CN115003814A

CN115003814A - Hmo产生

Info

Publication number: CN115003814A
Application number: CN202180010751.XA
Authority: CN
Inventors: M·帕帕扎基斯; K·B·坎普曼
Original assignee: Glycom AS
Current assignee: Glycom AS
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2022-09-02
Also published as: US20230072639A1; WO2021148618A9; AU2021211904A1; EP4093878A1; WO2021148611A1; JP2023511523A; WO2021148618A1; EP4093877A1; BR112022014423A2; AU2021209395A1; CN115003812A; WO2021148620A1

Abstract

本发明概念涉及能够产生寡糖(优选HMO)的遗传修饰细胞，其包含编码MFS超家族蛋白质的重组核酸；以及使用所述细胞用于产生寡糖(优选HMO)的方法。

Description

HMO产生

技术领域

本发明涉及在宿主细胞中重组产生生物分子的领域。更具体地，本发明涉及一种使用表达主要易化因子超家族(major facilitator superfamily)(MFS)蛋白质的遗传修饰细胞重组产生人乳寡糖(HMO)的方法。

背景技术

人乳寡糖(HMO)是人乳中第三大固体成分，对酶水解具有高度抗性。因此，很大一部分HMO基本上未被消化和吸收，这使得它们能够通过结肠。在结肠中，HMO可以作为底物，通过选择性刺激特定糖解细菌的生长来塑造肠道生态系统。这种选择性被视为对婴儿和成人都有益，因为双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株被认为对肠道健康有积极影响(Chichlowski M.等人,(2012)J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.5:251-258；Elison E.等人,(2016)Brit J.Nurt,116:1356-1368)。

除了益生元特性外，HMO还与其他积极作用有关，这拓展了其应用领域(Kunz C.等人,(2014)Food Oligosaccharides:Production,Analysis and Bioactivity,第1版,p 5-20,编辑:Moreno J.和Luz Sanz M.,John Wiley&Sons,Ltd)。

HMO明显的健康益处使其被批准用于食品，如婴儿配方奶粉和食品，以及消费性保健产品。生物技术产生HMO是一种有价值的成本效益高的大规模HMO制造方式。它依赖于构建的基因工程细菌，以表达合成所需寡糖所需的糖基转移酶，并利用细菌固有的核苷酸糖库作为HMO前体。HMO生物技术产生的最新发展使得克服细菌表达系统的某些固有限制成为可能。例如，可以对产生HMO的细菌细胞进行遗传修饰，以增加细菌中有限的细胞内核苷酸糖库(WO2012112777)，提高参与HMO产生的酶的活性(WO2016040531)，或促进合成HMO分泌到细胞外培养基中(WO2010142305、WO2017042382)。此外，重组细胞中目标基因的表达可通过使用特定启动子或其他基因表达调控因子来调控，例如最近在WO2019123324中描述的。

WO2010142305和WO2017042382中描述的方法的优点在于，它允许通过高水平的重组基因表达，例如使用WO2012112777、WO2016040531或WO2019123324的方法，减少对产生细胞造成的代谢负担。这种方法在重组HMO产生细胞中引起了越来越多的关注，例如，最近已经描述了发酵程序以及一些新的糖转运蛋白基因，这些基因编码的蛋白质可以促进重组产生的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的流出，2’-岩藻糖基乳糖是人乳中含量最丰富的HMO(WO2018077892、US201900323053、US201900323052)。然而，目前，由于定义糖转运蛋白底物特异性的结构/因子仍然没有得到很好的研究，并且高度不可预测，没有一种算法能够在多个蛋白质数据库(例如UniProt)中的具有预测的转运蛋白功能的众多细菌蛋白质中为不同重组产生的HMO结构的流出准确确定正确的转运蛋白。

发明内容

用于不同重组产生的HMO的高效糖流出转运蛋白，以及表达所述蛋白的重组细胞的开发有利于大规模工业HMO制造。

本发明提供能够产生人乳寡糖(HMO)的重组细胞，其中所述细胞表达编码假定的MFS(主要易化因子超家族)转运蛋白的异源基因，该蛋白源于细菌成团泛菌(Pantoeavagans)。更具体地，本发明涉及经优化以产生寡糖(特别是HMO)的遗传修饰细胞，其包含编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的蛋白质的重组核酸(图4)。本文中标识为SEQ ID NO:1的氨基酸序列是与具有GenBank登录号登录号WP_048785139.1的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_048785139.1)。具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的MFS转运蛋白在本文中可互换地标识为“Vag蛋白质”或“Vag转运蛋白”或“Vag”；本文将编码Vag蛋白的核酸序列标识为“vag编码核酸/DNA”或“vag基因”或“vag”。

本发明表明，使用表达Vag蛋白的HMO产生重组细胞可在HMO的发酵和纯化方面显著改善HMO的产生工艺。本文所公开的用于HMO产生的重组细胞和方法提供产生的HMO的较高总产量、较低的副产物形成或副产物与产物的比率、较低的每次发酵的生物质形成以及在发酵液的下游处理期间促进HMO的回收。

令人惊讶的是，发现在不同HMO产生细胞中编码Vag的DNA序列的表达与特定HMO在细胞外培养基中的积累和其他HMO在产生细胞内部的积累以及HMO总产量的增加有关。令人惊讶的是，发现所产生的HMO的流出增加是由单糖的三或四个单元组成的HMO的特征，即HMO是三糖和四糖，例如2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)、乳-N-三糖2(LNT-2)、乳-N-新四糖(LNnT)和乳-N-四糖(LNT)，但不适用于较大的寡糖结构，如积累在产生细胞内的五糖和六糖。令人惊讶的是，还发现表达Vag的相应HMO产生细胞的HMO，乳-N-新四糖(LNnT)和乳-N-四糖(LNT)的总产量也增加，而相应地，这些细胞中的副产物形成，例如对乳-N-新六糖(pLNnH)和对乳-N-六糖II(pLNH-II)通常减少，所述副产物寡糖通常积聚在HMO产生系统的细胞内部。此外，出乎意料的是，在HMO产生细胞中表达Vag蛋白导致高细胞密度发酵期间生物质形成减少，并导致更健康的细胞培养，例如，发酵结束时死亡细胞数量的减少反映了这一点，这使得制造过程更有效，因为每个生物质单位产生更多的产物。

因此，本发明的第一方面涉及能够产生一种或多种HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包括编码SEQ ID NO:1的蛋白质或其功能性同源物的重组核酸，功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性。

本发明的第二方面涉及包含编码MFS转运蛋白的核酸序列的核酸构建体，其中编码该蛋白质的核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性，比如至少80％，比如至少85％，比如至少95％，比如至少99％，以及包含核酸构建体的遗传修饰细胞，其为大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一个方面中，该核酸构建体包含编码MFS转运蛋白的核酸序列，其中该核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性。

本发明的第三方面涉及产生一种或多种寡糖的方法，该方法包括以下步骤：

(i)提供能够产生HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白质或其功能性同源物的重组核酸，该功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性；

(ii)在合适的细胞培养基中培养根据(i)的细胞，以表达所述重组核酸；

(iii)收获步骤(ii)中产生的一种或多种HMO。

本发明还涉及包含编码主要易化因子超家族(MFS)蛋白质的异源核酸序列的遗传修饰细胞或核酸构建体用于产生一种或多种人乳寡糖(HMO)的用途，所述核酸序列与SEQID NO:2具有至少70％序列同一性。

如上所述，在培养能够产生一种或多种HMO并包含编码Vag转运蛋白的核酸的遗传修饰细胞期间，令人惊讶地发现，相应的一种或多种HMO以高产量产生，而副产物和生物质的形成减少。这有助于在下游工艺中回收这些HMO，比如整体回收和纯化程序包含更少的步骤，程序通常简化，纯化的总时间缩短，因此产物回收更省力更经济高效。

提高产物产量和促进产物回收的这些效果使本发明优于现有技术的公开内容。

下面详细描述并通过非限制性工作实例说明本发明的其他方面和有利特征。

附图说明

图1显示(A)相应地表达GlcNacT和Gal4T基因以及异源转运蛋白基因yberC0001_9420、bad、fred、marc、vag、nec或yabM的七个菌株在总样品中相对LNnT浓度的百分比(％)。菌株MP3672表达糖基转移酶基因且不表达转运蛋白基因；(B)表达vag或yabM的细胞的上清液中相对LNnT浓度的百分比(％)。

图2显示菌株MP3020、MP4065和MP4064在总样品、上清液和沉淀物样品中相对LNnT和副产物浓度的百分比(％)。虽然这三种菌株均显示出所需糖基转移酶基因的最佳表达，但MP4065和MP4064分别在Plac或PglpF元件的控制下表达异源转运蛋白基因vag。

图3显示菌株MP4473和MP4546在总样品、上清液和沉淀物样品中相对LNT和副产物浓度的百分比(％)。虽然这两种菌株都显示出所需糖基转移酶基因的最佳表达，但只有MP4546在PglpF元件的控制下表达异源转运蛋白基因vag。

图4显示SEQ ID NO:1。

具体实施方式

在下文中，将进一步详细描述本发明的实施方式。除非另有明确说明，否则特征的每个具体变化都可以应用于本发明的其他实施方式。

通常，除非明确定义或另有说明，否则本文中使用的所有术语应根据其在技术领域中的普通含义进行解释，并适用于本发明的所有方面和实施方式。除非另有明确说明，否则对“一个/一种/该”[细胞、序列、基因、转运蛋白、步骤等]的所有引用应公开解释为指代所述细胞、序列、基因、转运蛋白、步骤等的至少一个实例。除非明确说明，否则本文所公开的任何方法的步骤不必按照所公开的确切顺序执行。

本发明总体上涉及用于高效产生寡糖的遗传修饰细胞以及所述遗传修饰细胞在产生寡糖的方法中的用途。具体地，本发明涉及能够合成寡糖、优选异源寡糖、尤其是人乳寡糖(HMO)的遗传修饰细胞。因此，对本发明的细胞进行修饰，以表达细胞合成一种或多种HMO(使细胞能够合成一种或多种HMO)所必需的一组重组核酸，例如编码具有下述糖基转移酶活性的一种或多种酶的基因。本发明的寡糖产生重组细胞进一步修饰为包含异源重组核酸序列，优选DNA序列，编码源自成团泛菌(Pantoea vagans)的MFS(主要易化因子超家族)蛋白质。更具体地，本发明涉及经优化用于产生一种或多种特定寡糖，特别是一种或多种特定HMO的遗传修饰细胞，其包含编码与SEQ ID NO:1(图4)的氨基酸序列具有至少80％序列相似性，优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％的序列相似性的蛋白质的重组核酸。本文中标识为SEQ ID NO:1的氨基酸序列是与具有GenBank登录号:WP_048785139.1的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_048785139.1)。

因此，本发明的第一方面涉及一种能够产生一种或多种HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白质或其功能性同源物的重组核酸，该功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性。

具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的MFS转运蛋白在本文中可互换地标识为“Vag蛋白质”或“Vag转运蛋白”或“Vag”；编码vag蛋白的核酸序列在这里标识为“vag编码核酸/DNA”或“vag基因”或“vag”。

术语“主要易化因子超家族(MFS)”是指次级活性转运蛋白类的一个大而异常多样的家族，负责运输一系列不同的底物，包括糖、药物、疏水分子、肽、有机离子等。糖转运蛋白的特异性高度不可预测，对寡糖等具有特异性的新型转运蛋白的鉴定需要无负担的实验室实验(有关更多详细信息，请参阅Reddy V.S.等人,(2012),FEBS J.279(11):2022-2035的综述)。术语“MFS转运蛋白”在本上下文中是指促进寡糖(优选HMO)通过细胞膜运输的蛋白质，优选由宿主细胞合成的HMO/寡糖从细胞溶胶运输到细胞外部的蛋白质，优选包含三个或四个糖单元的HMO/寡糖，特别是2’-FL、3-FL、6’-SL、DFL、LNT、LNT-2和LNnT。此外，或者，MFS转运蛋白也可促进不被视为根据本发明的HMO或寡糖的分子的流出，例如乳糖、葡萄糖、细胞代谢物或毒素。

在两个或多个核酸或氨基酸序列的上下文中，术语“[某一]序列同一性％”是指当在比较窗口或指定的核酸或氨基酸序列上以实现最大对应进行比较和对齐时，两个或多个序列在给定百分比内具有相同的核苷酸或氨基酸残基(即序列具有至少90％的同一性)。核酸或氨基酸序列的同一性百分比可以使用具有默认参数的BLAST 2.0序列比对算法，或通过手动对齐和目视检查来测量(例如，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。此定义也适用于测试序列的补码和具有缺失和/或添加的序列，以及具有替换的序列。适用于确定同一性百分比、序列相似性和对齐的算法实例是BLAST 2.2.20算法，该算法在Altschul等人,Nucl.Acids Res 25,3389(1997)中描述。BLAST2.2.20用于确定本发明核酸和蛋白质的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公开获取(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。序列比对算法的实例是CLUSTAL Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)、EMBOSS Needle(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)、MAFFT(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)或MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)。

在本发明的上下文中，术语“寡糖”是指含有多个单糖单元的糖聚合物。在一些实施方式中，优选寡糖是由三个或四个单糖单元(即三糖或四糖)组成的糖聚合物。本发明的优选寡糖为人乳寡糖(HMO)。

本上下文中的术语“人乳寡糖”或“HMO”是指人乳中发现的复杂碳水化合物(参考，请参阅Urashima等人:Milk Oligosaccharides.Nova Science Publisher(2011)；或Chen,Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.72,113(2015))。HMO具有核心结构，其在还原端包含乳糖单元，该乳糖单元可由一个或多个β-N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个β-乳-N-二糖基单元拉长，并且该核心结构可由α-L-岩藻吡喃基和/或a-N-乙酰基-神经氨酸基(唾液酸)部分取代。在这方面，非酸性(或中性)HMO不含唾液酸残基，并且酸性HMO在其结构中具有至少一个唾液酸残基。非酸性(或中性)HMO可以是岩藻糖基化或非岩藻糖基化。此类中性非岩藻糖基化HMO的实例包括乳-N-三糖2(LNT-2)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-新六糖(LNnH)、对-乳-N-新六糖(pLNnH)、对-乳-N-六糖(pLNH)和乳-N-六糖(LNH)。中性岩藻糖基化HMO的实例包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)、乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH-I)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(DFL)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III)、乳-N-二岩藻六糖III(LNDFH-III)、岩藻糖基-乳-N-六糖II(FLNH-II)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH-II)、岩藻糖基-乳-N-六糖I(FLNH-I)、岩藻糖基-对-乳-N-六糖I(FpLNH-I)、岩藻糖基-对-乳-N-新六糖II(F-pLNnH II)和岩藻糖基-乳-N-新六糖(FLNnH)。酸性HMO的实例包括3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)、3-岩藻糖基-3’-唾液酸基乳糖(FSL)、3’-O-唾液酸基乳-N-四糖a(LST a)、岩藻糖基-LST a(FLST a)、6’-O-唾液酸基乳-N-四糖b(LST b)、岩藻糖基-LST b(FLST b)、6’-O-唾液酸基乳-N-新四糖(LST c)、岩藻糖基-LST c(FLST c)、3’-O-唾液酸基乳-N-新四糖(LST d)、岩藻糖基-LST d(FLST d)、唾液酸-乳-N-六糖(SLNH)、唾液酸-乳-N-新六糖I(SLNH-I)、唾液酸-乳-N-新六糖II(SLNH-II)和二唾液酸-乳-N-四糖(DSLNT)。在本发明的背景下，乳糖不被视为HMO。

在本发明的一些实施方式中，三-HMO和四-HMO可以是优选的，例如三糖2’-FL、3-FL、6’-SL、LNT-2和四糖DFL、LNT、LNnT。

为了能够合成一种或多种HMO，本发明的重组细胞包含至少一种重组核酸，其编码具有糖基转移酶活性的功能酶。半乳糖基转移酶基因可以(通过染色体整合)整合到宿主细胞的基因组中，或者，它可以包含在质粒DNA中并由质粒携带表达。如果产生HMO需要两种或多种糖基转移酶，例如LNT或LNnT，则编码具有糖基转移酶活性的不同酶的两个或多个重组核酸可整合在基因组中和/或从质粒中表达，例如，用于产生LNnT的β-1,3-N-乙酰葡糖氨基转移酶(编码第一糖基转移酶的第一重组核酸)与β-1,4-半乳糖基转移酶(编码第二糖基转移酶的第二重组核酸)组合，其中，第一和第二重组核酸可以彼此独立地进行染色体整合或克隆到质粒上。在一个优选实施方式中，第一和第二重组核酸均整合到产生细胞的染色体中；在另一实施方式中，第一和第二糖基转移酶中的至少一个由质粒携带。具有糖基转移酶活性的蛋白质/酶(糖基转移酶)可在不同实施方式中从具有α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶、α-1,3/4-岩藻糖基转移酶、α-1,4-岩藻糖基转移酶、α-2,3-唾液酸基转移酶、α-2,6-唾液酸基转移酶、β-1,3-N-乙酰葡糖氨基转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖氨基转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶和β-1,4-半乳糖基转移酶活性的酶中选择。例如，LNnT的产生需要修饰的细胞表达有活性的β-1,3-N-乙酰葡糖氨基转移酶和有活性的β-1,4-半乳糖基转移酶。具有糖基转移酶活性的可以由产生细胞包含的重组基因编码的蛋白质的一些非限制性实施方式可以选自表1的非限制性实例。

表1

本发明的一个方面是提供一种核酸构建体，其包含编码能够进行糖转运的蛋白质的异源核酸序列，该蛋白质是如SEQ ID NO:1所示的主要易化因子超家族(MFS)蛋白质或其功能性同源物，该功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，其中，编码MFS蛋白质的核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％的序列同一性。

术语“异源核酸序列”，“重组基因/核酸/DNA编码”或“编码核酸序列”是指人工核酸序列(即使用制备核酸序列的标准实验室方法在体外产生的核酸序列)，其包括一组连续序列，非重叠三联体(密码子)，当置于适当的控制序列(即启动子)的控制下时，转录成mRNA并翻译成多肽。编码序列的边界通常由位于mRNA 5'端开放阅读框上游的核糖体结合位点、翻译起始密码子(AUG、GUG或UUG)和翻译终止密码子(UAA、UGA或UAG)决定。编码序列可以包括但不限于基因组DNA、cDNA、合成和重组核酸序列。术语“核酸”包括RNA、DNA和cDNA分子。众所周知，由于遗传密码的简并性，可以产生编码给定蛋白质的多个核苷酸序列。术语核酸可与术语“多核苷酸”互换使用。“寡核苷酸”是一种短链核酸分子。“引物”是一种寡核苷酸，无论是在纯化的限制性内切酶消化物中自然产生的还是合成产生的，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时，其能够作为合成的起始点，(即，在核苷酸和诱导剂(如DNA聚合酶)存在下，在适当的温度和pH下)。引物最好是单链的，以获得最大的扩增效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产品之前，首先对引物进行处理以分离其链。优选地，引物是脱氧核糖核酸。引物必须足够长，以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。

本发明的重组核酸序列可以是编码DNA序列，例如基因，或非编码DNA序列，例如调控DNA，例如启动子序列。本发明的一个方面涉及提供一种重组细胞，其包含编码一种或多种HMO产生所需酶的重组DNA序列和编码Vag转运蛋白的DNA序列。因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种核酸构建体，其包括编码核酸序列，即目标基因的重组DNA序列，例如糖基转移酶基因或vag基因，和非编码DNA序列，例如启动子DNA序列，例如衍生自lac操纵子或glp操纵子的启动子的重组启动子序列，或衍生自另一基因组启动子DNA序列的启动子序列，或合成启动子序列，其中编码序列和启动子序列可操作地连接。术语“可操作连接”是指两个或多个核酸(例如DNA)片段之间的功能关系。通常，它是指转录调控序列与转录序列的功能关系。例如，如果启动子序列刺激或调控适当宿主细胞或其他表达系统中编码序列的转录，则启动子序列可操作地连接到编码序列。通常，可操作地连接到转录序列的启动子转录调控序列在物理上与转录序列相邻，即它们是顺式作用的。

在一个实施方式中，本发明的核酸构建体可以是载体DNA的一部分，在另一个实施方式中，该构建体是整合在宿主细胞基因组中的表达盒/盒。因此，术语“核酸构建体”是指人工构建的核酸片段，特别是DNA片段，其旨在“移植”到靶细胞(例如细菌细胞)中，以修饰宿主基因的表达或表达可包括在构建体中的基因/编码DNA序列。在本发明的背景下，核酸构建体含有包含两个或多个重组DNA序列的重组DNA序列：基本上，非编码DNA序列包括启动子DNA序列和编码目标蛋白质的编码DNA序列，例如Vag蛋白质、糖基转移酶或可用于在宿主细胞中产生HMO的另一种蛋白质。优选地，该构建体包含调控该构建体的编码DNA的转录或翻译的进一步非编码DNA序列，例如促进核糖体结合到转录物的DNA序列、稳定转录物的前导DNA序列或转录终止序列。

构建体(即表达盒)中包含的目标重组基因可通过常规方法整合到细菌基因组中，例如通过使用包含与染色体上特定位点同源的侧翼序列的线性盒，如所描述的attTn7位点(Waddell C.S.和Craig N.L.,(1988)Feb；2(2):137-49.)；核酸序列的基因组整合方法，其中重组由噬菌体λ的Red重组酶功能或Rac原噬菌体的RecE/RecT重组酶功能介导(Murphy,JBacteriol.(1998)；180(8):2063-7；Zhang等,Nature Genetics(1998)20:123-128Muyrers等,EMBO Rep.(2000)1(3):239-243)；基于Red/ET重组的方法(Wenzel等人,Chem Biol.(2005),12(3):349-56；Vetcher等人,Appl Environ Microbiol.(2005)；71(4):1829-35)；或阳性克隆，即携带表达盒的克隆，可以例如通过标志物基因或基因功能的丧失或获得来选择。

根据本发明，包含目标基因的表达盒的单个拷贝足以确保所需HMO的产生并实现所需效果。因此，在一些优选实施方式中，本发明涉及重组HMO产生细胞，其包含整合在细胞基因组DNA中的目标基因的一个、两个或三个拷贝。在一些实施方式中，优选基因的单拷贝。

在一个优选实施方式中，本发明核酸构建体的重组编码核酸序列相对于启动子是异源的，这意味着在起源物种基因组中的等效天然编码序列中，在另一启动子序列(即不是构建体的启动子序列)的控制下转录。然而，就宿主细胞而言，编码DNA可以是异源的(即来源于另一生物物种或属)，例如编码在大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细胞中表达的Vag蛋白的DNA序列，或同源的(即来源于宿主细胞)，例如结肠酸操纵子的基因、GMAB基因。

术语“调控元件”或“启动子”或“启动子区域”或“启动子元件”是在转录启动期间被DNA依赖性RNA聚合酶识别和结合的核酸序列。启动子以及其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)是表达给定基因或基因的组(即操纵子)所必需的。一般来说，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、转录终止子和增强子或激活子序列。“转录起始位点”是指第一个被转录的核苷酸，被指定为+1。起始位点下游的核苷酸编号为+2、+3、+4等，5'相反(上游)方向的核苷酸编号为-1、-2、-3等。构建体的启动子DNA序列可以来自所选物种基因组的任何基因的启动子区域，优选大肠杆菌基因组DNA的启动子区域。因此，任何可以结合到RNA聚合酶并启动转录的启动子DNA序列都适合实施本发明。原则上，任何启动子DNA序列都可用于控制构建体的目标重组基因的转录，不同或相同的启动子序列可用于驱动整合在宿主细胞基因组或表达载体DNA中的不同目标基因的转录。为了获得包含在构建体中的重组基因的最佳表达，该构建体可包括进一步的调控序列，例如前导DNA序列，例如衍生自大肠杆菌的glp基因的5’-非翻译区(5'UTR)的DNA序列，一种用于核糖体结合的序列。WO2019123324(并入本文以供参考)中描述了后面序列的实例，并在本文的非限制性工作实例中进行了说明。

在一些优选实施方式中，用于调控包括在本发明构建体中的重组基因的表达的调控元件是glpFKX操纵子启动子PglpF，在其他优选实施方式中，启动子是lac操纵子启动子Plac。

在另一方面，用于调控包括在本发明构建体中的重组基因的表达的调控元件是mglBAC；半乳糖/甲基半乳糖苷转运蛋白启动子PmglB或其变体，例如但不限于SEQ ID NO:27的PmglB_70UTR，或SEQ ID NO:28的PmglB_70UTR_SD4。

在另一方面，用于调控包括在本发明构建体中的重组基因的表达的调控元件是gatYZA-BCD；塔格糖-1,6-bisP醛缩酶启动子PgatY或其变体，例如但不限于SEQ ID NO:29的PgatY_U70UTR。

存在于本发明的遗传修饰细胞和/或核酸构建体中的当前优选调控元件选自：PgatY_70UTR、PglpF、PglpF_SD1、PglpF_SD10、PglpF_SD2、PglpF_SD3、PglpF_SD4、PglpF_SD5、PglpF_SD6、PglpF_SD7、PglpF_SD8、PglpF_SD9、Plac_16UTR、Plac、PmglB_70UTR和PmglB_70UTR_SD4。

存在于本发明的遗传修饰细胞和/或核酸构建体中的特别优选调控元件选自PglpF和Plac。

然而，任何能够转录和/或调控编码一个或多个蛋白质(或一个或多个调控核酸)的一个或多个重组核酸的转录水平并允许实现根据本发明的预期效果的启动子适用于实施本发明，所述蛋白质(或一个或多个调控核酸)对于在宿主细胞中实现一种或多种HMO的最佳生物合成产物水平是必要的或有益的，例如葡萄糖基转移酶、涉及HMO或HMO前体的跨膜运输的蛋白质、基因表达调控蛋白质等。

优选地，在宿主细胞中表达包含与HMO生物合成产生相关的基因、启动子DNA序列和其他调控序列，例如核糖体结合位点序列(例如Shine-Dalgarno序列)的本发明构建体能够在包含宿主细胞悬浮液的1升发酵培养基中以至少0.03g/OD(光密度)的水平，例如，在约0.05g/l/OD、约0.1g/l/OD或更高的水平产生HMO。就本发明而言，后一水平的HMO产生被视为“充分”或“最优”，并且能够产生该水平的所需HMO的宿主细胞被视为“合适的宿主细胞”，即，可以进一步修饰该细胞以表达HMO转运蛋白，例如Vag，以实现本文所述的对HMO产生有利的至少一种效果。

本发明的遗传修饰细胞和/或核酸构建体包含核酸序列，例如编码假定MFS(主要易化因子超家族)转运蛋白的异源基因。

本发明中特别感兴趣的MFS转运蛋白是Vag蛋白。因此，本发明的核酸构建体包含与基因vag，SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的核酸序列。

包含在遗传修饰细胞或核酸构建体中的核酸序列编码SEQ ID NO:1的蛋白质或其功能性同源物，该功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性。

可通过诱变获得SEQ ID NO:1蛋白质的功能性同源物。与SEQ ID NO:1氨基酸序列的功能性相比，功能性同源物应具有至少50％，例如60％、70％、80％、90％或100％的剩余功能性。与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的功能性相比，功能性同源物可以具有更高的功能性。SEQ ID NO:1的功能性同源物应能够增强根据本发明的遗传修饰细胞的HMO产生。

遗传修饰细胞(宿主细胞或重组细胞)可以是例如细菌或酵母细胞。在一个优选实施方式中，遗传修饰细胞是细菌。关于细菌宿主细胞，原则上没有限制；它们可以是真细菌(革兰氏阳性或革兰氏阴性)或古细菌，只要它们允许插入目标基因的基因操作，并且可以在制造规模上培养。优选地，宿主细胞具有允许高细胞密度培养的特性。适于重组工业产生根据本发明的HMO的细菌宿主细胞的非限制性实例可以是草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)(成团泛菌(Pantoea agglomerans))、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)、胡萝卜软腐病果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)或野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。也可以使用芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、嗜热芽孢杆菌(Bacillusthermophilus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。类似地，可以使用本发明的方法修饰乳杆菌(Lactobacillus)属和乳球菌(Lactococcus)属的细菌，包括但不限于嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、唾液酸基乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)和费氏丙酸杆菌(Proprionibacterium freudenreichii)也是本文所述发明的合适细菌种类。作为本发明的一部分，还包括如本文所述修饰的菌株，其来自肠球菌(Enterococcus)属(例如，屎肠球菌(Enterococcus faecium)和嗜热肠球菌(Enterococcus thermophiles))、双歧杆菌(Bifidobacterium)属(例如，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)和两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum))、芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus spp.)、小单孢菌(Micromomospora spp.)、微球菌(Micrococcusspp.)、红球菌(Rhodococcus spp.)和假单胞菌(Pseudomonas)属(例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))。包含本文所述特征的细菌在乳糖下培养，并从细菌本身或细菌培养上清液中提取由细胞产生的寡糖，例如HMO。在一个优选实施方式中，本发明的遗传修饰细胞是大肠杆菌细胞。

在另一优选实施方式中，所述宿主细胞是酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluveromyces marxianus)等。

本发明的重组细胞产生的HMO可使用本领域可用的适当程序(例如，如WO2015188834、WO2017182965或WO2017152918中所述)进行纯化。本发明的遗传修饰细胞可以使用本领域的标准方法提供，例如Sambrook等人、Wilson&Walker、Maniatise等人和Ausubel等人的手册中所述的方法。

适合HMO产生的宿主细胞，例如大肠杆菌，可包含内源性β-半乳糖苷酶基因或外源性β-半乳糖苷酶基因，例如大肠杆菌包含内源性lacZ基因(例如GenBank登录号V00296(GI:41901))。就本发明而言，对HMO产生细胞进行遗传操作以包含任何β-半乳糖苷酶基因或包含该基因的失活变体。该基因可以通过从细菌基因组中完全或部分缺失相应的核酸序列而失活，或者该基因序列以其转录的方式突变，或者，如果转录，则转录本不翻译，或者如果翻译为蛋白质(即β-半乳糖苷酶)，则该蛋白质不具有相应的酶活性。通过这种方式，HMO产生细胞积累了增加的细胞内乳糖库，这有利于HMO的产生。

在一些实施方式中，产生的细胞包含缺陷的唾液酸分解代谢途径。“唾液酸分解代谢途径”是指一系列通常由酶控制和催化的导致唾液酸降解的反应。本文所述的实例性唾液酸分解代谢途径为大肠杆菌途径。在该途径中，唾液酸(Neu5Ac；N-乙酰神经氨酸)由NanA(N-乙酰神经氨酸裂解酶)和NanK(N-乙酰甘露糖胺激酶)和NanE(N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶)降解，所有酶均由nanATEK-yhcH操纵子编码，并由NanR抑制(http://ecocyc.org/ECOLI)。通过在内源性nanA(N-乙酰神经氨酸裂解酶)(例如GenBank登录号D00067.1(GL216588))和/或nanK(N-乙酰甘露糖胺激酶)基因(例如GenBank登录号(氨基酸)BAE77265.1(GL85676015))和/或nanE(N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶，GI:947745，并入本文以供参考)中引入突变，在大肠杆菌宿主中呈现缺陷唾液酸分解代谢途径。任选地，nanT(N-乙酰神经氨酸转运蛋白)基因也失活或突变。唾液酸代谢的其他中间产物包括：(ManNAc-6-P)N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸；(GlcNAc-6-P)N-乙酰葡糖氨基-6-磷酸；(GlcN-6-P)葡糖氨基-6-磷酸和(Fruc-6-P)果糖-6-磷酸。在一些优选实施方式中，nanA被突变。在其他优选实施方式中，nanA和nanK被突变，而nanE保持功能。在另一优选实施方式中，nanA和nanE被突变，而nanK未被突变、失活或缺失。突变是编码nanA、nanK、nanE和/或nanT基因产物的核酸序列中的一个或多个变化。例如，突变可能是核酸序列中的1、2、至多5、至多10、至多25、至多50或至多100个突变。例如，nanA、nanK、nanE和/或nanT基因通过无效突变被突变。本文所述的无效突变包括氨基酸替换、添加、缺失或插入，其要么导致酶功能丧失(即活性降低或无活性)要么导致酶丧失(即无基因产物)。“缺失”是指完全或部分缺失编码区，从而不产生(功能性)基因产物。失活是指编码序列已被改变，从而产生的基因产物在功能上不活跃，或编码的基因产物活性低于100％，例如天然、自然发生或内源性基因产物活性的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％。“未突变”基因或蛋白质与天然、自然发生或内源性编码序列或与相应的编码氨基酸序列没有1、2、至多5、至多10、至多20、至多50、至多100、至多200或至多500或更多密码子的差异。

此外，宿主细胞(例如大肠杆菌)还包含唾液酸合成能力。例如，该细菌通过提供外源UDP-GlcNAc 2-差向异构酶(例如空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的neuC(GenBankAAK91727.1；GL15193223)或等效物(例如大肠杆菌S88的neuC(GenBank YP_002392936.1；GI:218560023)、Neu5Ac合酶(例如空肠弯曲菌(C.jejuni)的neuB(GenBank AAK91726.1；GI:15193222)或等效物(例如柠檬黄杆菌(Flavobacterium limnosediminis)唾液酸合酶，GenBank GL559220424)和/或CMP-Neu5Ac合酶(例如空肠弯曲菌(C.jejuni)的neuA(GenBank AAK91728.1；GI:15193224)或等效物(例如巴西弧菌(Vibrio brasiliensis)CMP唾液酸合酶，GenBank GI:493937153)来包含唾液酸合成能力。

本领域已知在工程细菌和酵母中产生含中性N-乙酰氨基葡萄糖的HMO(参见例如Gebus C等人,(2012)Carbohydrate Research 363 83-90；US10,519,475)。

用于产生含N-乙酰葡糖氨基的HMO，例如乳-N-三糖2(LNT-2)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V)、乳-N-二岩藻六糖I(LDFH-I)、乳-N-二岩藻六糖II(LDFH-II)、和乳-N-新二岩藻六糖II(LNDFH-III)，如上文所述，该细菌包含功能性lacY和功能失调的lacZ基因，并经工程处理以包含外源性UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-乙酰葡糖氨基转移酶基因或其功能性变体或片段。这种外源性UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-乙酰葡糖氨基转移酶基因(GlcNAcT)可以从多种来源中的任何一种获得(见表1)，例如，从脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)(Genbank蛋白质登录号AAF42258.1)或淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)(Genbank蛋白质登录号ACF31229.1)中描述的lgtA基因。任选地，额外的外源性糖基转移酶基因可在包含外源性UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-乙酰葡糖氨基转移酶的细菌中共表达。例如，β-1,4-半乳糖基转移酶基因(Gal4T)与UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶基因共表达。这种外源性β-1,4-半乳糖基转移酶基因可以从多种来源中的任何一种获得，例如，所描述的来自于脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的lgtB基因(Genbank蛋白质登录号AAF42257.1)或来自幽门螺杆菌(H.pylori)的HP0826/galT基因(Genbank蛋白质登录号NP_207619.1)。任选地，在包含外源性UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-乙酰葡糖氨基转移酶基因的细菌中共表达的额外外源性糖基转移酶基因是β-1,3-半乳糖基转移酶(Gal3T)基因，例如，所描述的来自大肠杆菌055:H7的wbgO基因(Genbank蛋白质登录号WP_000582563.1)或选自幽门螺杆菌(H.pylori)jhp0563基因(Genbank蛋白质登录号AEZ55696.1)、或来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)Ib OI2型的cpslBJ基因Genbank蛋白质登录号AB050723.1)。上述任何酶的功能变体和片段也包含在本发明中。

N-乙酰葡糖氨基转移酶基因和/或半乳糖基转移酶基因也可操作地连接到Pglp，并从相应的基因组整合盒表达。在一个实施方式中，基因组整合的基因是编码半乳糖基转移酶的基因，例如编码幽门螺杆菌H.pylori GalT酶的HP0826基因(Genbank蛋白质登录号NP_207619.1)；在另一个实施方式中，基因组整合的基因是编码β-1,3-N-乙酰葡糖氨基转移酶的基因，例如来自脑膜炎奈瑟菌的lgtA基因(Genbank蛋白质登录号AAF42258.1)。在这些实施方式中，第二个基因，即编码β-1,3-N-乙酰葡糖氨基转移酶或半乳糖基转移酶的基因，相应地，可以从基因组整合盒或质粒载体盒表达。第二个基因可选择性地在glp启动子的控制下或在适用于表达系统的任何其他启动子(例如Plac)的控制下表达。

除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人(1994)《微生物学和分子生物学词典》，第二版，约翰·威利父子出版社(纽约)，提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但描述了优选方法和材料。本申请中所需的大多数命名法和一般实验室程序可在Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》，第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(2012)；Wilson K.和Walker J.，《生物化学和分子生物学原理与技术》(2010)，剑桥大学出版社；或Manatitis等人，《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室(2012)；或者在Ausubel等人的《分子生物学当前方案》中，John Wiley和Sohns(2010)。这些手册以下相应地简称为“Sambrook等人”、“Wilson&Walker”、“Maniatis等人”、“Ausubel等人”。

本发明的第二方面涉及一种产生一种或多种HMO的方法，该方法包括以下步骤：

(i)提供能够产生HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白质或其功能性同源物的重组核酸，该功能性同源物具有与SEQ ID NO:1至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性的氨基酸序列；

(i)在合适的细胞培养基中培养(i)的细胞以表达所述重组核酸；

(ii)收获步骤(ii)中产生的HMO。

根据本发明，术语“培养(culturing)”(或“培养(cultivating)”或“培养(cultivation)”，也称为“发酵”)涉及根据业内已知方法在受控生物反应器中繁殖细菌表达细胞。

为了产生一种或多种HMO，根据本领域已知的程序，在合适的碳源(例如葡萄糖、甘油、乳糖等)存在下培养本文所述的HMO产生菌，并从培养基和培养过程中形成的微生物生物质中收获所产生的HMO。此后，根据本领域已知的程序(例如WO2015188834、WO2017182965或WO2017152918中所述)纯化HMO，并且所纯化的HMO用作营养品、药物或任何其他目的，例如用于研究。HMO的制造通常通过大量培养来完成。本发明含义中的术语“制造”和“制造规模”定义了最小体积为5L培养液的发酵。通常，“制造规模”工艺定义为能够处理大量含有一种目标HMO或多种目标HMO的制剂，并产生满足临床试验和市场供应需求的目标蛋白质量，例如在治疗性化合物或组合物的情况下。除了大容量外，与简单的实验室规模方法(如摇瓶培养)相反，制造规模方法的特点是使用生物反应器(发酵罐)的技术系统，该系统配备有搅拌、曝气、营养物进料、监测和控制过程参数(pH、温度、溶解氧张力、背压等)的设备。在很大程度上，实验室规模方法中表达系统的行为，例如本发明实例中描述的摇瓶、台式生物反应器或深孔格式，确实允许预测该系统在生物反应器复杂环境中的行为。

关于发酵过程中使用的合适培养基，没有限制。培养基可以是半限定的，即含有复杂培养基化合物(例如酵母提取物、大豆蛋白胨、酪蛋白氨基酸等)，也可以是化学限定的，不含任何复杂化合物。

术语“一种或多种HMO”意味着HMO产生细胞可以产生单种HMO结构(第一HMO)或多个HMO结构(第二、第三等HMO)。在一些实施方式中，可以优选产生单种HMO的宿主细胞，在其他优选实施方式中，可以优选产生多种HMO结构的宿主细胞。产生单种HMO结构的宿主细胞的非限制性实例为2’-FL、3-FL、3’-SL、6’-SL或LNT-2产生细胞。能够产生多种HMO结构的宿主细胞的非限制性实例可以是DFL、FSL、LNT、LNnT、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-IV、LNFP-V、pLNnHor-II产生细胞。

本发明上下文中的术语“收获”涉及在发酵终止后收集产生的HMO。在不同实施方式中，其可包括收集生物质(即宿主细胞)和培养基中包括的HMO，即在发酵液与生物质分离之前/不分离发酵液与生物质。在其他实施方式中，可以从生物质和发酵液中单独收集产生的HMO，即在从培养基(即发酵液)分离生物质之后。可以使用本领域技术人员熟知的任何方法，例如任何合适类型的离心或过滤，从培养基中分离细胞。从培养基中分离细胞可以在收获发酵液后立即进行，也可以在将发酵液储存在适当条件下后的较后期进行。从剩余生物质(或总发酵)中回收所产生的HMO包括从生物质(即产生细胞)中提取HMO。它可以通过本领域任何合适的方法来完成，例如通过超声波、煮沸、均质、使用溶菌酶酶解或冷冻和研磨。

从发酵物中回收后，HMO可用于进一步加工和纯化。

可使用WO2016095924、WO2015188834、WO2017152918、WO2017182965、US20190119314(全部并入以供参考)中所述的适当程序来纯化发酵产生的HMO。

在本发明的一些实施方式中，宿主细胞可以产生多种HMO，其中一种HMO是“产物”HMO，而一些/所有其他HMO是“副产物”HMO。通常，副产物HMO是主要HMO前体或主要HMO进一步改性的产物。在一些实施方式中，可能需要大量产生产物HMO和少量副产物HMO。本文所述的用于HMO产生的细胞和方法允许控制产生具有定义的HMO分布的HMO产物，例如，在一个实施方式中，产生的HMO混合物，其中产物HMO是与混合物的其他HMO(即副产物HMO)相比的主要HMO，即产物HMO的产生量高于其他副产物HMO；在其他实施方式中，可以调控产生相同HMO混合物的细胞，以产生比产物HMO量更多的一种或多种副产物HMO。例如，在LNnT的产生过程中，产生了产物HMO，通常是大量pLNnH，即副产物HMO。在另一个实例中，在LNT的产生过程中，产生了大量的副产物pLNH-II。使用本发明的遗传修饰细胞，可以显著降低LNnT产品中的pLNnH水平。

有利的是，本发明提供了降低的副产物与产物的比率和增加的产物(和/或HMO总量)的总收率。这样，与产物形成相关的副产物形成更少，有助于提高产物产量，提高产生和产物回收过程的效率，提供优质的HMO制造程序。

在不同的优选实施方式中，可以选择产生2'-FL、3-FL、3'-SL、6'-SL、LNT-2、DFL、FSL、LNT、LNnT、DFL、FSL、LNT、LNnT、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-IV、LNFP-V、pLNnH、pLNH II之一/两种作为产物或副产物HMO的不同宿主细胞。在一个优选实施方式中，产物为LNnT，副产物为pLNnH。在另一优选实施方式中，产物为LNT，副产物为pLNH II。

本发明还涉及根据本发明的遗传修饰细胞和/或核酸构建体用于产生一种或多种寡糖，优选一种或多种人乳寡糖的用途。在一个实施方式中，根据本发明的遗传修饰细胞和/或核酸构建物用于产生选自2’-FL、3-FL、DLF、LNT、LNT-II、LNnT、pLNH II和pLNnH的特定HMO。

在特别优选的实施方式中，根据本发明的遗传修饰细胞和/或核酸构建物用于产生选自LNT、LNT-II、LNnT和pLNH II及pLNnH的特定HMO。

下文通过非限制性实例和实施方式进一步说明本发明。

实施例

材料和方法

除非另有说明，否则分子生物学领域中已知的标准技术、载体、控制序列元件和其他表达系统元件可以用于核酸操作、转录和表达。此类标准技术、载体和元件可参见，例如：Ausubel等人(著),Current Protocols in Molecular Biology(1995)(John Wiley&Sons)；Sambrook,Fritsch,&Maniatis(著),Molecular Cloning(1989)(Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY)；Berger&Kimmel,Methods in Enzymology 152:Guide toMolecular Cloning Techniques(1987)(Academic Press)；Bukhari等人(著),DNAInsertion Elements,Plasmids and Episomes(1977)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY)；Miller,J.H.Experiments in molecular genetics(1972.)(Cold springHarbor Laboratory Press,NY)。

以下描述的实施方式是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。

菌株

所用的细菌菌株MDO是由大肠杆菌K-12DH1构建的。大肠杆菌K12 DH1基因型是：Fˉ、

gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44。本实施例中使用的菌株描述于表2中。

表2

*菌株MP3672和MP3020具有相同的异源GlcNAcT和Gal4T，但相应GlcNAcT编码基因的拷贝数不同

**菌株MP3994和MP4065具有相同的异源GlcNAcT和Gal4T，但相应GlcNAcT编码基因的拷贝数不同

培养基

Luria Broth(LB)培养基使用LB培养液粉(LB Broth Powder)，Millers(FisherScientific)制成，LB琼脂平板使用LB琼脂粉(LB Agar Powder)，Millers(FisherScientific)制成。在适当时添加氨苄青霉素(100μg/mL)或任何适当的抗生素和/或氯霉素(20μg/mL)。

基础最低培养基的组成如下：NaOH(1g/L)、KOH(2.5g/L)、KH₂PO₄(7g/L)、NH₄H₂PO₄(7g/L)、柠檬酸(0.5g/L)、微量矿物质溶液(5mL/L)。微量矿物质储备液包含：ZnSO₄ ^*7H₂O0.82g/L、柠檬酸20g/L、MnSO₄ ^*H₂O 0.98g/L、FeSO₄ ^*7H₂O 3.925g/L、CuSO₄ ^*5H₂O 0.2g/L。用5NNaOH将基础最低培养基的pH值调整为7.0并高压灭菌。在接种之前，向基础最低培养基提供1mM MgSO₄、4μg/mL硫胺素、0.5％的给定碳源(甘油(Carbosynth))，并在适当时添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0.2mM)。硫胺素、抗生素和IPTG通过过滤灭菌。甘油的所有百分比浓度表示为v/v，葡萄糖的所有百分比浓度表示为w/v。

含有2-脱氧半乳糖的M9平板具有以下成分：15g/L琼脂(Fisher Scientific)、2.26g/L 5x M9微量盐(Sigma-Aldrich)、2mM MgSO₄、4μg/mL硫胺素、0.2％甘油和0.2％2-脱氧-D-半乳糖(Carbosynth)。

MacConkey指示板的成分如下：40g/L MacConkey琼脂基(BD Difco^TM)以及最终浓度为1％的碳源。

培养

除非另有说明，否则在37℃下将大肠杆菌菌株在含有0.2％葡萄糖的Luria-Bertani(LB)培养基中搅拌繁殖。在37℃下将琼脂平板培养过夜。

化学感受态细胞和转化

在37℃下，将大肠杆菌从LB平板接种到含有0.2％葡萄糖的5mL LB中，摇动直至OD600～0.4。通过在13,000g下离心25秒收获2mL培养物。去除上清液，并将细胞沉淀物重新悬浮在600μL冷TB溶液(10mM PIPES、15mM CaCl₂、250mM KCl)中。将细胞在冰上孵育20分钟，然后在13,000g下沉淀15秒。去除上清液，将细胞沉淀物重新悬浮在100μL冷TB溶液中。使用100μL感受态细胞和1-10ng质粒DNA进行质粒的转化。细胞和DNA在冰上孵育20分钟，然后在42℃下热击45秒。在冰上孵育2分钟后，添加400μL SOC(20g/L胰蛋白胨、5g/L酵母抽提物、0.5g/L NaCl、0.186g/L KCl、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄和20mM葡萄糖)，并在37℃下震荡孵育细胞培养物1小时，然后在选择性平板上涂板。

在供应商(ThermoFisher Scientific)推荐的条件下，将质粒转化进入TOP10化学感受态细胞。

DNA技术

使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌中分离质粒DNA。使用QIAmp DNA Mini试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌中分离染色体DNA。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。如供应商所建议的使用DreamTaq PCR Master Mix(Thermofisher)、Phusion U热启动PCR master mix(Thermofisher)、USER酶(New EnglandBiolab)。引物由德国Eurofins Genomics提供。PCR片段和质粒通过Eurofins Genomics进行测序。在T100^TM热循环器(Bio-Rad)中使用DreamTaq PCR Master Mix进行菌落PCR。

表3：用于扩增质粒主链、启动子元件和目标基因的寡核苷酸

表4：在本发明的微生物宿主中测试的异源MFS转运蛋白基因

^*就本发明的目的而言，给出基因名称是为了标识编码具有相应GenBank登录号的氨基酸序列的蛋白质的核酸。

表5：用于表达vag的合成DNA元件

质粒构建

合成质粒主链，其包含由适合同源重组到大肠杆菌基因组的两个DNA片段分隔的两个I-SceI内切酶位点和T1转录终止子序列。例如，在一个质粒主链中合成gal操纵子(galK中同源重组所需)和T1转录终止子序列(pUC57::gal)(GeneScript)。用于gal操纵子中同源重组的DNA序列覆盖大肠杆菌K-12MG155全基因组GenBank:ID:CP014225.1中的碱基对3.628.621-3.628.720和3.627.572-3.627.671。通过同源重组插入将导致galK的949个碱基对缺失和galK-表型。以类似的方式，可以合成基于pUC57(GeneScript)或任何其他合适载体的主链，该合适载体包含由用于同源重组到大肠杆菌基因组的两个DNA片段分隔的两个I-SceI内切酶位点和T1转录终止子序列。使用分子生物学领域中众所周知的标准技术设计引物和扩增大肠杆菌K-12DH1染色体DNA的特定DNA序列。这些标准技术、载体和元件可以参见，例如：Ausubel等人(著),Current Protocols in Molecular Biology(1995)(JohnWiley&Sons)；Sambrook,Fritsch和Maniatis(著),Molecular Cloning(1989)(纽约冷泉港实验室出版社)；Berger和Kimmel,Methods in Enzymology 152:Guide to MolecularCloning Techniques(1987)(学术出版社)；Bukhari等人(著)。

大肠杆菌DH1获得的染色体DNA被用于使用寡核苷酸O261和O262扩增包含启动子PglpF的300bp DNA片段，以及使用寡核苷酸O68和O113扩增包含Plac的195bp DNA片段(表3)。

由GeneScript合成一个1179bp的DNA片段，该片段包含源自成团泛菌(Pantoeavagans)的vag基因的密码子优化变体(表5)。使用寡核苷酸KABY745和KABY746通过PCR扩增vag基因。

纯化所有PCR片段(质粒主链、包含启动子的元件和vag基因)，组装质粒主链、启动子元件(PglpF或Plac)和包含vag的DNA片段。通过标准USER克隆法克隆质粒。可以使用任何标准的DNA克隆技术在任何适当的质粒中进行克隆。将质粒转化到TOP10细胞中，并在含有100μg/mL氨苄青霉素(或任何合适的抗生素)和0.2％葡萄糖的LB平板上进行选择。纯化构建的质粒，并通过DNA测序(MWG Eurofins Genomics)验证启动子序列和vag基因的5’端。通过这种方式，构建一个包含与vag基因连接的任何目标启动子的基因盒。

表6：用于菌株构建的辅助质粒和供体质粒实例

质粒	相关基因型	标志物基因
			pACBSR	Para-I-SceI-λRed,p15A ori,cam*	cam
pUC57	pMB1,bla	bla
			pUC57::gal	pUC57::galTK’/T1-galKM’	bla

编码目标转运蛋白或糖基转移酶的异源基因的DNA序列由GenScript进行密码子优化和合成。使用覆盖该基因起始密码子ATG和终止密码子TAA的适当引物，通过PCR扩增表4所示的编码转运蛋白的目标基因(表3)。为了构建含有任何目标异源基因的供体质粒，采用标准USER克隆将相关质粒主链、启动子元件和目标基因的纯化PCR片段组合起来。可以使用任何标准的DNA克隆技术在适当的质粒中进行克隆。克隆后，将DNA转化到TOP10细胞，并在含有100μg/mL氨苄青霉素(或50mg/mL卡那霉素，取决于所应用的主链)和0.2％葡萄糖的LB平板上进行选择。纯化构建的质粒，并通过DNA测序(MWG Eurofins Genomics)验证启动子序列和目标基因的5'端。

菌株的构建

所用的细菌菌株MDO由大肠杆菌K-12DH1构建。大肠杆菌K-12DH1基因型为：Fˉ,

gyrA96,recA1,relA1,endA1,thi-1,hsdR17,supE44。除了大肠杆菌K-12DH1基因型外，MDO还有以下修饰：lacZ：缺失1.5kbp，lacA：缺失0.5kbp，nanKETA：缺失3.3kbp，melA：缺失0.9kbp，wcaJ：缺失0.5kbp，mdoH：缺失0.5kbp，在gmd基因上游插入Plac启动子。

如Herring等人(Herring,C.D.,Glasner,J.D.和Blattner,F.R.(2003).Gene(311).153-163)所述，基本通过Gene Gorging进行包含与vag基因和T1转录终止子序列连接的启动子的表达盒的插入，表6提供了用于构建本申请中所述菌株的辅助质粒和供体质粒的实例。简而言之，将供体质粒和辅助质粒共转化到MDO中，并在含有0.2％葡萄糖、氨苄青霉素(100μg/mL)或卡那霉素(50mg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的LB平板上进行选择。将单个菌落接种在含有氯霉素(20μg/mL)和10μL的20％L-阿拉伯糖的1mL LB中，在37℃下振荡培养7至8小时。为了整合进大肠杆菌的galK位点，然后将细胞接种在M9-DOG平板上，并在37℃下培养48小时。对MM-DOG平板上形成的单个菌落在含有0.2％葡萄糖的LB平板上重新划线，并在37℃下培养24小时。在MacConkey半乳糖琼脂平板上显示白色并且对氨苄青霉素和氯霉素均敏感的菌落预计已失去供体和辅助质粒，并在galK位点中包含插入。使用引物O48(SEQ ID NO:23)和O49(SEQ ID NO:24)通过菌落PCR鉴定galK位点的插入，并通过测序验证插入的DNA(Eurofins Genomics，德国)。

使用不同的选择标志物基因，以类似的方式在大肠杆菌染色体DNA的其他位点插入遗传盒。

深孔试验(DWA)

DWA按照Lv等人(Bioprocess Biosyst Eng(2016)39:1737-1747)最初的描述进行，并为本发明的目的进行了优化。

更具体地，使用4天方案在24个深孔板中筛选实例中披露的菌株。在最初的24小时内，细胞生长到高密度，而在接下来的72小时内，将细胞转移到可以诱导基因表达和产物形成的培养基中。具体地，在第1天，使用补充有硫酸镁、硫胺素和葡萄糖的基础最低培养基制备新鲜接种物。在34℃将制备的培养物在700rpm摇动下培养24小时后，将细胞转移到补充有硫酸镁和硫胺素的新的基础最低培养基(2ml)中，向其中添加初始剂量的20％葡萄糖溶液(1μL)和10％乳糖溶液(0.1ml)，然后向细胞提供50％蔗糖溶液作为碳源。接种新培养基后，在28℃下将细胞以700rpm的速度摇动72小时。变性和随后离心后，用HPLC分析上清液。

为了分析总样品，通过4,700rpm离心10分钟，使煮沸制备的细胞裂解液沉淀。通过HPLC或HPAC方法测定上清液中的HMO浓度。

序列比对

启发式成对序列比对在NCBI数据库上的BLAST 2.1.2(基本局部比对搜索工具)(Altschul等人，1990)中实现(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，以测试本发明中提到的转运蛋白序列之间的同源性。对于每个BLAST比对，所有参数均保持其默认值。

结果

实施例1.Vag转运蛋白是一种新型的LNT-2核心转运蛋白，对LNnT具有高选择性

在本发明中，我们使用参考菌株，即MP3672，测试了所选异源MFS转运蛋白将LNnT导出宿主细胞的能力。该菌株具有产物形成所需的每个异源糖基转移酶的一个PglpF驱动的拷贝。

将每个所选异源转运蛋白基因(即vag、yberC0001_9420、marc、bad、nec、yabM和fred)(表4)的一个拷贝分别整合到在Plac启动子的控制下的菌株MP3672的基因组中，该启动子已知可提供中等转录水平。Plac启动子的核糖体结合位点(即翻译起始位点的上游16bp)已被修饰(见表5)，以加强核糖体与合成的转录物的结合，并以这种方式在翻译水平上积极调控Plac驱动的表达。

根据上述菌株工程方法并在DWA中测试菌株性能，我们在此报告，与参考菌株相比，只有表达Vag的LNnT产生细胞在产生的LNnT的流出和LNnT总产量方面表现出相对增加。

如图1A所示，大多数转运蛋白基因(marc、fred、bad、nec、yabM、yberC0001_9420)的Plac驱动表达要么没有显著影响，要么减少LNnT的产生(降至45％)。相反，在菌株MP3672的遗传背景中引入vag基因导致LNnT滴度显著增加(图1A)。

七种测试的假定MSF转运蛋白的氨基酸序列比对表明，Vag转运蛋白与本发明中测试的其余六种转运蛋白相比具有非常高的序列覆盖率(99％到100％)，序列同一性在65％到75％之间。Vag序列和由yabM基因编码的MFS转运蛋白序列的序列同一性评分最高(75％)(表7)。有趣的是，在WO2017042382中描述为假定LNT有效排出体的MFS转运蛋白YabM对最终总LNnT滴度和LNnT流出均未显示出任何显著影响(图1A、1B)。因此，与Vag相对较高的蛋白质序列相似性相反，YabM转运蛋白似乎对LNnT运输无效，相应宿主细胞培养物的细胞外级分中检测到的产物浓度清楚地反映了这一点(图1B)。具体地，如细菌培养物上清液级分的分析所示，菌株MP3994(vag表达细胞)的细胞外LNnT浓度远高于菌株MP4362(yabW表达细胞)和MP3672(不表达任何异源转运蛋白的参考细胞)(图1B)。

表7：本发明不同异源转运蛋白之间的同源性：

总之，这些数据表明，Vag转运蛋白是LNnT的有效转运蛋白。这一结论来源于在相同的培养条件下，在相同的启动子Plac的控制下，对同一参考菌株中基因组表达的七种转运蛋白基因的筛选程序的结果，以及对转运蛋白序列的分析，结果表明，与Vag具有相对高同源性的转运蛋白，例如YabM和Marc(75％和71％)，根本不排出LNnT，或者，如果排出，则效率非常低。

实施例2.使用vag基因对大肠杆菌工程化用于产生LNnT

大肠杆菌K-12(DH1)MDO菌株可以被操纵以表达目标异源基因。例如，菌株MP3020是过表达选自表1的非限制性实例中的β-1,3-N-乙酰葡糖氨基转移酶基因和β-1,3-半乳糖基转移酶基因的LNnT产生菌株。

如总样品的HPLC分析所示，将含有与vag基因连接的启动子元件PglpF或Plac的表达盒以单拷贝分别插入菌株MP3020的染色体DNA中，以产生菌株MP4064和MP4065(表2)，结果是i)更高的总LNnT滴度，ii)类似或略高的总LNT-2浓度，和iii)类似或更低的总pLNnH形成(图2)。转运蛋白基因的表达水平似乎对LNnT产生菌株的副产物形成有影响：Plac驱动的vag基因表达(相对温和)对总LNnT滴度有积极影响，伴随着总pLNnH滴度的轻微增加，但LNT-2滴度没有增加。PglpF驱动的vag基因表达(相对较高)也导致LNnT滴度高于参考菌株，但该菌株(MP4064)显示总LNT-2滴度略高，总pLNnH形成量显著减少(图2)。

然而，通过观察上清液样品的分析，可以更清楚地揭示在LNnT产生菌株中引入vag基因的重大影响。与在MP3020培养物的培养基中测得的浓度相比，菌株MP4064和MP4065培养物上清液级分中的LNnT浓度增加了2倍以上(图2)。尽管在表达转运蛋白的细胞中观察到的总LNT-2滴度没有明显升高，但菌株MP4064和MP4065上清液级分中的LNT-2似乎高于菌株MP3020。如上所述，pLNnH形成在菌株MP4065中略微增加，或在菌株MP4064中显著减少。有趣的是，仅在菌株MP4064和MP4065的细胞沉淀物中发现pLNnH，这表明Vag转运蛋白的表达对所产生的pLNnH的排出没有影响(图2)。

实施例3.使用vag基因对大肠杆菌工程化用于产生LNT

大肠杆菌K-12(DH1)MDO菌株可以被操纵以表达目标异源基因。例如，菌株MP4473是过表达选自表1的β-1,3-N-乙酰葡糖氨基转移酶基因和β-1,3-半乳糖基转移酶基因的LNT产生菌株。

如总样品的HPLC分析所示，将含有与vag基因连接的启动子元件(PglpF)的表达盒以单拷贝插入菌株MP4473的染色体DNA以产生菌株MP4546(表2)，结果是i)总LNT滴度增加(总LNT浓度比参考菌株高近50％)，ii)总LNT-2浓度增加约6倍，以及iii)总pLNH-II形成增加约2.5倍(图3)。

与上述观察结果一致，对上清液样品的分析表明，与在MP4473培养物的培养基中测得的浓度相比，菌株MP4546培养物上清液级分中的LNT浓度显著增加(图3)。在vag表达细胞中测得的总LNT-2滴度高得多，比MP4546培养物的上清液级分中检测到的LNT-2浓度高5倍。相反，产生的pLNH-II似乎仅存在于菌株MP4546的细胞沉淀物中，可能是因为Vag对pLNH-II的底物特异性低或没有，或者它不能运输大的糖类，如己糖(图3)。这种“能力不足”似乎是一个有利特征，因为它允许简化vag表达细胞产生的pLNH-II的下游工艺，因为在单一发酵中产生的多种不同HMO可以在纯化程序的第一阶段从HMO混合物中分离出来。

序列表

<110> 格礼卡姆股份公司（Glycom A/S）

<120> HMO产生

<130> P2939WO00

<150> DK202000087

<151> 2020-01-23

<160> 29

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 392

<212> PRT

<213> 成团泛菌（Pantoea vagans）

<220>

<223> vag_WP_048785139.1\优化的翻译:

<400> 1

Met Lys Ser Leu Leu Thr Arg Lys Arg Arg Ile Asn Pro Val Phe Leu

1 5 10 15

Ala Phe Met Ala Ala Ser Phe Met Ile Gly Val Ala Gly Ala Leu Gln

20 25 30

Ala Pro Thr Leu Ser Leu Phe Leu Thr Arg Glu Val Gln Ala Arg Pro

35 40 45

Leu Trp Val Gly Leu Phe Phe Thr Val Asn Ala Ile Ala Gly Ile Val

50 55 60

Val Ser Met Leu Val Ala Lys Arg Ser Asp Ser Arg Gly Asp Arg Arg

65 70 75 80

Thr Leu Ile Leu Phe Cys Cys Ala Met Ala Phe Cys Asn Ala Leu Leu

85 90 95

Phe Ala Phe Thr Arg His Tyr Leu Thr Leu Ile Thr Leu Gly Val Leu

100 105 110

Leu Ser Ala Leu Ala Ser Val Ser Met Pro Gln Ile Phe Ala Leu Ala

115 120 125

Arg Glu Tyr Ala Asp Gln Ser Ala Arg Glu Ala Val Met Phe Ser Ser

130 135 140

Val Met Arg Ala Gln Leu Ser Leu Ala Trp Val Ile Gly Pro Pro Leu

145 150 155 160

Ser Phe Ala Leu Ala Leu Asn Phe Gly Phe Val Thr Leu Phe Leu Val

165 170 175

Ala Ala Ala Leu Phe Leu Val Cys Ile Leu Leu Ile Lys Phe Thr Leu

180 185 190

Pro Ser Val Pro Arg Ala Glu Pro Leu Met Arg Ser Gly Gly Met Pro

195 200 205

Leu Ser Gly Trp Arg Asp Arg Asp Val Arg Leu Leu Phe Ile Ala Ser

210 215 220

Val Thr Met Trp Thr Cys Asn Thr Met Tyr Ile Ile Asp Met Pro Leu

225 230 235 240

Tyr Ile Ser Val Thr Leu Gly Leu Pro Glu Lys Leu Ala Gly Leu Leu

245 250 255

Met Gly Thr Ala Ala Gly Leu Glu Ile Pro Val Met Leu Leu Ala Gly

260 265 270

His Tyr Ala Lys Arg Val Gly Lys Arg Asn Leu Met Leu Ile Ala Val

275 280 285

Ala Ala Gly Val Leu Phe Tyr Ala Gly Leu Ala Met Phe Ala Ser Gln

290 295 300

Thr Ala Leu Met Ala Leu Gln Leu Phe Asn Ala Val Phe Ile Gly Ile

305 310 315 320

Ile Ala Gly Ile Gly Met Leu Trp Phe Gln Asp Leu Met Pro Gly Arg

325 330 335

Pro Gly Ala Ala Thr Thr Met Phe Thr Asn Ser Ile Ser Thr Gly Met

340 345 350

Ile Leu Ala Gly Val Ile Gln Gly Thr Leu Ser Glu Arg Phe Gly His

355 360 365

Ile Ala Val Tyr Trp Leu Ala Leu Gly Leu Ala Val Ala Ala Phe Ala

370 375 380

Met Ser Ala Arg Val Lys Asn Val

385 390

<210> 2

<211> 1182

<212> DNA

<213> 成团泛菌（Pantoea vagans）

<220>

<223> vag核苷酸序列

<400> 2

atgaagagcg cgctgacctt cagccgtcgt attaacccgg tttttctggc gttctttgtg 60

gttgcgttcc tgagcggtat tgcgggtgcg ctgcaggcgc cgaccctgag cctgttcctg 120

agcaccgagg tgaaagttcg tccgctgtgg gtgggcctgt tctacaccgt taacgcgatt 180

gcgggtatca ccgtgagctt tgttctggcg aagcgtagcg acctgcgtgg cgatcgtcgt 240

aaactgatcc tggtgtgcta cctgatggcg gttggtaact gcctgctgtt cgcgtttaac 300

cgtgactatc tgaccctgat taccgcgggc gtgctgctgg cggcggttgc gaacaccgcg 360

atgccgcaga ttttcgcgct ggcgcgtgag tacgcggata acagcgcgcg tgaagtggtt 420

atgtttagca gcattatgcg tgcgcaactg agcctggcgt gggttatcgg tccgccgctg 480

agcttcatgc tggcgctgaa ctatggcttc accctgatgt tttgcattgc ggcgggtatc 540

ttcgtgctga gcgcgctggt tgtgtggttt attctgccga gcgtgcagcg tgcggaaccg 600

gttatggatg cgccgaccgt ggcgcaaggc agcctgttcg cggacaagga tgttctgctg 660

ctgtttattg cgagcatgct gatgtggacc tgcaacacca tgtacatcat tgatatgccg 720

ctgtatatca ccgcgagcct gggtctgccg gagcgtctgg cgggtctgct gatgggcacc 780

gcggcgggtc tggaaatccc gattatgctg ctggcgggct acagcgtgcg tcgttttggc 840

aagcgtaaaa tcatgctgtt cgcggtgctg gcgggcgttc tgttttatac cggtctggtt 900

ctgttcaagt ttaaaagcgc gctgatgctg ctgcagattt tcaacgcgat ctttattggt 960

atcgtggcgg gtatcggcat gctgtacttc caagacctga tgccgggtcg tgcgggtgcg 1020

gcgaccaccc tgtttaccaa cagcattagc accggcgtta tcctggcggg cgtgctgcaa 1080

ggtgttctga ccgaaacctg gggtcacaac agcgtgtatg ttatggcgat gattctggcg 1140

atcctgagcc tgatcatttg cgcgcgtgtg cgtgaagcgt aa 1182

<210> 3

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PglpF调控序列

<300>

<310> WO2019123324

<311> 19.12.2018

<312> 27.06.2019

<313> 1-300

<400> 3

gcggcacgcc ttgcagatta cggtttgcca cacttttcat ccttctcctg gtgacataat 60

ccacatcaat cgaaaatgtt aataaatttg ttgcgcgaat gatctaacaa acatgcatca 120

tgtacaatca gatggaataa atggcgcgat aacgctcatt ttatgacgag gcacacacat 180

tttaagttcg atatttctcg tttttgctcg ttaacgataa gtttacagca tgcctacaag 240

catcgtggag gtccgtgact ttcacgcata caacaaacat taaccaagga ggaaacagct 300

<210> 4

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Plac表达元件

<300>

<310> WO2019123324

<311> 19.12.2018

<312> 27.06.2019

<400> 4

atgcgcaaat tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 60

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 120

accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctgggtacct 180

aaggaggaaa cagct 195

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物O40 主链.for

<220>

<221> misc_RNA

<222> 9

<400> 5

attaacccuc caggcatcaa ataaaacgaa aggc 34

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物O68, Plac.for

<400> 6

atgcgcaaau tgtgagttag ctcactcatt ag 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物O79 主链.rev

<220>

<221> misc_RNA

<222> 10

<400> 7

atttgcgcau caccaatcaa attcacgcgg cc 32

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物O113, Plac.rev

<400> 8

agctgttucc tccttaggta cccagctttt gttccc 36

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物O261, PglpF.for

<220>

<221> misc_RNA

<222> 10

<400> 9

atgcgcaaau gcggcacgcc ttgcagatta cg 32

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物O262, PglpF.rev

<220>

<221> misc_RNA

<222> 8

<400> 10

agctgttucc tccttggtta atgtttgttg tatgcg 36

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY745, vag.for

<400> 11

aaacagcuat gaagagcctg ctgacccgta aac 33

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY746, vag.rev

<220>

<221> misc_RNA

<222> 9

<400> 12

agggttaaut taaacgtttt tcacacgcgc g 31

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY721, yberC0001_9420.for

<220>

<221> misc_RNA

<222> 8

<400> 13

aaacagcuat gaagagcgcg ctgaccttta gc 32

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY722, yberC0001_9420.rev

<220>

<221> misc_RNA

<222> 9

<400> 14

agggttaaut tacgcctcac gcacacgcg 29

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY733, fred.for

<220>

<221> misc_RNA

<222> 8

<400> 15

aaacagcuat gaagagcgcg ctgaccttca g 31

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY734, fred.rev

<220>

<221> misc_RNA

<222> 9

<400> 16

agggttaaut tacgcttcac gcacacgcg 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY729, bad.for

<220>

<221> misc_RNA

<222> 8

<400> 17

aaacagcuat gagcagccgt cgtctgagc 29

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY730, bad.rev

<220>

<221> misc_RNA

<222> 9

<400> 18

agggttaaut tacacgtttt taacacgggt catcag 36

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY741, nec.for

<220>

<221> misc_RNA

<222> 8

<400> 19

aaacagcuat gcagagcttc accccgcc 28

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY742, nec.rev

<220>

<221> misc_RNA

<222> 9

<400> 20

agggttaaut tacgcctgct ctttaacacg cagc 34

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY737, marc.for

<220>

<221> misc_RNA

<222> 8

<400> 21

aaacagcuat gcagcgtctg agccgtctga g 31

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物KABY738, marc.rev

<220>

<221> misc_RNA

<222> 9

<400> 22

agggttaaut taaacttcac gcactttcgc gc 32

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物O48, galK.for

<400> 23

cccagcgaga cctgaccgca gaac 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物O49, glaK.rev

<400> 24

ccccagtcca tcagcgtgac tacc 24

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物MP1217, yabM.for

<220>

<221> misc_RNA

<222> 8

<400> 25

aaacagcuat gaaggcgctg tggagccgtc g 31

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物MP1218, yabM.rev

<220>

<221> misc_RNA

<222> 9

<400> 26

agggttaauc gccagcggaa cgctcttcac g 31

<210> 27

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子序列PmglB_70UTR

<400> 27

tgcgtcgcca ttctgtcgca acacgccaga atgcggcggc gatcactaac tcaacaaatc 60

aggcgatgta accgctttca atctgtgagt gatttcacag tatcttaaca atgtgatagc 120

tatgattgca ccgtgcctac aagcatcgtg gaggtccgtg actttcacgc atacaacaaa 180

cattaaccaa ggaggaaaca gct 203

<210> 28

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子序列PmglB_70UTR_SD4

<400> 28

tgcgtcgcca ttctgtcgca acacgccaga atgcggcggc gatcactaac tcaacaaatc 60

aggcgatgta accgctttca atctgtgagt gatttcacag tatcttaaca atgtgatagc 120

tatgattgca ccgtgcctac aagcatcgtg gaggtccgtg actttcacgc atacaacaaa 180

cattaaccaa ctaggaaaca gct 203

<210> 29

<211> 291

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子序列PgatY_70UTR

<400> 29

cggcaaccta tgcctgatgc gacgctgaag cgtcttatca tgcctacata gcactgccac 60

gtatgtttac accgcatccg gcataaaaac acgcgcactt tgctacggct tccctatcgg 120

gaggccgttt ttttgccttt cactcctcga ataattttca tattgtcgtt tttgtgatcg 180

ttatctcgat atttaaaaac aaataatttc attatatttt gtgcctacaa gcatcgtgga 240

ggtccgtgac tttcacgcat acaacaaaca ttaaccaagg aggaaacagc t 291

Claims

1.一种能够产生一种或多种人乳寡糖(HMO)的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白质或其功能性同源物的重组核酸，所述功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选至少90％同一性。

2.根据权利要求1所述的遗传修饰细胞，其中所述寡糖选自2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(DFL)、3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)、乳-N-三糖-2(LNT-2)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III)、乳-N-岩藻五糖IV(LNFP-IV)和乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V)和/或对乳-N-新六糖(pLNnH)。

3.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中所述遗传修饰细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。

4.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中所述细胞还包含重组DNA序列，所述重组DNA序列包含用于调控所述重组核酸表达的调控元件。

5.根据权利要求4所述的遗传修饰细胞，其中用于调控所述重组核酸表达的所述调控元件是启动子元件，比如lac启动子Plac或glp启动子PglpF。

6.一种核酸构建体，其包含编码SEQ ID NO:1的蛋白质或其功能性同源物的核酸序列，所述功能性同源物与SEQ ID NO:1具有大于80％的序列同一性，其中编码SEQ ID NO:1的蛋白质的核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％的序列同一性。

7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中所述构建体还包含核酸序列，所述核酸序列包含调控元件。

8.根据权利要求7所述的核酸构建体，其中所述调控元件调控与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的所述核酸序列的表达。

9.根据权利要求7-8中任一项所述的核酸构建体，其中用于调控重组核酸表达的调控元件是表达元件，比如lac启动子Plac或glp启动子PglpF。

10.一种用于产生一种或多种寡糖的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供能够产生HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白质或其功能性同源物的重组核酸，所述功能性同源物具有与SEQ ID NO:1至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选至少90％同一性的氨基酸序列；

(ii)在合适的细胞培养基中培养根据(i)所述的细胞，以表达所述重组核酸；

(iii)收获步骤(ii)中产生的一种或多种HMO。

11.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰细胞或根据权利要求6-9中任一项所述的核酸构建体用于产生一种或多种寡糖、优选一种或多种人乳寡糖的用途。

12.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰细胞或根据权利要求6-9中任一项所述的核酸构建体用于产生选自2’-FL、3-FL、DLF、LNT、LNT-II、LNnT、pLNH-II和pLNnH的HMO的用途。

13.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰细胞或根据权利要求6-9中任一项所述的核酸构建体用于产生选自LNT、LNT-II、LNnT、pLNH-II和pLNnH的HMO的用途。