KR20120004504A

KR20120004504A - ６˝－시알릴락토오스 염 및 그의 합성 및 기타 α－시알릴올리고사카라이드의 합성 방법

Info

Publication number: KR20120004504A
Application number: KR1020117026083A
Authority: KR
Inventors: 지안카를로 타멜라니; 일라리아 롬바르다; 데보라 바르탈루치; 안드레아 대니지; 리아나 살쉬니; 마르코 마노니; 지오반니 치폴레띠
Original assignee: 이날코에스피에이
Priority date: 2009-04-06
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2012-01-12
Also published as: CN102369208A; WO2010116317A1; ZA201108057B; JP2012522761A; CA2757685A1; CO6450620A2; EP2610262A1; IT1394503B1; JP5738272B2; US20120071441A1; RU2011144851A; EP2417145B2; EP2417145A1; ITFI20090071A1; MX2011010036A; AU2010233367A1; SG175066A1; EP2417145B1; US9034844B2

Abstract

본 발명은 산업적 규모로 사용할 수 있게 하는 조건 하에서 케니히스-크노르(Koenigs-Knorr) 반응에 의한 커플링 단계를 포함하는, α-시알릴 올리고사카라이드, 특히, 6'-시알릴락토오스 및 그의 염의 합성 방법에 관한 것이다.

Description

６˝－시알릴락토오스 염 및 그의 합성 및 기타 α－시알릴올리고사카라이드의 합성 방법{6˝-sialyllactose salts and process for their synthesis and for the synthesis of other α-sialyloligosaccharides}

본 발명은 6'-시알릴락토오스의 염에 관한 것이고: 본 발명은 또한 α-시알릴-올리고사카라이드의 합성 방법에 관한 것이며, 특히, 6'-시알릴락토오스 및 그의 염의 합성 방법에 관한 것이다.

R은 유리 히드록시기를 갖는 모노사카라이드, 디사카라이드, 또는 올리고사카라이드인 것인 하기 식 (I)의 α-시알릴-올리고사카라이드는 포유동물 및 조류의 조직에 존재하며, 리포올리고사카라이드(lipooligosaccharide), 리포폴리사카라이드, 또는 당단백질의 글리칸의 우세한 형태로 존재한다:

.

이들은 다양한 글리코시드 결합으로 존재하며, 보다 일반적으로 α(2-3) 및 α(2-6) 갈락토오스 (또는 락토오스)로 존재한다. 이 시알로시드(sialoside)의 기능은 올리고사카라이드 부분의 구조적 이질성(structural heterogeneity)에 따라 동물에서 크게 다양하다. 이들은 세포간 및 세포내 사건의 매개체이며, 특히, 다수의 병원체의 생리 및 증식에서 중요한 역할을 수행한다 (DK Ress, et al., Current Organic Synthesis, 2004, 1, 31-46).

1 리터의 모유(human milk)는 약 5 내지 10 g의 유리 올리고사카라이드를 함유하며, 이 함량은 단백질의 함량과 유사하고 지질 함량을 초과한다. 130종 이상의 상이한 올리고사카라이드가 모유(Human Milk Oligosaccharides - HMO)에서 확인되었고, 유아용 인공 조제 분유는 우유로부터 유래되며, 인간에 특이적인 이 올리고사카라이드의 미량만을 함유한다. 모유의 올리고사카라이드의 기본적인 빌딩 블럭(building block)은 5종의 모노사카라이드이고, D-글루코오스 (Glc), D-갈락코오스(Gal), N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), L-푸코오스 (Fuc) 및 시알산 (N-아세틸-뉴라민산, Neu5Ac)이다. 말단 환원성 종단(terminal reducing end)은 N-아세틸락토사민의 락토오스 (Galβ1-3Glc) 또는 그 이상의 반복 단위(최대 15개의 단위)에 의해 형성된다(Galβ1-3/4GlcNAc). 락토오스 또는 폴리락토사민은 α2-3 및/또는 α2-6 결합에 의해 시알릴화될 수 있다. 모유의 시알로시드의 예는 3'-시알릴-3-푸코실락토오스(3'-sialyl-3-fucosylactose, 3'S3FL), 6'-시알릴락코오스(6'-sialyllactose, 6'SL), 3'-시알릴락토오스(3'-sialyllactose, 3'SL), 3'-시알릴락토사민(3'-sialyllattosamine, 3'SLN), 6'-시알릴락토사민(6'-sialyllactosamine, 6'SLN)이다.

포유동물 조직 및 모유에 주로 존재하는 시알로시드 중, 식 (Ia)의 화합물, 6'-시알릴락토오스 (N-아세틸뉴라미닐-락토오스, α-NeuNAc-(2→6)-β-D-Gal-(1→4)-D-Glc 또는 6'-SL)은 세포 인식 및 면역 반응을 포함한 다양한 세포 경로에 관여하는 당단백질 및 당지질의 중요한 성분이기 때문에 특히 중요하다.

6'-SL 및 그의 염은 유아용 식품 제제(food formulation)의 보조 성분으로 관심을 끈다. 6'-시알릴락토오스의 염에 대해, 문헌에서 소디움 염 (CAS Number: 157574-76-0; FW: C₂₃H₃₈NO₁₉Na, 6'-시알릴락토오스 소디움 염, 6'-N-아세틸뉴라미닐-락토오스 염) 및 암모늄 염만이 알려져 있다. 소디움 염은 식품 및 의약에서 허용가능하나, 암모늄 염은 암모늄 이온때문에 잠재적으로 독성이다. 이 이유 때문에, 식품 및 의약용으로 허용가능할 수 있는 것으로 알려진 염에 대한 대안적인 염 형태로 6'-SL을 얻는 것이 필요하다.

종래 기술에서, 시알릴-올리고사카라이드(6'-SL 포함)의 합성을 위한 다양한 전략들이 공지되어 있고 모두 시알릴산 활성화 단편(sialic activated fragment)(공여체)이 올리고사카라이드 부분(수용체)에 위치- 및 입체 특이적으로 결합되는 것인 전환 방법을 예상한다. 이 커플링의 핵심 단계에 대해, 문헌에 전적으로 효소적인 방법, 전적으로 화학적인 방법, 또는 전적으로 화학적-효소적 방법을 예상하는 3 가지 상이한 합성 전략이 알려져 있다.

효소적 경로의 경우, 시알릴트랜스퍼라아제(sialyltransferase) 및 트랜스리피다아제(translipidase)의 패밀리(엄격하게 특이적 방식으로 시알릴산을 올리고사카라이드에 첨가하는 효소)가 사용되었다. 이 합성 경로의 예가 A.T.Beyer et al Adv. Enzymol ., 1981, 52, 23-175, 및 J. Weinstein et al. J. Biol . Chem ., 1982, 257, 13845-13853에 보고된다.

그러나, 이 효소들의 사용에 여러 한계가 있다:

1) 이 효소들의 제한된 이용가능성

2) 활성화된 기질 CMP- NeuAc. 또는 PNP-NeuAc의 공여체의 합성 필요성

3) 천연 시알로시드의 합성을 위한 이용에서 유연성을 저하시키는 시알릴트랜스퍼라아제의 엄격한 특이성 (Ichigawa Y. et al. Analytical Biochem 1992, 202, 215-238, S. Sabesan et al. J. Am . Chem . Soc ., 1986, 108, 2068-2080, O. Hindsgaul et al J.Biol.Chem., 1991, 266, 17858-17862, H.J.Gross et al. Eur .J. Biochem . 1988, 177, 583-589).

화학적-효소적 경로의 경우, 이들은 S. Sabesan et al., J. Am . Chem . Soc ., 1986, 108, 2068-2080에 개시된 바와 같이, 수용체(acceptor)의 화학적 합성 및 뒤이은 효소적 시알릴화(sialylation)을 포함한다.

전적으로 화학적 경로에 중점을 두면서, 시알릴산과의 글리코시드 결합의 형성은 공여체가 같은자리(geminal) 카르복시산에 의해 전기적으로 및 입체적으로 방해된다는 사실 때문에 다소 어려운 반응이라는 것이 강조된다. 또한, C-3 상의 작용기의 부재는 입체 화학 제어를 위한 인접기 관여(anchimeric assistance)를 배제하고, 제거(elimination) 반응을 통한 부산물의 형성을 초래하고, 최종적으로 α 구조(configuration)를 갖는 결합의 형성은 아노머 효과(anomeric effect)와 관련하여 열역학적으로 불리하다. 종래 기술에서 이와 같은 결함을 해소하기 위한 시도로, 다양한 글리코실화 방법을 통해 반응하는 적절하게 보호된 히드록시기를 갖는, 적절하게 활성화된 시알릴 공여체 및 수용체의 제조를 위한 다양한 전략들이 개발되었다.

시알릴 공여체에 대해, 복잡한 분자 구조가 그의 합성, 보호, 및 활성화에 상당한 정도의 어려움을 부여한다는 것이 강조된다. 다중 작용기 속성(3개의 히드록시기) 및 3차 아노머 중심이 합성 화학자의 작업을 복잡하게 한다. 현재, 시알릴 공여체가 2-크산틴염(xanthate) (A. Marra et al., Carbohydr . Res ., 1989, 187, 35), 2-아릴 술폰 (Y. Du et al, Carbohydr . Res., 1998, 308, 161), 2-포스피트(phosphite) (RR Schmidt et al., Tetrahedron Lett ., 1992, 33, 6123 or CH Wong et al., J. Am . Chem . Soc., 1992, 114, 8748) 또는 2-할로 유도체로서 활성화될 수 있다는 것이 종래 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이와 같은 모든 기들 중에, 포스피트 및 티오 유도체는 그들의 합성을 위해 독성 시약을 필요로 하고 업계에서 다루는 것이 용이하지 않기 때문에 할로겐 유도체가 바람직하다. 할로겐 중에서, 안정하고 합성이 용이하기 때문에 클로로 유도체가 바람직하고, 실제로, 브로모 유도체는 불안정하고, 용이하게 제거되며 글리코실화 반응 동안 아노머 혼합물을 초래하는 경향이 있다. 플루오로 유도체는 클로로 유도체보다 더 정교한 합성을 요구하고, β 글리코시드 결합을 형성하는 경향이 있다. 클로로 유도체가 제조 및 사용하기에 가장 용이한 공여체일 것이다.

공여체의 구조와 관련하여, 이전의 합성 경로들보다 훨씬 더 복잡한 다른 합성 경로들은 2,3 위치에서 경쟁적 제거(competitive elimination)를 방지하기 위해 시알릴산의 C-3에 글리코실화 반응에서 인접기 관여를 제공하는 작용기의 포함을 요구한다. 이 이유 때문에, 페닐티오 또는 페닐셀레늄과 같은 작용기가 도입되었다(Y. Ito et al., Tetrahedron Lett., 1988, 29, 3987 또는 L.O. Kononov et al., Tetrahedron Lett., 1997, 38, 1599). 따라서, 이 경로들은 수득된 특이성 및 중간체의 정제 용이성에 따라 변하는 수율로 일반적으로 2.3-데히드로(dehydro) NeuAc로부터 출발하는 글리코실화 반응을 위한 활성 공여체를 수득하기 위해 여러 단계들을 요구한다.

이 이유 때문에, 식 (I)의 시알릴올리고사카라이드 및 특히, 6'SL의 합성을 위해, 하기 식 (II)를 가지며:

식 중에서, P는 적합한 보호기이고, R1은 알킬기이며, X는 염소인 것인 의 2-클로로-공여체로서 간단한 시알릴유도체(R. Kuhn et al., Chem . Ber ., 1966, 99, 611, A. Marra et al., Carb . Res., 1989, 190, 317-322 and NF Byramova et al., Carb. Res, 1992, 237, 161-175에 보고된 방법에 의해 수득가능함)를 효율적으로 사용하는 것이 바람직하며 이는 또한, 높은 독성의 반응물의 사용 없이, 산업적 규모로 용이하게 합성할 수 있고, 글리코실화 반응에서 α 결합의 특이적 형성을 초래하기 때문이다. 그러나, 이 시알릭 공여체(sialic donor)의 사용은 제1 적용 후에 상당히 감소되었고, 당해 기술은 훨씬 더 복잡한 공여체를 다룬다.

6'SL의 합성을 위한 수용체 활성화에 대해, 문헌에, 에테르 보호기, 예를 들면, 벤질기에 의해 치환된 수용체가 있으나, 그의 제거는 수소화(hydrogenation)를 요구하고, 용이하게 수행될 수 없고 (G . Pazynina et al. Tetrahedron Lett, 2002, 43, 8011-8013) 따라서, 산업적 적용이 어렵다.

시알릴산의 α-글리코시드는 프로모터로서 Ag (I)의 사용을 포함하는 케니히스-크노르(Koenigs-Knorr) 반응에 의해[Koenigs, W., Knorr, E. Chem . Ber ., 1901, 34, 957] 또는 프로모터로서 Hg (II)를 사용하는 헬페리크 변형(Helferich modification) [Helferich, B.; Zirner, J. Chem . Ber ., 1962, 95, 2604]을 사용하는 것에 의해 제조되었다. 이 반응에서 선택된 기질은 β-글리코실-할로겐화물이다. 사용 기회(employment opportunity) 및 수율을 개선시키도록 설계된, 이 고전적 방법의 다수의 변형이 알려져 있다. 이 변형들 간의 주요한 차이는 금속성 프로모터(metallic promoter)의 반대 음이온의 선택과 관련된다. 가장 통상적으로 사용되는 프로모터는 AgOTf, Ag₂CO₃, HgX₂ (X = 할로겐화물), 및 Hg(CN) 이다. 일반적으로, Ag(I) 프로모터는 보다 활성이 높고, 입체선택적인 것으로 알려져 있으나(Pazynina G. et al. Tetrahedron Lett, 2002, 43, 8011-8013) 이들은 다량(수용체 대비 6 내지 7 당량)으로 사용되어야 하므로, 합성 비용(폐기물 생성의 처리 포함)을 증가시키고, Hg(II) 프로모터는 보다 높은 수율을 제공하나 (H. Paulsen et al. Angew.Chem.Int.Ed.Engl, 1982, 927-928) 독성 때문에 취급에 어려움을 부여할 수 있다.

따라서, 단순하고, 경제적이며, 산업적 규모로 적용될 수 있고, 따라서, 문헌에서 공지된 방법들과 관련된 전술된 기술적 문제들을 극복할 수 있게 하는, 식 (I)의 화합물의 합성 방법에 대한 요구가 명확하게 존재한다.

본 발명은 하기 식 (Ib)를 가지며,

식 중에서, Mⁿ ⁺는 K⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Sr² ⁺, Fe² ⁺ 및 Al³ ⁺로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물에 의해 전술된 문제를 해결한다.

본 발명의 추가적인 대상은 하기 식 (I)을 가지며,

식 중에서, R은 유리 히드록시기를 갖는 모노사카라이드, 디사카라이드, 또는 올리고사카라이드인 것인 α-시알릴-올리고사카라이드 화합물을 합성하는 방법으로서, 상기 방법은

(a) 케니히스-크노르(Koenigs-Knorr) 반응에 의해 P는 적합한 보호기이고; R₁은 알킬이며, X는 알로겐인 것인 하기 식 (II)의 시알릭 공여체(sialyc donor)를

R'은 보호기 P'에 의해 적절하게 보호되고, 0개, 1개, 또는 그 이상의 유리 히드록시기를 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드, 또는 올리고사카라이드이고, 상기 보호기 P'은 상호 간 및 상기 공여체에 존재하는 보호기와 동일하거나 상이할 수 있는 것인 식 R'OH의 수용체와 커플링시켜 P, R1 및 R'은 앞서 정의된 바와 같은 것인 하기 식 III의 중간체를 수득하는 단계를 적어도 포함하고, 케니히스-크노르 반응은 Ag(I)에 기반한 금속 프로모터가 수용체의 몰 대비 0.5 내지 2.0 당량의 몰량으로 사용된다는 사실을 특징으로 하는 것인 방법이다:

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본 발명의 다른 장점은 상세한 설명에서 이후에 검토된다.

본 발명의 대상은 하기 식 (Ib)를 가지며

식 중에서, Mⁿ ⁺은 K⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Sr² ⁺, Fe² ⁺및 Al³ ⁺ 로 구성된 군으로부터 선택되고, M의 산화 상태에 따라, n = 1, 2, 또는 3인 것인 화합물이다. 바람직하게는, Mⁿ⁺은 Ca² ⁺, Mg² ⁺ 또는 K⁺이다.

식 (Ib)의 화합물은 모두 영양학적으로 및 약제학적으로 허용가능하고, 잠재적 활성 성분으로부서 또는 식품 보충제(food supplement)(예를 들면, 유아용 조제 분유 중의 보충제)로 유용하다.

특히, 6'SL은:

- 칼슘 염은 골 성장을 촉진하기 위해 잠재적으로 유용하고;

- 칼륨 염 및 마그네슘 염은 생물 막을 통한 적절한 수송 및 막관통 전위(transmembrane potential)의 생리적 차이를 유지, 촉진, 또는 회복시키기에 잠재적으로 유용하고;

- 철 염은 Fe의 결합을 요구하는 병리적 상황을 위해 잠재적으로 유용하다.

칼슘 염은 특히, 잘 알려진 소디움 염보다 더 우수한 화학적-물리적 특성을 가지며, 그의 결정화가 더 용이하다. 실제로, 결정화 단계 동안, 취급하기 용이하고, 따라서, 산업적 규모에서도 관리하는 것이 더 용이한, 결정질 고체의 형성이 이루어지고, 그의 여과는 신속하고 고체의 효율적인 세척을 가능하게 하므로 문제가 없다.

소디움 염의 경우, 대신에, 결정화 단계 동안, 초기에 고무질 고체가 수득되며, 이는 교반이 어렵고, 분쇄되어야 하며, 그의 여과는 느리고, 힘들다. 이 두 종의 염의 안정성은 유사한 것으로 보인다.

칼슘 염의 또 다른 긍정적 측면은 산 형태의 6'SL의 동일한 매트릭스로부터 출발하여, 칼슘 염은 보다 높은 순도로 수득되는 염이라는 사실이다: 예를 들면, 6'SL의 동일한 매트릭스는 87% HPLC 순도의 소디움 염의 결정 및 93% HPLC 순도의 칼슘 염의 결정을 제공했다.

포타슘 염과 마그네슘 염은 모두 소디움 염과 유사한 화학-물리적 특성을 보이며, 그들의 결정화는 유사한 경향을 갖는다.

전술된 식 (Ib)의 화합물은 종래 기술에서 공지된, 상응하는 카르복시산으로부터 염을 제조하는 방법에 따라 6'SL에 의해 제조될 수 있다; 예를 들면, 이들은 바람직하게는 pH 8-10까지 히드록시드, 카르보네이트, 또는 비카르보네이트와 같은 Mⁿ ⁺를 포함하는 염기(즉, KOH, Ca(OH)₂, Mg(OH)₂, 등..; K₂CO₃, CaCO₃, MgCO₃ 등; KHCO₃, 등.)를 첨가하는 것에 의해 6'SL의 용액으로부터 제조될 수 있다. 용매의 제거 후에, 수득된 염은 알코올 또는 물/알코올, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 및 이들의 물과의 혼합물로부터 결정화에 의해 정제된다.

선택적으로, 용매의 제거 전에, 존재하는 경우, 과량의 용해되지 않은 염기를 여과에 의해 제거할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 식 (I)을 가지며,

식 중에서, R은 유리 히드록시기를 갖는 모노사카라이드, 디사카라이드, 또는 올리고사카라이드이고, 바람직하게는 R은 갈락토오스, 글루코오스, 글루코사민, 락토오스, 락토사민(lactosamine), 푸코실락토오스(fucosil락토오스)로부터 선택되며; 보다 바람직하게는, R은 6'-갈락토오스, 3'-글루코오스, 3'-글루코사민, 6'-락토오스, 3'-락토오스, 6'-락토사민, 3'-락토사민, 3'-3-푸코실락토오스로부터 선택되는 것인 α-시알릴 올리고사카라이드를 합성하는 방법으로서;

상기 방법은:

a) 하기 식 (II)를 가지며,

식 중에서:

P는 적합한 보호기이고;

R1은 알킬, 바람직하게는 Me, Et, 또는 Pr이며;

X는 할로겐, 바람직하게는 염소인: 것인 시알릭 공여체를 케니히스-크노르(Koenigs-Knorr) 반응에 의해

R'은 보호기 P'에 의해 적절하게 보호되고, 0개, 1개 또는 그 이상의 유리 히드록시기를 포함하는, 모노사카라이드, 디사카라이드, 또는 올리고사카라이드이고, 상기 보호기 P'은 상호 간에 및 상기 공여체에 존재하는 것들과 동일하거나 또는 상이할 수 있는 것인 식 R'OH의 적절하게 보호된 수용체와의 커플링시켜, P, R1 및 R'은 앞서 정의된 바와 같은 것인 하기 식 (III)의 중간체를 수득하는 단계를 적어도 포함하며,

상기 케니히스-크노르(Koenigs-Knorr)는 Ag (I)에 기반한 금속성 프로모터가 수용체의 몰 대비 0.5 내지 2.0 당량의 몰량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 것인 방법이 제공된다.

바람직한 양태에서, 이 방법은 또한 단계 (a) 후에, b) 보호기 P, P' 및 R1을 제거하여 전술된 바와 같은 식 (I)의 화합물을 수득하는 단계를 포함한다.

상기 보호기를 제거하는 단계 b)는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 수행된다 (TW Green and PGM WUTS. Green's Protective Groups in Organic Synthesis. Ed Wiley ed 4. 2006).

바람직한 양태에서, 이 금속성 프로모터는 수용체의 몰 대비 0.75 내지 0.85 몰 당량의 몰량으로 사용된다.

바람직한 양태에서, 상기 금속성 프로모터는 AgOTf, Ag₂CO₃와 같은 Ag(I) 염으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 Ag₂CO₃이다.

바람직한 양태에서, 상기 커플링시키는 단계 a)는 비양성자성(aprotic) 극성 용매에서 수행되고, 바람직하게는 디클로로메탄에서 수행된다.

바람직한 양태에서, 상기 커플링시키는 단계 a)는 20 내지 40℃의 온도에서 5 내지 10일의 시간 동안 혼합물을 교반하는 것에 의해 달성되고; 바람직하게는 상기 혼합물은 30℃에서 7일 동안 교반된다.

바람직한 양태에서, P 및 P'은 독립적으로 벤질 및 아실로부터 선택되고, 바람직하게는 P 및 P'은 독립적으로 아세틸, 벤조일, 또는 알콕시, 할로겐, 니트로기에 의해 단일-치환 또는 이-치환된 벤조일로부터 선택된다.

바람직한 양태에서, P 및 P'은 아실이다. 보다 바람직한 양태에서, P 및 P'은 동일하고 아세틸이다. P=P'=Ac인 본 발명의 방법에서, R이 6'-락토오스인 경우, 본 발명에서 사용된 수용체는 벤질기를 보이지 않고, 결론적으로 보호기의 제거를 위한 촉매적 수소화(catalytic hydrogenation)을 회피하는 장점을 갖기 때문에 6'SL의 합성을 위한 공지된 방법과 추가적인 구별점을 갖는다.

바람직한 양태에서, 적절하게 보호된 이 수용체 R'OH는 갈락토시드 모이어티의 C-6에 유리된 반응성 히드록시기를 가지며, 특히 바람직한 양태에서, 상기 수용체는 하기 식 (IV)를 가지며,

식 중에서 P'은 적절한 보호기이고, 바람직하게는 P'은 아실이고, 보다 바람직하게는 아세틸인 것인 락토오스 유도체이다.

특히 바람직한 양태에서, 따라서, 본 발명은 P 및 P'은 Ac이고, X는 염소이며, R1은 메틸인 것인 전술된 방법에 의해 R=6'-락토오스인 것인 식 (Ia)의 6'SL의 합성에 관한 것이고; 이 구체적 조합에서, 수용체는 하기 식 (IVa)의 화합물인 것인 커플링 반응은:

하기 식 (IIIa)의 화합물을 제공하며,

상기 식 (IIIa)의 화합물은 놀랍게도, 조 혼합물로부터 수득되기 때문에 시알릴산의 아노머 탄소(anomeric carbon)로의 히드록시기와 카르복시 작용기(funciton)의 순차적인 탈보호 반응 및 화합물 6'SL 식 (Ia)의 생성의 후속 반응에서 이용될 수 있다. 바람직하게는, 먼저 아세틸기의 제거 및 뒤이어 메틸 에스테르의 가수분해로 진행되어야 한다.

이 순차적 탈보호는 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이 수행된다. 바람직하게는 Ac기의 제거는 소디움 메톡시드, 소디움 에톡시드, 또는 소디움 히드록시드, 보다 바람직하게는 소디움 메톡시드와 같은 염기를 사용하여, 용매로서, 일차 알코올, 예를 들면, 메탄올 또는 에탄올, 가장 바람직하게는 메탄올을 이용하여 수행된다. 바람직하게는, 시알릴산의 아노머 탄소에서 메틸 에스테르의 가수분해는 1M NaOH에 의한 염기성 조건에서 수행된다.

바람직하게는, 메틸 에스테르 가수분해가 완료되면, 반응 혼합물의 최종 산성화가 이온 교환 수지, 특히, 강한 양이온성 수지 및 약한 음이온성 수지에 의해 수행되어, 6'SL를 함유한 용리물(eluate)을 수득한다.

전술된 방법에서, 특히, X는 염소이고, R'은 P=P'=Ac인 식 (IV)에 의해 보호된 락토오스인 경우, 사용된 시알릭 공여체는 제조가 간단하거나 용이하고 사용이 용이하다. 이 선택은 훨씬 더 복잡한 공여체에 대한 종래 기술에도 불구하고, 이 선택은 공지된 방법의 문제를 해결하기에 놀랍게도 적합하다는 것을 밝혔다.

단계 a)에서 사용된 프로모터 금속의 양은 놀랍게도, 당해 기술의 공지된 상태, 6 내지 7 당량 대비, 0.5 내지 2.0 당량으로 감소되며, 따라서, 합성 비용 및 생성된 폐기물의 처리 비용을 감소시킨다.

커플링 반응의 생성물은 우수한 수율 및 순도로 탈보호된 시알릴-올리고사카라이드를 수득하기 위한 탈보호의 후속 반응에 있기 때문에, 사용되기 충분한 순도로 놀랍게도 수득된다. 또한, 본 발명의 커플링 반응을 위한 방법은 α-이성질체가 유일하게 수득된 생성물이므로, 입체선택적이라는 것이 주목된다.

따라서, 본 발명의 방법은 산업적 규모에서 실시될 수 있다.

본 발명은 또한, Mⁿ ⁺ 은 Na⁺, K⁺, NH⁴ ⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Sr² ⁺, Fe² ⁺, Al³ ⁺ 인 것인 식 (Ib)의 화합물의 합성 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 전술된 방법을 통한 6'SL의 제조를 포함하고; 바람직하게는, 식 (Ib)의 염은 메틸 에스테르의 가수분해 후 이온 수지 치료 후에 수득된 6'SL을 포함하는 용리액에 의해, pH 8-10까지 히드록시드, 카르보네이트, 또는 비카르보네이트와 같은 M(ⁿ⁺)을 포함한 염기(즉, KOH, Ca(OH)₂, Mg(OH)₂, 등..;K₂CO₃, CaCO₃, MgCO₃ , 등; KHCO₃, , 등)를 추가하는 것에 의해 직접 제조될 수 있다.

식 (II)의 화합물은 (R. Kuhn et al., Chem . Ber., 1966, 99, 611, A. Marra et al., Carb . Res, 1989, 190, 317-322 및 NF Byramova et al., Carb . Res, 1992, 237, 161-175)에 보고된 것과 같은 종래 기술에 알려진 기법에 의해 수득될 수 있다.

적절하게 보호된 수용체의 합성은 당업자의 지식에 따라 수행될 수 있고, 특히, P는 Ac인 것인 식 (IIIa)의 수용체의 합성은 반응식(scheme) 1과 일치하는 공지된 방법에 따라 수행된다.

(IVa) 반응식 1

본 발명에 따르면, 알콕시는 예를 들면, -OMe, -OEt, -OnPr, -OiPr, -OnBu, -OiBu, -OtBu를 의미한다.

본 발명에 따르면, 할로겐은 불소, 염소, 브롬, 요오드를 의미한다.

본 발명에 따르면, 알킬은 할로겐, 히드록시, 알콕시, 니트로 중에서 선택된 하나 이상의 기(group)에 의해 치환될 수 있는, 1개 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄형 또는 분지형 알킬 사슬이다.

본 발명에 따르면, 아릴은 할로겐, 알콕시, 니트로로부터 선택된 하나 이상의 기에 의해 궁극적으로 치환된 벤젠이다.

본 발명에 따르면, 아실은 알킬 또는 아실은 앞서 정의된 바와 같은 것인 작용기 -OCO-알킬, 또는 -OCO-아실을 의미한다.

본 발명에 따르면, 모노사카라이드는 n= 3, 4, 5, 6, 7인 식 (CH₂O)_n, C_nH_2nO_n-1, C_nH_2nO_n _-1NH₂ 또는 C_nH_2nO_n _-1NHAc의 단순 당(simple sugar), 또는 폴리옥시알데히드(polyoxyaldeide)(알도오스) 또는 폴리옥시케톤(케토오스)을 의미한다; 모노사카라이드는 그 정의 내에서 모든 가능한 입체이성질체 및 모든 개방형 또는 고리형 또는 분자내 세미 아세탈 및 세미 케탈, 예를 들면, 피라노실 형태 및 푸라노실 형태를 의미한다; 예를 들면, 글리세르알데히드, 알로오스(allose), 알트로오스(altrose), 아라비노오스, 에리트로오스, 푸코오스, 갈락토오스, 글루코오스, 글루코사민, N-아세틸-글루코사민, 이도오스(idose), 릭소오스(lixose), 만노오스, 사이코오스(psychose), 리보오스, 데옥시리보오스, 소르보오스, 타가토오스, 트레오스, 자일로오스, 및 상응하는 케토오스가 정의 내에 포함된다.

본 발명에 따르면, 디사카라이드(disaccharide)는 아세탈(acetalic) 결합 또는 O-글리코시드 또는 N-글리코시드 결합을 통해 결합된 두 개의 모노사카라이드로 구성된 폴리옥시드릴레이트(polyoxydrilated) 화합물을 의미한다; 정의 내에, 모든 가능한 입체이성질체 및 개방형 또는 고리형의 모든 형태가 포함된다; 예를 들면, 락토오스, 락토사민, N-아세틸-락토사민, 말토오스, 셀로비오스, 수크로오스, 트레할로오스(threalose), 투라노오스(turanose)가 포함된다.

본 발명에 따르면, 올리고사카라이드(oligosaccharide)는 직쇄형 또는 분지형 사카라이드 사슬을 형성하기 위해 글리코시드 결합에 의해 함께 연결된 3개 내지 6개의 모노사카라이드로 구성된 폴리머를 의미하며, 예를 들면, 라피노오스, 멜레지토오스(melezitose), 말토트리오스, 아카르보오스(acrbose), 스타키오스(stachyose)가 포함된다.

실시예 1

디 4',6'O-벤질리덴락토오스의 제조

200 g (0.555 mol)의 락토오스 모노히드레이트를 교반 하에 1.4 l의 N,N-디메틸포름아미드에 첨가하고, 209 ml (1.39 mol)의 벤즈알데히드 디메틸 아세탈 및 5.28 g (0.028 mol)의 p-톨루엔술폰산 모노히드레이트를 첨가했다. 결과적으로 수득된 현탁액을 55℃에서 가열하고, TLC가 성공적으로 수행될 때까지(16 내지 18시간) 상기 온도를 유지시켰다 (Pharmacopoeia). 실온에서 냉각시킨 후, 4.7 ml의 트리에틸아민을 pH 7-8까지 첨가했다. 수득된 혼합물을 농축시켜 700 ml의 용액을 수득하고, 강한 교반을 유지하면서 3 리터의 고온(50-55℃)의 아세톤 중에 배액(drain)시켰다. 상기 혼합물을 0±5℃까지 냉각시켜 침전을 완료시켰다. 침전물을 여과시키고, 0.7 리터의 저온 아세톤(cold acetone)으로 세척하고, 건조시켜, 백색 생성물로서 208 g의 4',6'-O-벤질리덴 락토오스(α/β 아노머의 혼합물)를 수득하였다(분석 HPLC 66%, 0319 mol, 수율: 57%).

먼저, MeOH를 이용하고, 및 뒤이어 MeOH/H₂O 4/1 v/v를 이용한 이중 결정화(double crystallization)에 의해, α 아노머가 강화된(enriched) 분석 시료를 수득하였고, NMR 특성이 보고된다:

¹H NMR (DMSOd ₆ , 300 MHz): δ ppm 7.51-7.34 (5H, m, Ph); 6.36 (d, J_OH _-1= 4.8 Hz, 1H, C1-OH); 5.58 (s, 1H, PhCH); 5.28 (d, J= 4.2 Hz, 1H, OH); 5.01 (d, J= 5.7 Hz, OH); 4.92 (pseudo t, J₁ _- _OH= J₁ _-2= 4.0 Hz, 1H, H-1); 4.68 (d, J= 6.9 Hz, 1H, OH); 4.45 (m, 2H, 2xOH); 4.37 (d, J_1' _-2'= 7.5 Hz, 1H, H-1'); 4.16-3.95 (m, 3H); 3.84-3.11 (m, 9H) (H-2, H-3, H-4, H-5, CH₂-6, H-2', H-3', H-4', H-5', CH₂-6').

¹³C NMR (DMSOd ₆, 75 MHz): δ ppm 138.5, 128.6, 127.9, 126.2 (Ph); 103.1 (C-1'); 99.8 (PhCH); 92.1 (C-1); 79.6, 75.8, 72.2, 71.6, 71.3, 69.9, 69.8, 68.5 (C2, C2', C3, C3', C4, C4', C5, C5'); 66.2 (C6'); 60.3 (C6).

Rf (pharmacopoeia, UV-가시광선 및 나프토레소르신(naftoresorcine))= 0.7

실시예 2

4',6'O-p-메톡시벤질리덴락토오스의 제조

200 g (0,555 mol)의 락토오스 모노히드레이트를 교반 하에 1.4 l의 N,N-디메틸포름아미드에 첨가하고, 그 후, 237 ml (1.39 mol)의 p-메톡시벤즈알데히드 디메틸 아세탈 및 5,28 g (0,028 mol)의 p-톨루엔술폰산 모노히드레이트를 첨가했다. 수득된 현탁액을 55℃에서 가열하고 TLC가 성공적으로 수행될 때까지(16 내지 18시간) 상기 온도를 유지시켰다 (Pharmacopoeia). 실온에서 냉각시킨 후, 5.0 ml의 트리에틸아민을 pH 7-8까지 첨가했다. 수득된 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 3 리터의 고온(50-55℃)의 아세톤 중에 결정화시켰다. 상기 혼합물을 0±5℃까지 냉각시켜 침전을 완료시켰다. 침전물을 여과시키고, 2x200 ml의 저온 아세톤으로 세척하여, 엷은 황색 고체로서 219 g의 4',6'-O-p-메톡시벤질리덴 락토오스(α/β아노머의 혼합물)를 수득하였다(분석 HPLC 76%, 0361 mol, 수율: 65%). 고온의 아세톤/H2O 4/1 v/v으로부터의 결정화는 α/β아노머 혼합물로서의 분석 시료(1/1 mol/mol)를 수득했고, NMR 특성이 하기에 보고된다:.

¹H NMR (DMSOd ₆, 300 MHz): δ ppm 7.38 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 6.93 (d, J= 8.7 Hz, 2H) (Ph); 6.70 (d, J_OH _-1= 6.6 Hz, 1H, C1-OH β); 6.36 (d, J_OH _-1= 4.1 Hz, 1H, C1-OH α); 5.52 (s, 1H, PhCH α+β); 5.27 (m, 1H, OH α+β); 5.04-4.95 (m, 1H, OH α+β); 4.92 (pseudo t, J= 4.1 Hz, H-1 α); 4.72-4.60 (m, 1H, OH α+β); 4.56-4.28 (m, H-1' α+β + H-1 β + 2xOH α+β); 4.12-3.92 (m, 3H); 3.76 (s, 3H, OMe); 3.80-3.11 (m, 9H); 2.98 (m, 1H β).

¹³C NMR (DMSOd ₆, 75 MHz): δ ppm 159.4, 130.9, 127.6, 113.2 (Ph); 103.0 (C-1' α+β); 99.7 (PhCH α+β); 96.7 (C-1β); 92.1 (C-1α); 79.6, 79.2, 75.7, 74.9, 74.8, 74.6, 72.2, 71.6, 71.3, 69.9, 69.8, 68.4 (C2, C2', C3, C3', C4, C4', C5, C5', α+β); 66.2 (C6' α+β); 60.4, 60.3 (C6 α+β); 55.1 (OMe α+β).

Rf (pharmacopoeia, UV-가시광선 및 나프토레소르신)= 0.8

실시예 3

1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-4',6'-O-벤질리덴-β-D-락토오스의 제조

실시예 1에 따라 수득된, 100 g (HPLC 기준 0.153 몰)의 4',6'-O-벤질리덴락토오스 및 256 ml (1.84 mol)의 트리에틸아민을 600 ml의 메틸 에틸 케톤에 첨가했다. 반응 혼합물을 60 ℃에서 가열하고, 내부 온도를 70℃ 미만으로 유지하면서, 174 ml (1.84 mol)의 아세트산 무수물을 첨가하였다. TLC가 성공적으로 수행될 때까지(10 내지 12시간) (AcOEt) 반응 혼합물을 70℃에서 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 270 ml의 디클로로메탄 및 200 ml의 물에 용해시켰다. NaOH 30%를 교반 하에 pH 9-9.5까지 첨가하고, 층을 분리시켰다; 수성층을 75 ml의 디클로로메탄으로 다시 추출하였다. 수집된 유기층을 200 ml의 물로 세척하고, 32% HCl 용액을 교반 하에 pH 1-1.5까지 첨가했다. 산성 수성층을 75 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 수집된 유기층을 370 ml의 NaCl 20%로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 숯 및 벤토나이트(bentonite)를 이용하여 탈색시켰다. 용매를 농축시키고, 잔류물을 그대로 다음 반응에서 사용하였다. HPLC에 의한 정량(dosage)은 본질적으로 β-아노머인 103 g (0,151 mol)의 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-4',6'-O-벤질리덴 락토오스를 생성했다(α아노머 <10 mol%) (수율: 99%). 9 mol%의 α아노머를 포함하는 분석 시료를 고온의 MeOH로부터의 결정화에 의해 수득하였다; NMR 특성분석 결과는 하기와 같았다 (β-아노머).

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ ppm 7.54-7.34 (m, 5H, Ph); 5.68 (d, J₁ _-2= 8.4 Hz, 1H, H-1), 5.47 (pseudo s, 1H, CHPh); 5.32-5.21 (m, 2H, H-3+H-2'), 5.07 (dd, J₂ _-3= 9.6 Hz e J₂ _-1= 8.4 Hz, 1H, H-2), 4.87 (dd, J_3' _-2'=10.4 Hz e J_3' _-4' = 3.8 Hz, 1H, H-3'), 4.54-4.43 (m, 2H, H-1', H-6a), 4.38-4.25 (m, 2H, H-4'+H-6'a), 4.14 (dd, J_6b _-6a= 12.2 e J_6b _-5= 4.6 Hz, 1H, H-6b), 4.04 (d, J_6'b _-6'a = 12.3 Hz, 1H, H-6'b), 3.90-3.70 (m, 2H, H4+H5); 3.46 (pseudo s, 1H, H-5'), 2.14-2.00 (6xCOCH₃).

¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz): δppm 170.8, 170.4, 170.1, 169.7, 169.0, 168.9 (6xCOCH₃); 137.5, 129.3, 128.3, 126.6 (Ph); 101.4 (CHPh); 101.1 (C-1'); 91.8 (C-1); 75.5, 73.8, 73.2, 72.4, 72.2, 70.5, 69.0, 68.5 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5'); 66.6 (C-6'); 61.8 (C-6), 20.9-20.7 (6xCOCH₃).

Rf (AcOEt:헥산=1:1, UV-가시광선 및 H₂SO₄/MeOH)= 0.3

실시예 4

1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-4',6'-O-p-메톡시벤질리덴-β-D-락토오스의 제조

실시예 2에 따라 수득된 100 g (HPLC 용량(dosage) 0.165 mol)의 4',6'-O-p-메톡시벤질리덴락토오스 및 242 ml (1.74 mol)의 트리에틸아민을 600 ml의 메틸 에틸 케톤에 첨가했다. 현탁액을 60℃에서 가열하고 내부 온도를 70℃ 미만으로 유지하면서 164 ml (1.74 mol)의 아세트산 무수물을 점적하였다. 수득된 반응 혼합물을 포지티브 TLC가 성공적으로 수행될 때까지(10 내지 12 시간) 70℃에서 교반시켰다(AcOEt:헥산=1:1). 용매를 증발시키고 잔류물을 270 ml의 디클로로메탄 및 200 ml의 물에 용해시켰다. 교반 하에, NaOH 30%를 pH 9-9.5까지 첨가하고, 층들을 분리시켰다; 수성층을 다시 75 ml의 디클로로메탄으로 추출했다. 수집된 유기층을 200 ml의 물로 세척하고, 32% HCl 용액을 교반 하에 pH 1-1.5까지 첨가했다. 산성 수성 층을 75 ml의 디클로로메탄으로 추출했다. 수집된 유기층을 400 ml의 포화 NaHCO₃로, 및 400 ml의 NaCl 20%로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고 숯 및 벤토나이트(bentonite)로 표백시켰다. HPLC 용량(dosage)은 본질적으로 β-아노머인 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-4',6'-O-p-메톡시벤질리덴락토오스 110 g (0,155 mol)을 확인했다(수율: 94% ). 분석 시료는 고온의 MeOH로부터의 결정화에 의해 수득했다: 하기는 NMR 특성(β-아노머)이다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ ppm 7.36 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 6.88 (d, J= 8.7 Hz, 2H) (Ph); 5.66 (d, J₁ _-2= 8.4 Hz, 1H, H-1); 5.40 (pseudo s, 1H, CHPh); 5.24 (pseudo t, J₃ _-2= J₃ _-4= 9.6 Hz, 1H, H-3); 5.23 (dd, J_2' _-3' = 10.2 Hz e J_2' _-1'=7.8 Hz, 1H, H-2'); 5.04 (dd, J₂ _-3= 9.6 Hz e J₂ _-1= 8.4 Hz, 1H, H-2); 4.84 (dd, J_3' _-2'= 10.2 Hz e J_3' _-4'= 3.6 Hz, 1H, H-3'), 4.46 (dd, J_6a _-6b = 12.0 Hz e J_6a _-5= 1.5 Hz, 1H, H-6a); 4.44 (d, J_1' _-2'= 7.8 Hz, 1H, H-1'); 4.28 (d, J_4' _-3'= 3.6 Hz, 1H, H-4'); 4.25 (d, J_6'a _-6'b= 12.6 Hz, 1H, H-6'a); 4.12 (dd, J_6b _-6a= 12.0 e J_6b _-5= 4.5 Hz, 1H, H-6b), 4.00 (dd, J_6'b _-6'a=12.6 Hz e J_6'b _-5' = 1.5 Hz, 1H, H-6'b); 3.87-3.69 (m, 2H, H4+H5); 3.79 (s, 3H, OMe); 3.42 (pseudo s, 1H, H-5'); 2.09, 2.07, 2.03, 2.02, 2.00 (6xCOCH₃).

¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz): δ ppm 170.8, 170.4, 170.1, 169.6, 168.93, 168.89 (6xCOCH₃); 160.3, 130.1, 127.9, 113.7 (Ph); 101.3 (CHPh); 101.1 (C-1'); 91.8 (C-1); 75.5, 73.8, 73.2, 72.4, 72.1, 70.5, 69.0, 68.4 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5'); 66.5 (C-6'); 61.8 (C-6), 55.4 (OMe); 20.9-20.6 (6xCOCH₃).

Rf (AcOEt:헥산=1:1, UV-가시광선 및 H₂SO₄/MeOH)= 0.2

실시예 5

1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-β-D-락토오스의 제조

실시예 2에 따라 수득된 100 g (0.15 moles)의 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-4',6'-O-벤질리덴락토오스를 함유한 시럽을 400 ml의 빙초산(glacial acetic acid)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 80℃에서 가열하고, 100 ml의 물(80℃로 미리 가온됨)을 첨가하고, 수득된 혼합물을 이 온도에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 그 후, 반응 혼합물을 신속하게 실온까지 냉각시키고 500 ml의 톨루엔 및 350 ml의 물을 첨가하고 추출했다. 수성층을 150 ml의 톨루엔으로 추출했다. 통합된 톨루엔 층은 미반응 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-4',6'-O-벤질리덴락토오스를 포함했고, 이는 다른 반응에서 이용될 수 있다. 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-β-D-락토오스를 포함하는, 수성층을 500 ml 및 150 ml의 메틸렌 클로라이드로 연속해서 추출하고; 유기 추출물을 3x150 ml의 물로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 580 ml의 고온의 이소프로필 아세테이트(50-55℃)로부터 결정화시켜, 건조 후에, 백색 고체(chalky white solid)로서 30.8 g의 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-β-D-락토오스 (0.05 mol)를 수득했다. 통합된 톨루엔 층에서 20.2 g의 미반응 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-4',6'-O-벤질리덴락토오스 (0.03 mol)를 회수한 것을 고려할 때, 수율은 42%이다.

Mp 188-190℃.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ ppm 5.68 (d, J₁ _-2= 8.1 Hz, 1H, H-1), 5.24 (pseudo t, J₃ _-2=J₃ _-4= 9.3 Hz, 1H, H-3), 5.19 (dd, J_2' _-3'=10.2 Hz e J_2' _-1'=7.8 Hz, 1H, H-2'), 5.05 (dd, J₂ _-3= 9.3 Hz e J₂ _-1= 8.1 Hz, 1H, H-2), 4.88 (dd, J_3' _-2'= 10.2 Hz e J_3' _-4' =3.3 Hz, 1H, H-3'), 4.49 (d, J_1' _-2'= 7.8 Hz, 1H, H-1'), 4.49 (dd, J_6a _-6b= 11.1 Hz e J_6a _-5= 1.8 Hz, 1H, H-6a), 4.15-4.05 (m, 2H, H-4'+H-6b), 4.00-3.70 (m, 4H, H-4+H-5+H-6'a+H-6'b), 3.56 (pseudo t, J= 5.4 Hz, 1H, H-5'), 2.96 (d, J_OH-4'=4.2 Hz, C4'-OH), 2.59 (dd, J_OH _-6'=7.5 e 4.8 Hz, C6'-OH), 2.11, 2.09, 2.08, 2.07 2.04, 2.03 (6xCOCH ₃).

¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz): δ ppm 170.6, 170.4, 170.3, 169.7, 169.6, 169.0 (6xCOCH₃); 101.2 (C-1'), 91.7 (C-1), 75.9 (C-4), 74.6 (C-5'), 73.7 (C-3'), 73.6 (C-5), 73.1 (C-3), 70.7 (C-2), 69.7 (C-2'), 67.8 (C-4'), 62.1, 62.0 (C-6, C-6'), 20.9, 20.8, 20.7 (6xCOCH₃).

Rf (AcOEt, UV-가시광선 및 H₂SO₄/MeOH)= 0.4

실시예 6

디 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-β-D-락토오스의 제조

실시예 4에 따라 수득된 100 g(0.14 mol)의 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-4',6'-O-p-메톡시벤질리덴락토오스를 포함하는 시럽을 400 ml의 빙초산에 용해시키고, 100 ml의 물을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4.5 시간 동안 교반시켰다. 500 ml의 톨루엔 및 350 ml의 물을 첨가하고 추출하였다. 수성층을 150 ml의 톨루엔으로 추출하였다. 수집된 톨루엔층은 다른 반응에서 이용될 수 있는, 반응하지 않은 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-4',6'-O-p-메톡시벤질리덴락토오스를 포함했다. 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-β-D-락토오스를 포함하는 수성층을 연속적으로 500 ml 및 150 ml의 메틸렌 클로라이드로 추출하고; 유기 추출물을 3x150 ml의 물로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 580 ml의 고온의 이소프로필 아세테이트(50-55℃)로부터 결정화시켜, 건조 후에 그 특성이 실시예 5에서 수득된 고체와 유사한 백색 분말 고체로서 40.6 g의 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-β-D-락토오스 (0.07 mol, 수율 50%)을 수득했다.

실시예 7

(메틸 5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-D-글리세로-α-D-갈락토-논-2-울로피라노실로네이트)-(2→6)-2,3-디-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-1,2,3,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노오스의 제조

실시예 3에 따라 수득된, 100 g (0,168 mol)의 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-β-D-락토오스를 600 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 뒤이어 250 g의 분자 체(molecular sieve) 3A를 첨가했다. 수득된 용액을 5 내지 10분 동안 교반하고, 38.0 g의 탄산은(silver carbonate) (0.14 mol)을 첨가했다. 500 ml의 디클로로메탄 중, P는 아세틸이고, X는 클로로이며, R1은 메틸인 것인 식 (II)의 염소 유도체 128.5 g (0,252 mol) (1.5 eq)의 용액을 첨가하고, 수득된 현탁액을 강한 교반 하에 30℃에서 염소 유도체가 사라질 때까지(TLC, CH₂Cl₂:MeOH = 10:1) 7일 동안 유지시키고, 반응 혼합물을 디칼리트(dicalite) 상에서 여과시키고, 용매를 제거하여, 응축 생성물, 1,2,3,6,2',3'-헥사-O-아세틸-β-D-락토오스와 (II)의 2.3 제거(elimination)의 생성물의 혼합물, 및 미량의 4,7,8,9-테트라-O-아세틸-NANA를 포함하는 부서지기 쉬운(brittle) 고체 잔류물(약 230 g)을 수득했다. ¹³C NMR에 의해, 약 90% mol의 전환으로 평가되었다. 에탄올:이소프로필 에테르 = 1:3 v/v으로부터의 결정화에 의해 백색 무정형 고체로서 응축 생성물의 분석 시료를 수득했다:

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ ppm 5.66 (d, J₁ _-2= 8.4 Hz, 1H, H-1); 5.42-5.10 (m, 5H, H-3+H-2'+H-7"+H-8"-NH); 5.01 (pseudo t, J₂ _-1= 8.4 Hz, 1H, H-2); 4.94-4.78 (m, 2H, H-3'+H-4"); 4.53-4.27 (m, 3H, H-1'+H-6a+H-9"); 4.24-3.92 (m, 5H, H-6b+H-4'+H-5"+H-6"+H-9"b); 3.92-3.50 (m, 5H, H-4+H-5+H-5'+H-6'a+H-6'b); 3.80 (s, 3H, COOCH ₃), 2.93 (broad s, 1H, OH); 2.55 (dd, J₃ _" _eq _-3" _ax= 12.6 e J_3"eq-4"=4.5 Hz, 1H, H-3"eq); 2.17-1.97 (31H, 10x CH ₃CO e H-3"ax), 1.86 (s, 3H, NHCOCH ₃).

¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz): δ ppm 171.05, 170.98, 170.5, 170.4, 170.29, 170.28, 170.24, 170.0, 169.6, 169.4, 169.0, 168.0 (OAc, NHAc, COOMe); 100.8 (C-1'); 99.1 (C-2"); 91.7 (C-1); 75.7, 73.7, 73.6, 72.94, 72.90, 72.4, 70.7, 69.7, 68.95, 68.87, 67.4, 66.3 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5', C-4", C-6", C-7", C-8"); 62.6, 62.4, 62.1 (C-6, C-6', C-9"); 53.2 (OCH₃); 49.4 (C-5"); 37.4 (C-3"); 23.2 (NHCOCH₃), 21.1, 20.9, 20.8, 20.74, 20.67 (10xCH₃CO).

실시예 8

( 메틸 5- 아세트아미도 -3,5- 디데옥시 -D- 글리세로 -α-D- 갈락토 -논-2- 울로피라노실로네이트 )-(2→6)-β-D- 갈락토피라노실 -(1→4)-(α/β)-D- 글루코피라노오스의 제조

실시예 7에 따라 수득된, 230 g의 조 생성물을 1.4 l의 MeOH에 용해시키고, 메탄올 25 중량% 중 소디움 메톡시드 29.6 ml를 첨가했다. 수득된 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하면서 유지시켰다; 포지티브 TLC 대조군(Pharmacopoeia)에서, 39 g의 건조 IR120(H⁺)로 중화시켰다. 수지를 여과시키고, 용매를 회전증발기(rotavapor)에 의해 제거하여, 143 g의 잔류물을 수득하고, 다음 반응에서 사용하였다. 수율은 정량적이었다.

¹H NMR (D₂O, 300 MHz): δ ppm 5.21 (d, J₁ _-2 3.6Hz, 1H, H-1a), 4.66 (d, J₁ _-2 7.8Hz, 1H, H-1β), 4.42 (d, J_1' _-2': 7.5Hz, 1H, H-1'), 4.15-3.45 (m, 19H), 3.89 (s, 3H, COOCH ₃), 3.29 (m, 1H), 2.70 (dd, J₃ _" _eq _-3" _ax 12.9 e J₃ _" _eq _-4"4.8 Hz, H-3"eq), 2.03 (s, 3H, NHCOCH ₃), 1.88 (pseudo t, J₃ _" _ax _-3" _eq = J₃ _" _ax _-4" 12.9 Hz, H-3"ax).

¹³C NMR (D₂O, 75 MHz): δ ppm 175.5 (NHCOCH₃), 170.4 (COOMe), 103.9 (C-1'), 99.6 (C-2"), 96.3 (C-1β), 92.5 (C-1α), 80.5, 80.4, 75.2 (2C), 74.4, 74.0, 73.5, 73.0, 72.2, 71.7, 71.3, 71.2, 70.5, 69.0 (2C), 67.9 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5', C-4", C-6", C-7", C-8"), 64.0 (C-6'), 63.8 (C-9"), 60.8 e 60.7 (C-6α+β), 54.1 (COOCH₃), 52.3 (C-5"), 39.6 (C-3"), 22.8 (NHCOCH₃).

실시예 9

소디움 5- 아세트아미도 -3,5- 디데옥시 -D- 글리세로 -α-D- 갈락토 -논-2- 울로피라노실로네이트 -(2→6)-β-D- 갈락토피라노실 -(1→4)-(α/β)-D- 글루코피라노오스의 제조

실시예 8에 따라 수득된, 조 탈아세틸화 생성물 143 g을 715 ml의 물에 용해시키고, 수득된 용액을 4℃에서 냉각시켰다. pH를 NaOH 수용액에 의해 중성 pH로 조정하고, 용액의 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서, 23 ml의 NaOH 30%를 첨가했다. 상기 용액을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 양성 TLC 대조군 (Pharmacopoeia)에서, 용액을 IR120(H⁺)/IRA96(OH^-)를 통해 통과시켰다. 용리물(eluate)을 NaOH로 pH 9까지 조정하고, 시럽으로 농축시키고, 부서지기 쉬운 백색 고체를 수득할 때까지,순수(absolute) EtOH로 수회 스티립핑(stripping) 시키고, 상기 고체를 96% EtOH로부터 재결정화시켰다. 77.3 gr을 수득했다.

이 화합물에 대한 ¹H 및 ¹³C NMR 데이터는 문헌에 보고된 것과 일치했다 (L. Dorland et al., Eur . J. Biochem. 1978, 87, 323; J.P. Kamerling et al., Carbohydr. Res . 1982, 100, 331).

¹H NMR (D₂O, 300 MHz): δ ppm 5.22 (d, J₁ _-2 3.8Hz, 1H, H-1a), 4.66 (d, J₁ _-2 7.8Hz, 1H, H-1β), 4.43 (d, J_1' _-2': 7.6Hz, 1H, H-1'), 4.02-3.48 (m, 19H), 3.31 (m, 1H), 2.71 (dd, J₃ _" _eq _-3" _ax 12.5 e J₃ _" _eq _-4"4.7 Hz, H-3"eq), 2.03 (s, 3H, NHCOCH ₃), 1.74 (pseudo t, J₃ _" _ax _-3" _eq = J₃ _" _ax _-4" 12.5 Hz, H-3"ax).

¹³C NMR (D₂O, 75 MHz, 외부 기준 아세톤): δ ppm 175.6 (NHCOCH₃), 174.1 (COO^-), 103.9 (C-1'), 100.9 (C-2"), 96.3 (C-1β), 92.5 (C-1α), 80.4, 80.3, 75.30, 75.26, 74.4, 74.3, 73.2, 73.0, 72.4, 72.3, 71.7, 71.4, 70.6, 69.2, 69.04, 69.01 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5', C-4", C-6", C-7", C-8"), 64.2 (C-6'), 63.3 (C-9"), 60.9 e 60.8 (C-6α+β), 52.4 (C-5"), 40.7 (C-3"), 22.7 (NHCOCH₃).

[α]_D ^20℃: +9,3˚(c:1%,H₂O)

Mp: 191,4÷194,2 ℃ (T 분해)

실시예 10

칼슘 5- 아세트아미도 -3,5- 디데옥시 -D- 글리세로 -α-D- 갈락토 -논-2- 울로피라노실로네이트 -(2→6)-β-D- 갈락토피라노실 -(1→4)-(α/β)-D- 글루코피라노오스의 제조

실시예 8에 따라 수득된, 조 탈아세틸화 생성물 100 g을 500 ml의 물에 용해시키고, 수득된 용액을 4℃에서 냉각시켰다. pH를 NaOH 수용액에 의해 중성 pH로 조정하고, 용액의 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서, 23 ml의 NaOH 30%를 첨가했다. 결과적으로 수득된 용액을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 포지티브 TLC 대조군 (Pharmacopoeia)에서, 용액을 IR120(H⁺)/IRA96(OH^-)를 통해 통과시켰다. 용리물을 Ca(OH)₂로 pH 8.7까지 조정하고, 여과시키고, 65 °Brix의 시럽으로 농축시켰다. 이 시럽을 50℃에서 540 ml의 메탄올에 첨가했다(drop). 결과적으로 수득된 현탁액을 50℃에서 강한 교반 하에 1시간 동안 유지시키고, 그 후, 실온에서 1시간 동안 교반하고, 진공 하에 여과시켰다. 수득된 고체를 160 ml의 메탄올로 세척하고, 진공 하에 50÷5℃에서 건조시켰다. 수득된 생성물: 46.2 g

¹H NMR (D₂O, 300 MHz): δ ppm 5.22 (d, J₁ _-2 3.8Hz, 1H, H-1a), 4.66 (d, J₁ _-2 7.8Hz, 1H, H-1β), 4.43 (d, J_1' _-2': 7.8Hz, 1H, H-1'), 4.02-3.48 (m, 19H), 3.31 (m, 1H), 2.71 (dd, J₃ _" _eq _-3" _ax 12.0 e J₃ _" _eq _-4"4.5 Hz, H-3"eq), 2.03 (s, 3H, NHCOCH ₃), 1.74 (pseudo t, J₃ _" _ax _-3" _eq = J₃ _" _ax _-4" 12.0 Hz, H-3"ax).

¹³C NMR (D₂O, 75 MHz, 내부 기준 아세토니트릴): δ ppm 175.5 (NHCOCH₃), 174.1 (COO^-), 103.8 (C-1'), 100.9 (C-2"), 96.2 (C-1β), 92.4 (C-1α), 80.3, 80.3, 75.26, 75.22, 74.4, 74.3, 73.1, 73.0, 72.4, 72.2, 71.7, 71.4, 70.5, 69.1, 69.13, 69.00 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5', C-4", C-6", C-7", C-8"), 64.2 (C-6'), 63.2 (C-9"), 60.9 e 60.7 (C-6α+β), 52.4 (C-5"), 40.7 (C-3"), 22.7 (NHCOCH₃).

Ca² ⁺기준 분석: 98,3%

[α]_D ^20℃: +10°(c:1%,H₂O)

Mp: 204,5÷206,6 ℃ (T 분해)

IRν ^KBr _max: 3400, 1612, 1380, 1033 cm^-1.

실시예 11

포타슘 5- 아세트아미도 -3,5- 디데옥시 -D- 글리세로 -α-D- 갈락토 -논-2- 울로피라노실로네이트 -(2→6)-β-D- 갈락토피라노실 -(1→4)-(α/β)-D- 글루코피라노오스의 제조

실시예 8에 따라 수득된, 조 탈아세틸화 생성물 100 g을 500 ml의 물에 용해시키고, 수득된 용액을 4℃에서 냉각시켰다. pH를 NaOH 수용액에 의해 중성 pH로 조정하고, 용액의 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서, 23 ml의 NaOH 30%를 첨가했다. 상기 용액을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 포지티브 TLC 대조군 (Pharmacopoeia)에서, 용액을 IR120(H⁺)/IRA96(OH^-)를 통해 통과시켰다. 용리물을 KOH로 pH 10까지 조정하고, 시럽으로 농축시키고, 부서지기 쉬운 백색 고체를 수득할 때까지, 순수 EtOH로 수회 스티립핑 시키고, 상기 고체를 96% EtOH로부터 재결정화시켰다. 상기 고체를 진공 하에 50÷5℃에서 건조시켰다.

수득된 생성물: 35.7 gr

¹H NMR (D₂O, 200 MHz): δppm 5.22 (d, J₁ _-2 3.8Hz, 1H, H-1α), 4.66 (d, J₁ _-2 7.8Hz, 1H, H-1β), 4.43 (d, J_1' _-2': 7.6Hz, 1H, H-1'), 4.02-3.48 (m, 19H), 3.31 (m, 1H), 2.71 (dd, J₃ _" _eq _-3" _ax 12.0 e J₃ _" _eq _-4"4.4 Hz, H-3"eq), 2.03 (s, 3H, NHCOCH ₃), 1.74 (pseudo t, J₃ _" _ax _-3" _eq = J₃ _" _ax _-4" 12.0 Hz, H-3"ax).

¹³C NMR (D₂O, 75 MHz, 내부 기준 아세톤): δ ppm 175.5 (NHCOCH₃), 174.0 (COO^-), 103.8 (C-1'), 100.9 (C-2"), 96.2 (C-1β), 92.4 (C-1α), 80.3, 80.2, 75.22, 75.19, 74.4, 74.3, 73.1, 72.9, 72.4, 72.2, 71.7, 71.4, 70..5, 69.1, 69.04, 69.01 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5', C-4", C-6", C-7", C-8"), 64.1 (C-6'), 63.2 (C-9"), 60.8 e 60.7 (C-6α+β), 52.4 (C-55"), 40.7 (C-3"), 22.6 (NHCOCH₃).

[α]_D ^20℃: +9,8°(c: 1%, H₂O)

Mp: 179,3÷182,8℃ (T 분해)

IRν ^KBr _max: 3391, 1612, 1379, 1034 cm^-1.

실시예 12

마그네슘 5- 아세트아미도 -3,5- 디데옥시 -D- 글리세로 -α-D- 갈락토 -논-2- 울로피라노실로네이트 -(2→6)-β-D- 갈락토피라노실 -((1→4)-(α/β)-D- 글루코피라노오스의 제조

실시예 8에 따라 수득된, 조 탈아세틸화 생성물 100 g을 500 ml의 물에 용해시키고, 수득된 용액을 4℃에서 냉각시켰다. pH를 NaOH 수용액에 의해 중성 pH로 조정하고, 용액의 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서, 23 ml의 NaOH 30%를 첨가했다. 상기 용액을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 포지티브 TLC 대조군 (Pharmacopoeia)에서, 용액을 IR120(H⁺)/IRA96(OH^-)를 통해 통과시켰다. 용리물을 MgO로 pH 9.8까지 조정하고, 시럽으로 농축시키고, 백색 이쇄성(friable) 고체를 수득할 때까지, 순수 EtOH로 수회 스티립핑시키고, 상기 고체를 96% EtOH로부터 재결정화시켰다.

수득된 생성물: 50.8 g

¹H NMR (D₂O, 300 MHz): δ ppm 5.22 (d, J₁ _-2 3.6Hz, 1H, H-1α), 4.66 (d, J_1-2 8.1Hz, 1H, H-1β), 4.43 (d, J_1' _-2':7.5Hz, 1H, H-1'), 4.02-3.48 (m, 19H), 3.31 (m, 1H), 2.71 (dd, J₃ _" _eq _-3" _ax 12.3 e J₃ _" _eq _-4"4.5 Hz, H-3"eq), 2.03 (s, 3H, NHCOCH ₃), 1.74 (pseudo t, J₃ _" _ax _-3" _eq = J₃ _" _ax _-4" 12.3 Hz, H-3"ax).

¹³C NMR (D₂O, 75 MHz, 내부 기준 아세토니트릴): δ ppm 175.5 (NHCOCH₃), 174.1 (COO^-), 103.8 (C-1'), 100.9 (C-2"), 96.3 (C-1β), 92.4 (C-1α), 80.3, 80.2, 75.26, 75.23, 74.4, 74.3, 73.1, 73.0, 72.4, 72.2, 71.7, 71.4, 70.6, 69.1, 69.00, 68.96 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5', C-4", C-6", C-7", C-8"), 64.2 (C-6'), 63.3 (C-9"), 60.9 e 60.7 (C-6α+β), 52.4 (C-5"), 40.7 (C-3"), 22.7 (NHCOCH₃).

Mg² ⁺기준 분석: 97,5%

[α]_D ^20℃: +9,8°(c: 1%, H₂O)

Mp: 183.1÷185.1℃ (T 분해)

IRν ^KBr _max: 3391, 1634, 1379, 1035 cm^-1.

Claims

하기 식 (Ib)를 가지며,

식 중에서, Mⁿ ⁺는 K⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Sr² ⁺, Fe² ⁺ 및 Al³ ⁺로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
제1항에 있어서, 상기 Mⁿ ⁺는 K⁺, Ca² ⁺, 및 Mg² ⁺로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
6'-시알릴락토오스(6'SL)로부터 개시되는, 제1항 또는 제2항에 정의된 식 (Ib)의 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 8 내지 10의 pH 값을 얻기 위해 6'SL 용액에 M⁽ⁿ⁺⁾ 함유 염기를 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
하기 식 (I)을 가지며,

식 중에서, R은 유리 히드록시기를 갖는 모노사카라이드, 디사카라이드, 또는 올리고사카라이드인 것인 α-시알릴-올리고사카라이드 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) 케니히스-크노르(Koenigs-Knorr) 반응에 의해, P는 적합한 보호기이고; R₁은 알킬이며, X는 알로겐인 것인 하기 식 (II)의 시알릭 공여체(sialyc donor)를

R'은 보호기 P'에 의해 적절하게 보호되고, 0개, 1개, 또는 그 이상의 유리 히드록시기를 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드, 또는 올리고사카라이드이고, 상기 보호기 P'은 상호 간 및 상기 공여체에 존재하는 보호기와 동일하거나 상이할 수 있는 것인 식 R'OH의 수용체(acceptor)와 커플링시켜 P, R1 및 R'은 앞서 정의된 바와 같은 것인 하기 식 III의 중간체를 수득하는 단계를 적어도 포함하고:

상기 케니히스-크노르 반응은 Ag(I) 기반 금속 프로모터가 상기 수용체의 몰당 0.5 내지 2.0 당량의 몰량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 단계 (a) 후에, 하기 단계를 더 포함하는 것인 방법:
(b) 보호기 P, P' 및 R₁을 제거하여, 제4항에 정의된 바와 같은 식 (I)의 화합물을 수득하는 단계.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 R은 6'-락토오스인 것인 6'SL을 제조하는 방법.
Mⁿ ⁺는 Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Sr² ⁺, Fe² ⁺ 또는 Al³ ⁺인 것인 식 (Ib)의 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제6항에 따른 방법에 의해 6'SL을 제조하는 단계를 포함하는 것인 방법.
의약 및 식품 첨가제(food integrator)로 사용하기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 식 (Ib)의 화합물.
제1항 또는 제2항에 따른 식 (Ib)의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 또는 영양학적으로 허용가능한 성분을 포함하는 약제 및 식품용 조성물(pharmaceutical and foodstuff composition).