CN103958537A - Hmo核心结构的合成 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于制备HMO核心结构的前体的方法,所述方法包括以下步骤:使N-乙酰乳糖胺或乳-N-二糖衍生物供体与乳糖或N-乙酰乳糖胺衍生物受体反应。
Description
发明领域
本发明涉及用于合成人乳寡糖(“HMO”)的前体并且,经由所述前体,制备Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(乳-N-新四糖,LNnT)和Galpβ1-3GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(乳-N-四糖,LNT)以及其他HMO核心(core)寡糖结构,特别地优选为乳-N-新六糖(LNnH)和对-乳-N-新六糖(对-LNnH)结构的一般方法。
发明背景
在过去的十年期间,合成HMO及使其商品化的兴趣不断增加。HMO的重要性与其在人中的独特生物学活性直接相关,如其抗菌和抗病毒活性及其免疫系统和认知发展增强活性。
四糖Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(乳-N-新四糖,LNnT)和Galpβ1-3GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(乳-N-四糖,LNT)是存在于人乳中的寡糖中的两种[LNnT:Kuhn等.Chem.Ber.1962,95,513和518,KobataMethods Enzymol.1972,28,262;LNT:Kuhn等Chem.Ber.1953,86,827]。
LNnT和LNT两者都充当肺炎球菌(pneumococci)的细菌受体,并且两者都已被发现可用于识别糖基转移酶的受体特异性、糖苷酶的底物特异性和抗原决定簇的结构。它们还代表其他HMO的核心结构单元,以及在人体中具有生理学活性的糖脂和糖蛋白的其他更复杂的寡糖核心的核心结构单元。
HMO的核心寡糖结构由乳糖和N-乙酰乳糖胺和/或乳-N-二糖二糖嵌段构成并且可以被唾液酸化和/或岩藻糖基化。在各核心结构中,乳糖位于还原端。至今,已经提出了13种HMO核心结构(T.Urashima等:MilkOligosaccharides(乳寡糖),Nova Biomedical Books,NY,2011):
表1:人乳寡糖(HMO)的13种不同核心结构
至今,由已知的分离、生物技术和化学合成方法还没有获得大量的LNnT、LNT和相关核心结构。即使以毫克量由人乳分离LNnT、LNT和伸长的核心结构也很困难,原因在于在人乳中存在大量的类似寡糖。
化学合成包括LNnT和LNT在内的HMO核心结构需要许多反应步骤、保护基操作和色谱法纯化,并且仅提供毫克量的较差或中等的收率。因此,对于大规模生产来说,化学合成不被认为是有吸引力的。
四糖如LNnT、LNT和更大的HMO核心寡糖的现有化学合成中的关键步骤是糖基化反应,将半乳糖基寡糖受体如乳糖受体衍生物与二糖N-乙酰乳糖胺供体或二糖乳-N-二糖供体偶联,然后任选地将所得的四糖转化为能够接收另外的二糖N-乙酰乳糖胺/乳-N-二糖供体的衍生物。当通过离去基团如三氯乙酰亚胺酯、氯化物或苯硫基在其异头中心上被活化,并且具有以例如邻苯二甲酰基、三氯乙酰基或二甲基马来酰基形式的经保护的氨基时,二糖葡糖胺基衍生物被认为是合适的供体。[Paulsen等Carbohydr.Res.1987,169,105:Aly等ibid.1999,316,121:Aly等Eur.J.Org.Chem.2000,319;Ponpipom等Tetrahedron Lett.1978,20,1717;Malleron等Carbohydr.Res.2008,343,970;WO2011/100980A1]。
唑啉单糖供体也已经与促进剂一起使用以对单糖受体提供直接和立体选择性的糖基化[Toshima:5.3Miscellaneous Glycosyl Donors(各种糖基供体),5.3.11Oxazoline(唑啉)In:Handbook of Chemical Glycosylation(Ed.:Demchenko),Wiley,2008,pp.457-458;Xia等Bioorg.Med.Chem.Lett.1999,9,2941]。因此,已经尝试了利用磺酸促进剂将衍生自N-乙酰乳糖胺的唑啉二糖供体用于糖基化3’,4’-二羟基二糖乳糖受体。虽然提供了更直接的反应路径,但是衍生自N-乙酰乳糖胺的二糖唑啉供体与3’,4’-二羟基二糖受体的反应性低[Zurabyan等Soviet J.Bioorg.Chem.1978,4,679]。因此,仅获得复杂的糖基化反应混合物,从该混合物以相当差的收率获得LNnT。
活化的3’-一羟基二糖受体-具有2’、4’和/或6’给电子基团如苄基而不是吸电子基团如酰基-的使用因此已被推荐用于利用二糖唑啉供体和磺酸促进剂的糖基化[Dahmén等Carbohydr.Res.1985,138,17;Takamura等Chem.Pharm.Bull.1980,28,1804;1981,29,2270]。这是因为苄基不迁移,但是它们活化附近的OH-基团以使其被糖基化,由此使得二糖受体更具活性。然而,当使用活化的3’-一羟基二糖受体时,仍需要大大过量的反应性差的二糖唑啉供体,这虽然对良好的产率是合理的,但却在将四糖产物与大体积的未反应的唑啉供体分离中导致无法避免的困难。
因此,通过糖基化二糖受体和供体以可接受的产率来化学合成LNT、LNnT和更高级的HMO核心寡糖结构的工艺仍然是复杂且昂贵的。因此需要可以用于大型工业规模生产的更简单且更多产的方法。
附图简述
以下将参考附图更详细地描述本发明,其中:
图1显示在D2O中,在25℃600MHz,1-O-苄基-β-LNnH的1H-NMR谱。
图2显示在D2O中,在25℃125MHz,1-O-苄基-β-LNnH的13C-NMR谱。
图3显示在D2O中,在25℃600MHz,1-O-苄基-β-对-LNnH的1H-NMR谱。
图4显示在D2O中,在25℃125MHz,1-O-苄基-β-对-LNnH的13C-NMR谱。
发明概述
本发明涉及可以一种用于制备式3的HMO核心结构前体的方法,
其中R4是酰基,R6是H或酰基,优选为H,R8是通过氢解可去除的基团,Y是-OR4或任选地被卤素原子取代的乙酰氨基,当Y是-OR4时Q是键,或当Y是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时Q是包含任选地被过酰化N-乙酰乳糖胺基残基(peracylated N-acetyllactosaminyl residue)或过酰化乳-N-二糖基残基(peracylated lacto-N-biosyl residue)取代的过酰化乳糖部分(peracylated lactose moiety)的糖连接物(carbohydrate linker),R9选自由以下各项组成的组:式B的残基,过酰化N-乙酰乳糖胺基残基和过酰化乳-N-二糖基残基,并且R10选自由以下各项组成的组:式B的残基,酰基,缩醛型基团(acetal type groups),甲硅烷基和任选地被1或2个过酰化N-乙酰乳糖胺基部分或乳-N-二糖基部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基,前提是R9和R10中的至少一个是式B的残基,
其中X是选自由F,Cl,Br和I组成的组中的卤素原子,n是0,1,2或3,和R1基团中的一个是式A的残基,
并且另一个R1基团是酰基,并且R2和R3独立地是酰基,
所述方法是通过在卤化硼(boron halogenide)促进剂存在下,使式1的二糖葡糖胺供体,
其中R1,R2,X和n如以上所定义,
与式2的受体衍生物反应,
其中R4,R6,R8,Y和Q如以上所定义,R5选自由以下各项组成的组:H,过酰化N-乙酰乳糖胺基残基和过酰化乳-N-二糖基残基,优选为H,和R7选自由以下各项组成的组:H,酰基,缩醛型基团,甲硅烷基和任选地被1或2个过酰化N-乙酰乳糖胺基部分或乳-N-二糖基部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基,前提是R5和R7中的至少一个是H。
此外,提供一种式3’的化合物
其中R4’是低迁移性(low-migrating)酰基基团,R6是H或酰基,优选为H,R8是通过氢解可去除的基团,Y是-OR4’或任选地被卤素原子取代的乙酰氨基,当Y是-OR4’时Q是键,或者当Y是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时Q是包含任选地被过酰化N-乙酰乳糖胺基残基或过酰化乳-N-二糖基残基取代的过酰化乳糖部分的糖连接物,R9选自由以下各项组成的组:式B的残基,过酰化N-乙酰乳糖胺基残基和过酰化乳-N-二糖基残基,并且R10选自由以下各项组成的组:式B的残基,酰基,缩醛型基团,甲硅烷基和任选地被1或2个过酰化N-乙酰乳糖胺基部分或乳-N-二糖基部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基,前提是R9和R10中的至少一个是式B的残基,
其中X是选自由F,Cl,Br和I组成的组中的卤素原子,n是0,1,2或3,并且R1基团中的一个是式A的残基,
并且另一个R1基团是酰基,R2和R3独立地是酰基,
以及式2B的化合物
其中R4是酰基,并且R8是通过氢解可去除的基团。
发明详述
根据本发明,术语“酰基”优选是指R-C(=O)-基团,其中R可以是H,具有1-6个碳原子的直链或支链烷基,或芳基,包括苯基和萘基,优选为苯基,如甲酰基,乙酰基,丙酰基,丁酰基,新戊酰基,苯甲酰基等。烷基和芳基残基可以是未取代或被取代一次或多次,优选1-5次,更优选为1-3次。取代基可以优选为烷基(对于芳酰基),羟基,烷氧基,羧基,氧基(对于烷基,形成酮或醛官能),烷氧基羰基,烷基羰基,甲酰基,芳基,芳基氧基羰基,芳基氧基,芳基氨基,芳基羰基,氨基,一-和二-烷基氨基,氨基甲酰基,一-和二烷基-氨基羰基,烷基羰基氨基,氰基,烷酰基氧基,硝基,烷硫基和/或卤素(F,Cl,Br,I)。酰基基团的芳基和烷基部分上的取代基可以改变该酰基基团的总体化学特性,并且由此改变分子作为整体的特性,如稳定性,溶解性和形成晶体的能力。
本文中,术语“通过氢解可去除的基团”优选是指这样的保护基,其与1-氧的C-O键可以在催化量的钯,阮内镍(Raney nickel)或任何其他常规氢解催化剂存在下被氢分解从而产生1-OH基团。这样的保护基被描述于Wuts和Greene:Protective Groups in Organic Synthesis(化学合成中的保护基),John Wiley&Sons,2007,并且包括苄基,二苯基甲基(二苯甲基),1-萘基甲基,2-萘基甲基和三苯基甲基(三苯甲基),其各自可以任选地被以下基团中的一个或多个取代:烷基,烷氧基,苯基,氨基,酰基氨基,烷基氨基,二烷基氨基,硝基,羧基,烷氧基羰基,氨基甲酰基,N-烷基氨基甲酰基,N,N-二烷基氨基甲酰基,叠氮基,卤素烷基或卤素。优选地,这样的取代,如果存在,是在芳族环上。优选的保护基是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基。这些优选的和特别优选的保护基具有这样的优点:其氢解的副产物全部是甲苯或取代的甲苯。这样的副产物可以经由蒸发和/或萃取工艺从水溶性寡糖产物中容易地除去,甚至是以数吨的量。
本文中,R5,R7或Q中的术语“过酰化N-乙酰乳糖胺基部分”优选是指以β-键连接的N-乙酰基-乳糖胺(LacNAc,Galpβ1-4GlcNAcp)的糖基残基,并且OH-基团被酰基(参见上文)保护,优选被相同的酰基保护:
此外,本文中,R5,R7,R9或Q中的术语“过酰化乳-N-二糖基部分”优选是指以β-键连接的乳-N-二糖(LNB,Galpβ1-3GlcNAcp)的糖基残基,并且OH-基团被酰基(参见上文)保护,优选被相同的酰基保护:
R7和R10中的术语“任选地被1或2个选自过酰化N-乙酰乳糖胺基基团和过酰化乳-N-二糖基基团的部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基”优选地在本文中是指如上所定义的过酰化N-乙酰乳糖胺基部分可以通过替代酰基基团中的一个或两个,被1或2个选自由过酰化N-乙酰乳糖胺基部分(参见上文)和过酰化乳-N-二糖基部分(参见上文)组成的组中的二糖残基取代。
基团Q中的术语“包含任选地被过酰化N-乙酰乳糖胺或过酰化乳-N-二糖取代的过酰化乳糖部分的糖连接物”在本文中优选是指这样的二价基团,所述二价基团包含经由异头碳原子连接于OR8基团并且任选地被过酰化N-乙酰乳糖胺基残基或过酰化乳-N-二糖基残基取代的过酰化乳糖基(Galpβ1-4Glcp)残基过酰化过酰化过酰化。
本文中,R7中的术语“无环的缩醛型基团”优选是指这样的保护基,其与待保护的羟基的氧原子形成具有与相同碳原子相连的两个单键键合的氧的结构,其由以下一般结构表征:
其中Ra,Rb和Rc是碳键合的基团。此类基团是本领域技术人员已知的,其中很多被P.G.M.Wuts和T.W. Greene:Protective Groups in OrganicSynthesis(有机合成中的保护基),John Wiley&Sons,2007提及,并且包括但不限于甲氧基甲基,叔丁氧基甲基,2-甲氧基-乙氧基甲基,苄氧基甲基,四氢吡喃基,四氢呋喃基,1,4-二烷-2-基,1-甲基-1-甲氧基乙基,1-甲基-1-苯氧基乙基等。上述缩醛型保护基在温和酸性条件下是不稳定的。
术语“甲硅烷基基团”在本文中优选是指含有与要保护的羟基的氧原子共价键合的硅原子的保护基(甲硅烷基醚)。此类基团是本领域技术人员熟知的,其中很多被P.G.M.Wuts和T.W.Greene:Protective Groups inOrganic Synthesis(有机合成中的保护基),John Wiley&Sons,2007提及,并且包括但不限于三甲基甲硅烷基,三异丙基甲硅烷基,叔丁基二甲基甲硅烷基,叔丁基二苯基甲硅烷基等。甲硅烷基醚在温和酸性条件下是不稳定的。
术语“低迁移性酰基基团”在本文中优选是指4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基。这些低迁移性酰基基团的表征在于不易于迁移,即,在所采用的反应条件下在-OH基团间移动的倾向低。
根据本发明,惊人地发现,可以在温和条件下将式1的二糖葡糖胺供体偶联到半乳糖基寡糖受体,尤其是失活的受体,从而产生出乎意料地高收率的偶联产物。该方法可以用于制备多种HMO核心结构,甚至是以工业规模。
根据本发明,所述方法包括制备HMO核心结构的前体,其通过在卤化硼促进剂存在下,使式1的二糖葡糖胺供体
其中X是选自由F,Cl,Br和I组成的组的卤素原子,n是0,1,2或3,并且R1基团中的一个是式A的残基,
与式2的受体衍生物反应,
并且另一个R1基团是酰基,并且R2和R3独立地是酰基,
其中R4是酰基,R5选自由以下各项组成的组:H,过酰化N-乙酰乳糖胺基残基和过酰化乳-N-二糖基残基,R6是H或酰基,优选为H,R7选自由以下各项组成的组:H,酰基,缩醛型基团,甲硅烷基和任选地被1或2个过酰化N-乙酰乳糖胺基部分或乳-N-二糖基部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基,R8是通过氢解可去除的基团,Y是-OR4或任选地被卤素原子取代的乙酰氨基,当Y是-OR4时Q是键,或者当Y是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时Q是包含任选地被过酰化N-乙酰乳糖胺基残基或过酰化乳-N-二糖基残基取代的过酰化乳糖部分的糖连接物,前提是R5和R7中的至少一个是H。通过该方法可获得的HMO核心结构可由式3表征,
其中R4,R6,R8,Y和Q如以上所定义,R9选自由以下各项组成的组:式B的残基,过酰化N-乙酰乳糖胺基残基和过酰化乳-N-二糖基残基,并且R10选自由以下各项组成的组:式B的残基,酰基,缩醛型基团,甲硅烷基和任选地被1或2个过酰化N-乙酰乳糖胺基部分或乳-N-二糖基部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基,前提是R9和R10中的至少一个是式B的残基,
其中R1,R2,X和n如以上所定义。
式3的化合物包括列于以上表1中的所有HMO核心结构,及其衍生化(被保护的)形式的结构异构体。
使式2的受体与式1的葡糖胺基供体反应的方法可以在非质子溶剂如乙腈,卤代烃如氯仿、二氯甲烷或二氯乙烷,醚如二乙醚、四氢呋喃或二烷,芳烃如甲苯、苯或二甲苯中,或在非质子溶剂的混合物中,在卤化硼活化剂(即促进剂或催化剂)存在下进行,从而产生所需的式3的糖基化产物。供体-受体比从1至3,优选1.2至1.8,更优选1.5至1.6变化。相对于供体,存在于糖基化反应中的活化剂的量为0.1至0.5当量,优选为0.2至0.4,更优选为0.25至0.35当量。温度可以为从室温至回流,优选为约50-55℃至回流变化。优选的卤化硼活化剂是三氟化硼,更优选为三氟化硼乙醚(boron trifluoride etherate)。
在所述方法的优选实施方案中,在式1的化合物中n是3,因此形成2-甲基-唑啉型化合物。此外,当Y是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时,该乙酰氨基优选是非取代的。即-NHCOCH3。
同样在所述方法的优选实施方案中,当Q是如上所定义的寡糖连接物并且Y是任选被卤素原子取代的乙酰氨基时,连接物可以是二价乳糖基残基,所述二价乳糖基残基经由异头碳原子连接于OR8基团,并且还经由一个OH-基团通过糖苷间键优选β-键连接于式2的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分。连接物优选被相同的酰基基团过酰化。更优选地,式2的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分可以连接至乳糖基残基的3’-OH,因此二价连接物可以是如下所示的:
此外,连接物Q可以包括被N-乙酰乳糖胺基或乳-N-二糖基部分取代的乳糖基残基,该乳糖基可以经由异头碳原子连接至OR8基团,并且还可以经由一个OH-基团通过糖苷间键(优选β-键)连接至式2的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分。取代基N-乙酰乳糖胺基或乳-N-二糖基部分可以通过β-糖苷间键连接至乳糖基残基的OH-基团,优选连接至3’-OH基团。连接物优选被相同的酰基基团过酰化。更优选地,式2的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分可以连接至乳糖基残基的6’-OH,因此二价连接物可以是以下所示的那些:
此外,连接物Q可以包括被N-乙酰乳糖胺基部分取代的乳糖基残基,该乳糖基可以经由异头碳原子连接至OR8基团。取代基N-乙酰乳糖胺基部分可以通过β-糖苷间键连接至乳糖基残基的一个OH-基团,优选连接至3’-OH基团。连接物优选被相同的酰基基团过酰化,其可以经由取代基N-乙酰乳糖胺基残基的一个OH-基团通过糖苷间键(优选β-键)连接至式2的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分。更优选地,式2的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分可以连接至取代基N-乙酰乳糖胺基残基的3’-OH,因此二价连接物可以是如下所示的:
同样在所述方法的优选实施方案中,其中n是3的式1的供体与式2A的乳糖受体反应,
其中R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,
并且R4,R6和R8如以上所定义,
从而产生式4的LNT或LNnT前体,其属于式3的化合物,
其中R1,R2,R4,R6,R7和R8如以上所定义。
在这方面,可以特别优选的是使式1A的N-乙酰乳糖胺供体,
其中R1,R2和R3如以上所定义,优选地它们是相同的并且是指乙酰基或苯甲酰基,
与式2A的乳糖受体反应,其中R6是H,R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,优选为酰基或甲硅烷基,更优选为酰基,并且R4和R8如以上所定义,从而产生式4A的LNnT前体,
其中R1,R2,R3,R4,R7和R8如以上所定义。
可以十分优选的是,R4和R7是相同的酰基基团,特别是低迁移性酰基基团。
同样在所述方法的优选实施方案中,在选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、甲苯、THF和乙腈或其混合物的溶剂中,尤其是在甲苯或甲苯/二氯甲烷混合物中,在三氟化硼乙醚促进剂存在下,以上式1A的供体可以与式2A的乳糖受体反应,其中R6是H,R4和R7是相同的低迁移性酰基基团,如4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,-OR8处于β-取向。
同样在所述方法的优选实施方案中,式1B的乳-N-二糖供体
其中R1,R2和R3如以上所定义,优选地它们是相同的并且是指乙酰基或苯甲酰基,
可以与式2A的乳糖受体反应,其中R6是H,R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,优选为酰基或甲硅烷基,更优选为酰基,并且R4和R8如以上所定义,提供式4B的LNT前体,
其中R1,R2,R3,R4,R7和R8如以上所定义。
在这方面,可以特别优选的是,R4和R7是相同的酰基基团,特别是低迁移性酰基基团,并且可以最特别优选的是,在选自氯仿,二氯甲烷,二氯乙烷,甲苯,THF和乙腈或其混合物的溶剂中,尤其是在甲苯或甲苯/二氯甲烷混合物中,在三氟化硼乙醚促进剂存在下,使以上式1B的供体与式2A的乳糖受体反应,其中R6是H,R4和R7是相同的低迁移性酰基基团,如4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,并且-OR8处于β-取向。
此外,提高的式4B的LNT前体的收率可以通过使用以下中的至少一种使式1B的供体和式2A的乳糖受体反应获得:
-分子筛;
-相对于受体,1-2当量过量的供体;
-额外的活化剂,如三甲基氯硅烷(TMSCl),三甲基溴硅烷(TMSBr),三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(TMSOTf),三氟甲磺酸(TfOH),对甲苯磺酸(pTsOH),樟脑磺酸(CSA),三氟甲磺酸吡啶对甲苯磺酸吡啶(PPTS),三氟甲磺酸镧(La(OTf)3),三氟甲磺酸钪(Sc(OTf)3),三氟甲磺酸镱(Yb(OTf)3),氯化铜(CuCl2)和/或溴化铜(CuBr2),优选的相对于供体的量为15-100mol%。
同样在所述方法的优选实施方案中,以上式1的供体可以与乳糖式2B的受体反应,
其中R4是酰基并且R8是通过氢解可去除的基团,
从而获得HMO核心结构的前体,其是属于式3的化合物的由式5表征的六糖,
其中R1,R2,R4和R8如以上所定义。
在这方面,可以特别优选的是使式1A的N-乙酰乳糖胺供体,
其中R1,R2和R3如以上所定义,优选地它们是相同的并且是指乙酰基或苯甲酰基,
与以上式2B的乳糖受体反应,从而产生式5A的LNnH(乳-N-新六糖)前体,
其中R1,R2,R3,R4和R8如以上所定义。
可以十分优选的是,R4是低迁移性酰基基团,并且可以最特别优选的是,在选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、甲苯、THF和乙腈或其混合物的溶剂中,尤其是在甲苯或甲苯/THF混合物中,在三氟化硼乙醚促进剂存在下,使式1A的供体与式2B的乳糖受体反应,在所述式1A中,R1,R2和R3是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,在所述式2B中,R4是低迁移性酰基基团,如4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,并且-OR8处于β-取向。
同样在所述方法的优选实施方案中,式1A的供体,
其中R1,R2和R3如以上所定义,优选地它们是相同的并且是指乙酰基或苯甲酰基,
可以与式2C或2D的受体反应,
其中R4和R11独立地是酰基,并且R8是通过氢解可去除的基团,从而产生HMO核心结构的前体,其分别是式5B的LNnH(乳-N-新六糖)前体或式5C的LNH(乳-N-六糖)前体,二者都属于式3的化合物,
其中R1,R2,R3,R4,R8和R11如以上所定义。
在这方面,可以特别优选的是,R4是低迁移性酰基基团,并且可以最特别优选的是,在选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、甲苯、THF和乙腈或其混合物的溶剂中,尤其是在甲苯或甲苯/二氯甲烷混合物中,在三氟化硼乙醚促进剂存在下,使式1A的供体与式2C或2D的乳糖受体反应,在所述式1A中,R1,R2和R3是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,在所述式2C或2D中,R4是低迁移性酰基基团,如4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,-OR8处于β-取向,并且R11是乙酰基或苯甲酰基,优选为乙酰基。
同样在所述方法的优选实施方案中,以上式1的供体可以与式2E的四糖受体反应,
其中R4是酰基,R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,优选为酰基,R8是通过氢解可去除的基团,并且R12是酰基,从而产生HMO核心结构的前体,其是由式6表征的线性六糖,并且属于式3的化合物,
其中R1,R2,R4,R7,R8和R12如以上所定义。
在这方面,可以特别优选的是,将式1A或1B的N-乙酰基葡糖胺供体,
其中R1,R2和R3如以上所定义,优选地它们是相同的并且是指乙酰基或苯甲酰基,
与以上式2E的四糖受体反应,从而分别产生式6A的对-LNnH(对-乳-N-新六糖)前体或式6B的对-LNH(对-乳-N-六糖)前体,
其中R1,R2,R3,R4R7,R8和R12如以上所定义。
可以十分优选的是,R4是低迁移性酰基基团,并且最特别优选的是,在选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、甲苯、THF和乙腈或其混合物的溶剂中,尤其是在甲苯或甲苯/二氯甲烷混合物中,在三氟化硼乙醚促进剂存在下,使式1A的供体与式2E的乳糖受体反应,在所述式1A中,R1,R2和R3是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,在所述式2E中,R4和R7是相同的并且是酰基,特别是低迁移性酰基基团,如4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,-OR8处于β-取向,并且R11是酰基,特别是低迁移性酰基基团,如4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基。
式1的化合物可以通过已知方法制备,例如:i)通过用三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯处理,制备自相应的N-乙酰基过酰基衍生物[例如Range等Tetrahedron1997,531695,Sato等.J.Carbohydr.Chem.1998,17,703],或ii)通过用肼处理然后用甲磺酰氯处理,制备自相应的N-乙酰基过酰基衍生物[例如Bovin等Bull.Acad.Sci.USSR,Div.Chem.Sci.1981,30,2339],或iii)通过用三氟甲磺酸银处理,制备自相应的糖基氯[例如Kaji等Heterocycles2004,64,317]。优选的在本发明的方法中用作供体的根据式1的化合物是那些化合物,其具有不是残基A的R1基团,R2和R3是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基。
可以经由以下方案1,通过首先在路易斯酸(例如汞盐,BF3-乙醚)的活化条件下,用式R8OH的醇处理八-O-乙酰基乳糖或七-O-乙酰基溴化乳糖来制备其中R4和R7是相同的并且R6是H或酰基的式2A的化合物。在脱-O-乙酰基化(例如Zemplén-去保护,氨解或碱性水解),接着在酸催化剂存在下利用二甲氧基丙烷的区域选择性丙酮化(acetonidation),产生3’,4’-保护的乳糖苷,然后其可以用R4-卤化物或(R4)2O(酸酐)在常规条件下被酰化。所得的衍生物可以用酸水解以除去保护性亚异丙基基团从而产生式2的二醇,其中R5和R6是H,所述二醇可以任选地用原酸酯处理。由此获得的环状原酸酯随后可以利用酸催化剂重排而形成式2的另一种化合物,其中R6是酰基[参见例如Paulsen等Carbohydr.Res.1985,137,39;Lubineau等ibid.1997,305,501;以及其中所引用的文献]。在优选的所述方法中用作受体的根据式2A的化合物中,R6是H,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,-OR6处于β-取向,并且R4酰基基团是低迁移性酰基基团,如4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基。这些低迁移性酰基基团的特征在于不易于迁移,即,在酸性条件下在-OH基团之间移动的倾向性低。
可以由式2B的三醇化合物(参见下文),通过对伯OH的选择性保护来制备其中R6是H并且R7是缩醛保护基或甲硅烷基的式2A的乳糖受体。所得的二醇在6’-位置上的选择性无环缩醛形成可以利用例如甲氧基甲基,叔丁氧基甲基,2-甲氧基乙基,苄氧基甲基,2-四氢呋喃基卤等,在三乙胺,吗啉,二异丙基乙胺,吡啶等存在下,或利用例如二氢吡喃,1,4-二氢二英,二氢呋喃,2-甲氧基丙烯,2-苯氧基丙烯等,在酸存在下在有机溶剂如DMF,THF,二烷,乙腈等中,在0-60℃温度进行,从而产生式2A的化合物,其中R7是缩醛型基团。利用氯硅烷,在胺碱(如咪唑,三乙胺等)存在下,在室温,或利用三氟甲磺酸甲硅酯之后利用胺碱(例如2,6-二甲基吡啶)在低温度,乳糖苷二醇的选择性伯OH-甲硅烷基化反应可以产生通式2A的化合物,其中R7是甲硅烷基。
式2B的乳糖三醇受体可以以如下方式制备(参见方案2)。利用苯甲醛,取代的苯甲醛如4-甲氧基-苯甲醛,二苯甲酮或其二-O-缩醛,以产生4’,6’-保护的衍生物的已知方式对R8O-乳糖苷(参见上文)进行选择性保护,其然后在常规条件下通过酰基卤或酸酐被酰化。亚苄基缩醛通过酸性处理除去并且伯OH被选择性地甲硅烷基化。然后在碱催化的酯交换反应或碱性水解反应中除去酰基基团。在酸催化剂存在下利用二甲氧基丙烷的区域选择性丙酮化产生3’,4’-二-O-亚异丙基-6-O-甲硅烷基乳糖苷衍生物,其然后用R4-卤化物或(R4)2O(酸酐)在常规条件下被酰化。亚异丙基和甲硅烷基保护基通过酸处理除去,得到式2B的化合物。备选地,R8O-乳糖苷可以经由3’,4’-甲锡亚烷基缩醛(3’,4’-stannylidene acetal),通过加入烯丙基卤被区域选择性地烯丙基化。然后亚苄基化后接着是酰化和酸性水解如上所述地进行,从而产生3’-烯丙基化的二醇中间体,由该3’-烯丙基化的二醇中间体,在通过将烯烃异构化为乙烯基醚以及随后的裂解选择性地除去烯丙基基团后,可以获得式2B的化合物,或者在甲硅烷基化/无环缩醛化和去烯丙基化后,可以获得式2A的化合物,其中R7是甲硅烷基或无环的缩醛。
以上式4的四糖产物可以在几步中转化为适合于进一步糖基化反应的受体。例如,本文显示了式4A的化合物向式2E的化合物的转化(参见方案3)。将式4A的化合物(其中R1,R2和R3是乙酰基,并且R4和R7是相同的并且是除乙酰基外的酰基,优选为低迁移性酰基,并且在以上公开的糖基化反应中获得)用酸处理从而以选择性的方式除去乙酰基,同时其他不是乙酰基的酰基(R4和R7)不受影响。这样去保护的末端半乳糖基残基的区域择性亚异丙基化封闭3-和4-OH基团,并且剩余的OH被酰基化。在酸性条件下除去环状缩醛保护容易提供适合于在位置4处的糖基化的式2E的化合物。上述方法通常可应用于将具有类似保护模式的任何式3的产物转化为要在末端半乳糖基残基的位置4处伸长的受体。
通过本发明的方法可获得的HMO核心结构的前体可以具有与以上方案3中的式4A的化合物类似的保护模式,并且可以通过选择性酸性脱乙酰化去保护。进行如以上方案2中所示的转化步骤可以产生式2的三醇受体,其中R5,R6和R7是H。
此外,通过所述方法可获得的其中R10是无环的缩醛基团或甲硅烷基的式3的HMO核心结构的前体可以用酸处理以除去这些酸敏感性保护基并且使受影响的伯OH-基团游离以用于根据本发明方法的进一步糖基化。备选地,甲硅烷基基团可以用氟化物除去。例如,其中R7是甲硅烷基或无环的缩醛的式4A的化合物可以去-O-甲硅烷基化/去-O-缩醛化为式2C的化合物:
通过本发明的方法可获得的式3的化合物可以是这样的中间体,其可用于制备HMO核心结构如以上表1中所列出的那些,因为仅两类或三类、优选两类保护基需要被去除。
因此,式3的化合物的R10中的无环的缩醛基团或甲硅烷基基团可以在酸性条件下被裂解。起始化合物也可以含有酰基保护基。技术人员完全清楚的是,酰基基团可以仅通过极强的酸性水解(pH<1)而被去保护。技术人员能够区分哪种去保护条件影响缩醛/甲硅烷基基团同时酰基基团保持完整。此外,糖苷间键和葡糖基残基的糖苷配基也可能对酸敏感。技术人员完全清楚的是,糖苷间键和异头保护基可以仅通过强的酸性水解(pH<1-2)而被分解。技术人员能够区分哪种去保护条件影响缩醛/甲硅烷基基团而同时糖苷间键保持完整。水-其在反应环境中作为试剂必须存在-可以充当溶剂或也可以充当助溶剂。在酸性条件下稳定并且与水或酸的水溶液可完全或部分互溶的有机质子或非质子溶剂如C1-C6醇,丙酮,THF,二烷,乙酸乙酯,MeCN,二氯甲烷等可以以与水的混合物使用。所用的酸通常是质子酸,其选自但不限于乙酸,三氟乙酸,HCl,甲酸,硫酸,高氯酸,草酸,对甲苯磺酸,苯磺酸,阳离子交换树脂等,其可以以催化量至大过量的量存在。水解可以在20℃至回流的温度进行直至达到完成,这需要约2小时至3天,取决于温度、浓度和pH。优选地,使用有机酸,包括但不限于乙酸、甲酸、氯乙酸、草酸等的水溶液。另一个优选的条件是在HCl或磺酸如对甲苯磺酸或樟脑磺酸存在下,使用C1-C6醇-乙腈或C1-C6醇-水混合物。备选地,包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等的无水C1-C6醇也可以经由酸催化的转缩醛化过程用于所需的无环的缩醛型部分的分解。在20℃至回流的温度可以使用催化量的氯化氢,硫酸,高氯酸,对甲苯磺酸,乙酸,草酸,樟脑磺酸,强酸性离子交换树脂等。甲硅烷基醚可以容易地用基于HF的试剂如例如Bu4NF,KF,HF·吡啶络合物,含水的HF,NH4F,CsF,H2SiF6分解。
在碱催化的酯交换反应中,用于羟基基团的O-酰基保护基在醇溶剂如甲醇,乙醇,丙醇,叔丁醇等中,在醇化物如NaOMe,NaOEt或KOtBu存在下,在20-100℃的温度被除去。醇溶剂和醇化物优选是匹配的,也就是说,例如,乙醇溶剂应当与NaOEt一起使用。此外,使用助溶剂如甲苯或二甲苯可以有利于控制产物的粒度并避免形成凝胶。优选地,催化量的NaOMe在甲醇(Zemplén脱-O-酰化)中使用。
在碱性水解反应中,用于羟基基团的O-酰基保护基通过碱催化的水解,在水、醇或水-有机溶剂混合物中,在均相或多相反应条件下,在0-100℃的温度被除去。选择的碱通常是强碱,如LiOH,NaOH,KOH,Ba(OH)2,K2CO3,碱性离子交换树脂,四烷基氢氧化铵等。碱可以在水溶液中使用。由此,仅除去O-酰基,并且乙酰胺基不受影响。优选地,碱是NaOH,并且溶剂是甲醇。
因此,所述方法的优选实施方案可以包括以下的另外步骤:对通式3的化合物进行脱-O-酰化和任选的去-O-甲硅烷基化/去-O-缩醛化以获得由式7表征的HMO核心结构的R8-糖苷,
其中R8是通过氢解可去除的基团,Z是-OH或任选地被卤素原子取代的乙酰氨基,当Y是-OH时Q’是键,或者当Z是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时Q’是包含任选被N-乙酰乳糖胺基残基或乳-N-二糖基残基取代的乳糖部分的糖连接物,R13选自由以下各项组成的组:式C的残基,N-乙酰乳糖胺基残基和乳-N-二糖基残基,R14选自由以下各项组成的组:H,式C的残基,和任选地被1或2个N-乙酰乳糖胺基部分或乳-N-二糖基部分取代的N-乙酰乳糖胺基残基,前提是R13和R14中的至少一个是式C的残基,
其中R15基团中的一个是β-D-吡喃半乳糖基基团而另一个R15基团是H。
在这方面,可以尤其优选的是,在式C的残基中n是3,并且当Z是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时,该乙酰氨基优选为-NHCOCH3。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中,当在式7的化合物中的Q’是如上所定义的寡糖连接物并且Z是任选被卤素原子取代的乙酰氨基时,连接物可以是二价乳糖基残,其与OR8基团经由异头碳原子相连,并且还经由一个OH-基团通过糖苷间键(优选为β-键)与式7的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分相连基。更优选地,式7的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分连接至乳糖基残基的3’-OH,并且因此二价连接物可以是如下所示的:
此外,连接物Q’可以包括被N-乙酰乳糖胺基或乳-N-二糖基部分取代的乳糖基残基,该乳糖基经由异头碳原子连接至OR8基团,并且还经由一个OH-基团通过糖苷间键(优选为β-键)连接至式7的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分。取代基N-乙酰乳糖胺基或乳-N-二糖基部分通过β-糖苷间键连接至乳糖基残基的一个OH-基团,优选连接至3’-OH基团。更优选地,式7的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分连接至乳糖基残基的6’-OH,因此二价连接物可以是以下显示的那些:
此外,连接物Q’可以包括被N-乙酰乳糖胺基部分取代的乳糖基残基,所述乳糖基经由异头碳原子连接至OR8基团。取代基N-乙酰乳糖胺基部分通过β-糖苷间键连接至乳糖基残基的一个OH-基团,优选连接至3’-OH基团。连接物经由取代基N-乙酰乳糖胺基残基的一个OH-基团通过糖苷间键(优选为β-键)连接至式7的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分。更优选地,式7的衍生物的N-乙酰乳糖胺组分连接至取代基N-乙酰乳糖胺基残基的3’-OH,因此二价连接物可以是以下显示的那些:
在更优选的实施方案中,式7的HMO核心结构的R8-糖苷是由式8表征的LNT或LNnT的R8-糖苷,
其中R8和R15如以上所定义,
其可以通过脱-O-酰化反应,优选地通过碱催化的酯交换反应或碱性水解反应,制备自以上式4的化合物,优选地制备自式4的化合物,其中R7是酰基,特别地其中R4是低迁移性酰基基团。
同样更优选地,式7的HMO核心结构的R8-糖苷是LNnH的R8-糖苷,其可以通过脱-O-酰化反应,优选地通过碱催化的酯交换反应或碱性水解反应,制备自以上式5A或5B的化合物,优选地制备自式5A或5B的化合物,其中R4是低迁移性酰基基团。
同样更优选地,式7的HMO核心结构的R8-糖苷是对-LNnH的R8-糖苷,其可以通过脱-O-酰化反应,优选地通过碱催化的酯交换反应或碱性水解反应,制备自以上式6A的化合物,优选地制备自式6A的化合物,其中R7是酰基,特别地其中R4是低迁移性酰基基团。
去除R8-配基并且由此恢复异头OH-基团典型地发生在质子溶剂或质子溶剂的混合物中。质子溶剂可以选自由水、乙酸和C1-C6醇组成的组。也可以使用一种或多种质子溶剂与一种或多种合适的与该质子溶剂可部分或完全互溶的非质子有机溶剂(如THF,二烷,乙酸乙酯或丙酮)的混合物。水,一种或多种C1-C6醇或水和一种或多种C1-C6醇的混合物优选被用作溶剂系统。可以使用含有任意浓度的要被氢解的化合物的溶液或悬浮液。将反应混合物在10至100℃、优选20至60℃的温度,在1至50bar的氢气氛中,在催化剂如钯,阮内镍或任何其他合适的金属催化剂、优选为碳载钯或钯黑存在下搅拌,直至反应完成。催化剂浓度的范围通常为0.1%至10%(基于式7的化合物的重量)。优选地,催化剂浓度的范围为0.15%至5%,更优选为0.25%至2.25%。也可以进行转移氢解,其中氢在原位产生自环己烯,环己二烯,甲酸或甲酸铵。加入有机或无机碱/酸和/或碱性和/或酸性离子交换树脂也可以用于改善催化氢解的动力学。当卤素取代基存在于前体的取代苄基部分上时,使用碱性物质是尤其优选的。优选的有机碱包括三乙胺,二异丙基乙胺,氨水,氨基甲酸铵或二乙胺。优选的有机/无机酸包括甲酸,乙酸,丙酸,氯乙酸,二氯乙酸,三氟乙酸,HCl或HBr。这些条件允许简单、方便且精巧地去除异头保护基从而产生纯的HMO核心结构,其可以使用常规后处理(work-up)程序以结晶、非结晶固体,糖浆形式或浓缩的水溶液与反应混合物分离。应当强调的是,其中n是0、1或2的官能团,和/或式7的化合物中表示被卤素原子取代的乙酰氨基的Z基团在所采用条件下容易地转化为乙酰氨基。
在优选的实施方案中,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,并且-OR8处于β-取向。更优选地,对1-O-苄基LNT,1-O-苄基LNnT,1-O-苄基LNnH或1-O-苄基对-LNnH进行催化氢解以分别产生LNT,LNnT,LNnH或对-LNnH。氢解可以在水或含水的醇中、优选在水/甲醇或水/乙醇混合物(醇含量:10-50v/v%)中,在15-65℃、优选在60-65℃进行。1-O-苄基衍生物的浓度可以为140-230g/l,并且催化剂浓度可以为0.4%至1.2%(基于1-O-苄基衍生物的重量的金属含量的重量)[参见WO2011/100980]。
式3的化合物是有价值的中间体,其用于制备HMO核心结构如LNT,LNnT,LNnH或对-LNnH,以及用于制备具有LNT或LNnT基序的寡糖如Lewisa或Lewisx型化合物。特别有价值的是本发明的式3’的化合物,
其中R4’是低迁移性酰基基团,R6是H或酰基,优选为H,R8是通过氢解可去除的基团,Y是-OR4’或任选地被卤素原子取代的乙酰氨基,当Y是-OR4’时Q是键,或者当Y是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时Q是包含任选地被过酰化N-乙酰乳糖胺基残基或过酰化乳-N-二糖基残基取代的过酰化乳糖部分的糖连接物,R9选自由以下各项组成的组:式B的残基,过酰化N-乙酰乳糖胺基残基和过酰化乳-N-二糖基残基,并且R10选自由以下各项组成的组:式B的残基,酰基,缩醛型基团,甲硅烷基和任选地被1或2个过酰化N-乙酰乳糖胺基部分或乳-N-二糖基部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基,前提是R9和R10中的至少一个是式B的残基,
其中X是选自由F,Cl,Br和I组成的组中的卤素原子,n是0,1,2或3,并且R1基团中的一个是式A的残基,
并且另一个R1基团是酰基,并且R2和R3独立地是酰基。
式3’的化合物可以是α-或β-异头物或α-和β-异头物的异头混合物。式3’的HMO核心结构前体可以是结晶固体,油,浆液,沉淀的非结晶物质或喷雾干燥的产物。如果是结晶的,则式3’的化合物可以以无水的或水合的晶体形式(通过在其晶体结构中结合一个或若干个水分子)存在。同样地,式3’的化合物可以作为晶体物质存在,将配体如有机分子和/或离子结合到其晶体结构中。
在优选的式3’的化合物中,n是3并且,当Y是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时,该乙酰氨基是非取代的,即-NHCOCH3。
在另一个优选的式3’的化合物中,提供式4’的LNT或LNnT前体,
其中R1,R2,R4’,R6和R8如以上所定义,并且R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,优选为酰基或甲硅烷基,更优选为酰基。
特别优选的化合物是式4A’的LNnT前体,
其中R1,R2和R3如以上所定义并且优选是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,优选为酰基或甲硅烷基,更优选为酰基,并且R4’和R8如以上所定义。更优选地,R4’和R7是相同的低迁移性酰基基团,是4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,并且-OR8处于β-取向。
同样特别优选的化合物是式4B’的LNT前体,
其中R1,R2和R3如以上所定义并且优选是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,优选为酰基或甲硅烷基,更优选为酰基,并且R4’和R8如以上所定义。更优选地,R4’和R7是相同的低迁移性酰基基团,是4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,并且-OR8处于β-取向。
在另一个优选的式3’的化合物中,提供属于式3’的化合物的式5’的六糖HMO核心结构的前体,
其中R1,R2,R4’和R8如以上所定义,
特别是式5A’的LNnH(乳-N-新六糖)前体,
其中R1,R2和R3如以上所定义并且优选是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,并且R4’和R8如以上所定义,
或式5B’的LNnH前体,
其中R1,R2和R3如以上所定义并且优选是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,R4’和R8如以上所定义,并且R11是酰基,优选为乙酰基或苯甲酰基。
更优选地,在5A’或5B’的化合物中,R4’是低迁移性酰基基团,是4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,并且-OR8处于β-取向。
同样优选的式3的化合物’是式6’的线性六糖前体,
其中R1,R2,R4’和R8如以上所定义,R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,优选为酰基,并且R12是酰基,
特别是式6A’的对-LNnH前体,
其中R1,R2和R3如以上所定义并且优选是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,并且R4’,R7,R8和R12如以上所定义。
更优选地,R4’是低迁移性酰基基团,是4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,并且-OR8处于β-取向。
还提供式2B的乳糖受体,
其中R4是酰基并且R8是通过氢解可去除的基团。
以上式2B的化合物可以是α-或β-异头物或α-和β-异头物的异头混合物。式2B的乳糖受体可以是结晶的固体,油,浆液,沉淀的非结晶物质或喷雾干燥的产物。如果是结晶的,则式2B的化合物可以以无水的或水合的晶体形式(通过在其晶体结构中结合一个或若干个水分子)存在。同样地,式2B的化合物可以作为晶体物质存在,将配体如有机分子和/或离子结合到其晶体结构中。
优选地,式2B的化合物中的R4是低迁移性酰基基团。更优选地,选择式2B的化合物,其中R4是低迁移性酰基基团,是4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,尤其是2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,尤其是苯甲酰基或4-氯苯甲酰基,R8是任选地被以下基团中的一个或多个取代的苄基:苯基,烷基和卤素,特别是未取代的苄基,4-氯苄基,3-苯基苄基和4-甲基苄基,并且-OR8处于β-取向。
参考以下举例说明性的且不限制本发明的示例性实施方案,本发明的其他特征将变得明显。
实施例
供体
式1A(R1=R2=R3=乙酰基)和1B(R1=R2=R3=乙酰基)的化合物根据Range等Tetrahedron1997,53,1695中所述的方法分别合成自过乙酸N-乙酰乳糖胺和过乙酸乳-N-二糖。
实施例1
苄基4-O-(6-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷
将苄基2,3,6-三-O-乙酰基-4-O-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(103g,Paulsen等Carbohydr.Res.1985,137,39),叔丁基二甲基氯硅烷(29g)和咪唑(26.2g)在DMF(473ml)中的混合物在室温搅拌24小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释并在真空中除去溶剂。将残余物溶解在二氯甲烷(11)中并用1M氢氧化钠溶液(2x550ml)和饱和氯化钠溶液(400ml)萃取。将有机相用硫酸钠干燥并将溶剂蒸发。然后将己烷(300ml)添加到浆液状残余物并倾析。将剩余的物质置于甲苯(400ml)中并蒸发至干,从而得到稠浆液(138g),其被用于下一步。
将以上粗浆液(121.3g)溶解在甲醇(1.41)中并通过加入甲醇钠(2.36g)将pH调至9。在室温搅拌15小时后,将反应混合物用二氯甲烷稀释并将溶剂蒸发。残余物结晶自二异丙基醚-异丙醇混合物从而得到白色固体(70.16g,两步80%。第二部分产物(second crop)(10.2g,12%)获得自母液。
实施例2
苄基4-O-(3,4-O-亚异丙基-6-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷
将苄基4-O-(6-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(70g)溶解在乙腈(245ml)和2,2-二甲氧基丙烷(88ml)中。加入对甲基苯磺酸在水(80ml)中的5%溶液,并将混合物在45℃搅拌2.5小时。通过加入Na2CO3来中和酸,并通过蒸发除去溶剂。将残余物分配在氯仿(700ml)和水(250ml)之间,并将有机相用水、1M HCl-溶液和盐水洗涤。在干燥和浓缩后获得的残余物结晶自叔丁基甲基醚从而得到白色固体(47g,63%)。
实施例3
苄基2,3,6-三-O-苯甲酰基-4-O-(2-O-苯甲酰基-3,4-O-亚异丙基-6-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷
将苄基4-O-(3,4-O-亚异丙基-6-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(50.1g)和4-二甲基氨基吡啶(0.21g)溶解在吡啶(101ml)和二氯甲烷(80ml)中。在用冷水冷却下缓慢加入苯甲酰氯(48ml)在二氯甲烷(20ml)中的溶液,并在室温继续搅拌90min。用甲醇猝灭后,通过蒸发除去挥发性溶剂,并将残余物置于二氯甲烷(800ml)中,将其用水洗涤,充分地用10%柠檬酸溶液和饱和Na2CO3溶液洗涤。将有机相干燥和浓缩,并且将残余物结晶自通过加入己烷的叔丁基甲基醚,从而得到白色固体(77.8g,91%)。
实施例4
苄基2,3,6-三-O-苯甲酰基-4-O-(2-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷
A)将苄基2,3,6-三-O-苯甲酰基-4-O-(2-O-苯甲酰基-3,4-O-亚异丙基-6-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(74.8g)悬浮在乙酸(600ml)和水(120ml)的混合物中,并在65℃搅拌2.5小时。当开始结晶时,在真空下除去约一半的溶剂。冷却后,收集形成的晶体并用醚洗涤。将母液浓缩至干并且第二部分产物结晶自异丙醇。合并两部分产物从而得到白色固体(40g,63%)。
M.p.:213-214℃
LC-MS(ES+):m/z866.4[M+NH4]+,871.4[M+Na]+,887.5[M+K]+
13C-NMR(400MHz,CDCl3)δ:Glc C-198.8C-271.6C-373.4C-476.5C-573.0C-662.8,Gal C-1101.1C-273.6C-372.8C-469.7C-574.3C-662.1,CH2Ph70.3,CH2 Ph136.5128.5128.1128.0,COPh166.4,166.0165.6,165.2,COPh136.4,133.3133.2,129.8129.7129.6129.2,129.1128.6.
B)将苄基4-O-(3-O-烯丙基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(Jung等Liebigs Ann.Chem.,1989,1099;33.07g)、苯甲醛二甲缩醛(12.6ml)和对甲苯磺酸(1.33g)溶解在DMF(420ml)中。将溶液在70℃保持45min。然后加入第二部分的苯甲醛二甲缩醛(12.6ml)并继续加热达另外的30min。冷却后,加入固体NaHCO3(600mg)用于中和酸。在真空下蒸发溶剂,得到白色固体粗产物,其未经进一步纯化下用于下一步。
向以上粗物质在吡啶(280ml)中的冷溶液中加入苯甲酰氯(42ml)和4-二甲基氨基吡啶(0.20g)。将反应混合物在室温搅拌24小时然后蒸发至干。将残余物溶解在氯仿(1000ml)中并用饱和NaHCO3溶液萃取。将有机相用Na2SO4干燥并蒸发。在加入醚后,白色粉末被沉淀(47g,两步的69%)。
将以上白色粉末悬浮在80%乙酸溶液(21)中,并将溶液回流1h,得到清澈溶液。将溶剂完全蒸发并将残余物用醚处理从而沉淀白色粉末,在过滤和干燥后,将所述白色粉末悬浮在甲醇(1800ml)中。小心地加入碳载钯(10%,5g)在水(100ml)中的悬浮液,之后加入在水(100ml)中的对甲苯磺酸(5g)。将反应混合物回流14小时。滤除催化剂并用CHCl3洗涤。将溶剂蒸发,并在二氧化硅上对残余物进行急骤色谱。收集澄清级分并蒸发,得到产物,通过加入醚使所述产物沉淀(20g,两步中49%)。
实施例5
根据WO2011/100980的实施例2制备受体。
向供体(1.823g,2.95mmol)和受体(2.076g,1.85mmol)在无水甲苯(15mL)中的混合物中,加入BF3·OEt2(105μL,0.83mmol))。在加入Et3N(100μL)时将反应烧瓶加热至60℃达5小时,之后允许混合物达到室温然后蒸发而得到泡沫。将获得的粗产物通过急骤色谱法纯化并且再结晶而得到产物,为白色固体(1.65g,0.95mmol,51%)。M.p.254.5-255.5℃。
1H-NMR(CDCl3,600MHz)δ=1.42(s,3H),1.93(s,3H),1.96(s,3H),1.98(s,3H),1.99(s,3H),2.00(s,3H),2.01(s,3H),2.80(s,1H),3.47(dd,1H,J=5.15.1Hz),3.49(ddd,1H,J=2.64.9,9.3Hz),3.58(ddd,1H,J=8.0,8.7,9.8Hz),3.62(dd,1H,J=9.19.3Hz),3.66(dd,1H,J=3.19.7Hz),3.68(ddd,1H,J=1.84.49.8Hz),3.72(dd,1H,J=5.111.6Hz),3.82(dd,1H,J=6.37.1Hz),3.90(d,1H,J=3.1Hz),3.97(dd,1H,J=4.912.2Hz),4.02(dd,1H,J=7.111.2Hz),4.03(dd,1H,J=9.09.8Hz),4.06(dd,1H,J=6.311.2Hz),4.20(dd,1H,J=5.111.6Hz),4.38(dd,1H,J=1.812.1Hz),4.43(dd,1H,J=2.612.2Hz),4.44(d,1H,J=8.0Hz),4.48(dd,1H,J=4.4,12.1Hz),4.50(d,1H,J=8.2Hz),4.52(d,1H,J=12.6Hz),4.63(d,1H,J=8.0Hz),4.65(d,1H,J=8.0Hz),4.77(d,1H,J=12.6Hz),4.92(dd,1H,J=3.29.9Hz),5.03(dd,1H,J=9.19.8Hz),5.04(dd,1H,J=8.09.9Hz),5.14(d,1H,J=8.7Hz),5.30(d,1H,J=3.2Hz),5.31(dd,1H,J=8.29.7Hz),5.36(dd,1H,J=8.09.5Hz),5.54(dd,1H,J=9.09.5Hz),7.08-8.0(m,25H).
13C-NMR(CDCl3,150.9MHz)δ=20.5,20.6(3C),20.7(2C),22.6,54.7,60.7,61.5,62.8,62.9,66.5,67.6,69.1,70.6,70.7,70.8,71.2,71.6,71.9,72.3,72.8,72.9,73.0,75.4,80.3,98.8,100.5,100.7,101.0,127.3,127.6,127.7,128.0,128.2,128.4,128.6,128.7,128.9,129.1,129.2,130.8,130.9,131.0,131.1,131.2,136.3,136.3,163.6,164.4,164.6,165.1,165.2,169.1,170.0,170.1,170.2,170.3(2C),170.4.
实施例6
根据WO2011/100980的实施例4制备受体。
A)向供体(0.488g,0.789mmol)和受体(0.470g,0.493mmol)在无水甲苯/DCM混合物(9:1,5mL)中的混合物中,加入BF3·OEt2(30μL,0.24mmol))。将反应烧瓶加热至55℃过夜并用Et3N猝灭。允许混合物达到室温然后蒸发而得到粗产物。通过急骤色谱法的纯化和再结晶,得到产物,为白色固体(0.387g,0.2465mmol,50%)。M.p.255-256℃。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ=1.40(s,3H),1.94(s,3H),1.96(s,3H),1.98(s,3H),2.00(s,3H),2.02(s,3H),2.11(s,3H),2.65(s,1H),3.45-3.51(m,2H),3.58-4.21(m,11H),4.39-4.44(m,3H),4.50-4.55(m,3H),4.64(d,1H,J=8.1Hz),4.64(d,1H,J=8.1Hz),4.78(d,1H,J=12.6Hz),4.91(dd,1H,J=3.310.2Hz),4.99-5.07(m,3H),5.30(d,1H,J=3.3Hz),5.36(dd,1H,J=8.19.6Hz),5.45(dd,1H,J=7.89.9Hz),5.63(dd,1H,J=9.69.6Hz),7.09-8.09(m,30H).
13C-NMR(CDCl3,75.4MHz)δ20.4,20.5,20.6(2C),20.6,20.7,22.4,54.8,60.6,61.7,62.5,62.7,66.5,67.8,69.0,70.4,70.5,70.8,71.0,71.7,71.8,72.4,72.70(2C),72.9,75.7,76.1,80.4,99.0,100.6,100.7,100.9,127.6-129.9,132.9,133.1,133.2,133.3,133.5,136.4,164.5,165.2,165.4,165.9,166.0,169.1,170.0,170.0,170.2,170.3,170.6.
B)在75℃向受体(135.2g)在甲苯(400ml)和二氯甲烷(l20m1)中的溶液zh,加入BF3-乙醚(16.5ml),之后加入供体的溶液(132g溶解在300ml甲苯和100ml二氯甲烷中)。在加入后,将反应混合物在75℃搅拌2小时,冷却至室温,用二氯甲烷(540ml)稀释并用饱和碳酸氢钠溶液(140ml)萃取。将水相用二氯甲烷(150ml)萃取并将合并的有机相用盐水(150ml)洗涤。对有机相进行蒸馏,由此蒸馏出约650ml溶剂。然后加入甲苯(450ml)并且继续蒸馏直至获得结晶浆液。在冷却、过滤和干燥后,获得标题化合物,为白色晶体物质(156.7g,75%)。
实施例7
1-O-苄基-β-LNnT
将实施例6的化合物(13.6g)悬浮在甲醇(200ml)中并加入NaOMe的溶液(25%,在甲醇中,2.7ml)。将悬浮液在55-56℃搅拌7小时。蒸馏出约45-50ml甲醇并将所得的浆液在室温搅拌7小时,然后过滤,并用甲醇洗涤。然后在真空中干燥获得的白色固体,从而得到5.75g(83%)的标题化合物。特性符合根据WO2011/100980中公开的那些。
实施例8
受体根据WO2011/100980的实施例4制备。
将供体(100mg)和受体(200mg)悬浮在甲苯(1ml)中,加入粉末状的分子筛4A(100mg),之后加入BF3·OEt2(10μl)。在73-75℃将混合物在密闭的小瓶中振动12小时,并且在冷却后直接将其送至硅胶柱。色谱法得到108mg的白色固体(42%)收率。
MS:C80H83NO32的m/z计算值1569.49,实验值1570.58[M+H]+和1592.7[M+Na]+。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.85-8.1(m,10H),7.05-7.65(m,20H),5.63(重叠的t,J=9.3Hz,1H和br.s,1H,NH),5.47(dd,J=9.7,7.8Hz,1H),5.35(dd,J=9.7,7.9Hz,1H),5.26(d,J=3.5Hz,1H),5.05(d,J=8.1Hz,1H),4.96(dd,J=10.4,7.8Hz,1H),4.75-4.85(m,3H),4.65(d,J=7.8Hz,1H),4.4-4.6(m,5H),4.30(d,J=7.8Hz,1H),4.1-4.2(m,2H),3.95-4.05(m,4H),3.94(d,J=3.5Hz,1H),3.45-3.8(m,7H),2.95(dt,J=10.1,7.4Hz,1H,CH-NHAc),2.09,2.01,1.97,1,95,1.93,1,92(6s,18H,OAc的6Me),1.25(s,3H,NHAc的Me).
13C NMR(75MHz,CDCl3=77.16ppm)δ171.18,170.67,170.44,170.27,170.20,169.41,168.96(7C=O of Ac),166.12,166.04,165.77,165.30,165.03(5C=O of Bz),136.59(Bn),133.73,133.54,133.42,133.28,133.14(5Bz),129.95,129.88,129.62,129.41,129.12,128.84,128.78,128.60,128.40,128.30,127.95,127.80(芳族的CH),125.39,100.83,100.65,99.39,99.22(4异头CH),80.89,76.04,75.76,73.06,72.91,72.45,72.00,71.85,71.12,71.05,70.60(CH2OBn),69.39,68.89,68.02,66.90,62.72,62.64,62.31,61.06,58.47,22.68(NHAc的Me),20.84,20.75,20.72,20.63(OAc的Me,重叠的)。
实施例9
1-O-苄基-β-LNT
在实施例7公开的条件下,对根据实施例8的化合物进行脱酰基化,得到标题化合物,为白色固体。
1H-NMR(D2O,400MHz)δ2.03(s,3H,CH 3CONH),3.35(dd,1H,J=8.18.5Hz,H-2),3.49(m,1H,H-5``),3.53(m,H-2```),3.65(m,1H,H-3```),3.57(dd,1H,J=8.19.0Hz,H-4``),3.58(m,1H,H-5),3.59(dd,1H,J=7.710.0Hz,H-2`),3.62(m,1H,H-3),3.63(m,1H,H-4),3.71(m,1H,H-5`),3.71(m,1H,H-5```),3.73(dd,1H,J=3.310.0Hz,H-3`),3.76(m,2H,H-6ab```),3.76(m,2H,H-6ab`),3.80(m,1H,H-6a``),3.80(dd,1H,J=5.012.2Hz,H-6a),3.82(dd,1H,J=8.110.5Hz,H-3``),3.90(m,1H,H-6b``),3.90(dd,1H,J=8.410.5Hz,H-2``),3.92(d,1H,J=3.3Hz,H-4```),3.98(dd,1H,J=1.612.2Hz,H-6b),4.15(d,1H,J=3.3Hz,H-4`),4.44(d,1H,J=7.7Hz,H-1`),4.45(d,1H,J=7.7Hz,H-1```),4.56(d,1H,J=8.1Hz,H-1),4.73(d,1H,J=8.4Hz,H-1``),4.76(d,1H,J=11.7Hz,CH 2Ph),4.94(d,1H,J=11.7Hz,CH 2Ph),7.40-7.50(m,5H,Ph).
13C-NMR(D2O,100MHz)δ24.9(CH3CONH),57.4(C-2``),62.8(C-6),63.2(C-6``),63.7(C-6```),63.7(C-6`),71.0(C-4`),71.2(C-4```),71.3(C-4``),72.7(C-2`),73.4(C-2```),74.2(CH2Ph),75.2(C-3```),75.5(C-2),77.1(C-3),77.5(C-5`),77.6(C-5```),77.9(C-5),78.0(C-5``),81.1(C-4),84.7(C-3`),84.8(C-3``),103.7(C-1),105.3(C-1``),105.6(C-1`),106.2(C-1```),131.1(Ph),131.4(2C,Ph),131.5(2C,Ph),139.2(Ph),177.7(CH3 CONH).
M.p.245℃(dec.).[α]D 22=-10.3(c=1,H2O).
实施例10
将根据实施例4的化合物(47.8g)溶解在THF(100ml)中并加入BF3-乙醚(0.5ml)。在68-75℃向该溶液中缓慢加入溶解在甲苯(260ml)中的供体(98.8g)(4天)。在冷却至室温后,加入饱和碳酸氢钠溶液(60ml)和水(30ml),并将所得的两相系统用乙酸乙酯(200ml)萃取。然后将有机相用盐水和水洗涤,用硫酸钠干燥并蒸发。将残余物用TBDMS氯化物甲硅烷基化从而衍生出极性副产物。在柱色谱后,分离出标题六糖(105.9g)。
1H和13C共振归属,在CDCl3中,25℃,600MHz:
O-酰基保护基的羰基:170.6170.6170.5170.5170.3170.3170.1170.0170.0170.0169.3169.1(OAc)165.9165.5165.3164.6(OBz)
实施例11
将苄基2,3,6-三-O-苯甲酰基-4-O-(2-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(10g)、4-二甲基氨基-吡啶(30mg)和叔丁基二苯基氯硅烷(3.1ml)溶解在吡啶(50ml)中,并将混合物在45℃搅拌20小时。在将溶剂蒸发后,将残余物置入二氯甲烷(120ml)中,用水、10%柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液萃取,之后干燥并除去溶剂。向获得的残余物中加入己烷,并将沉淀过滤,用异丙基醚洗涤并且干燥,从而得到苄基2,3,6-三-O-苯甲酰基-4-O-(2-O-苯甲酰基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷,为固体(11.42g)。
将10g的以上固体溶解在甲苯(30ml)和二氯甲烷(10ml)的混合物中。向该溶液中加入BF3-乙醚(180μl),之后在82℃在6小时期间加入供体(8.5g)在甲苯(26ml)中的溶液。在相同温度继续搅拌达另外的2小时。在冷却至室温后,将反应混合物用二氯甲烷(60ml)稀释,用饱和碳酸氢钠溶液和盐水萃取,并干燥。在溶剂蒸发后,获得粗的甲硅烷基化的四糖,为黄色泡沫(23.5g),从其中通过柱色谱纯化出19g,从而得到纯的甲硅烷基化的四糖(6.8g)。
将6.25g的以上甲硅烷基化的四糖溶解在THF(28ml)中,并加入Bu4NF(1.15g)。将混合物在室温搅拌20min,用二氯甲烷(130ml)稀释并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。将有机相干燥和蒸发,将获得的泡沫通过加入己烷固化,从而得到标题四糖二醇,为粉末(5.55g)。
实施例12
将根据实施例11的化合物(8.0g)溶解在甲苯(24ml)和二氯甲烷(8ml)的混合物中,并加入BF3-乙醚(67μl)。在6小时内在75℃向该溶液中加入溶解在甲苯(15ml)中的供体(5.05g)。在冷却至室温后,将混合物用二氯甲烷(100ml)稀释,用饱和碳酸氢钠溶液和盐水(30ml)洗涤,干燥并蒸发而得到泡沫状残余物(13.4g)。对小量样品进行色谱法从而获得纯的标题四糖,其与实施例10的化合物具有相同的分析数据。
实施例13
1-O-苄基-β-LNnH
将根据实施例10的化合物(5.71g)用NaOMe/MeOH脱酰基化,如在实施例19中所述,得到标题化合物(1.99g)。
LC-MS(ES+):m/z1185.5[M+Na]+,604.3[M+2Na]2+
NMR:参见图1和2。
实施例14
将根据实施例6的化合物(58.5g)溶解在二氯甲烷(300ml)和甲醇(300ml)中。在1小时中向该溶液中逐滴加入乙酰氯(19ml)同时保持温度在-5℃。在30min额外的搅拌后,除去冷却浴并在室温继续搅拌过夜。加入碳酸氢钠以调节pH至7,然后将混合物用甲醇(50ml)和二氯甲烷(50ml)稀释,之后加入活性炭。在过滤后,将滤液蒸发至其初始体积的一半并且溶液变为悬浮液。在用甲醇稀释后,滤出固体并干燥,从而得到白色粉末(39.2g,80%)。
LC-MS(ES+):m/z1318[M+H]+,1340.6[M+Na]+
实施例15
A)向根据实施例14的化合物(9.8g)在乙腈(49ml)中的溶液中加入2,2-二甲氧基-丙烷(5.0ml)和对甲苯磺酸一水合物在乙腈(395μl)中的10%溶液。将混合物在45℃搅拌1小时。在冷却至室温后,通过加入固体碳酸氢钠来中和酸。在除去溶剂后,将残余物置入二氯甲烷(140ml)和水(20ml)中,分离各相,将有机相用水洗涤并干燥。在去除溶剂后获得标题化合物,为浅褐色固体物质(9.9g)。
1H和13C共振归属,在DMSO中,25℃,400MHz(酰基保护基未详述于表中):
B)将根据实施例14的化合物(33.3g)、4-二甲基氨基吡啶(120mg)和叔丁基二苯基氯甲硅烷(14ml)在吡啶(130ml)中的混合物在室温搅拌5小时。在加入额外的叔丁基二苯基氯甲硅烷(3.5ml)后,继续搅拌16小时。在真空下蒸发大部分吡啶,将残余物溶解在二氯甲烷(500ml)中并用水、10%柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。在除去溶剂后,将所得的稠浆液通过加入己烷固化,得到二甲硅烷基化的产物,为浅褐色固体(50.4g)。
将以上浅褐色物质溶解在乙腈(250ml)中,并将其亚异丙基化,如方法A中所述(使用30ml的2,2-二甲氧基丙烷和0.24g的对甲苯磺酸一水合物)。将产物通过柱色谱纯化从而得到23.2g的亚异丙基化的产物。
在室温将在四氢呋喃(200ml)中的以上物质用四丁基氟化铵(7.45g)处理。在反应完成后(1小时),在真空中除去溶剂,将残余物溶解在氯仿(300ml)中,用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤,并干燥。在除去溶剂后,残余物在己烷中沉淀,从而获得标题物质,为浅褐色固体(18.8g)。
实施例16
在0℃向根据实施例15的化合物(0.62g)、4-二甲基氨基-吡啶(1mg)在吡啶(4.5ml)中的混合物中加入苯甲酰氯(355μl)。将混合物在室温搅拌21小时,然后滴入额外部分的苄基氯(100μl)。18小时后,缓慢加入甲醇(1ml),之后加入甲苯(401ml),并将混合物蒸发至干。将残余物溶解在二氯甲烷(25ml)中,用水和饱和碳酸氢钠溶液萃取并干燥。在除去溶剂后,将所得的物质在己烷中固化从而得到标题化合物(0.66g)。
LC-MS(ES+):m/z946.2[M+2Li]2+
1H和13C共振归属,在CDCl3中,25℃,400MHz(酰基保护基未详述于表中):
实施例17
在室温在剧烈搅拌下向根据实施例16的化合物(11.29g)在二氯甲烷中的溶液35%中加入高氯酸溶液(2.3ml)。1小时后,将混合物用二氯甲烷(75ml)稀释,用饱和碳酸氢钠洗涤并干燥。在除去溶剂后,获得标题化合物,为白色固体(10.3g)。
LC-MS(ES+):m/z926.4[M+2Li]2+
1H和13C共振归属,在CDCl3中,30℃,400MHz(保护基未详述于表中):
实施例18
向根据实施例17的化合物(5.0g)在二氯甲烷(6ml)和甲苯(24ml)中的被加热至75℃的溶液中加入BF3-醚(67μl),之后在相同温度在23小时中缓慢加入在甲苯(9ml)中的供体(3.05g)。在冷却至室温后,加入饱和碳酸氢钠溶液(5ml)并将两相系统搅拌5min。然后加入乙酸乙酯(10ml)和水(10ml),并将各相分离,将有机相用盐水和水洗涤并干燥。在除去溶剂后,将残余物在二氧化硅柱上纯化,得到白色固体(4.55g)。
LC-MS(ES+):m/z1251[M+2Na]2+,1240[M+H+Na]2+
实施例19
1-O-苄基-β-对-LNnH
在室温向根据实施例18的化合物(11.0g)在甲醇(110ml)中的溶液中加入2mM甲醇钠溶液(1ml)。14小时后,加入乙酸(120μl)并在真空下蒸发溶剂。将残余物置入水(32ml)和四氢呋喃(65ml)中,并在室温用1M NaOH-溶液(6.5ml)处理24小时。在用乙酸(100μl)中和后,将两相乳液浓缩至15ml并用水(10ml)和甲醇(180ml)稀释。形成胶状物质,将其滤出。干燥后获得标题化合物,为白色固体(3.4g)。
LC-MS(ES+):m/z1169.5[M+Li]+
NMR:参见图3和4。
实施例20
LN T
将1-O-苄基-β-LNT(5g)悬浮在水(20ml)中,并通过加入1M HCl水溶液将pH调至5.8。加入碳载钯(10%,0.5g),并将反应烧瓶抽真空,然后用H2饱和(4bar)。将反应温度设置为50℃,并在搅拌1.5小时后,允许温度达到室温,通过过滤除去催化剂,并将水用于洗涤(10ml)。将滤液浓缩至干,获得3.46g(78%)的白色固体。
实施例21
LNnH
将1-O-苄基-β-LNnH(10.44g)溶解在水(50ml)和四氢呋喃(50ml)中。加入碳载钯(10%,1.04g)并将反应烧瓶抽真空,然后用H2饱和。将混合物在室温搅拌16小时,然后通过过滤除去催化剂,并将水用于洗涤。将滤液浓缩至干,获得8.06g(84%)的白色固体。
实施例22
对-LNnH
将对-LNnH1-O-苄基-β-对-LNnH(8.23g)溶解在水(100ml)中。加入碳载钯(10%,0.90g),并将反应烧瓶抽真空,然后用H2饱和。将混合物在室温搅拌16小时,然后通过过滤除去催化剂,并将水用于洗涤。将滤液浓缩至干,获得6.39g(84%)的白色固体。
Claims (20)
1.一种用于制备HMO核心结构的前体的方法,所述方法包括以下步骤:在卤化硼促进剂存在下,使式1的二糖葡糖胺供体,
其中X是选自由F、Cl、Br和I组成的组中的卤素原子,n是0、1、2或3,并且R1基团中的一个是式A的残基,
并且另一个R1基团是酰基,并且R2和R3独立地是酰基,
与式2的受体反应,
其中R4是酰基,R5选自由以下各项组成的组:H,过酰化N-乙酰乳糖胺基残基和过酰化乳-N-二糖基残基,R6是H或酰基,优选为H,R7选自由以下各项组成的组:H,酰基,缩醛型基团,甲硅烷基和任选地被1或2个选自过酰化N-乙酰乳糖胺基基团和乳-N-二糖基基团中的部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基,R8是通过氢解可去除的基团,Y是-OR4或任选地被卤素原子取代的乙酰氨基,当Y是-OR4时Q是键,并且当Y是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时Q是包含任选地被过酰化N-乙酰乳糖胺基残基或过酰化乳-N-二糖基残基取代的过酰化乳糖部分的糖连接物,前提是R5和R7中的至少一个是H。
2.根据权利要求1所述的方法,所述方法产生式3的化合物:
其中R4、R6、R8、Y和Q如权利要求1中所定义,R9选自由以下各项组成的组:式B的残基,过酰化N-乙酰乳糖胺基残基和过酰化乳-N-二糖基残基,并且R10选自由以下各项组成的组:式B的残基,酰基,缩醛型基团,甲硅烷基和任选地被1或2个选自过酰化N-乙酰乳糖胺基基团和乳-N-二糖基基团中的部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基,前提是R9和R10中的至少一个是式B的残基,
其中R1、R2、X和n如权利要求1中所定义。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法,其中所述卤化硼促进剂是三氟化硼,特别是三氟化硼乙醚。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中n是3并且Y是-NHCOCH3。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述受体具有式2A:
其中R4是酰基,R6是H或酰基,优选为H,R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,并且R8是通过氢解可去除的基团,
并且所述HMO核心结构的前体是式4的LNT或LNnT前体,
其中R1和R2如权利要求1中所定义,并且R4、R6、R7和R8如以上所定义。
6.根据权利要求5所述的方法,其获得式4A的LNnT前体,
其中R1、R2、R4、R6、R7和R8在权利要求5中被定义。
7.根据权利要求5所述的方法,其获得式4B的LNT前体,
其中R1、R2、R4、R6、R7和R8在权利要求5中被定义。
8.根据权利要求4所述的方法,其中所述受体具有式2B:
其中R4是酰基并且R8是通过氢解可去除的基团。
9.根据权利要求4所述的方法,其中所述受体具有式2C或2D:
其中R4和R11独立地是酰基,并且R8是通过氢解可去除的基团。
10.根据权利要求4所述的方法,其中所述受体具有式2E:
其中R4是酰基,R7选自由以下各项组成的组:酰基,缩醛型基团和甲硅烷基,R8是通过氢解可去除的基团,并且R12是酰基。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中R4是低迁移性酰基基团。
12.根据权利要求11所述的方法,其中R4是4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,优选为2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,优选为苯甲酰基或4-氯苯甲酰基。
13.根据权利要求11和12中任一项所述的方法,其中所述R1基团不是所述残基A,R2和R3是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,R8是苄基,并且-OR8处于β-取向。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法,所述方法还包括以下步骤:将所述式3的化合物脱-O-乙酰化以获得式7的HMO核心结构的R8-糖苷,
其中R8是通过氢解可去除的基团,Z是-OH或任选地被卤素原子取代的乙酰氨基,当Y是-OH时Q’是键,并且当Z是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时Q’是包含任选地被N-乙酰乳糖胺基残基或乳-N-二糖基残基取代的乳糖部分的糖连接物,R13选自由以下各项组成的组:式C的残基,N-乙酰乳糖胺基残基和乳-N-二糖基残基,R14选自由以下各项组成的组:H,式C的残基和任选地被1或2个选自N-乙酰乳糖胺基基团和乳-N-二糖基基团中的部分取代的N-乙酰乳糖胺基残基,前提是R13和R14中的至少一个是式C的残基,
其中R15基团中的一个是β-D-吡喃半乳糖基基团并且另一个R15基团是H,X是选自由F、Cl、Br和I组成的组中的卤素原子,并且n是0、1、2或3。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述式7的化合物是1-O-苄基LNT、1-O-苄基LNnT、1-O-苄基LNnH或1-O-苄基对-LNnH。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,所述方法还包括以下步骤:催化氢解以获得HMO核心结构,优选为LNT、LNnT、LNnH或对-LNnH。
17.一种式3’的化合物:
其中R4’是低迁移性酰基基团,R6是H或酰基,优选为H,R8是通过氢解可去除的基团,Y是-OR4’或任选地被卤素原子取代的乙酰氨基,当Y是-OR4’时Q是键,并且当Y是任选地被卤素原子取代的乙酰氨基时Q是包含任选地被过酰化N-乙酰乳糖胺基残基或过酰化乳-N-二糖基残基取代的过酰化乳糖部分的糖连接物,R9选自由以下各项组成的组:式B的残基,过酰化N-乙酰乳糖胺基残基和过酰化乳-N-二糖基残基,并且R10选自由以下各项组成的组:式B的残基,酰基,缩醛型基团,甲硅烷基和任选地被1或2个选自过酰化N-乙酰乳糖胺基基团或过酰化乳-N-二糖基基团中的部分取代的过酰化N-乙酰乳糖胺基残基,前提是R9和R10中的至少一个是式B的残基,
其中X是选自由F、Cl、Br和I组成的组中的卤素原子,n是0、1、2或3,并且R1基团中的一个是式A的残基,
并且另一个R1基团是酰基,R2和R3独立地是酰基。
18.根据权利要求17所述的化合物,其中R4,是4个以上碳原子的直链或支链烷酰基基团,优选为2-甲基-丁酰基或新戊酰基,或未取代或取代的苯甲酰基或萘甲酰基基团,优选为苯甲酰基或4-氯苯甲酰基。
19.根据权利要求17和18中任一项所述的化合物,其中所述R1基团不是所述残基A,R2和R3是相同的并且是乙酰基或苯甲酰基,R5是H,R6是苄基,并且-OR6处于β-取向。
20.一种式2B的化合物:
其中R4是酰基并且R8是通过氢解可去除的基团。
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