－フコシルラクトースの発酵での産生のためのフコシルトランスフェラーゼｆｕｔＣ、ｆｕｔＣ＊、ｆｕｔＬ、ハイブリッド、及び短縮型変異体のｃｄｓのクローニング
発現ベクターの調製：
使用した発現ベクターはｐＷＣ１であった。これは低コピープラスミドである。ｐＷＣ１は、ｐＡＣＹＣの複製の起点に基づいて、細胞あたり約１０コピーで、細胞に存在する。プラスミドのマップを図１に示し、配列番号１に示されている配列を示し、慣用的な制限酵素（６塩基認識配列を有する）の位置を、プラスミドマップに示す。
このプラスミドに、それぞれの酵素のコード配列（ｃｄｓ）を、ラクトース及びＩＰＴＧ誘導性プロモーターｐｔａｃの制御下に置いた。ベクターは、酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩの制限部位を含む。これらの酵素でプラスミドを処理すると、とりわけ４７９９ｂｐの大きな断片が形成される。これをアガロースゲル電気泳動（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（Ｒ）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｕｉａｇｅｎ）によって単離し、アルカリホスファターゼ（ｒＡＰｉｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｒｏｃｈｅ）で処理して再ライゲーションを回避した。このベクター断片を、種々のフコシルトランスフェラーゼのクローニングに使用した。
ｆｕｔＣ、ｆｕｔＣ＊、ｆｕｔＬ用のｃｄｓのクローニング
イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の最適なコドン使用のために改変されたフコシルトランスフェラーゼｆｕｔＣ（配列番号２）及びｆｕｔＣ＊（配列番号６）のｃｄｓは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、レーゲンスブルク）によって合成され、ｆｕｔＬ（配列番号４）はＧｅｎｅｗｉｚ（ライプツィヒ）によって合成された。ｆｕｔＣ及びｆｕｔＣ＊をコードするｃｄｓを、プライマー対ｆｕｔＣ／ｆｕｔＣ＊－ｆｗ（配列番号２０）及びｆｕｔＣ／ｆｕｔＣ＊－ｒｖ（配列番号２１）との２つの別々の混合物において、標準条件下でＰＣＲ増幅し、ｆｕｔＬをコードするｃｄｓを、プライマー対ｆｕｔＬ－ｆｗ（配列番号２２）及びｆｕｔＬ－ｒｖ（配列番号２３）との第３の混合物において増幅し、それらはＥｃｏＲＩ又はＸｂａＩ切断部位の導入に使用された。ｆｕｔＣ ｃｄｓ及びｆｕｔＣ＊ｃｄｓの実質的な相同性のために、これらの構築物の両方に１つのプライマー対（ｆｕｔＣ／ｆｕｔＣ＊－ｆｗ及びｆｕｔＣ／ｆｕｔＣ＊－ｒｖ）を使用することが可能であった。
イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の最適なコドン使用のために改変されたフコシルトランスフェラーゼｆｕｔＣ（配列番号２）及びｆｕｔＣ＊（配列番号６）のｃｄｓは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、レーゲンスブルク）によって合成され、ｆｕｔＬ（配列番号４）はＧｅｎｅｗｉｚ（ライプツィヒ）によって合成された。ｆｕｔＣ及びｆｕｔＣ＊をコードするｃｄｓを、プライマー対ｆｕｔＣ／ｆｕｔＣ＊－ｆｗ（配列番号２０）及びｆｕｔＣ／ｆｕｔＣ＊－ｒｖ（配列番号２１）との２つの別々の混合物において、標準条件下でＰＣＲ増幅し、ｆｕｔＬをコードするｃｄｓを、プライマー対ｆｕｔＬ－ｆｗ（配列番号２２）及びｆｕｔＬ－ｒｖ（配列番号２３）との第３の混合物において増幅し、それらはＥｃｏＲＩ又はＸｂａＩ切断部位の導入に使用された。ｆｕｔＣ ｃｄｓ及びｆｕｔＣ＊ｃｄｓの実質的な相同性のために、これらの構築物の両方に１つのプライマー対（ｆｕｔＣ／ｆｕｔＣ＊－ｆｗ及びｆｕｔＣ／ｆｕｔＣ＊－ｒｖ）を使用することが可能であった。
その後、対応するＰＣＲ産物を同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで処理し、次いで、それぞれをリガーゼ混合物の富化させた脱リン酸化ベクター断片と合わせた。次いで、標準的な方法を使用して、ライゲーション混合物をコンピテントＳｔｅｌｌａｒイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｔａｋａｒａ、滋賀、日本）に形質転換した。首尾よくライゲーションされたプラスミドを有する単一のコロニーを、テトラサイクリン耐性によって選択した。これらのコロニーから得たいくつかのプラスミドを制限パターン及び配列決定によって分析した。最後に、産生実験又はさらなるクローニングのために、正しいプラスミドを使用した。得られたプラスミドは、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊及びｐＷＣ１－ｆｕｔＬであった。
ＳｃａＩ制限切断部位のｆｕｔＬ ｃｄｓへの導入：
まず、ｆｕｔＬ発現プラスミド全体をＰＣＲで増幅した。ここでのプライマーは、ｆｕｔＬ（配列番号４）のｃｄｓに新しい制限切断部位（ＳｃａＩ）を含んでいた。目的は、アミノ酸配列を変更することなく、フコシルトランスフェラーゼの２つの酵素ドメイン間のリンカー配列に制限切断部位を導入することであった。次いで、３つの制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ、及びＸｂａＩ）によって、２つのドメインを任意の所望の代替ドメインと交換することが可能であった。ＰＣＲ反応には、上記の発現ベクターｐＷＣ１－ｆｕｔＬをマトリックスとして用いた。使用したプライマーは、ｆｕｔＬ－Ｓｃａ－ｆｗ（配列番号５２）及びｆｕｔＬ－Ｓｃａ－ｒｖ（配列番号５３）であった。
まず、ｆｕｔＬ発現プラスミド全体をＰＣＲで増幅した。ここでのプライマーは、ｆｕｔＬ（配列番号４）のｃｄｓに新しい制限切断部位（ＳｃａＩ）を含んでいた。目的は、アミノ酸配列を変更することなく、フコシルトランスフェラーゼの２つの酵素ドメイン間のリンカー配列に制限切断部位を導入することであった。次いで、３つの制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ、及びＸｂａＩ）によって、２つのドメインを任意の所望の代替ドメインと交換することが可能であった。ＰＣＲ反応には、上記の発現ベクターｐＷＣ１－ｆｕｔＬをマトリックスとして用いた。使用したプライマーは、ｆｕｔＬ－Ｓｃａ－ｆｗ（配列番号５２）及びｆｕｔＬ－Ｓｃａ－ｒｖ（配列番号５３）であった。
ＰＣＲ反応の終了時に、プラスミドＤＮＡをクロマトグラフィーで精製した後、制限酵素ＤｐｎＩ（１０ユニット、ＮＥＢ）を添加して、メチル化マトリックスＤＮＡを混合物から除去した。ＤｐｎＩ混合物を３７℃で１時間インキュベートした。これに続いて、ＤＮＡのクロマトグラフィー精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ）Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ）及びコンピテントＳｔｅｌｌａｒイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞への形質転換（Ｔａｋａｒａ、滋賀、日本）を行った。陽性クローンの選択を上記のように行った。ベクターをｐＷＣ１－ｆｕｔＬ（ＳｃａＩ）と命名した。
融合タンパク質ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ及びｆｕｔＣ／ｆｕｔＬのｃｄｓのクローニング：
ハイブリッド酵素のクローニングのために、プラスミドｐＷＣ１－ｆｕｔＬ（ＳｃａＩ）を制限酵素ＳｃａＩ及びＸｂａＩで処理した。約５２４３ｂｐのベクターバックボーン断片が、ｆｕｔＬ ｃｄｓ（配列番号４）のＮ末端部分を含んでいる。この断片を脱リン酸化し、アガロースゲル電気泳動によって富化した。
ハイブリッド酵素のクローニングのために、プラスミドｐＷＣ１－ｆｕｔＬ（ＳｃａＩ）を制限酵素ＳｃａＩ及びＸｂａＩで処理した。約５２４３ｂｐのベクターバックボーン断片が、ｆｕｔＬ ｃｄｓ（配列番号４）のＮ末端部分を含んでいる。この断片を脱リン酸化し、アガロースゲル電気泳動によって富化した。
これと並行して、プライマーＣ－ｆｕｔＣ＊－ｆｗ及びＣ－ｆｕｔＣ＊－ｒｖ（配列番号５４、５５）、またベクターｐＷＣ－１－ｆｕｔＣ＊を、マトリックスとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、主にｆｕｔＣ＊（配列番号６）のＣ末端ドメインからなっていた。
ＰＣＲ反応の終了時に、ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩ及びＸｂａＩで処理し、クロマトグラフィーにより精製し、次いで、プラスミド断片と共にライゲーション混合物において使用した。次いで、標準的な方法を使用してライゲーション混合物をコンピテントＳｔｅｌｌａｒイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｔａｋａｒａ、滋賀、日本）に形質転換した。首尾よくライゲーションされたプラスミドを有する単一のコロニーを、テトラサイクリン耐性によって選択した。これらのコロニーから得たいくつかのプラスミドを制限パターン及び配列決定によって分析した。最後に、産生実験又はさらなるクローニングのために、正しいプラスミドを使用した。
得られたプラスミドをｐＷＣ１－ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊と命名した。
同様に、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬハイブリッド（配列番号８（ＤＮＡ）／配列番号９（ＰＲＴ））を作製するために、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｃａＩで処理することによって、ベクターｐＷＣ１－ｆｕｔＬ（ＳｃａＩ）を調製した。ここでの約５２４０ｂｐのベクター断片は、ｆｕｔＬ ｃｄｓ（配列番号４）のＣ末端ドメインを含有していた。
先のハイブリッドクローニングと同様に、ｆｕｔＣ＊ｃｄｓ（配列番号６）のＮ末端ドメインをＰＣＲによって増幅した。ベクターｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊は再び鋳型として機能し、使用したプライマー対は（Ｎ－ｆｕｔＣ＊－ｆｗ（配列番号５６）及びＮ－ｆｕｔＣ＊－ｒｖ（配列番号５７）であった。
脱リン酸化及び富化後に、ベクター断片を、制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＳｃａＩ）で処理して同様に富化したＰＣＲ産物とライゲーションし、標準的な方法を用いて混合物をコンピテントＳｔｅｌｌａｒイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｔａｋａｒａ、滋賀、日本）に形質転換した。所望のハイブリッドプラスミドを上記のように単離した。得られたプラスミドをｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬと命名した。
同様に、ハイブリッド構築物ｆｕｔＣ／ｆｕｔＬ（配列番号１２（ＤＮＡ）／配列番号１３（ＰＲＴ））をベクターｐＷＣ１－ｆｕｔＬ（ＳｃａＩ）からクローニングした。
上記のようにして、ｆｕｔＬ ｃｄｓのＣ末端部分でベクター断片を生成し、後述のようにＰＣＲ産物を生成し、さらに二者を上記のように処理してライゲーションした。ＰＣＲに使用したマトリックスは、ｆｕｔＣ（配列番号２）用のｃｄｓを含むベクターｐＷＣ１－ｆｕｔＣであり、使用したプライマー対は、Ｎ－ｆｕｔＣ＊－ｆｗ（配列番号５６）及びＮ－ｆｕｔＣ＊－ｒｖ（配列番号５７）であった。
得られたプラスミドをｐＷＣ１－ｆｕｔＣ／ｆｕｔＬと命名した。
ｒｃｓＡを用いたフコシルトランスフェラーゼ発現プラスミドのクローニング
イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における活性化フコース（ＧＤＰ－フコース）のデノボ合成を増加させるために、最適化されたシャイン－ダルガルノ配列（ＡＧＧＡＧＧＵ；ＳＤＳ）、続いてＲｃｓＡ（配列番号１８）に対するイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）内在性ｃｄｓを、フコシルトランスフェラーゼを含むオペロンのそれぞれのフコシルトランスフェラーゼのｃｄｓのＣ末端に直接クローニングした。このために、ＮｈｅＩ又はＸｂａＩ切断部位を導入するために使用されたプライマーｒｃｓＡ－ｆｗ（配列番号２４）及びｒｃｓＡ－ｒｖ（配列番号２５）を使用して、ｒｃｓＡからｃｄｓを増幅した。イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のゲノムＤＮＡがマトリックスとして機能した。
イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における活性化フコース（ＧＤＰ－フコース）のデノボ合成を増加させるために、最適化されたシャイン－ダルガルノ配列（ＡＧＧＡＧＧＵ；ＳＤＳ）、続いてＲｃｓＡ（配列番号１８）に対するイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）内在性ｃｄｓを、フコシルトランスフェラーゼを含むオペロンのそれぞれのフコシルトランスフェラーゼのｃｄｓのＣ末端に直接クローニングした。このために、ＮｈｅＩ又はＸｂａＩ切断部位を導入するために使用されたプライマーｒｃｓＡ－ｆｗ（配列番号２４）及びｒｃｓＡ－ｒｖ（配列番号２５）を使用して、ｒｃｓＡからｃｄｓを増幅した。イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２のゲノムＤＮＡがマトリックスとして機能した。
フコシルトランスフェラーゼ発現ベクターのクローニングと同様に、後者、すなわちｐＷＣ１－ｆｕｔＬ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊、ｐＷＣ１－ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ、及びｐＷＣ１－ｆｕｔＣ／ｆｕｔＬをそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで処理し、脱リン酸化し、アガロースゲル電気泳動により富化した。ｒｃｓＡ ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｂａＩで処理した。これに続いて、ＤＮＡのクロマトグラフィー精製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ）Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ）を行った。ライゲーション混合物については、それぞれの富化させた脱リン酸化ベクター断片を、富化させたＰＣＲ産物と合わせた。次いで、標準的な方法を使用して、ライゲーション混合物を、コンピテントＳｔｅｌｌａｒイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｔａｋａｒａ、滋賀、日本）に形質転換した。首尾よくライゲーションされたプラスミドを有する単一のコロニーを、テトラサイクリン耐性によって選択した。これらのコロニーから得たいくつかのプラスミドを制限パターン及び配列決定によって分析した。最後に、正しいプラスミド（ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＬ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ／ｆｕｔＬ－ｒｃｓＡ）を産生実験又はさらなるクローニングのために使用した。
短縮されたｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ変異体のクローニング：
８ａａ短縮されたｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ変異体ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ８ａａ）のクローニングのために、別個のＰＣＲにおいて、ｐＷＣ１－ｆｕｃ＊／ｆｕｔＬに基づくｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬハイブリッド（配列番号８）のｃｄｓを、最初にプライマーｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ－ｆｗ（配列番号５８）及びｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ８－ｒｖ（配列番号５９）を用いて増幅し、ｒｃｓＡ（配列番号１８）については、プライマーｒｃｓＡ－２－ｆｗ（配列番号６０）及びｒｃｓＡ－２－ｒｖ（配列番号６１）を用いて増幅したｐＷＣ１－ｆｕｔＣ－ｒｃｓＡに基づくｃｄｓを用いて増幅した。次いで、末端相同オリゴヌクレオチドｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ８－ｒｖ（配列番号５９）及びｒｃｓＡ－２－ｆｗ（配列番号６０）を使用して、得られた線状ＤＮＡ断片をさらなるＰＣＲでプライマーｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ－ｆｗ（配列番号５８）及びｒｃｓＡ－２－ｒｖ（配列番号６１）と融合させた。最終的な線状ＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩ切断部位、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬのｃｄｓ（Δ８ａａ）（配列番号１４）、ＲＢＳ、ｒｃｓＡのｃｄｓ及びＸｂａＩ切断部位を含んでいた。
８ａａ短縮されたｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ変異体ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ８ａａ）のクローニングのために、別個のＰＣＲにおいて、ｐＷＣ１－ｆｕｃ＊／ｆｕｔＬに基づくｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬハイブリッド（配列番号８）のｃｄｓを、最初にプライマーｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ－ｆｗ（配列番号５８）及びｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ８－ｒｖ（配列番号５９）を用いて増幅し、ｒｃｓＡ（配列番号１８）については、プライマーｒｃｓＡ－２－ｆｗ（配列番号６０）及びｒｃｓＡ－２－ｒｖ（配列番号６１）を用いて増幅したｐＷＣ１－ｆｕｔＣ－ｒｃｓＡに基づくｃｄｓを用いて増幅した。次いで、末端相同オリゴヌクレオチドｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ８－ｒｖ（配列番号５９）及びｒｃｓＡ－２－ｆｗ（配列番号６０）を使用して、得られた線状ＤＮＡ断片をさらなるＰＣＲでプライマーｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ－ｆｗ（配列番号５８）及びｒｃｓＡ－２－ｒｖ（配列番号６１）と融合させた。最終的な線状ＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩ切断部位、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬのｃｄｓ（Δ８ａａ）（配列番号１４）、ＲＢＳ、ｒｃｓＡのｃｄｓ及びＸｂａＩ切断部位を含んでいた。
１５ａａ短くされたｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ変異体ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ１５ａａ）についての線状ＤＮＡ断片を同じ方法でクローニングしたが、ｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ８－ｒｖ（配列番号５９）の代わりにオリゴヌクレオチドｆｕｔＣ＊－ｓｈｏｒｔ１５－ｒｖ（配列番号６２）、ｒｃｓＡ－２－ｆｗ（配列番号６０）の代わりにｒｃｓＡ－３－ｆｗ（配列番号６３）を用いた。最終的な線状ＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩ切断部位、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬのｃｄｓ（Δ１５ａａ）（配列番号１６）、ＲＢＳ、ｒｃｓＡのｃｄｓ及びＸｂａＩ切断部位を含んでいた。
最後に、両方の線状ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで処理し、次いで、富化された脱リン酸化ベクター断片（ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断したｐＷＣ１、上記参照）でそれぞれライゲーションし、コンピテントＳｔｅｌｌａｒイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｔａｋａｒａ、滋賀、日本）を形質転換した。ライゲーションされたプラスミドの単一コロニーを、導入されたテトラサイクリン耐性に基づいて選択した。フコシルトランスフェラーゼ活性を実証するために２’－ＦＬ産生実験で使用する前に、プラスミドを制限パターン及び配列決定によって分析した。プラスミドｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ８ａａ）－ｒｃｓＡ及びｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ１５ａａ）－ｒｃｓＡを得た。
［実施例３］
１Ｌの発酵槽における２－フコシルラクトース及びジフコシルラクトースの発酵産生に対する異なるフコシルラクトーストランスフェラーゼの影響
３００ｍＬのバッフル付き三角フラスコの３０ｍＬ中のＬＢ培地（ペプトン３％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％）を、接種ループを使用して、実施例２から得たそれぞれの産生プラスミド（ｐＷＣ１－ｆｕｔＬ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ／ｆｕｔＬ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ８ａａ）－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ１５ａａ）－ｒｃｓＡ）で形質転換された実施例１から得た産生株イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎΔｓｕｌＡ－ｌａｃ－ｍｏｄの単一クローンを、予め播種した高密度に覆われたＬＢ寒天プレートから接種した。細菌シェーカー（１４５ｒｐｍ、３０℃）中で４．５～５時間インキュベートした後、ＯＤ６００は１．５～３．０であった（ＯＤ６００は６００ｎｍで分光光度的に決定された光学密度を指す）。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＢｉｏｓｔａｔ Ｂ－ＤＣＵ研究発酵槽における発酵のために、６～１３ｍｌの前培養物を、各々の場合において、発酵槽の最初に装入された培地に移した。接種後の初期の体積は約１Ｌであった。
１Ｌの発酵槽における２－フコシルラクトース及びジフコシルラクトースの発酵産生に対する異なるフコシルラクトーストランスフェラーゼの影響
３００ｍＬのバッフル付き三角フラスコの３０ｍＬ中のＬＢ培地（ペプトン３％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％）を、接種ループを使用して、実施例２から得たそれぞれの産生プラスミド（ｐＷＣ１－ｆｕｔＬ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ／ｆｕｔＬ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＬ／ｆｕｔＣ＊－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ８ａａ）－ｒｃｓＡ、ｐＷＣ１－ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬ（Δ１５ａａ）－ｒｃｓＡ）で形質転換された実施例１から得た産生株イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎΔｓｕｌＡ－ｌａｃ－ｍｏｄの単一クローンを、予め播種した高密度に覆われたＬＢ寒天プレートから接種した。細菌シェーカー（１４５ｒｐｍ、３０℃）中で４．５～５時間インキュベートした後、ＯＤ６００は１．５～３．０であった（ＯＤ６００は６００ｎｍで分光光度的に決定された光学密度を指す）。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＢｉｏｓｔａｔ Ｂ－ＤＣＵ研究発酵槽における発酵のために、６～１３ｍｌの前培養物を、各々の場合において、発酵槽の最初に装入された培地に移した。接種後の初期の体積は約１Ｌであった。
発酵培地は以下の成分を含有していた：１ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５０ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、１０ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ／ｌのＨｉｇｈＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ（Ｋｅｒｒｙ）、１．０ｇ／ｌのＡｍｉｓｏｙ（Ｋｅｒｒｙ）、０．５ｇ／ｌのＨｙ－Ｙｅａｓｔ ４１２（Ｋｅｒｒｙ）、及び１０ｍｌ／ｌの微量元素溶液（発酵槽にこれらの成分のＨ２Ｏ溶液を最初に装入し、これを１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した）。微量元素溶液は、１５０ｍｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、３００ｍｇ／ｌのＨ３ＢＯ３、２００ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２５０ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び１．３５ｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏで構成されていた。２５％のＮＨ４ＯＨ溶液中でポンプ輸送することによって、培地のｐＨを６．８に調整した。次いで、これに、適切なストック溶液から１５ｇ／ｌのグルコース、１、２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２２５ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍｇ／ｌのビタミンＢ１、及び２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを滅菌条件下で添加し、その後、接種材料を振盪フラスコから発酵槽に移した。
発酵させている間、培養物を４００～１５００ｒｐｍで撹拌し、滅菌微生物フィルターを介して供給される一定の２ｓｌｐｍの空気を通気した。撹拌速度を調整することによって酸素分圧を５０％に維持した。指数期の後期では、培養液中のＯ２分圧について所望の公称値５０％を確保するために、純粋なＯ２の供給空気を３２％のＯ２含有量まで富化する必要があった。２５％のＮＨ４ＯＨ溶液又は２０％のＨ３ＰＯ４溶液による自動補正によってｐＨを６．８に維持した。温度は最初は３０℃であり、誘導の３０分前に３０分間かけて３０℃から２５℃に徐々に低下させた。次いで、発酵の終了（６５時間）まで温度を２５℃に維持した。過剰な発泡は、自動的に制御される消泡剤の添加によって防止された（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３、Ｓｃｈｉｌｌ＆Ｓｅｉｌｎａｃｈｅｒ、Ｈ２Ｏ中１０％（ｖ／ｖ））。
発酵の段階に応じて、グルコース及びラクトースを、２つの別個の（無菌）供給液を介して添加した。グルコース含有量は、ＹＳＩのグルコースアナライザーを用いて判定した。接種からの第１段階では、最初に装入した培地のグルコースを消費した。発酵開始から約１０時間後に開始する第２段階では、グルコース濃度０ｇ／ｌで、培養物に無制限のグルコースの供給をする目的で、培養物に添加剤（６６０．２ｇ／ｋｇのグルコース一水和物（Ｂｉｅｓｔｅｒｆｅｌｄ－Ｓｐｅｚｉａｌｃｈｅｍｉｅ）、５ｇ／ｌのストック溶液からの２．５ｇ／ｋｇのビタミンＢ１、１４７ｇ／ｌのストック溶液からの３．６５ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２４０ｇ／ｌのストック溶液からの１２．３１ｇ／ｋｇのＭｇＳＯ４７・Ｈ２Ｏ、４．０４ｇ／ｋｇの微量元素溶液（上記参照）及び３１７．３ｇ／ｋｇの脱塩水）を含む６０％（ｗ／ｗ）グルコース供給溶液を、連続的に供給した。継続したグルコースの供給の完全な消費を特徴とする第３段階では、グルコースの供給の継続した添加は、接種後約１８．５時間で、発酵の終了（６５時間）まで一定の９．２ｇ／Ｌ／ｈまで減少し、それぞれの１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びｒｃｓＡの発現は、０．２５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導された。それに並行して、第３段階の開始時に、２０ｇ／ｌのラクトースを、７３７ｇ／ｋｇの脱塩Ｈ２Ｏに溶解した２５％（ｗ／ｗ）ラクトース溶液（２６３ｇ／ｋｇのα－Ｄ－ラクトース一水和物（ａｂｃｒ））からバッチとして添加し、次いで発酵の終了まで維持した４ｇ／ｌ／ｈの２５％（ｗ／ｗ）ラクトース溶液で継続的に供給した。したがって、出発体積１Ｌに基づいて合計６５ｇ／ｌのラクトースを添加した。
２’－ＦＬの発酵産生のための代替混合物（混合物２）では、誘導開始の３０分前、温度を３０分間かけて徐々に２７℃に下げ、誘導時に３０ｇ／ｌのラクトースをバッチとして添加し、発酵の終了まで維持した５ｇ／ｌ／ｈの２５％（ｗ／ｗ）ラクトース溶液を継続的に供給した。これは、１Ｌの初期体積に基づいて合計８６ｇ／ｌのラクトースに相当した。
６５時間後の培地の２’－ＦＬ、３’－ＦＬ、ＤＦＬ及びラクトース含有量を、実施例４に記載されているように試料の無細胞の上清からクロマトグラフィーにより判定し、表１にｇ／ｌでまとめた。
表１：２’－ＦＬ及びＤＦＬの収率に関する異なるフコシルトランスフェラーゼ活性の比較。
［実施例４］
２－フコシルラクトースの発酵産生のＨＰＬＣ分析
培地中の２’－ＦＬ、３’－ＦＬ、ＤＦＬ及びラクトース含有量のクロマトグラフィーでの判定のために、培養ブロス１ｍｌを発酵後６５時間、ベンチトップ遠心分離機において１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、透明な上清を脱塩水で１：２から１：５に希釈した。次いで、３００μｌの希釈物を、０．２μｍのシリンジフィルターを使用してＨＰＬＣリザーバー容器に濾過した。
２－フコシルラクトースの発酵産生のＨＰＬＣ分析
培地中の２’－ＦＬ、３’－ＦＬ、ＤＦＬ及びラクトース含有量のクロマトグラフィーでの判定のために、培養ブロス１ｍｌを発酵後６５時間、ベンチトップ遠心分離機において１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、透明な上清を脱塩水で１：２から１：５に希釈した。次いで、３００μｌの希釈物を、０．２μｍのシリンジフィルターを使用してＨＰＬＣリザーバー容器に濾過した。
分析物の分離のために、ＴＳＫｇｅｌアミド－８０カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；粒径５μｍ）及び対応するガードカラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇｕａｒｄｇｅｌ ａｍｉｄｅ－８０、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１５ｍｍ×３．２ｍｍ）を、以下のモジュール、バイナリポンプ、脱気装置、オートサンプラー、サーモスタット式カラムオーブン、１２６０ＲＩ検出器を有するＡｇｉｌｅｎｔ １２００／１２６０ ＨＰＬＣシステムにおいて使用した。カラム用オーブンの温度は３０℃であった。使用した溶離液は、Ｈ２Ｏ（３０％）及びアセトニトリル（７０％）の脱気混合物であった。カラムの平衡化後、調製した試料を１５℃に冷却したオートサンプラーから１０μｌずつ注入した。次いで、溶出を１ｍｌ／分の流量で２５分間アイソクラティックに実行した。検出には、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ製のＲＩ検出器（温度３５℃）及びＱ－ＴＯＦ Ｉｍｐａｃｔ ＩＩ質量分析計を使用した。
標準溶液の保持時間（２’－ＦＬ：１５．４分、３’－ＦＬ：１７．３分；ＤＦＬ：２２．３分；ラクトース：１２．２分）に基づいて、分析物にピークを割り当てた。ｇ／ｌ単位での分析物の濃度は、それぞれの希釈を考慮して、ピーク面積を積分し、標準の較正線を用いて、最終的に判定した。
［実施例５］
１Ｌ発酵槽でのジフコシルラクトースの形成を伴わない、ラクトースの２’－フコシルラクトースへの完全なフコシル化。
１Ｌ発酵槽でのジフコシルラクトースの形成を伴わない、ラクトースの２’－フコシルラクトースへの完全なフコシル化。
実施例３で前述したように、混合物２、ｆｕｔＣ＊／ｆｕｔＬに相同な融合タンパク質をコードする産生プラスミドの産生株イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ΔｗｃａＪΔｌｏｎΔｓｕｌＡ－ｌａｃ－ｍｏｄを形質転換し、発酵させた。実施例３から逸脱して、ラクトースの供給は６５時間後に終了したが、グルコースの継続的な添加は維持した。８８時間後、発酵を終了し、前と同様に、培養上清に存在する糖をＨＰＬＣによって判定した。０ｇ／ｌのＤＦＬ及び０ｇ／ｌの残存ラクトースと共に６７ｇ／ｌの２’－ＦＬを形成することは、融合タンパク質が、副産生物ＤＦＬの形成なしにラクトースの２’－ＦＬへの完全な変換を達成することができることを示し、これは、ラクトース及びジフコシルラクトースを除去するための処理工程がその後の後処理の間に必要とされないことを意味する。
略語
ａａ：アミノ酸
ΔＺａａ：Ｚアミノ酸の欠失、Ｚは欠失アミノ酸の数を示す
ＯＤ６００：波長６００ｎｍにおける光学密度
ＲＢＳ：リボソーム結合部位
ＦＴ：フコシルトランスフェラーゼ
ＧＴ：グリコシルトランスフェラーゼ
ｎＲＩＵ：ナノ屈折率単位
ａａ：アミノ酸
ΔＺａａ：Ｚアミノ酸の欠失、Ｚは欠失アミノ酸の数を示す
ＯＤ６００：波長６００ｎｍにおける光学密度
ＲＢＳ：リボソーム結合部位
ＦＴ：フコシルトランスフェラーゼ
ＧＴ：グリコシルトランスフェラーゼ
ｎＲＩＵ：ナノ屈折率単位
発酵後の上清のＨＰＬＣ分析は、ＦｕｔＣ＊／ＦｕｔＬに相同な酵素を使用して、２’－ＦＬ及び－存在する場合－ＤＦＬの産生、並びに残留ラクトースを示す。
Claims (15)
- 融合タンパク質であることを特徴とする酵素であって、
（ｉ）フコシルトランスフェラーゼのＮ末端ドメインを含み、及び、
ｉｉ）配列番号５の少なくともアミノ酸１５５～２８６、又はそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列をＣ末端ドメインとして含み、
フコシルトランスフェラーゼ活性を有し、
前記Ｎ末端ドメイン及び前記Ｃ末端ドメインは、２つの異なるフコシルトランスフェラーゼに由来する、酵素。 - 融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端ドメインのアミノ酸配列が、微生物の配列又はそれに対して相同な配列であることを特徴とする、請求項１に記載の酵素。
- 融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端ドメインのアミノ酸配列が、ヘリコバクター属の配列又はそれに対して相同な配列であることを特徴とする、請求項１及び２の一項以上に記載の酵素。
- Ｎ末端ドメインが、
配列番号７の少なくともアミノ酸１～１２９又は
それに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～３の一項以上に記載の酵素。 - 融合タンパク質のＮ末端ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸１～１４８又はそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１～４の一項以上に記載の酵素。
- Ｃ末端ドメインが、
配列番号５の少なくともアミノ酸１５５～２８６、又はそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～５の一項以上に記載の酵素。 - 融合タンパク質のＣ末端ドメインのアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸１４２～２８６又はそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１～６の一項以上に記載の酵素。
- 前記融合タンパク質が、配列番号９、配列番号１３、配列番号１５、又はそれに対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１～７の一項以上に記載の酵素。
- 請求項１～８の一項以上に記載の少なくとも１つの酵素と反応するグルコース、グリセロール、スクロース、フコース並びにＧＤＰ－、ＡＤＰ－、ＣＤＰ－及びＴＤＰ－フコースからなる物質の群より選択される少なくとも１つの物質の存在下、反応混合物にラクトースが存在することを特徴とする、２’－フコシルラクトースの製造方法。
- ラクトースが、５％を超えるＤＦＬが形成されることなく完全に変換されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
- 反応混合物が、酵素を組換え発現する微生物の培養物であることを特徴とする、請求項９及び１０の一項以上に記載の方法。
- ２’－フコシルラクトースが、培養上清から単離されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
- 少なくとも４％多い２’－フコシルラクトースが、融合タンパク質に１つのドメインが含まれる融合されていない野生型酵素よりも前記融合タンパク質によって形成されることを特徴とする、請求項９～１２の一項以上に記載の方法。
- 反応において少なくとも４７ｇ／ｌの２’－フコシルラクトースが形成されることを特徴とする、請求項９～１３の一項以上に記載の方法。
- 反応において１ｇ／ｌ未満、及びより好ましくは０ｇ／ｌのジフコシルラクトースが形成されることを特徴とする、請求項９～１４の一項以上に記載の方法。
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