JP2023511523A - Ｈｍｏの産生 - Google Patents
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Abstract
本発明の概念は、ＭＦＳスーパーファミリーのタンパク質をコードする組換え核酸を含む、オリゴ糖、好ましくはＨＭＯを産生できる遺伝子改変細胞；及びオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの産生のために前記細胞を使用する方法に関する。【選択図】なし
Description
［技術分野］
本発明は、宿主細胞における生物学的分子の組換え産生の分野に関する。より具体的には、本発明は、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を使用するヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の組換え産生の方法に関する。
本発明は、宿主細胞における生物学的分子の組換え産生の分野に関する。より具体的には、本発明は、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を使用するヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の組換え産生の方法に関する。
［本発明の背景］
ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、ヒト乳の３番目に大きな固形成分を構成し、酵素による加水分解に対して高い耐性がある。結果として、ＨＭＯのかなりの部分がほとんど消化されず、吸収されないままであり、結腸への通過を可能にする。結腸では、ＨＭＯは、特定の糖分解細菌の増殖を選択的に刺激することにより、腸内エコシステムを形成するための基質として機能し得る。この選択性は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の菌株が腸の健康に好ましい影響を与えると考えられているため、幼児及び成人の両方に有益であると見なされている（Ｃｈｉｃｈｌｏｗｓｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ，（２０１２）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．５：２５１－２５８；Ｅｌｉｓｏｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ，（２０１６）Ｂｒｉｔ Ｊ．Ｎｕｔｒ，１１６：１３５６－１３６８）。
ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、ヒト乳の３番目に大きな固形成分を構成し、酵素による加水分解に対して高い耐性がある。結果として、ＨＭＯのかなりの部分がほとんど消化されず、吸収されないままであり、結腸への通過を可能にする。結腸では、ＨＭＯは、特定の糖分解細菌の増殖を選択的に刺激することにより、腸内エコシステムを形成するための基質として機能し得る。この選択性は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の菌株が腸の健康に好ましい影響を与えると考えられているため、幼児及び成人の両方に有益であると見なされている（Ｃｈｉｃｈｌｏｗｓｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ，（２０１２）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．５：２５１－２５８；Ｅｌｉｓｏｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ，（２０１６）Ｂｒｉｔ Ｊ．Ｎｕｔｒ，１１６：１３５６－１３６８）。
プレバイオティクス特性に加えて、ＨＭＯは、さらなる好ましい影響に関連し、これにより、その適用分野が拡大している（Ｋｕｎｚ Ｃ．ｅｔ ａｌ，（２０１４）Ｆｏｏｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ５－２０，Ｅｄｓ．Ｍｏｒｅｎｏ Ｊ．ａｎｄ Ｌｕｚ Ｓａｎｚ Ｍ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ）。
ＨＭＯの明らかな健康上の利点により、乳児用調製粉乳及び食品などの食品、並びに消費者向け健康製品での使用が承認された。ＨＭＯの生物工学的生産は、ＨＭＯ製造の有益な費用効果の高い大規模な方法である。この方法は、所望のオリゴ糖の合成に必要なグリコシルトランスフェラーゼを発現するように作製された、遺伝子操作された細菌に依存し、ＨＭＯ前駆体として細菌の生来のヌクレオチド糖のプールを利用する。ＨＭＯの生物工学的生産における最近の開発により、細菌発現系の特定の固有の制限を克服することが可能になった。例えば、ＨＭＯ産生細菌細胞は、ＨＭＯの産生に関与する酵素の活性を改善するために（国際公開第２０１６０４０５３１号パンフレット）、又は合成されたＨＭＯの細胞外培地への分泌を促進するために（国際公開第２０１０１４２３０５号パンフレット、同第２０１７０４２３８２号パンフレット）、細菌内のヌクレオチド糖の限られた細胞内プールを増加させるように遺伝子改変することができる（国際公開第２０１２１１２７７７号パンフレット）。さらに、組換え細胞における目的の遺伝子の発現は、例えば、国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレットに最近記載されたもののように、特定のプロモーター又は他の遺伝子発現調節因子を使用することによって調節することができる。
国際公開第２０１０１４２３０５号パンフレット及び同第２０１７０４２３８２号パンフレットに記載のアプローチは、例えば、国際公開第２０１２１１２７７７号パンフレット、同第２０１６０４０５３１号パンフレット、又は同第２０１９１２３３２４号パンフレットの方法を使用して、高レベルの組換え遺伝子発現によって産生細胞にかかる代謝負荷を低減することを可能にするという利点を有する。このアプローチは、組換えＨＭＯ産生細胞においてますます注目を集めている。例えば、最近、発酵手順や、ヒト乳の最も豊富なＨＭＯである、組換え産生される２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）の排出を促進できるタンパク質をコードするいくつかの新しい糖トランスポーター遺伝子が報告されている（国際公開第２０１８０７７８９２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１９００３２３０５３号明細書、同第２０１９００３２３０５２号明細書）。しかしながら、現時点では、糖トランスポーターの基質特異性を規定する構造／因子がまだ十分に研究されておらず、まったく予測不可能なままであるため、複数のタンパク質データベース、例えばＵｎｉＰｒｏｔでトランスポーター機能が予測される多数の細菌タンパク質の中で、組換えにより生成される様々なＨＭＯ構造の排出に適したトランスポータータンパク質を特定できるアルゴリズムは存在しない。
［発明の概要］
組換え生産される様々なＨＭＯのための効率的な糖排出トランスポータータンパク質、及び前記タンパク質を発現する組換え細胞の開発は、大規模な産業用ＨＭＯ製造に有利である。
組換え生産される様々なＨＭＯのための効率的な糖排出トランスポータータンパク質、及び前記タンパク質を発現する組換え細胞の開発は、大規模な産業用ＨＭＯ製造に有利である。
本発明は、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる組換え細胞を提供し、この細胞は、細菌パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）に由来する推定ＭＦＳ（主要ファシリテータースーパーファミリー）トランスポータータンパク質をコードする異種遺伝子を発現している。より具体的には、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列（図４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする組換え核酸を含むオリゴ糖、特にＨＭＯを生成するように最適化された遺伝子改変細胞に関する。本明細書で配列番号１として識別されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０４８７８５１３９．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＷＰ＿０４８７８５１３９．１）を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では、「Ｖａｇタンパク質」又は「Ｖａｇトランスポーター」又は「Ｖａｇ」として互換的に識別され；Ｖａｇタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では「ｖａｇコード核酸／ＤＮＡ」又は「ｖａｇ遺伝子」又は「ｖａｇ」として識別される。
本発明は、Ｖａｇタンパク質を発現するＨＭＯ産生組換え細胞の使用が、ＨＭＯの発酵及び精製の両方の観点から、ＨＭＯ製造プロセスの非常に明確な改善をもたらすことを示す。本発明は、Ｎｅｃタンパク質を発現するＨＭＯ産生組換え細胞の使用が、ＨＭＯの発酵及び精製の両方に関連するＨＭＯ製造プロセスの非常に明確な改善をもたらすことを示している。本明細書に開示される組換え細胞及びＨＭＯ産生の方法は、全産生ＨＭＯのより高い収率、より低い副産物形成又は副産物対生成物比、より低い発酵あたりのバイオマス形成と、発酵ブロスの下流処理中のＨＭＯの容易な回収との両方を提供する。
驚くべきことに、異なるＨＭＯ産生細胞におけるＶａｇをコードするＤＮＡ配列の発現は、細胞外培地における特定のＨＭＯの蓄積、及び産生細胞の内部における他のＨＭＯの蓄積、並びに総ＨＭＯ生産の増加に関連することが見出されている。驚くべきことに、産生されたＨＭＯの排出の増加が、単糖の三単位又は四単位のいずれかからなるＨＭＯ、即ち、三糖及び四糖であるＨＭＯ、例えば、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース２、（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、及びラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）に特徴的であるが、産生細胞内に蓄積する五糖及び六糖のようなより大きなオリゴ糖構造には特徴的ではないことが見出されている。驚くべきことに、Ｖａｇを発現する対応するＨＭＯ産生細胞によるＨＭＯラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）及びラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）の総産生量も増加するが、副産物の形成、例えば、これらの細胞のパラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）及びパラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）がそれに応じて減少することが多く、前記副産物オリゴ糖が、典型的にはＨＭＯ生産系の細胞内部に蓄積することも見出されている。さらに、非常に意外なことに、ＨＭＯ産生細胞におけるＶａｇタンパク質の発現は、高細胞密度の発酵中のバイオマス形成の減少と、例えば発酵終了時の死細胞数の減少によって反映されるように、より正常な細胞培養につながり、これにより、バイオマス単位あたりの産生量が増えるため、製造プロセスがより効率的になる。
従って、本発明の第１の態様は、１つ又は複数のＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞に関し、前記細胞は、配列番号１のタンパク質をコードする組換え核酸、又はアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくはと少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体を含む。
本発明の第２の態様は、ＭＦＳトランスポータータンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する、核酸構築物に関し、この核酸構築物を含む、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である遺伝子改変細胞にも関する。
一態様では、核酸構築物は、ＭＦＳトランスポータータンパク質をコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％同一である。
本発明の第３の態様は、１つ又は複数のオリゴ糖の産生のための方法に関し、この方法は：
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供するステップであって、前記細胞が、配列番号１のタンパク質をコードする組換え核酸、又はアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体を含む、ステップ；
（ｉｉ）（ｉ）による細胞を適切な細胞培養培地で培養して、前記組換え核酸を発現させるステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で産生された１つ又は複数のＨＭＯを収集するステップを含む。
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供するステップであって、前記細胞が、配列番号１のタンパク質をコードする組換え核酸、又はアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体を含む、ステップ；
（ｉｉ）（ｉ）による細胞を適切な細胞培養培地で培養して、前記組換え核酸を発現させるステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で産生された１つ又は複数のＨＭＯを収集するステップを含む。
本発明はまた、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞又は核酸構築物の使用に関し、前記核酸配列は、１つ又は複数のヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の産生のために配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。
上記のように、１つ又は複数のＨＭＯを産生することができ、且つＶａｇトランスポータータンパク質をコードする核酸を含む遺伝子改変細胞の培養中に、驚くべきことに、対応する１つ又は複数のＨＭＯが高収率で産生される一方、副産物及びバイオマス形成が減少することが見出された。これにより、下流プロセス中のこれらのＨＭＯの回収が容易になり、例えば、全体的な回収及び精製手順を、より少ないステップで構成することができ、手順が全体的に単純化され、精製の全体の時間が短縮され、従って、産物の回収の労力が減り、経済的効率が向上する。
産物の収量の増加及び産物回収の促進のこれらの効果により、本発明は、先行技術の開示よりも優れている。
本発明の他の態様及び有利な特徴は、以下に、詳細に説明され、非限定的な実施例によって例示される。
［詳細な説明］
以下で、本発明の実施形態をさらに詳細に説明する。特徴のそれぞれの特定の変形例は、特に明記されていない限り、本発明の他の実施形態に適用することができる。
以下で、本発明の実施形態をさらに詳細に説明する。特徴のそれぞれの特定の変形例は、特に明記されていない限り、本発明の他の実施形態に適用することができる。
一般に、本明細書で使用されるすべての用語は、技術分野におけるそれらの通常の意味に従って解釈されるべきであり、明示的に定義されても、特に明記もされていない限り、本発明のすべての態様及び実施形態に適用可能である。「１つの（ａ）／１つの（ａｎ）／その（ｔｈｅ）［細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、ステップなど］」へのすべての言及は、特に明記されていない限り、前記細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、ステップなどの少なくとも１つの例を指すものとして公然と解釈されるべきである。本明細書に開示される任意の方法のステップは、特に明記されていない限り、開示された正確な順序で実行する必要はない。
本発明は、一般に、オリゴ糖を効率的に産生させるための遺伝子改変細胞、及びオリゴ糖を産生させる方法における前記遺伝子改変細胞の使用に関する。特に、本発明は、オリゴ糖、好ましくは異種オリゴ糖、特にヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を合成することを可能にする遺伝子改変細胞に関する。従って、本発明の細胞は、下記のグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する１つ又は複数の酵素をコードする遺伝子などの、細胞による１つ又は複数のＨＭＯの合成に必要な組換え核酸のセット（細胞が１つ又は複数のＨＭＯを合成することを可能にする）を発現するように改変される。本発明のオリゴ糖を産生する組換え細胞は、細菌パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）に由来する、ＭＦＳ（主要ファシリテータースーパーファミリー）タンパク質をコードする異種組換え核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列を含むようにさらに改変される。より具体的には、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列（図４）に対して少なくとも８０％の配列類似性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するタンパク質をコードする組換え核酸を含む、１つ又は複数の特定のオリゴ糖、特に１つ又は複数の特定のＨＭＯの産生のために最適化された遺伝子改変細胞に関する。本明細書で配列番号１として識別されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ：ＷＰ＿０４８７８５１３９．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＷＰ＿０４８７８５１３９．１）を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。
従って、本発明の第１の態様は、１つ又は複数のＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞に関し、前記細胞は、配列番号１のタンパク質をコードする組換え核酸、又はアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体を含む。
配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では、「Ｖａｇタンパク質」又は「Ｖａｇトランスポーター」又は「Ｖａｇ」として互換的に識別され；ｖａｇタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「ｖａｇコード核酸／ＤＮＡ」又は「ｖａｇ遺伝子」又は「ｖａｇ」として識別される。
「主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）」という用語は、糖、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオンなどを含む様々な異なる基質の輸送に関与する二次能動輸送体クラスの大きくて非常に多様なファミリーを意味する。糖トランスポータータンパク質の特異性は、全く予測不可能であり、例えばオリゴ糖に対する特異性を有する新規トランスポータータンパク質の同定には、負担のない実験室での実験が必要である（詳細については、Ｒｅｄｄｙ Ｖ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），ＦＥＢＳ Ｊ．２７９（１１）：２０２２－２０３５による概説を参照）。「ＭＦＳトランスポーター」という用語は、本文脈において、細胞膜を介したオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの輸送、好ましくは、宿主細胞によって合成されたＨＭＯ／オリゴ糖の細胞サイトゾルから細胞外部への輸送、好ましくは３つ又は４つの糖単位を含むＨＭＯ／オリゴ糖、特に２’－ＦＬ、３－ＦＬ、６’－ＳＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＴ－２、及びＬＮｎＴの輸送を促進するタンパク質を意味する。加えて、又は代わりに、ＭＦＳトランスポーターはまた、ラクトース、グルコース、及び細胞代謝産物又は毒素などの、本発明によるＨＭＯともオリゴ糖とも見なされない分子の排出を促進し得る。
２つ以上の核酸又はアミノ酸配列に関連する「［特定の］％の配列同一性」という用語は、２つ以上の配列が、核酸又はアミノ酸の比較枠又は指定された配列に対して最大限一致するように整列させて比較したときに、所与のパーセントで共通のヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する（即ち、配列が少なくとも９０パーセント（％）同一性を有する）ことを意味する。核酸又はアミノ酸配列のパーセント同一性は、デフォルトのパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動のアラインメントと目視検査によって測定することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照）。この定義は、試験配列の相補体、並びに欠失及び／又は付加を有する配列、及び置換を有する配列にも適用される。パーセント同一性、配列類似性、及びアラインメントを決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９（１９９７）に記載のＢＬＡＳＴ ２．２．２０ アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ ２．２．２０が、本発明の核酸及びタンパク質のパーセント配列同一性を決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公開されている。配列アラインメントアルゴリズムの例としては、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）、又はＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）が挙げられる。
本発明に関連して、「オリゴ糖」という用語は、いくつかの単糖単位を含む糖ポリマーを意味する。いくつかの実施形態では、好ましいオリゴ糖は、３つ又は４つの単糖単位、即ち三糖又は四糖からなる糖ポリマーである。本発明の好ましいオリゴ糖は、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）である。
本文脈における「ヒト乳オリゴ糖」又は「ＨＭＯ」という用語は、ヒト母乳に見られる複雑な炭水化物を意味する（例えば、Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（２０１１）；又はＣｈｅｎ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５）を参照）。ＨＭＯは、１つ又は複数のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ又は複数のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長できる還元末端にラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、α－Ｌ－フコピラノシル及び／又はα－Ｎ－アセチル－ノイラミニル（シアリル）部分で置換することができる。これに関連して、非酸性（又は中性）ＨＭＯにはシアリル残基がなく、酸性ＨＭＯは、その構造に少なくとも１つのシアリル残基がある。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化又は非フコシル化され得る。このような中性の非フコシル化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）、及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）、及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ ａ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｄ）、フコシル－ＬＳＴ ｄ（ＦＬＳＴ ｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）、及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。本発明に関連して、ラクトースは、ＨＭＯ種とは見なされない。
本発明のいくつかの実施形態では、トリ－ＨＭＯ及びテトラ－ＨＭＯは、好ましくは、例えば、三糖２’－ＦＬ、３－ＦＬ、６’－ＳＬ、ＬＮＴ－２、及び四糖ＤＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴであり得る。
１つ又は複数のＨＭＯを合成できるようにするために、本発明の組換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する機能酵素をコードする少なくとも１つの組換え核酸を含む。ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主細胞のゲノムに（染色体組み込みによって）組み込まれ得るか、或いは、プラスミドＤＮＡに含まれ、プラスミド由来として発現され得る。２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが、ＨＭＯ、例えば、ＬＮＴ又はＬＮｎＴの産生に必要な場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する異なる酵素、例えば、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の組換え核酸）と組み合わせられるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の組換え核酸）をコードする２つ以上の組換え核酸を、ＬＮＴの産生のためにゲノムに組み込んでもよいし、且つ／又はプラスミドから発現させてもよく、第１及び第２の組換え核酸は、互いに独立して染色体上に組み込まれるか、又はプラスミドにクローニングにされ得る。好ましい一実施形態では、第１及び第２の組換え核酸の両方が、産生細胞の染色体に安定して組み込まれ；別の実施形態では、第１及び第２のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つは、プラスミド由来である。グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質／酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）は、異なる実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，４－フコシルトランスフェラーゼα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を有する酵素から選択することができる。例えば、ＬＮｎＴの生産では、改変細胞が、活性なβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素及び活性なβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素を発現する必要がある。産生細胞に含まれる組換え遺伝子によってコードされ得る、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のいくつかの非限定的な実施形態を、表１の非限定的な例から選択することができる。
本発明の一態様は、配列番号１に示される主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）タンパク質である糖輸送が可能なタンパク質をコードする異種核酸配列を含む核酸構築物、又はアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０％同一であるその機能的相同体の提供であり、ＭＦＳタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。
「異種核酸配列」、「組換え遺伝子／核酸／ＤＮＡコード化」、又は「コード核酸配列」という用語は、適切な制御配列、即ちプロモーターの制御下に置かれると、ｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドに翻訳される、連続する重複しないトリプレット（コドン）のセットを含む人工核酸配列（即ち、核酸配列を作製するための標準的な実験方法を使用してインビトロで作製される）を意味する。コード配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端のオープンリーディングフレームのすぐ上流に位置するリボソーム結合部位、転写開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ、又はＵＵＧ）、及び翻訳停止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）によって決定される。コード配列は、限定されるものではないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、及び組換え核酸配列を含み得る。「核酸」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びｃＤＮＡ分子を含む。遺伝暗号の縮重の結果として、所与のタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列が生成され得ることを理解されたい。核酸という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、短鎖核酸分子である。「プライマー」は、精製された制限消化物のように天然に存在するか、又は合成的に生成されるかを問わず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（即ち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、適切な温度及びｐＨで）に置かれたときに合成の開始点として機能し得るオリゴヌクレオチドである。プライマーは、増幅の効率を最大にするために一本鎖であることが好ましいが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物の調製に使用される前に、まずその鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマーは、デオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、及び方法の使用を含む多くの要因に依存する。プライマーは、伸長産物の調製に使用される前に、最初にその鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマーは、デオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、及び方法の使用を含む多くの因子に依存する。
本発明の組換え核酸配列は、コードＤＮＡ配列、例えば遺伝子、又は非コードＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列などの調節ＤＮＡであり得る。本発明の一態様は、１つ又は複数のＨＭＯの産生に必要な酵素をコードする組換えＤＮＡ配列及びＶａｇトランスポーターをコードするＤＮＡ配列を含む組換え細胞を提供することに関する。従って、一実施形態では、本発明は、コード核酸配列、即ち、目的の遺伝子、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子又はｖａｇ遺伝子の組換えＤＮＡ配列、及び非コードＤＮＡ配列、例えば、プロモーターＤＮＡ配列、例えば、ｌａｃオペロン又はｇｌｐオペロンのプロモーターに由来する組換えプロモーター配列、又は別のゲノムプロモーターＤＮＡ配列に由来するプロモーター配列、又は合成プロモーター配列を含み、コード配列とプロモーター配列が作動可能に連結されている核酸構築物に関する。「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、この用語は、転写調節配列と転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列は、適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接する、即ち、これらはシス作用性である。
一実施形態では、本発明の核酸構築物は、ベクターＤＮＡの一部であり得、別の実施形態では、本構築物は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる発現カセット／カートリッジである。従って、「核酸構築物」という用語は、人工的に構築された核酸のセグメント、特に、標的細胞、例えば細菌細胞に「移植」されて宿主遺伝子の発現を改変すること、又は構築物に含まれ得る遺伝子／コードＤＮＡ配列を発現することを目的とするＤＮＡセグメントを意味する。本発明の文脈において、核酸構築物は、２つ以上の組換えＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列：本質的に、プロモーターＤＮＡ配列を含む非コードＤＮＡ配列、及び目的のタンパク質、例えば、Ｖａｇタンパク質、グリコシルトランスフェラーゼ、又は宿主細胞でのＨＭＯの産生に有用な別のタンパク質をコードするコードＤＮＡ配列を含む。好ましくは、構築物は、その構築物のコードＤＮＡの転写又は翻訳のいずれかを調節するさらなる非コードＤＮＡ配列、例えば、転写物へのリボソームの結合を促進するＤＮＡ配列、転写物を安定させるリーディングＤＮＡ（ｌｅａｄｉｎｇ ＤＮＡ）配列、又は転写ターミネーター配列を含む。
構築物（発現カセット）に含まれる目的の組換え遺伝子の細菌ゲノムへの組み込みは、従来の方法、例えば、ａｔｔＴｎ７サイト（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；２（２）：１３７－４９．）に記載のように、染色体上の特定の部位に相同な隣接配列を含む線形カートリッジを使用すること；組換えがファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能によって媒介される核酸配列のゲノム組み込みのための方法（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８ Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３）；Ｒｅｄ／ＥＴ組換えに基づく方法（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５），１２（３）：３４９－５６．；Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５）；又は陽性クローン、即ち、例えばマーカー遺伝子、若しくは遺伝子機能の喪失若しくは獲得によって選択することができる発現カセットを保有するクローンによって達成することができる。
目的の遺伝子を含む発現カセットの単一のコピーは、所望のＨＭＯの産生を確実にし、本発明による所望の効果を達成するのに十分であり得る。従って、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた目的の遺伝子の１つ、２つ、又は３つのコピーを含む組換えＨＭＯ産生細胞に関する。いくつかの実施形態では、遺伝子の単一コピーが好ましい。
好ましい一実施形態では、本発明の核酸構築物の組換えコード核酸配列は、プロモーターに対して異種であり、これは、由来する種のゲノムにおける同等の天然コード配列が、別のプロモーター配列（即ち、構築物のプロモーター配列ではない）の制御下で転写されることを意味する。それでも、宿主細胞に関して、コードＤＮＡは、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主細胞で発現されるＶａｇタンパク質をコードするＤＮＡ配列などの異種（即ち、別の生物種又は属に由来する）、又は、例えば結腸酸オペロンの遺伝子、ＧＭＡＢ遺伝子などの同種（即ち、宿主細胞に由来する））のいずれかであり得る。
「調節エレメント」又は「プロモーター」又は「プロモーター領域」又は「プロモーターエレメント」という用語は、転写の開始の際にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識及び結合される核酸配列である。プロモーターは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）とともに、所与の遺伝子又は遺伝子群（即ち、オペロン）を発現するために必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列には、限定されるものではないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、転写ターミネーター及びエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれる。「転写開始部位」は、転写される最初のヌクレオチドを意味し、＋１で示される。開始部位の下流のヌクレオチドには、＋２、＋３、＋４などが付番され、５’反対（上流）方向のヌクレオチドには－１、－２、－３などが付番される。構築物のプロモーターＤＮＡ配列は、選択された種のゲノムの任意の遺伝子のプロモーター領域、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡのプロモーター領域に由来し得る。従って、ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始することができる任意のプロモーターＤＮＡ配列は、本発明を実施するのに適している。原則として、任意のプロモーターＤＮＡ配列を使用して、構築物の目的の組換え遺伝子の転写を調節することができ、異なる又は同じプロモーター配列を使用して、宿主細胞のゲノム又は発現ベクターＤＮＡに組み込まれた目的の異なる遺伝子の転写を駆動することができる。構築物に含まれる組換え遺伝子の最適な発現を得るために、構築物は、さらなる調節配列、例えば、リボソーム結合のための配列である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇｌｐ遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来するＤＮＡ配列などのリーディングＤＮＡ配列を含み得る。後の配列の例は、国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載され、本明細書の非限定的な実施例に例示される。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の構築物に含まれる組換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、ｇｌｐＦＫＸオペロンプロモーター、ＰｇｌｐＦであり、他の好ましい実施形態では、プロモーターは、ｌａｃオペロンプロモーター、Ｐｌａｃである。
さらなる態様では、本発明の構築物に含まれる組換え遺伝子の発現の調節のための調節エレメントは、ｍｇＩＢＡＣ；ガラクトース／メチル－ガラクトシダーゼ（ｍｅｔｈｙｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｄｅ）トランスポータープロモーターＰｍｇＩＢ又はその変異体、例えば、限定されるものではないが、配列番号２７のＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ又は配列番号２８のＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４である。
さらなる態様では、本発明の構築物に含まれる組換え遺伝子の発現の調節のための調節エレメントは、ｇａｔＹＺＡＢＣＤ；タガトース－１，６－ｂｉｓＰアルドラーゼプロモーターＰｇａｔＹ又はその変異体、例えば、限定されるものではないが、配列番号２９のＰｇａｔＹ＿Ｕ７０ＵＴＲである。
本発明の遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物に存在する現在好ましい調節エレメントは、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４からなる群から選択される。
本発明の遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物に存在する特に好ましい調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ及びＰｌａｃからなる群から選択される。
しかしながら、宿主細胞における１つ又は複数のＨＭＯの最適レベルの生合成産生を達成するために必要又は有益である１つ又は複数のタンパク質（又は１つ又は複数の調節核酸）、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ、ＨＭＯ又はＨＭＯ前駆体の膜貫通輸送、遺伝子発現調節タンパク質などに関与し、本発明による所望の効果の達成を可能にするタンパク質をコードする１つ又は複数の組換え核酸の転写及び／又は転写レベルの調節を可能にする任意のプロモーターが、本発明を実施するのに適している。
好ましくは、宿主細胞で発現されるＨＭＯ、プロモーターＤＮＡ配列、及び他の調節配列、例えば、リボソーム結合部位配列（例えば、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）の生合成産生に関連する遺伝子を含む本発明の構築物は、宿主細胞の懸濁液を含む１リットルの発酵培地の少なくとも０．０３ｇ／ＯＤ（光学密度）のレベル、例えば、約０．０５ｇ／ｌ／ＯＤ～約０．１ｇ／ｌ／ＯＤのレベルでのＨＭＯの産生を可能にする。本発明の目的のために、後のＨＭＯ産生レベルは、「十分」又は「最適」であると見なされ、このレベルの所望のＨＭＯを産生することができる宿主細胞は、「適切な宿主細胞」と見なされる、即ち、この細胞は、ＨＭＯ産生に有利な本明細書に記載の少なくとも１つの効果を達成するために、ＨＭＯトランスポータータンパク質、例えばＶａｇを発現するようにさらに改変することができる。
本発明の遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物は、推定ＭＦＳ（主要ファシリテータースーパーファミリー）トランスポータータンパク質をコードする異種遺伝子などの核酸配列を含む。
本発明において特に関心のあるＭＦＳ輸送タンパク質はＶａｇタンパク質である。従って、本発明の核酸構築物は、遺伝子ｖａｇ、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
遺伝子改変細胞又は核酸構築物に含まれる核酸配列は、配列番号１のタンパク質、又はアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０％同一であるその機能的相同体をコードする。
配列番号１のタンパク質の機能的相同体は、突然変異誘発によって得ることができる。機能的相同体は、配列番号１のアミノ酸配列の機能と比較して、少なくとも５０％、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の機能を残しているべきである。この機能的相同体は、配列番号１のアミノ酸配列の機能性と比較してより高い機能性を有し得る。配列番号１の機能的相同体は、本発明による遺伝子改変細胞のＨＭＯ産生を促進できるはずである。
遺伝子改変細胞（宿主細胞又は組換え細胞）は、例えば、細菌又は酵母細胞であり得る。好ましい一実施形態では、遺伝子改変細胞は細菌である。細菌宿主細胞は、目的の遺伝子を挿入するための遺伝子操作を可能にし、製造規模で培養できる限り、真正細菌（グラム陽性又はグラム陰性）又は古細菌であり得る。好ましくは、宿主細胞は、高い細胞密度までの培養を可能にする特性を有する。本発明によるＨＭＯの組換え工業産生に適した細菌宿主細胞の非限定的な例は、エルイウニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、又はキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）であり得る。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、及びバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）を含むバチルス属の細菌も使用することができる。同様に、限定されるものではないが、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、及びラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を含むラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌は、本発明の方法を使用して改変することができる。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びプロプリオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）も、本明細書に記載の本発明に適した細菌種である。本発明の一部として、本明細書に記載のように、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・サーモフィレス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ））、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ））、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びシュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））から改変された菌株も含まれる。本明細書に記載の特徴を含む細菌は、ラクトースの存在下で培養され、細胞によって産生されるＨＭＯなどのオリゴ糖は、細菌自体又は細菌の培養上清のいずれかから回収される。好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などである。
本発明の組換え細胞によって産生されるＨＭＯは、当技術分野で利用可能な適切な手順（例えば、国際公開第２０１５１８８８３４号パンフレット、同第２０１７１８２９６５号パンフレット、又は同第２０１７１５２９１８号パンフレットに記載のものなど）を使用して精製することができる。本発明の遺伝子改変細胞は、当技術分野の標準的な方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｗａｌｋｅｒ，“Ｍａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．によるマニュアルに記載の方法を使用して提供することができる。
ＨＭＯの産生に適した宿主、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子又は外因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子を含み得、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性ｌａｃＺ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００２９６（ＧＩ：４１９０１））を含む。本発明の目的のために、ＨＭＯ産生宿主細胞は、任意のβ－ガラクトシダーゼ遺伝子を含むか、又は不活性化型の遺伝子を含むように遺伝子操作される。遺伝子は、細菌ゲノムからの対応する核酸配列の完全又は部分的な欠失によって不活性化され得るか、又は遺伝子配列が、転写されるように、若しくは転写される場合、転写物が翻訳されないように、若しくはタンパク質（即ち、β－ガラクトシダーゼ）に翻訳される場合、そのタンパク質が対応する酵素活性を有さないように変異される。このようにして、ＨＭＯ産生細胞は、ＨＭＯの産生に有益な増大した細胞内ラクトースプールをためる。
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされた細胞は、不十分なシアル酸異化経路を含む。「シアル酸異化経路」は、通常は酵素によって制御及び触媒され、シアル酸の分解をもたらす一連の反応を意味する。本明細書に記載の例示的なシアル酸異化経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）経路である。この経路では、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ；Ｎ－アセチルノイラミン酸）は、酵素ＮａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）及びＮａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）及びＮａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ）によって分解され、これらはすべて、ｎａｎＡ ＴＥＫ－ｙｈｃＨオペロンからコードされ、ＮａｎＲ（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ＥＣＯＬＩ）によって抑制される。不十分なシアル酸異化経路は、内因性ｎａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ０００６７．１（ＧＬ２１６５８８））、及び／又はｎａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（アミノ酸）ＢＡＥ７７２６５．１（ＧＬ８５６７６０１５））、及び／又はｎａｎＥ（参照により本明細書に組み込まれる、Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ、ＧＩ：９４７７４５）に変異を導入することによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主にもたらされる。任意選択により、ｎａｎＴ（Ｎ－アセチルノイラミン酸トランスポーター）遺伝子も不活性化又は変異される。シアル酸代謝の他の中間体には：（ＭａｎＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸；（ＧｌｃＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸；（ＧｌｃＮ－６－Ｐ）グルコサミン－６－リン酸、及び（Ｆｒｕｃ－６－Ｐ）フルクトース－６－リン酸が含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、ｎａｎＡは変異している。他の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＫは変異しているが、ｎａｎＥは、機能を維持する。別の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＥは変異しているが、ｎａｎＫは変異も、不活性化も、欠失もしていない。変異は、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ、及び／又はｎａｎＴの遺伝子産物をコードする核酸配列の１つ又は複数の変化である。例えば、変異は、核酸配列の１つ、２つ、最大５つ、最大１０、最大２５、最大５０、又は最大１００の変化であり得る。例えば、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ、及び／又はｎａｎＴ遺伝子は、ヌル変異によって変異する。本明細書に記載のヌル変異は、アミノ酸の置換、付加、欠失、又は挿入を包含し、これは、酵素の機能の喪失（即ち、活性の低下若しくは欠如）又は酵素の喪失（即ち、遺伝子産物の欠如）のいずれかを引き起こす。「欠失された」は、（機能的な）遺伝子産物が産生されないようにコード領域が完全に又は部分的に除去されていることを意味する。不活性化は、得られた遺伝子産物が機能的に不活性であるか、又は天然に存在する天然の内因性遺伝子産物の１００％未満、例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、若しくは２０％の活性である遺伝子産物をコードするようにコード配列が変更されていることを意味する。「変異していない」遺伝子又はタンパク質は、天然に存在する天然のコード配列又は内因性のコード配列と、１つ、２つ、最大５つ、最大１０、最大２０、最大５０、最大１００、最大２００、又は最大５００以上異ならない、又は対応するコードされたアミノ酸配列と異ならない。
さらに、宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））はまた、シアル酸合成能力を有する。例えば、細菌は、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ ２－エピメラーゼ（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２７．１；ＧＬ１５１９３２２３）又は同等物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ８８のｎｅｕＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿００２３９２９３６．１；ＧＩ：２１８５６００２３）、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２６．１；ＧＩ：１５１９３２２２）又は同等物（例えば、フラボバクテリウム・リムノセジミニス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｎｏｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＬ５５９２２０４２４）、及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２８．１；ＧＩ：１５１９３２２４）又は同等物（例えば、ビブリオ・ブラジリエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）ＣＭＰ－シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ：４９３９３７１５３）の提供によるシアル酸合成能力を有する。
エンジニアリングされた細菌及び酵母における中性Ｎ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの産生は当技術分野で公知である（例えば、Ｇｅｂｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６３ ８３－９０；米国特許第１０，５１９，４７５号明細書を参照）。
ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＤＦＨ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＤＦＨ－ＩＩ）、及びラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）などのＮ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの産生では、細菌は、上記のように機能的ｌａｃＹ及び機能不全ｌａｃＺ遺伝子を含み、この細菌は、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒβ－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子、又はその機能的変異体又は断片を含むようにエンジニアリングされている。この外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒβ－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子（ＧｌｃＮＡｃＴ）は、いくつかの供給源（表１を参照）のいずれか１つから得ることができ、例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッションＡＡＦ４２２５８．１）又は淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッションＡＣＦ３１２２９．１）から記載のＩｇｔＡ遺伝子を得ることができる。任意選択により、追加の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒβ－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含む細菌で共発現させることができる。例えば、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇａｌ４Ｔ）は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒβ－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子と共発現される。この外因性β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、いくつかの供給源のいずれか１つから得ることができ、例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から記載の１つ、ＩｇｔＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッションＡＡＦ４２２５７．１）を、又はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からＨＰ０８２６／ｇａｌＴ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッションＮＰ＿２０７６１９．１）を得ることができる。任意選択により、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒβ－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を含む細菌で共発現される追加の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ３Ｔ）遺伝子、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０５５：Ｈ７由来の記載のもの、ｗｂｇＯ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッションＷＰ＿０００５８２５６３．１）、又はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のｊｈｐ０５６３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッションＡＥＺ５５６９６．１）、又はＢ群β溶血連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）タイプＩｂ ＯＩ２由来のｃｐｓＩＢＪ遺伝子Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッションＡＢ０５０７２３．１）である。上記の酵素のいずれかの機能的変異体及び断片もまた、開示される発明に包含される。
Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子はまた、Ｐｇｌｐに作動可能に連結して、対応するゲノム組み込みカセットから発現させることができる。一実施形態では、ゲノムに組み込まれる遺伝子は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのＧａｌＴ酵素をコードするＨＰ０８２６（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッションＮＰ＿２０７６１９．１）遺伝子であり；別の実施形態では、ゲノムに組み込まれる遺伝子は、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＩｇｔＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッションＡＡＦ４２２５８．１）である。これらの実施形態では、第２の遺伝子、即ち、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ又はガラクトシルトランスフェラーゼを相応にコードする遺伝子は、ゲノム組み込み又はプラスミド由来のカセットのいずれかから発現され得る。第２の遺伝子は、任意選択により、ｇｌｐプロモーターの制御下で、又は発現系に適した他の任意のプロモーター、例えば、Ｐｌａｃの制御下で発現され得る。
特に明記されていない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の一般的な技術者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）は、本発明で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本出願で必要な命名法と一般的な実験手順のほとんどは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）；Ｗｉｌｓｏｎ Ｋ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ Ｊ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；又はＭａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２０１２）；又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｈｎｓ（２０１０）で確認することができる。マニュアルは、以降、それぞれ「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」、「Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｗａｌｋｅｒ」、「Ｍａｎｉａｔｉｓｅら」、「Ａｕｓｕｂｅｌら」と呼ばれる。
本発明の第２の態様は、１つ又は複数のＨＭＯの産生のための方法に関連し、この方法は：
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供するステップであって、前記細胞が、配列番号１のタンパク質をコードする組換え核酸、又は配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含む、ステップ；
（ｉ）（ｉ）の細胞を適切な細胞培養培地で培養して、前記組換え核酸を発現させるステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉｉ）で産生されたＨＭＯを収穫するステップを含む。
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供するステップであって、前記細胞が、配列番号１のタンパク質をコードする組換え核酸、又は配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含む、ステップ；
（ｉ）（ｉ）の細胞を適切な細胞培養培地で培養して、前記組換え核酸を発現させるステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉｉ）で産生されたＨＭＯを収穫するステップを含む。
本発明によると、「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」（又は「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」又は「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）」、「発酵」とも呼ばれる）という用語は、業界で公知である方法による制御されたバイオリアクターにおける細菌発現細胞の増殖に関連する。
１つ又は複数のＨＭＯを産生させるために、本明細書に記載のＨＭＯ産生細菌が、適切な炭素源、例えば、グルコース、グリセロール、ラクトースなどの存在下で当技術分野で公知の手順に従って培養され、産生されたＨＭＯが、培養培地及び培養プロセス中に形成された微生物バイオマスから収集される。その後、ＨＭＯは、例えば、国際公開第２０１５１８８８３４号パンフレット、同第２０１７１８２９６５号パンフレット、又は同第２０１７１５２９１８号パンフレットなどに記載のように当技術分野で公知である手順に従って精製され、精製されたＨＭＯが、栄養補助食品、医薬品、又は研究などの他の目的で使用される。ＨＭＯの製造は、典型的には、大量の培養を行うことによって達成される。本発明の意味での「製造」及び「製造規模」という用語は、最小容量５Ｌの培養ブロスでの発酵を定義する。通常、「製造規模」プロセスは、目的の１つ又は複数のＨＭＯを含む大量の調製物を処理し、例えば治療用化合物又は組成物の場合に、臨床試験及び市場供給の需要を満たす量の目的のタンパク質を産生できることによって定義される。大量産生に加えて、製造規模の方法は、振とうフラスコ培養のような単純な実験室規模の方法とは対照的に、攪拌、曝気、栄養素の供給、プロセスパラメータ（ｐＨ、温度、溶存酸素圧、背圧など）のモニタリング及び制御のための装置を装備したバイオリアクター（発酵槽）の技術システムの使用によって特徴付けられる。大体において、振とうフラスコ、ベンチトップバイオリアクター、又は本開示の実施例に記載のディープウェルフォーマットなどの実験室規模の方法における発現系の挙動は、バイオリアクターの複雑な環境におけるそのシステムの挙動を予測することを可能にする。
発酵プロセスで使用される適切な培養培地に関しては制限がない。培養培地は、半定義される、即ち、複雑な培地化合物（例えば、酵母エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸など）を含み得る、又は複雑な化合物なしで化学的に定義され得る。
「１つ又は複数のＨＭＯ」という用語は、ＨＭＯ産生細胞が、単一のＨＭＯ構造（第１のＨＭＯ）又は複数のＨＭＯ構造（第２、第３のＨＭＯなど）を産生可能性であり得ることを意味する。いくつかの実施形態では、単一のＨＭＯを産生する宿主細胞が好ましい場合があり、他の好ましい実施形態では、複数のＨＭＯ構造を産生する宿主細胞が好ましい場合がある。複数のＨＭＯ構造を産生することができる宿主細胞の非限定的な例としては、ＤＦＬ、ＦＳＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ＬＮＦＰ－ＩＩＩ、ＬＮＦＰ－ＩＶ、ＬＮＦＰ－Ｖ、ｐＬＮｎＨ、又はｐＬＮｎＨ－ＩＩ産生細胞を挙げることができる。
本発明との関連で「収集」という用語は、発酵の終了後に、産生されたＨＭＯを収集することに関連する。異なる実施形態では、収集は、バイオマス（即ち、宿主細胞）及び培養培地の両方に含まれる、即ち、発酵ブロスをバイオマスから分離する前に／分離せずにＨＭＯを収集することを含み得る。他の実施形態では、産生されたＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスとは別に、即ち、バイオマスを培養培地（即ち、発酵ブロス）から分離した後に／次に収集され得る。培地からの細胞の分離は、任意の適切なタイプの遠心分離又は濾過などの当業者に周知の任意の方法で行うことができる。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスを収集した直後に行ってもよいし、又は発酵ブロスを適切な条件で保存した後の後期に行ってもよい。残りのバイオマス（又は全発酵）からの産生されたＨＭＯの回収には、バイオマス（即ち、産生細胞）からのその抽出が含まれる。この抽出は、当技術分野の任意の適切な方法によって、例えば、超音波処理、煮沸、均質化、リゾチームを使用する酵素溶解、又は凍結及び粉砕によって行うことができる。残りのバイオマス（又は全発酵）からの産生されたＨＭＯの回収には、バイオマス（産生細胞）からのその抽出が含まれる。この抽出は、当技術分野の任意の適切な方法によって、例えば、超音波処理、煮沸、均質化、リゾチームを使用する酵素溶解、又は凍結及び粉砕によって行うことができる。
発酵からの回収後、ＨＭＯは、さらなる処理及び精製が可能である。
発酵によって産生されたＨＭＯの精製は、国際公開第２０１６０９５９２４号パンフレット、同第２０１５１８８８３４号パンフレット、同第２０１７１５２９１８号パンフレット、同第２０１７１８２９６５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１９０１１９３１４号明細書（すべて参照により組み込まれる）に記載の適切な手順を使用して行うことができる。
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、いくつかのＨＭＯを産生することができ、１つのＨＭＯは、「産物」ＨＭＯであり、他のいくつか／すべてのＨＭＯは、「副産物」ＨＭＯである。典型的には、副産物ＨＭＯは、主要なＨＭＯ前駆体、又は主要なＨＭＯをさらに改変した産物のいずれかである。いくつかの実施形態では、豊富な量の産物ＨＭＯを産生し、少量の副産物ＨＭＯを産生することが望ましいであろう。本明細書に記載のＨＭＯ産生のための細胞及び方法は、定義されたＨＭＯプロファイルを有するＨＭＯ産物の制御された産生を可能にし、例えば、一実施形態では、産生されたＨＭＯ混合物では、産物ＨＭＯがこの混合物の他のＨＭＯ（即ち、副産物ＨＭＯ）と比較してＨＭＯが優勢である、即ち、産物ＨＭＯが、他の副産物ＨＭＯよりも大量に産生され；他の実施形態では、同じＨＭＯ混合物を産生する細胞を、産物ＨＭＯよりも大量に１つ又は複数の副産物ＨＭＯを産生するように調整することができる。例えば、ＬＮｎＴ、産物ＨＭＯの産生中に、多くの場合、かなりの量のｐＬＮｎＨ、副産物ＨＭＯが生産される。別の例では、ＬＮＴの産生中に、かなりの量の副産物ｐＬＮＨ－ＩＩが産生される。本発明の遺伝子改変細胞を用いて、ＬＮｎＴ産物中のｐＬＮｎＨのレベルを著しく低下させることができる。
有利なことに、本発明は、産物に対する副産物の比率の減少と、産物（及び／又は全体としてのＨＭＯ）の全体的な収率の増加の両方を可能にする。これにより、産物形成に対して副産物形成が少なくなり、産物形成の向上が促進され、産生プロセスと産物回収プロセスの両方の効率が向上し、ＨＭＯの優れた製造手順が提供される。
異なる好ましい実施形態では、産物又は副産物ＨＭＯとして２’－ＦＬ、３－ＦＬ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＬＮＴ－２、ＤＦＬ、ＦＳＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＤＦＬ、ＦＳＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ＬＮＦＰ－ＩＩＩ、ＬＮＦＰ－ＩＶ、ＬＮＦＰ－Ｖ、ｐＬＮｎＨ、ｐＬＮＨ－ＩＩのいずれか／両方を産生する異なる宿主細胞を選択することができる。好ましい一実施形態では、産物はＬＮｎＴであり、副産物はｐＬＮｎＨである。別の好ましい実施形態では、産物はＬＮＴであり、副産物はｐＬＮＨ－ＩＩである。
本発明はまた、１つ又は複数のオリゴ糖、好ましくは１つ又は複数のヒト乳オリゴ糖の産生のための、本発明による遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物の使用に関する。一実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物は、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＬＦ、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＴ、ｐＬＮＨ－ＩＩ、及びｐＬＮｎＨからなる群から選択される特定のＨＭＯの産生に使用される。
特に好ましい実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物は、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＴ、ｐＬＮＨ－ＩＩ、及びｐＬＮｎＨからなる群から選択される特定のＨＭＯの生成に使用される。
本発明は、以下の非限定的な実施例及び実施形態によってさらに例示される。
［材料及び方法］
特に明記されていない限り、分子生物学の分野で公知である標準的な技術、ベクター、制御配列エレメント、及び他の発現系エレメントが、核酸の操作、形質転換、及び発現に使用される。このような標準的な技術、ベクター、及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２．）（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）で確認することができる。
特に明記されていない限り、分子生物学の分野で公知である標準的な技術、ベクター、制御配列エレメント、及び他の発現系エレメントが、核酸の操作、形質転換、及び発現に使用される。このような標準的な技術、ベクター、及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２．）（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）で確認することができる。
以下に記載される実施形態は、本発明を例示するために選択され、決して本発明を限定するものではない。
［菌株］
使用した細菌株ＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＤＨ１の遺伝子型は：Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。本実施例で利用される菌株を表２に記載する。
使用した細菌株ＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＤＨ１の遺伝子型は：Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。本実施例で利用される菌株を表２に記載する。
［培地］
ルリアブロス（ＬＢ）培地を、ＬＢブロス粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して調製し、ＬＢ寒天プレートを、ＬＢ寒天粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して調製した。必要に応じて、アンピシリン（（１００μｇ／ｍＬ）又は適切な抗生物質）及び／又はクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を加えた。
ルリアブロス（ＬＢ）培地を、ＬＢブロス粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して調製し、ＬＢ寒天プレートを、ＬＢ寒天粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して調製した。必要に応じて、アンピシリン（（１００μｇ／ｍＬ）又は適切な抗生物質）及び／又はクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を加えた。
最小基礎培地は、組成：ＮａＯＨ（１ｇ／Ｌ）、ＫＯＨ（２．５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（７ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（７ｇ／Ｌ）、クエン酸（０．５ｇ／ｌ）、微量ミネラル溶液（５ｍＬ／Ｌ）を有していた。微量ミネラルストック溶液は、ＺｎＳＯ４
＊７Ｈ２Ｏ ０．８２ｇ／Ｌ、クエン酸２０ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４
＊Ｈ２Ｏ ０．９８ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４
＊７Ｈ２Ｏ ３．９２５ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４
＊５Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌを含んでいた。最小基礎培地のｐＨを５Ｎ ＮａＯＨで７．０に調整し、オートクレーブにかけた。接種前に、最小基礎培地に１ｍＭ ＭｇＳＯ４、４μｇ／ｍＬチアミン、０．５％の所与の炭素源（グリセロール（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ））を加え、必要に応じてイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（０．２ｍＭ）を添加した。チアミン、抗生物質、及びＩＰＴＧをろ過滅菌した。すべてのパーセンテージ濃度を、グリセロールの場合はｖ／ｖとして表し、グルコースの場合はｗ／ｖとして表す。
２－デオキシ－ガラクトースを含むＭ９プレートは、組成：１５ｇ／Ｌ寒天（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２．２６ｇ／Ｌ ５×Ｍ９最小塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、４μｇ／ｍＬチアミン、０．２％グリセロール、及び０．２％ ２－デオキシ－Ｄ－ガラクトース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）を有していた。
マッコンキーインジケータープレートは、組成：４０ｇ／Ｌ マッコンキー寒天基礎培地（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））及び最終濃度１％の炭素源を有していた。
［培養］
特に明記されていない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、０．２％グルコースを含むルリア－ベルターニ（ＬＢ）培地で、３７℃で攪拌しながら増殖させた。寒天プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
特に明記されていない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、０．２％グルコースを含むルリア－ベルターニ（ＬＢ）培地で、３７℃で攪拌しながら増殖させた。寒天プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
［化学的コンピテント細胞と形質転換］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ＬＢプレートから０．２％グルコースを含む５ｍＬ ＬＢに入れ、ＯＤ６００が約０．４になるまで３７℃で振とうしながら接種した。１３．０００ｇで２５秒間遠心分離することにより、２ｍＬの培養物を収集した。上清を除去し、細胞ペレットを、６００μＬの冷ＴＢ溶液（１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ２、２５０ｍＭ ＫＣｌ）に再懸濁した。細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、１３．０００ｇで１５秒間ペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの冷ＴＢ溶液に再懸濁した。１００μＬのコンピテント細胞及び１～１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを使用してプラスミドの形質転換を行った。細胞及びＤＮＡを、氷上で２０分間インキュベートした後、４２℃で４５秒間熱ショックを与えた。氷上で２分間インキュベートした後、４００μＬ ＳＯＣ（２０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１８６ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び２０ｍＭグルコース）を添加し、細胞培養物を、３７℃で１時間振とうしながらインキュベートした後、選択プレートにプレーティングした。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ＬＢプレートから０．２％グルコースを含む５ｍＬ ＬＢに入れ、ＯＤ６００が約０．４になるまで３７℃で振とうしながら接種した。１３．０００ｇで２５秒間遠心分離することにより、２ｍＬの培養物を収集した。上清を除去し、細胞ペレットを、６００μＬの冷ＴＢ溶液（１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ２、２５０ｍＭ ＫＣｌ）に再懸濁した。細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、１３．０００ｇで１５秒間ペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの冷ＴＢ溶液に再懸濁した。１００μＬのコンピテント細胞及び１～１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを使用してプラスミドの形質転換を行った。細胞及びＤＮＡを、氷上で２０分間インキュベートした後、４２℃で４５秒間熱ショックを与えた。氷上で２分間インキュベートした後、４００μＬ ＳＯＣ（２０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１８６ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び２０ｍＭグルコース）を添加し、細胞培養物を、３７℃で１時間振とうしながらインキュベートした後、選択プレートにプレーティングした。
供給業者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が推奨する条件で、プラスミドをＴＯＰ１０化学コンピテント細胞に形質転換した。
［ＤＮＡ技術］
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離した。ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、染色体ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。Ｄｒｅａｍ Ｔａｑ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＵホットスタートＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＥＲ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を、供給業者によって推奨されるように使用した。プライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙから提供された。ＰＣＲ断片及びプラスミドを、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって配列決定した。コロニーＰＣＲを、Ｔ１００（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＤｒｅａｍ Ｔａｑ ＰＣＲマスターミックスを使用して行った。
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離した。ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、染色体ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。Ｄｒｅａｍ Ｔａｑ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＵホットスタートＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＥＲ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を、供給業者によって推奨されるように使用した。プライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙから提供された。ＰＣＲ断片及びプラスミドを、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって配列決定した。コロニーＰＣＲを、Ｔ１００（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＤｒｅａｍ Ｔａｑ ＰＣＲマスターミックスを使用して行った。
［プラスミドの構築］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの相同組換えに適した２つのＤＮＡ断片及びＴ１転写ターミネーター配列によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含むプラスミドバックボーンを合成した。例えば、１つのプラスミドバックボーンでは、ｇａｌオペロン（ｇａｌＫでの相同組換えに必要）及びＴ１転写ターミネーター配列（ｐＵＣ５７：：ｇａｌ）を合成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）。ｇａｌオペロンの相同組換えに使用するＤＮＡ配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１５５完全ゲノムＧｅｎＢａｎｋ：ＩＤ：ＣＰ０１４２２５．１の配列における塩基対３．６２８．６２１～３．６２８．７２０及び３．６２７．５７２～３．６２７．６７１をカバーしていた。相同組換えによる挿入は、ｇａｌＫの９４９塩基対及びｇａｌＫ－表現型の欠失をもたらすことになる。同様の方法で、ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）、又は２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの相同組換えに適した２つのＤＮＡ断片とＴ１転写ターミネーター配列によって分離されたその他の適切なベクターに基づくバックボーンを合成することができる。このような標準的な技術、ベクター、及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）で確認することができる。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの相同組換えに適した２つのＤＮＡ断片及びＴ１転写ターミネーター配列によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含むプラスミドバックボーンを合成した。例えば、１つのプラスミドバックボーンでは、ｇａｌオペロン（ｇａｌＫでの相同組換えに必要）及びＴ１転写ターミネーター配列（ｐＵＣ５７：：ｇａｌ）を合成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）。ｇａｌオペロンの相同組換えに使用するＤＮＡ配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１５５完全ゲノムＧｅｎＢａｎｋ：ＩＤ：ＣＰ０１４２２５．１の配列における塩基対３．６２８．６２１～３．６２８．７２０及び３．６２７．５７２～３．６２７．６７１をカバーしていた。相同組換えによる挿入は、ｇａｌＫの９４９塩基対及びｇａｌＫ－表現型の欠失をもたらすことになる。同様の方法で、ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）、又は２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの相同組換えに適した２つのＤＮＡ断片とＴ１転写ターミネーター配列によって分離されたその他の適切なベクターに基づくバックボーンを合成することができる。このような標準的な技術、ベクター、及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）で確認することができる。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１から得られた染色体ＤＮＡを用いて、オリゴＯ２６１及びＯ２６２を使用してプロモーターＰｇｌｐＦを含む３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、オリゴＯ６８及びＯ１１３を使用してＰｌａｃを含む１９５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した（表３）。
パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）に由来するｖａｇ遺伝子のコドン最適化バージョンを含む１．１７９ｂｐのＤＮＡ断片を、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成した（表５）。ｖａｇ遺伝子を、オリゴＫＡＢＹ７４５及びＫＡＢＹ７４６を使用するＰＣＲによって増幅した。
すべてのＰＣＲ断片（プラスミドバックボーン、エレメントを含むプロモーター、及びｖａｇ遺伝子）を精製し、プラスミドバックボーン、プロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃ）、及びｖａｇを含むＤＮＡ断片を構築した。プラスミドを、標準的なＵＳＥＲクローニングによってクローニングした。任意の適切なプラスミドのクローニングは、任意の標準的なＤＮＡクローニング技術を使用して行うことができる。プラスミドをＴＯＰ１０細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン（又は適切な抗生物質）及び０．２％グルコースを含むＬＢプレートで選択した。構築されたプラスミドを精製し、プロモーター配列及びｖａｇ遺伝子の５’末端を、ＤＮＡシークエンシング（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって検証した。このようにして、ｖａｇ遺伝子に連結された目的の任意のプロモーターを含む遺伝子カセットを構築した。
目的のトランスポーター又はグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子のＤＮＡ配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってコドン最適化して合成した。表４に示されているトランスポータータンパク質をコードする目的の遺伝子は、遺伝子の開始コドンＡＴＧ及び停止コドンＴＡＡをカバーする適切なプライマー（表３）を使用するＰＣＲによって増幅した。目的の任意の異種遺伝子を有するドナープラスミドを構築するために、標準的なＵＳＥＲクローニングを使用して、関連するプラスミドバックボーン、プロモーターエレメント、及び目的の遺伝子の精製されたＰＣＲ断片を組み合わせた。適切なプラスミドでのクローニングは、任意の標準的なＤＮＡクローニング技術を使用して行うことができる。クローニング後、ＤＮＡをＴＯＰ１０細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン（又は適用されるバックボーンに応じて５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン）及び０．２％グルコースを含むＬＢプレートで選択した。構築されたプラスミドを精製し、プロモーター配列及び目的の遺伝子の５’末端を、ＤＮＡシーケンシング（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって検証した。
［菌株の構築］
使用する菌株ＭＤＯを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ＤＨ１遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ＤＨ１遺伝子型に加えて、ＭＤＯに次の改変を行った：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモーターの挿入。
使用する菌株ＭＤＯを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ＤＨ１遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ＤＨ１遺伝子型に加えて、ＭＤＯに次の改変を行った：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモーターの挿入。
ｖａｇ遺伝子及びＴ１転写ターミネーター配列に連結されたプロモーターを含む発現カセットの挿入を、Ｈｅｒｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅｒｒｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．，Ｇｌａｓｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ，Ｆ．Ｒ．（２００３）．Ｇｅｎｅ（３１１）．１５３－１６３）に記載のように、本質的にＧｅｎｅ Ｇｏｒｇｉｎｇによって行い、本出願で提示された菌株を構築するために使用されたヘルパー及びドナープラスミドの例を表６に示す。簡単に説明すると、ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを、ＭＤＯに同時形質転換し、０．２％グルコース、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、又はカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレートで選択した。単一コロニーを、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）及び１０μＬの２０％Ｌ－アラビノースを含む１ｍＬのＬＢに接種し、３７℃で７～８時間振とうしながらインキュベートした。次に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子座に組み込むために、細胞をＭ９－ＤＯＧプレートにプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。ＭＭ－ＤＯＧプレート上に形成された単一コロニーを、０．２％グルコースを含むＬＢプレート上に筋を付け直して、３７℃で２４時間インキュベートした。マッコンキー－ガラクトース寒天プレート上で白く見え、アンピシリン及びクロラムフェニコールの両方に感受性のあるコロニーは、ドナー及びヘルパープラスミドを喪失し、ｇａｌＫ遺伝子座への挿入を含むと予想した。ｇａｌＫ部位への挿入を、プライマーＯ４８（配列番号２３）及びＯ４９（配列番号２４）を使用してコロニーＰＣＲによって同定し、挿入されたＤＮＡを、シークエンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検証した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体ＤＮＡの他の遺伝子座への遺伝子カセットの挿入は、異なる選択マーカー遺伝子を使用して同様の方法で行った。
［ディープウェルアッセイ（ＤＷＡ）］
ＤＷＡを、Ｌｖ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ（２０１６）３９：１７３７－１７４７）に元々記載されているように行い、本発明の目的のために最適化した。より具体的には、実施例に開示される菌株を、４日間のプロトコルを使用して２４のディープウェルプレートでスクリーニングした。最初の２４時間の間に、細胞を高密度に増殖させ、次の７２時間で、細胞を、遺伝子発現及び産物形成の誘導を可能にする培地に移した。具体的には、１日目に、硫酸マグネシウム、チアミン、及びグルコースを添加した基礎最小培地を使用して、新鮮な接種材料を調製した。調製した培養物を３４℃、７００ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした後、細胞を、硫酸マグネシウム及びチアミンを添加した新しい基礎最小培地（２ｍｌ）に移し、２０％グルコース溶液（１μｌ）及び１０％ラクトース溶液（０．１ｍｌ）の最初のボーラスを加え、次に炭素源として５０％スクロース溶液を細胞に供給した。新しい培地の接種後、細胞を２８℃、７００ｒｐｍで７２時間振とうした。変性及びその後の遠心分離の後、上清をＨＰＬＣによって分析した。
ＤＷＡを、Ｌｖ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ（２０１６）３９：１７３７－１７４７）に元々記載されているように行い、本発明の目的のために最適化した。より具体的には、実施例に開示される菌株を、４日間のプロトコルを使用して２４のディープウェルプレートでスクリーニングした。最初の２４時間の間に、細胞を高密度に増殖させ、次の７２時間で、細胞を、遺伝子発現及び産物形成の誘導を可能にする培地に移した。具体的には、１日目に、硫酸マグネシウム、チアミン、及びグルコースを添加した基礎最小培地を使用して、新鮮な接種材料を調製した。調製した培養物を３４℃、７００ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした後、細胞を、硫酸マグネシウム及びチアミンを添加した新しい基礎最小培地（２ｍｌ）に移し、２０％グルコース溶液（１μｌ）及び１０％ラクトース溶液（０．１ｍｌ）の最初のボーラスを加え、次に炭素源として５０％スクロース溶液を細胞に供給した。新しい培地の接種後、細胞を２８℃、７００ｒｐｍで７２時間振とうした。変性及びその後の遠心分離の後、上清をＨＰＬＣによって分析した。
全サンプルの分析のために、煮沸によって調製された細胞溶解物を、４，７００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によってペレット化した。上清中のＨＭＯ濃度を、ＨＰＬＣ又はＨＰＡＣ法によって決定した。
［配列アラインメント］
ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のＢＬＡＳＴ ２．１．２（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０）に実装されたヒューリスティックペアワイズ配列アラインメントを行って、本発明で言及されるトランスポータータンパク質配配列における相同性を試験した。すべてのパラメーターは、すべてのＢＬＡＳＴアラインメントでデフォルト値を維持した。
ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のＢＬＡＳＴ ２．１．２（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０）に実装されたヒューリスティックペアワイズ配列アラインメントを行って、本発明で言及されるトランスポータータンパク質配配列における相同性を試験した。すべてのパラメーターは、すべてのＢＬＡＳＴアラインメントでデフォルト値を維持した。
［結果］
［実施例１．Ｖａｇトランスポーターは、ＬＮｎＴに対して高い選択性を有する新規なＬＮＴ－２コアトランスポーターである］
本発明では、本発明者らが、選択された異種ＭＦＳトランスポーターが、参照株、即ち、ＭＰ３６７２を使用して、ＬＮｎＴを宿主細胞から輸送する能力を試験した。この菌株は、産物形成に必要な各異種グリコシルトランスフェラーゼの１つのＰｇｌｐＦ駆動コピーを有する。
［実施例１．Ｖａｇトランスポーターは、ＬＮｎＴに対して高い選択性を有する新規なＬＮＴ－２コアトランスポーターである］
本発明では、本発明者らが、選択された異種ＭＦＳトランスポーターが、参照株、即ち、ＭＰ３６７２を使用して、ＬＮｎＴを宿主細胞から輸送する能力を試験した。この菌株は、産物形成に必要な各異種グリコシルトランスフェラーゼの１つのＰｇｌｐＦ駆動コピーを有する。
選択された異種トランスポーター遺伝子、即ち、ｖａｇ、ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０、ｍａｒｃ、ｂａｄ、ｎｅｃ、ｙａｂＭ、及びｆｒｅｄ（表４）のそれぞれの１つのコピーを、適度な転写レベルを提供することが公知であるＰｌａｃプロモーターの制御下でＭＰ３６７２株のゲノムに個別に組み込んだ。Ｐｌａｃプロモーターのリボソーム結合部位（即ち、翻訳開始部位の１６ｂｐ上流）は、合成された転写産物へのリボソーム結合を強化するように改変され（表５を参照）、このようにして、翻訳レベルでのＰｌａｃ駆動発現を積極的に調節する。
上記の菌株エンジニアリングアプローチ及びＤＷＡでの菌株性能の試験に続いて、本発明者らは、ここで、Ｖａｇを発現するＬＮｎＴ産生細胞のみが、参照株と比較して、産生されたＬＮｎＴの排出及びＬＮｎＴの総産生量の両方で相対的な増加を示すことを報告する。
図１Ａに示されているように、ほとんどのトランスポーター遺伝子（ｍａｒｃ、ｆｒｅｄ、ｂａｄ、ｎｅｃ、ｙａｂＭ、ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０）のＰｌａｃ駆動発現が、有意な効果がないか、又はＬＮｎＴ産生を減少させる（４５％まで）。逆に、ＭＰ３６７２株の遺伝的背景にｖａｇ遺伝子を導入すると、ＬＮｎＴ力価が著しく増加する（図１Ａ）。
７つの試験した推定ＭＳＦトランスポーターのアミノ酸配列のアラインメントにより、Ｖａｇトランスポーターが、本発明で試験した残りの６つのトランスポーターに対して非常に高い配列カバー率（９９～１００％）を有し、配列同一性が６５％～７５％の範囲であることが明らかになった。最高の配列同一性（７５％）は、Ｖａｇの配列及びｙａｂＭ遺伝子によってコードされるＭＦＳトランスポーターの配列についてスコアリングした（表７）。興味深いことに、推定上のＬＮＴの有効な輸送体（ｅｘｐｏｒｔｅｒ）として国際公開第２０１７０４２３８２号パンフレットに記載のＭＦＳトランスポーターＹａｂＭは、最終的な総ＬＮｎＴ力価にもＬＮｎＴ排出にも有意な影響を示さなかった（図１Ａ、図１Ｂ）。従って、Ｖａｇに対する比較的高いタンパク質配列類似性とは対照的に、ＹａｂＭトランスポーターは、ＬＮｎＴ輸送に関して効果がないようであり、これは、対応する宿主細胞培養物の細胞外画分で検出された産物濃度に明確に反映されている（図１Ｂ）。具体的には、細菌培養物の上清画分の分析によって明らかにされたように、細胞外ＬＮｎＴ濃度は、ＭＰ４３６２株（ｙａｂＭ発現細胞）及びＭＰ３６７２株（異種トランスポーターを発現しない参照細胞）よりもＭＰ３９９４株（ｖａｇ発現細胞）の方がはるかに高かった（図１Ｂ）。
まとめると、このデータは、ＶａｇトランスポーターがＬＮｎＴの効率的なトランスポーターであることを示唆している。この結論は、同じプロモーターＰｌａｃの制御下、同じ培養条件下で同じ参照株でゲノム発現された７つのトランスポーター遺伝子のスクリーニング手順の結果と、ＹａｂＭやＭａｒｃ（７５％及び７１％）などのＶａｇに対して比較的高い相同性を有するトランスポータータンパク質が、ＬＮｎＴをまったく輸送しないか、又は輸送する場合も、効率が非常に低いことを明らかにしたトランスポータータンパク質配列の分析との両方から導き出される。
［実施例２．ｖａｇ遺伝子を使用したＬＮｎＴ産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエンジニアリング］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ株を操作して、目的の異種遺伝子を発現させることができる。例えば、ＭＰ３０２０株は、表１の非限定的な例から選択されるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現するＬＮｎＴ産生株である。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ株を操作して、目的の異種遺伝子を発現させることができる。例えば、ＭＰ３０２０株は、表１の非限定的な例から選択されるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現するＬＮｎＴ産生株である。
全サンプルのＨＰＬＣ分析から分かるように、ｖａｇ遺伝子に連結されたプロモーターエレメントＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃを含む発現カセットをＭＰ３０２０株の染色体ＤＮＡに単一コピーで挿入して、ＭＰ４０６４株とＭＰ４０６５株（表２）をそれぞれ作製すると、（ｉ）総ＬＮｎＴ力価が高くなり、（ｉｉ）総ＬＮＴ－２濃度が同様であるか又はわずかに高くなり、且つ（ｉｉｉ）総ｐＬＮｎＨ形成が同様であるか又ははるかに低くなった（図２）。トランスポーター遺伝子の発現レベルが、ＬＮｎＴ産生株の副産物形成に影響を与え：ｖａｇ遺伝子のＰｌａｃ駆動発現（比較的穏やか）が、総ＬＮｎＴ力価に好ましい影響を与え、これに伴ってＬＮＴ－２力価ではなく総ｐＬＮｎＨ力価がわずかに増加したようである。ｖａｇ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動発現（比較的高い）は、参照株よりも高いＬＮｎＴ力価をもたらしたが、この株（ＭＰ４０６４）は、わずかに高い総ＬＮＴ－２力価を示し、総ｐＬＮｎＨ形成を著しく減少させた（図２）。
しかしながら、ＬＮｎＴ生産株へのｖａｇ遺伝子導入の重要な影響は、上清サンプルの分析を見ると、より明らかになる。ＭＰ４０６４株及びＭＰ４０６５株の培養物の上清画分におけるＬＮｎＴ濃度は、ＭＰ３０２０培養物の培地で測定されたものと比較して２倍以上増加している（図２）。トランスポーター発現細胞では著しく高い総ＬＮＴ－２力価は観察されていないが、上清画分中のＬＮＴ－２は、ＭＰ３０２０株よりもＭＰ４０６４株及びＭＰ４０６５株で高いようである。上記のように、ｐＬＮｎＨ形成は、ＭＰ４０６５株でわずかに増加するか、又はＭＰ４０６４株で著しく減少する。興味深いことに、ｐＬＮｎＨは、ＭＰ４０６４株及びＭＰ４０６５株の両方の細胞ペレットのみに見られ、Ｖａｇトランスポーターの発現が、産生されたｐＬＮｎＨの輸送に影響を及ぼさないことを示唆している（図２）。
［実施例３．ｖａｇ遺伝子を使用したＬＮＴ産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエンジニアリング］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ株を操作して、目的の異種遺伝子を発現させることができる。例えば、ＭＰ４４７３株は、表１から選択されるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子と及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現するＬＮＴ産生株である。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ株を操作して、目的の異種遺伝子を発現させることができる。例えば、ＭＰ４４７３株は、表１から選択されるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子と及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現するＬＮＴ産生株である。
全サンプルのＨＰＬＣ分析から分かるように、ｖａｇ遺伝子に連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ）を含む発現カセットをＭＰ４４７３株の染色体ＤＮＡに単一コピーで挿入して、ＭＰ４５４６株を作製すると（表２）、（ｉ）総ＬＮＴ力価が高くなり（参照株よりもほぼ５０％高い総ＬＮＴ濃度）、（ｉｉ）総ＬＮＴ－２濃度が約６倍高くなり、且つ（ｉｉｉ）総ｐＬＮＨ－ＩＩ形成が約２．５倍増加する（図３）。
上記の観察と一致して、上清サンプルの分析により、ＭＰ４５４６株の培養物における上清画分のＬＮＴ濃度が、ＭＰ４４７３の培養物の培地で測定されたものと比較して著しく増加していることが明らかになった（図３）。ｖａｇ発現細胞で測定されたはるかに高い総ＬＮＴ－２力価は、ＭＰ４５４６の培養物の上清画分で検出された５倍高いＬＮＴ－２濃度を伴う。逆に、産生されたｐＬＮＨ－ＩＩは、おそらくＶａｇがｐＬＮＨ－ＩＩに対する基質特異性が低いかまったくないか、又は六糖のような大きな糖を輸送できないため、ＭＰ４５４６株の細胞ペレットのみに存在するようである（図３）。この「能力の欠如」は、単一の発酵で産生される複数の異なるＨＭＯを精製手順の最初の段階でＨＭＯミックスから分離することができるため、ｖａｇ発現細胞によって産生されるｐＬＮＨ－ＩＩの単純化された下流処理が可能になることから、有利な機能のようである。
Claims (13)
- １つ又は複数のヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のタンパク質をコードする組換え核酸、又はアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体を含む、遺伝子改変細胞。
- 前記オリゴ糖が、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ－ＩＶ）、及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、並びに／又はパラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）のリストから選択される、請求項１に記載の遺伝子改変細胞。
- 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記組換え核酸の発現を調節するための調節エレメントを含む組換えＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記組換え核酸の発現を調節するための前記調節エレメントが、ｌａｃプロモーターＰｌａｃ又はｇｌｐプロモーターＰｇｌｐＦなどのプロモーターエレメントである、請求項４に記載の遺伝子改変細胞。
- 配列番号１のタンパク質をコードする核酸配列、又は配列番号１に対して８０％を超える配列同一性を有するその機能的相同体を含む核酸構築物であって、配列番号１のタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、核酸構築物。
- 調節エレメントを含む核酸配列をさらに含む、請求項６に記載の核酸構築物。
- 前記調節エレメントが、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列の発現を調節する、請求項７に記載の核酸構築物。
- 前記組換え核酸の発現を調節するための前記調節エレメントが、ｌａｃプロモーター、Ｐｌａｃ、又はｇｌｐプロモーター、ＰｇｌｐＦなどの発現エレメントである、請求項７又は８に記載の核酸構築物。
- １つ又は複数のオリゴ糖の産生のための方法であって：
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供するステップであって、前記細胞が、配列番号１のタンパク質をコードする組換え核酸、又は配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含む、ステップ；
（ｉｉ）（ｉ）による前記細胞を適切な細胞培養培地で培養して、前記組換え核酸を発現させるステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で産生された１つ又は複数のＨＭＯを収集するステップを含む、方法。 - １つ又は複数のオリゴ糖、好ましくは１つ又は複数のヒト乳オリゴ糖の生産のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項６～９のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用。
- ２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＬＦ、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＴ、ｐＬＮＨ－ＩＩ、及びｐＬＮｎＨからなる群から選択されるＨＭＯの産生のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項６～９のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用。
- ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＴ、ｐＬＮＨ－ＩＩ、及びｐＬＮｎＨからなる群から選択されるＨＭＯの産生のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項６～９のいずれか一項に記載の核酸構築物の使用。
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