ITFI20120017A1 - SALI DI 6Âeuro¿-SIALILLATTOSIO E PROCESSO PER LA LORO SINTESI E PER LA SINTESI DI ALTRI Ï¿¡-SIALILOLIGOSACCARIDI. - Google Patents
SALI DI 6Âeuro¿-SIALILLATTOSIO E PROCESSO PER LA LORO SINTESI E PER LA SINTESI DI ALTRI Ï¿¡-SIALILOLIGOSACCARIDI. Download PDFInfo
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Classifications
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Description
Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:
Sali di 6’-sialillattosio e processo per la loro sintesi e per la sintesi di altri asialiloligosaccaridi
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente Invenzione si riferisce al campo del sali di 6’-sialillattosio; la presente Invenzione si riferisce Inoltre al campo del processi della sintesi di a-sialiloligosaccaridi ed In particolare al campo del processi per la sintesi del 6’-sialillattosio e del suol sali.
STATO DELLA TECNICA
α-Slalll-ollgosaccarldl di formula (I)
in cui R è un residuo mono- di- o oligosaccaridico con i gruppi ossidrilici liberi sono presenti in tessuti di mammiferi e uccelli e in forma predominante di lipooligosaccaridi, lipopolisaccaridi o come glicani di glicoproteine. Esistono in una varietà di legami glicosidici, più tipicamente a(2-3) e a (2-6) al galattosio (o lattosio). La funzione di questi sialosidi varia enormemente negli animali in base alla eterogeneità strutturale della porzione oligosaccaridica. Sono mediatori di eventi inter- ed intracellulari in particolar modo giocano un ruolo importante nella fisiologia e sviluppo di molti agenti patogeni (D. K. Ress, et al., Current Organic Synthesis, 2004, 1 , 31-46).
Un litro di latte umano contiene -5-10 g di oligosaccaridi non legati, questo contenuto è simile al contenuto di proteine ed eccede il contenuto di lipidi. Sono stati individuati più di 130 diversi oligosaccaridi del latte umano (Human Milk Oligosaccharides - HMO), formulazioni di latte artificiale per neonati derivano da latte bovino e contengono solo tracce di questi oligosaccaridi che sono specifici della specie umana. I mattoni fondamentali ( building blocks) degli oligosaccaridi del latte umano sono i 5 monosaccaridi D-glucosio (Glc), D-galattosio (Gal), N-acetilglucosamina (GIcNAc), L-fucosio (Fuc), e acido sialico (acido AAacetil neuraminico, Neu5Ac). La parte terminale riducente può essere formata da lattosio (Gal/?1-4Glc) o da più unità ripetitive (fino a 15 unità )di iV-acetillattosamina (Gal/31-3/4GlcNAc). Lattosio o la polilattosamina possono essere sialilati con legami «2-3 e/o «2-6. Esempi di sialosidi del latte umano sono: 3'-sialil-3-fucosillattosio (3'S3FL), 6'-sialillattosio (6'SL), 3'-sialillattosio (3'SL), 3'-sialillattosamina (3'SLN), 6'-sialillattosamina (6'SLN).
Fra i sialosidi maggiormente presenti in tessuti di mammiferi e nel latte umano è di particolare importanza il composto di formula (la) 6’-sialillattosio (6’SL, N-acetilneuramin-lattosio, a-NeuNAc-(2→6)-p-D-Gal-(1→4)-D-Glc) che è un importante costituente di glicoproteine e glicolipidi coinvolti in vari eventi cellulari fra cui il riconoscimento cellulare e risposta immunitaria.
II 6’-SL e suoi sali sono interessanti come integratori in formulazioni di alimenti per lattanti. Per quello che riguarda i sali del 6’-sialillattosio in letteratura sono noti solo sali di sodio (CAS NUMBER: 157574-76-0; FWCzaHasNO^Na; 6'-sialillattosio sale sodico, 6'-N-Acetylneuraminyl-lactose sodium salt) e di ammonio. Mentre il sale sodico è accettabile dal punto di vista alimentare e farmaceutico, il sale di ammonio è potenzialmente tossico a causa dello ione ammonio.
Risulta pertanto evidente la necessità di poter disporre di 6’-SL in forme saline alternative a quelle note che siano accettabili dal punto di vista alimentare e farmaceutico.
Allo stato dell’arte sono note varie strategie di sintesi di sialil-oligosaccaridi (fra cui il 6’SL) e tutte prevedono un approccio convergente in cui il frammento sialico attivato (donatore) è regio- e stereo-selettivamente legato alla porzione oligosaccaridica (accettore). Per questo passaggio chiave di accoppiamento sono note in letteratura tre diverse strategie sintetiche che prevedono un approccio esclusivamente enzimatico, esclusivamente chimico oppure chemo-enzimatico. Per quello che riguarda le vie enzimatiche, sono state impiegate le famiglie delle sialiltransferasi e delle transialidasi, enzimi che addizionano I’ acido sialico ad oligosaccaridi in modo strettamente specifico. Esempi di questa via di sintesi sono riportati in A.T.Beyer et al Adv. Enzymol., 1981 , 52, 23-175, in J.Weinstein et al. J.Biol. Chem. , 1982, 257, 13845-13853.
Diverse sono però le limitazioni nell’utilizzo di questi enzimi:
1) la limitata disponibilità dei suddetti enzimi
2) la necessità di sintetizzare il donatore di substrato attivato CMP-NeuAc. o PNP-NeuAc
3) la stretta specificità delle sialiltransferasi che riduce la versatilità nell’impiego per la sintesi di sialosidi naturali (Y.lchigawa et al. Analytical Biochem 1992, 202, 215-238, S. Sabesan et al. J.Am.Chem.Soc., 1986, 108, 2068-2080, O.Hindsgaul et al JBiol.Chem., 1991 , 266, 17858-17862, H.J.Gross et al. Eur.J. Biochem. 1988, 177, 583-589).
Per quanto riguarda le vie chemo-enzimatiche queste prevedono la sintesi chimica dell’accettore e poi la sialilazione enzimatica come in S. Sabesan et al., J.Am.Chem.Soc., 1986, 108, 2068-2080.
Riguardo le vie esclusivamente chimiche è da sottolineare che la formazione del legame glicosidico con l’acido sialico è una reazione alquanto difficoltosa perché è ostacolata dal fatto che il donatore è ingombrato elettronicamente e stericamente dal gruppo carbossilico geminale. Inoltre la mancanza del gruppo funzionale sul C-3 esclude la sua assistenza anchimerica per il controllo stereochimico e porta alla formazione di sottoprodotti attraverso la reazione di eliminazione; infine la formazione del legame con configurazione a è termodinamicamente sfavorita in relazione all’effetto anomerico. Nel tentativo di ovviare a tali inconvenienti sono state sviluppate allo stato dell’arte varie strategie per la preparazione di donatori sialici opportunamente attivati e accettori con gruppi ossidrilici opportunamente protetti che sono fatti reagire mediante tecniche di glicosidazione varie.
Per quanto riguarda il donatore sialico è da sottolineare che I’ architettura molecolare complicata impartisce un sostanziale grado di difficoltà nella sua sintesi, protezione e attivazione. La natura polifunzionale (3 gruppi idrossilici secondari), così come il centro anomerico terziario, complicano il lavoro del chimico sintetico. Attualmente allo stato dell’arte è noto che il donatore sialico può essere attivato ad esempio come 2-xantato (A.Marra et al., Carbohydr.Res., 1989, 187, 35), come 2-aril sulfone (Y. Du et al, Carbohydr. Res. , 1998, 308, 161), come 2-fosfito (R.R. Schmidt et al., Tetrahedron Leti., 1992, 33, 6123 o in C.H. Wong et al., J.Am.Chem.Soc., 1992, 114, 8748) o come 2-alo derivato. Tra tutti questi gruppi sono preferibili gli alogeno derivati in quanto i fosfiti ed i tio derivati richiedono per la loro sintesi reattivi tossici e poco maneggevoli a livello industriale. Tra gli alogeni è da preferire il cloruro per la sua facilità di sintesi e stabilità, infatti il bromuro è instabile e tende a dare facilmente in glicosidazione reazioni di eliminazione e miscele anomeriche. Il fluoruro richiede una sintesi più elaborata rispetto al cloruro e tende a formare legami glicosidici di tipo β. Il cloruro sarebbe quindi il donatore più semplice da fare e usare.
Riguardo ancora la struttura del donatore, altre vie sintetiche, ancora più complesse delle precedenti, prevedono la inclusione sul C-3 dell’acido sialico di un gruppo funzionale che dia assistenza anchimerica nella reazione di glicosidazione per prevenire le competitive reazioni di eliminazione in posizione 2,3. A tale scopo gruppi introdotti sono stati ad esempio feniltio o fenilseleno (Y. Ito et al., Tetrahedron Leti., 1988, 29, 3987 o in L.O. Kononov et al., Tetrahedron Lett., 1997, 38, 1599). Queste vie prevedono quindi molteplici passaggi per ottenere il donatore attivato per la reazione di glicosidazione in genere a partire dal 2,3-deidro NeuAc con rese variabili a seconda della specificità ottenuta e della facilità di purificazione degli intermedi.
Alla luce di ciò per la sintesi di sialiloligosaccaridi di formula (I) ed in particolare del 6’SL sarebbe preferibile poter impiegare in maniera efficiente un sialilderivato semplice come il 2-cloro-donatore di formula (II)
in cui P è un opportuno gruppo protettore; Ri è alchile e X è cloro;
(ottenibile mediante metodica riportata in R.Kuhn et al., Chem.Ber., 1966, 99, 611, A. Marra et al., Carb.Res., 1989, 190, 317-322 e in N.F. Byramova et al., Carb. Res., 1992, 237, 161-175) perché è facilmente sintetizzabile anche a livello industriale senza l'impiego di reattivi particolarmente tossici e, coinvolto in reazioni di glicosidazione, porta alla formazione di legami a specificamente. L’impiego di questo donatore sialico, però, è diminuita sensibilmente dopo la sue prime applicazioni e lo stato deN’arte ha indirizzato verso donatori molto più complessi. Per quello che riguarda l’attivazione dell’accettore per la sintesi del 6’SL, si trovano in letteratura accettori sostituiti con gruppi funzionali di tipo etereo ad esempio con gruppi benzilici la cui rimozione, richiedendo un’idrogenazione, non è molto agevole (G.Pazynina et al. Tetrahedron Leti., 2002, 43, 8011-8013) e pertanto di difficile applicazione industriale.
α-Glicosidi dell’acido sialico sono stati preparati mediante la reazione di Koenigs-Knorr che prevede l’impiego di Ag(l) come promotore [Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber., 1901 , 34, 957] oppure usando la modifica di Helferich che impiega Hg(ll) come promotore [Helferich, B.; Zirner, J. Chem. Ber., 1962, 95, 2604], I substrati scelti in queste reazioni sono β-glicosil-alogenuri. Sono note numerose variazioni di questi metodi classici progettate per migliorarne le possibilità d’impiego e le rese. Le principali differenze fra queste variazioni sono relative alla scelta del contro-anione del promotore metallico. I più comuni promotori usati sono AgOTf, Ag2C03, HgX2(X = alogenuro), and Hg(CN)2. In generale è noto che promotori di Ag(l) sono più attivi e stereosellettivi (G.Pazynina et al. Tetrahedron Leti., 2002, 43, 8011-8013) che però devono essere utilizzati in elevate quantità (6-7 eq rispetto all’accettore) quindi contribuendo ad aumentare i costi della sintesi (anche per lo smaltimento dei reflui di produzione), mentre promotori di Hg(ll) forniscono rese più alte (H.Paulsen et al. Angew.Chem.Int.Ed.Engl., 1982, 927-928) però presentano difficoltà di manipolazione dovuti alla loro tossicità e scarsa maneggevolezza.
Risulta quindi evidente la necessità di un processo per la sintesi del composto (I) che sia semplice ed economico, applicabile su scala industriale, e che quindi consenta di superare i problemi tecnici suddetti dei processi noti in letteratura.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione risolve i problemi suddetti mediante composti di formula (Ib)
in cui M<n+>è scelto nel gruppo consistente in K<+>, Ca<2+>, Mg<2+>, Sr<2>*, Fe<2+>, Al<3+>, Inoltre oggetto della presente invenzione è un processo per la sintesi di composti α-sialil-oligosaccaridi di formula (I) ;;; ;;
in cui R è un residuo mono-, di- o oligosaccaridico con gli ossidrili liberi; detto processo comprendente almeno un passaggio di: ;a) accoppiamento mediante reazione di Koenigs-Knorr di un donatore sialico di formula (II) ;;; ;;
in cui P è un opportuno gruppo protettore; Ri è alchile, e X è un alogeno; con un accettore di formula R’OH in cui R’ è un residuo mono-, di- o oligosaccaridico opportunamente protetto con gruppi protettori P’ e contenente zero, uno o più gruppi ossidrilici liberi; in cui detti gruppi protettori P’ possono essere uguali o diversi tra loro e da quelli presenti sul donatore; ;detta reazione di Koenigs-Knorr caratterizzata dal fatto che il promotore metallico a base di Ag(l) è impiegato in quantità molari comprese fra 0.5 e 2.0 eq rispetto alle moli di accettore; ;per ottenere un intermedio di formula (Ili) ;;; ;;
in cui P, R1 ed R’ sono come definiti sopra. ;In particolare il processo suddetto offre una vantaggiosa via di sintesi per il 6’SL dal quale possono poi essere preparati i suoi sali di formula (Ib) in cui M<n+>è Na<+>, K<+>, NH4<+>, Ca<2+>, Mg<2+>, Sr<2>*, Fe<2+>, Al<3+>.
Altri vantaggi della presente invenzione sono illustrati più avanti nella descrizione dettagliata.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La presente invenzione ha inoltre per oggetto composti di formula (Ib)
in cui M<n+>è scelto nel gruppo consistenti in K<+>, Ca<2+>, Mg<2+>, Sr<2+>, Fe<2+>, Al<3+>, dove n = 1 , 2, 3 in corrispondenza allo stato di ossidazione di M.
Preferibilmente M<n+>è Ca<2+>, Mg<2+>o K<+>.
Composti di formula (Ib) sono tutti accettabili dal punto di vista alimentare e farmaceutico e sono utili come potenziali principi attivi o come integratori alimentari (ad esempio come integratori in formulazioni di latte artificiale per lattanti).
In particolare 6’SL in forma di:
- sale di calcio è potenzialmente utile a favorire l’accrescimento osseo;
- sale di potassio e magnesio sono potenzialmente utili nel mantenere, favorire o ripristinare un corretto trasporto attraverso le membrane biologiche e la fisiologica differenza di potenziale transmqmbrana;
- sale di ferro è potenzialmente utile per tutte le situazioni patologiche che richiedano un’integrazione di Fe;
Il sale di calcio in particolare presenta proprietà chimico-fisiche migliori rispetto al noto sale di sodio e la sua cristallizzazione risulta più agevole. Infatti in fase di cristallizzazione si ha la formazione di un solido cristallino facilmente manipolabile e quindi più facilmente gestibile anche a livello industriale e la sua filtrazione non presenta problemi in quanto è veloce e permette un lavaggio efficiente del solido. Nel caso del sale di sodio invece in fase di cristallizzazione si ottiene inizialmente un solido gommoso, poco agitabile che è necessario poi triturare, anche la sua filtrazione risulta lenta e laboriosa. La stabilità dei due sali risulta essere analoga. Un altro aspetto positivo del sale di calcio è dato dal fatto che a partire da una stessa matrice di 6’SL in forma acida il sale di calcio è quello ottenuto con purezza più elevata: per esempio la stessa matrice di 6’SL ha fornito un cristallo di sale sodico a purezza HPLC 87% e un cristallo di sale di calcio a purezza HPLC 93%. I sali sia di potassio che di magnesio presentano caratteristiche chimico-fisiche simili al sale di sodio ed anche la loro cristallizzazione ha andamento simile.
Composti di formula (Ib) sopra descritti possono essere preparati da 6’SL secondo metodi noti allo stato dell’arte per la preparazione di sali dai corrispondenti acidi carbossilici; ad esempio e preferibilmente possono essere preparati da una soluzione di 6’SL mediante aggiunta di una base contenente M<(n+>>come ad esempio idrossidi, carbonati o bicarbonati (cioè KOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2, etc.; K2C03, CaC03, MgC03etc.; KHC03, etc.) fino ad ottenere un pH 8-10. In seguito a rimozione del solvente i sali così ottenuti sono purificabili per cristallizzazione da alcoli o miscele acqua/alcoli; preferibilmente metanolo, etanolo e loro miscele con acqua.
Opzionalmente prima della rimozione del solvente è possibile rimuovere per filtrazione l’eccesso di base indisciolta eventualmente presente.
Per un altro aspetto la presente invenzione ha per oggetto un processo per la sintesi di composti α-sialil-oligosaccaridi di formula (I)
in cui R è un residuo mono-, di- o oligosaccaridico con ossidrili liberi; preferibilmente R è scelto fra galattosio, glucosio, glucosamina, lattosio, lattosamin e fucosillattosio; più preferibilmente R è scelto fra 6-galattosio, 3-glucosio, 3-glucosamina, 6’-lattosio, 3’-lattosio, 6’-lattosamina, 3’-lattosamina e 3’-3-fucosillattosio;
detto processo comprendente almeno un passaggio:
a) accoppiamento mediante reazione di Koenigs-Knorr di un donatore sialico di formula (II)
in cui
P è un opportuno gruppo protettore ;
Ri è alchile, preferibilmente Me, Et, o Pr;
X è un alogeno, preferibilmente cloro;
con un accettore opportunamente protetto di formula R’OH in cui R’ è un residuo mono-, di- o oligosaccaridico opportunamente protetto con gruppi protettori P’ e contenente zero, uno o più gruppi ossidrilici liberi; detti gruppi protettori P’ possono essere uguali o diversi tra loro e da quelli presenti sul donatore;
detta reazione di Koenigs-Knorr caratterizzata dal fatto che il promotore metallico a base di Ag(l) è impiegato in quantità molari comprese fra 0.5 e 2.0 eq rispetto alle moli di accettore; per ottenere un intermedio di formula (Ili)
in cui P, R1 ed R’ sono come definiti sopra.
Per un aspetto preferito detto processo comprende inoltre dopo il passaggio (a), il seguente passaggio:
b) rimozione dei gruppi protettivi P, P’ ed Ri per ottenere i composti di formula (I) come descritti sopra.
La rimozione dei gruppi protettivi b) è effettuata secondo metodiche note allo stato dell’arte (T.W. Green and P.G.M. Wuts. Green’s Protective Groups in Organic Synthesis. Ed. Willey ed 4. 2006).
Per un aspetto preferito detto promotore metallico è impiegato in quantità molari comprese fra 0.75 e 0.85 eq rispetto alle moli di accettore.
Per un aspetto preferito detto promotore metallico è scelto fra sali di Ag(l) quali ad esempio AgOTf, Ag2C03, e più preferibilmente è Ag2C03.
Per un aspetto preferito l’accoppiamento a) è condotto in solvente polare aprotico; preferibilmente è condotto in diclorometano.
Per un aspetto preferito l’accoppiamento a) è effettuato mantenendo la miscela in agitazione ad una temperatura compresa fra 20 e 40° C per un tempo compreso fra 5 e 10 giorni; preferibilmente la miscela è tenuta in agitazione a 30°C per 7 giorni.
Per un aspetto preferito P e P’ sono indipendentemente scelti fra benzile e acile; preferibilmente P e P’ sono indipendentemente scelti fra acetile, benzoile, benzoile mono- o di sostituito con alcossi, alogeno, nitro.
Per un aspetto preferito P e P’ sono di natura acilica. Per un aspetto ancora più preferito P e P’ sono uguali e sono acetile. Nel caso in cui R è 6’-lattosio il processo della presente invenzione con P=P’=Ac si ha un ulteriore differenziazione da processi noti per la sintesi di 6’SL in quanto in questo caso l’accettore impiegato per la presente invenzione non presente gruppi benzili e presenta quindi il vantaggio di evitare idrogenazioni catalitiche per la rimozione di gruppi protettivi.
Per un aspetto preferito detto accettore R’OH opportunamente protetto presenta come gruppo OH libero e reattivo quello presente al C-6 di un unità galattosidica; in maniera particolarmente preferita detto accettore è un derivato del lattosio di formula (IV):
in cui P’ è un opportuno gruppo protettore; preferibilmente P’ è acile; più preferibilmente acetile.
Per un aspetto particolarmente preferito quindi la presente invenzione si riferisce alla sintesi del 6’SL di formula (la) in cui R=6’-lattosio mediante il processo descritto sopra in cui P e P’ sono Ac, X è cloro ed Ri è metile; in questa particolare combinazione la reazione di accoppiamento in cui l’accettore è un composto di formula (IVa)
fornisce il composto di formula (Il la)
che sorprendentemente può essere utilizzato tal quale come ottenuto dal grezzo di reazione per la successiva reazione di deprotezione sequenziale dei gruppi ossidrilici e della funzione carbossilica al carbonio anomerico dell’acido sialico e ottenimento del composto 6’SL di formula (la). Preferibilmente si procede prima alla rimozione del gruppi acetlle e poi all’Idrolisi del metllestere. Detta deprotezlone sequenziale è effettuata secondo quanto noto allo stato deH’arte. Preferibilmente la rimozione del gruppi Ac è effettuata utilizzando una base come metossldo di sodio, etossldo di sodio o idrossido di sodio, più preferibilmente metossldo di sodio e utilizzando come solvente un alcol primario, come metanolo o etanolo, più preferibilmente metanolo. Preferibilmente l'idrolisi del metilestere al carbonio anomerico dell’acido sialico è effettuata in condizioni basiche con NaOH 1M.
Preferibilmente al termine dell’Idrolisi del metilestere la miscela di reazione è acidificata mediante passaggio su resine a scambio ionico , in particolare una resina cationica forte e una resina anionica debole, per ottenere un eluato contenente 6’SL.
Il donatore sialico utilizzato nel processo sopra descritto, in particolare quando X è cloro e R' è lattosio protetto di formula (IV) con P=P’=Ac, è semplice ovvero è di facile preparazione e di agevole impiego. Questa scelta si è rivelata sorprendentemente adeguata a risolvere i problemi dei processi noti nonostante lo stato dell’arte avesse indirizzato verso donatori molto più complessi.
La quantità di promotore metallico impiegata nel passaggio a) è sorprendentemente ridotta rispetto a quanto noto allo stato dell’arte, 0.5-2.0 eq contro 6-7eq, e pertanto riduce molto i costi di sintesi nonché i costi di smaltimento dei reflui di produzione.
Il prodotto della reazione di accoppiamento viene ottenuto sorprendentemente con purezza sufficiente da poter essere utilizzato tal quale nella successiva reazione di deprotezione per l’ottenimento del sialil-oligosaccaride deprotetto con buone rese e purezze. Inoltre occorre sottolineare che il processo per la reazione di coupling della presente invenzione è stereoselettiva in quanto si ottiene solo il prodotto a. Il processo della presente invenzione risulta pertanto attuabile anche su scala industriale.
La presente invenzione si riferisce inoltre ad un processo per la sintesi di composti di formula (Ib) in cui M<n+>è Na<+>, K<+>, NhV, Ca<2+>, Mg<2+>, Sr<2+>, Fe<2+>, Al<3+>detto processo comprendente la preparazione di 6’SL mediante il processo sopra descritto; preferibilmente i sali di formula (Ib) possono essere preparati direttamente dall’eluato contenente 6’SL, ottenuto in seguito a passaggio su resine a scambio ionico dopo idrolisi del metilestere, mediante aggiunta di una base contenente M<(n+>>come ad esempio idrossidi, carbonati 0 bicarbonati (cioè KOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2, etc.; K2C03, CaC03, MgC03etc.; KHC03, etc.)fino ad ottenere pH 8-10.
Composti di formula (II) sono ottenibili mediante tecniche note allo stato dell’arte come ad esempio quanto riportato in (R.Kuhn et al., Chem.Ber., 1966, 99, 611 , A. Marra et al., Carb.Res., 1989, 190, 317-322 e in N.F. Byramova et al., Carb. Res., 1992, 237, 161-175)
La sintesi dell’accettore opportunamente protetto può essere effettuata secondo quanto noto all’uomo dell’arte, in particolare la sintesi dell’accettore di formula (Il la) in cui P è Ac è stata effettuata secondo metodiche note all’uomo dell’arte in accordo con lo Schema 1 .
Schema 1
Secondo l’invenzione alcossi significa ad esempio -OMe, -OEt, -OnPr, -OPr, -OnBu, -OBu, -O/Bu.
Secondo l’invenzione alogeno significa fluoro, cloro, bromo, iodo.
Secondo l’invenzione alchile è una catena alchilica lineare o ramificata contenente da 1 a 6 atomi di carbonio eventualmente sostituita da uno o più gruppi scelti fra alogeno, idrossi, alcossi, nitro.
Secondo l’invenzione arile è benzene eventualmente sostituito da uno o più gruppi scelti fra alogeno, alcossi, nitro.
Secondo l’invenzione acile significa un gruppo -OCO-alchile, o -OCO-arile in cui alchile e arile sono come sopra definiti.
Secondo l’invenzione per monosaccaride s’intende una poliossialdeide (aldoso) od un poliossichetone (chetoso) ovvero uno zucchero semplice di formula (CH20)n, CnH2nOn-i, CnH2nOn-iNH2oppure CnH2nOn-iNHAc con n=3,4,5,6,7; si intendono comprese nella definizione tutti i possibili stereoisomeri e tutte le forme aperte o cicliche ovvero semiacetali e semichetali intramolecolari come ad esempio le forme piranosidiche e furanosidiche; ad esempio sono comprese nella definizione gliceraldeide, allosio, altrosio, arabinosio, eritrosio, fucosio, galattosio, glucosio, glucosamina, N-acetil-glucosamina, idosio, lixosio, mannosio, psicosio, ribosio, deossiribosio, sorbosio, tagatosio, treosio, xilosio e corrispondenti chetosi. Secondo l’invenzione per disaccaride s’intende un composto poliossidrilato costituito da due monosaccaridi legato attraverso un legame acetalico ovvero glicosidico sia O-glicosidico che N-glicosidico; si intendono comprese nella definizione tutti i possibili stereoisomeri e tutte le forme aperte o cicliche; s’intendono inclusi ad esempio lattosio, lattosammina, N-acetil-lattosammina, maltosio, cellobiosio, saccarosio, trealosio, turanosio.
Secondo l’invenzione per oligosaccaride s’intende un polimero costituito da tre a 6 monosaccaridi legati tra loro attraverso legami glicosidici in modo da formare catene saccaridiche lineari o ramificate; s’intendono inclusi ad esempio raffinosio, melezitosio, maltotriosio, acarbosio, stachiosio.
PARTE SPERIMENTALE
ESEMPIO 1
Preparazione di 4',6'-0-benziliden lattosio
200 g (0.555 mol) di lattosio monoidrato sono aggiunti sotto agitazione a 1.4 I di A/,A/-dimetilformammide. Si aggiungono 209 mi (1.39 mol) di benzaldeide dimetil acetale e 5.28 g (0.028 mol) di acido p-toluensolfonico monoidrato. Si scalda la sospensione così ottenuta a 55°C e si tiene a tale temperatura fino ad esito positivo della TLC (16-18 ore) (farmacopea). Si raffredda a temperatura ambiente e si aggiungono 4.7 mi di trietilammina in modo da portare il pH a 7-8. Si concentra il solvente fino all’ottenimento di 700 mi di soluzione, la quale viene sgocciolata in 3 I di acetone preriscaldato a 50-55°C, mantenendo una vigorosa agitazione. Si completa la precipitazione raffreddando a T:0±5°C la miscela. Il solido precipitato viene filtrato, lavato con 0.7 I di acetone freddo e seccato, ottenendo 208 g di 4’,6’-0-benziliden lattosio (miscela di anomeri α/β) come prodotto bianco (titolo HPLC 66%, 0.319 mol, resa: 57%).
Mediante doppia cristallizzazione, prima da MeOH e poi da MeOH/H20 4/1 v/v a caldo, è stato ottenuto un campione analitico arricchito in anomero a, di cui viene riportata la caratterizzazione NMR:
<1>H NMR (DMSOcfe, 300 MHz): δ ppm 7.51-7.34 (5H, m, Ph); 6.36 (d, JOH-i= 4.8 Hz, 1 H, C1-OH); 5.58 (s, 1H, PhCH)\ 5.28 (d, J= 4.2 Hz, 1 H, OH); 5.01 (d, J= 5.7 Hz, OH); 4.92 (pseudo t, J.|.OH= JI-2= 4.0 Hz, 1 H, H-1); 4.68 (d, J= 6.9 Hz, 1H, OH); 4.45 (m, 2H, 2xOH); 4.37 (d, Jr.2.= 7.5 Hz, 1H, H-1 ’); 4.16-3.95 (m, 3H); 3.84-3.11 (m, 9H) (H-2, H-3, H-4, H-5, CH2-6, H-2’, H-3’, H-4’, H-5’, CH2-6’).
<13>C NMR (DMSOdfe, 75 MHz): δ ppm 138.5, 128.6, 127.9, 126.2 (Ph); 103.1 (C-1 ’); 99.8 (PhCH); 92.1 (C-1); 79.6, 75.8, 72.2, 71.6, 71.3, 69.9, 69.8, 68.5 (C2, C2’, C3, C3’, C4, C4’, C5, C5’); 66.2 (C6’); 60.3 (C6).
Rf (farmacopea, UV-vis e naftoresorcina)= 0.7
ESEMPIO 2
Preparazione di 4',6'-0-p-metossibenziliden lattosio
200 g (0.555 mol) di lattosio monoidrato sono aggiunti sotto agitazione a 1.4 I di A/,A/-dimetilformammide. Si aggiungono 237 mi (1.39 mol) di p-metossibenzaldeide dimetil acetale e 5.28 g (0.028 mol) di acido p-toluensolfonico monoidrato. Si scalda la sospensione così ottenuta a 55°C e si tiene a tale temperatura fino ad esito positivo della TLC (16-18 ore) (farmacopea). Si raffredda a temperatura ambiente e si aggiungono 5.0 mi di trietilammina in modo da portare il pH a 7-8. Si concentra il solvente e si ricristallizza il residuo in 3 I di acetone preriscaldato a 50-55°C. Si completa la precipitazione raffreddando la miscela a T: 0÷5°C. Il solido precipitato viene filtrato, lavato con 2x200 mi di acetone freddo e seccato, ottenendo 219 g di 4’,6’-0-p-metossibenziliden lattosio (miscela di anomeri α/β) come solido giallo chiaro (titolo HPLC 76%, 0.361 mol, resa: 65%)
Mediante cristallizzazione a caldo da acetone/H20 4/1 v/v è stato ottenuto un campione analitico come miscela di anomeri α/β circa 1/1 mol/mol., di cui viene riportata la caratterizzazione NMR
<1>H NMR (DMSOcfe, 300 MHz): δ ppm 7.38 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 6.93 (d, J= 8.7 Hz, 2H) (Ph); 6.70 (d, JOH-i= 6.6 Hz, 1H, C1-OH β); 6.36 (d, JOH-i= 4.1 Hz, 1H, C1-OH a); 5.52 (s, 1H, PhCtf α+β); 5.27 (m, 1H, OH a+β); 5.04-4.95 (m, 1H, OH α+β);
4.92 (pseudo t, J= 4.1 Hz, H-1 a); 4.72-4.60 (m, 1H, OH α+β); 4.56-4.28 (m, H-1 ’ α+β H-1 β 2x0 H a+β); 4.12-3.92 (m, 3H); 3.76 (s, 3H, OMe); 3.80-3.11 (m, 9H); 2.98 (m, 1H β).
<13>C NMR (DMSOcfe, 75 MHz): δ ppm 159.4, 130.9, 127.6, 113.2 (Ph); 103.0 (C-1' α+β); 99.7 (PhCH α+β); 96.7 (C- 1 β) ; 92.1 (C-1a); 79.6, 79.2, 75.7, 74.9, 74.8, 74.6, 72.2, 71.6, 71.3, 69.9, 69.8, 68.4 (C2, C2', C3, C3\ C4, C4\ C5, C5' α+β); 66.2 (C6’ a+β); 60.4, 60.3 (C6 a+β); 55.1 (OMe α+β).
Rf (farmacopea, UV-vis e naftoresorcina)= 0.8
ESEMPIO 3
Preparazione di l,2,3,6,2',3'-esa-0-acetil-4',6'-0-benziliden-3-D-lattosio 100 g (da dosaggio HPLC 0.153 moli) di 4’,6’-0-benzilidenlattosio, ottenuto come da esempio 1 , sono aggiunti a 600 mi di metiletilchetone e 256 mi (1.84 moli) di trietilammina. La miscela di reazione è scaldata a 60°C e si gocciolano 174 mi (1.84 moli) di anidride acetica, mantendo la temperatura interna inferiore a 70°C. La miscela di reazione viene mantenuta in agitazione a 70°C fino a controllo TLC positivo (10-12 ore) (AcOEt). Si allontana il solvente al rotavapor, riprendendo il residuo con 270 mi di diclorometano e 200 mi di acqua. La fase acquosa è alcalinizzata con NaOH 30% fino a pH 9-9.5, quindi si estrae e la fase acquosa è riestratta con 75 mi di diclorometano. Le fasi organiche riunite sono estratte con 200 mi di acqua, acidificando con una soluzione di HCI 32% fino a pH 1-1.5. La fase acquosa acida è estratta con 75 mi di diclorometano. Le fasi organiche riunite sono infine lavate con 370 mi di soluzione di NaCI al 20%, seccate su Na2S04anidro e decolorate con carbone e bentonite. Si concentra il solvente fino a residuo oleoso, impiegato come tale nella reazione successiva. Da dosaggio HPLC si ottengono 103 g (0.151 mol) di 1 , 2,3,6, 2<,>,3<,>-esa-0-acetil-4<,>,6<,>-0· benzilidenlattosio essenzialmente come anomero β (anomero a<10% mol) (resa: 99%). Un campione analitico contenente 9%mol di anomero a è stato ottenuto per cristallizzazione da MeOH caldo; di seguito viene riportata la caratterizzazione NMR (anomero β).
<1>H NMR (CDCI3, 300 MHz): δ ppm 7.54-7.34 (m, 5H, Ph); 5.68 (d, J1-2= 8.4 Hz, 1H, H-1), 5.47 (pseudo s, 1H, CHPh); 5.32-5.21 (m, 2H, H-3+H-2'), 5.07 (dd, J2.3= 9.6 Hz e J2-1= 8.4 Hz, 1H, H-2), 4.87 (dd, J3.2= 10.4 Hz e J3.4'= 3.8 Hz, 1H, H-3'), 4.54-4.43 (m, 2H, H-1'+H-6a), 4.38-4.25 (m, 2H, H-4'+H-6'a), 4.14 (dd, J6b.6a= 12.2 e J6b-5= 4.6 Hz, 1 H, H-6b), 4.04 (d, J6'b-6'a= 12.3 Hz, 1 H, Η-6'b), 3.90-3.70 (m, 2H, H4+H5); 3.46 (pseudo s, 1H, H-5'), 2.14-2.00 (6xCOCH3).
<13>C NMR (CDCI3, 75 MHz): δ ppm 170.8, 170.4, 170.1 , 169.7, 169.0, 168.9 (6XCOCH3); 137.5, 129.3, 128.3, 126.6 (Ph); 101.4 (CHPh); 101.1 (C-1'); 91.8 (C-1); 75.5, 73.8, 73.2, 72.4, 72.2, 70.5, 69.0, 68.5 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2\C-3', C-4', C-5'); 66.6 (C-6'); 61.8 (C-6), 20.9-20.7 (6xCOCH3).
Rf (AcOEt:esano=1 :1 , UV-vis e H2S04/Me0H)= 0.3
ESEMPIO 4
Preparazione di 1,2, 3,6,2', 3'-esa-0-acetil-4',6'-0-p-metossibenziliden-3-D-
lattosio
100 g (da dosaggio HPLC 0.165 mol) di 4’,6’-0-p-metossibenzilidenlattosio, ottenuto come da esempio 2, sono aggiunti a 600 mi di metiletilchetone e 242 mi (1.74 mol) di trietilammina. La sospensione è scaldata a 60°C e si gocciolano 164 mi (1.74 moli) di anidride acetica, mantendo la temperatura interna inferiore a 70°C. La miscela di reazione viene mantenuta in agitazione a 70°C fino a controllo TLC positivo (10-12 ore) (AcOEt:esano=1 :1). Si allontana il solvente al rotavapor, riprendendo il residuo con 270 mi di diclorometano e 200 mi di acqua. La fase acquosa è alcalinizzata con NaOH 30% fino a pH 9-9.5, quindi si estrae e la fase acquosa è riestratta con 75 mi di diclorometano. Le fasi organiche riunite sono estratte con 200 mi di acqua, acidificando con una soluzione di HCI 32% fino a pH 1-1.5. La fase acquosa acida è estratta con 75 mi di diclorometano. Le fasi organiche riunite sono infine lavate con 400 mi di soluzione di NaHC03satura, con 400 mi di soluzione di NaCI al 20%, seccate su Na2S04anidro e decolorate con carbone e bentonite. Si concentra il solvente fino a residuo oleoso, impiegato come tale nella reazione successiva. Da dosaggio HPLC si ottengono 110 g (0.155 mol) di 1 ,2,3,6,2’,3’-esa-0-acetil-4’,6’-0-p-metossibenzilidenlattosio essenzialmente come anomero β (resa: 94%). Un campione analitico è stato ottenuto per cristallizzazione da MeOH caldo; di seguito viene riportata la caratterizzazione NMR (anomero β).
<1>H NMR (CDCI3, 300 MHz): δ ppm 7.36 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 6.88 (d, J= 8.7 Hz, 2H) (Ph); 5.66 (d, J1-2= 8.4 Hz, 1H, H-1); 5.40 (pseudo s, 1H, CHPh); 5.24 (pseudo t, J3-2= J3-4= 9.6 Hz, 1 H, H-3); 5.23 (dd, J2.3= 10.2 Hz e J2.r= 7.8 Hz, 1H, H-2’); 5.04 (dd, J2.3= 9.6 Hz e J2-1= 8.4 Hz, 1H, H-2); 4.84 (dd, J3.2= 10.2 Hz e J3.4'= 3.6 Hz, 1H, H-3'), 4.46 (dd, J6a-6b= 12.0 Hz e J6a-5= 1.5 Hz, 1H, H-6a); 4.44 (d, Jr.2= 7.8 Hz, 1 H, H-1'); 4.28 (d, J4.3= 3.6 Hz, 1H, H-4'); 4.25 (d, J6 a-6'b<=>12.6 Hz, 1H, Η-6'a); 4.12 (dd, J6b-6a= 12.0 e J6b-5= 4.5 Hz, 1H, H-6b), 4.00 (dd, J6'b-6'a = 12.6 Hz e J6 b-5' = 1.5 Hz, 1 H, Η-6'b); 3.87-3.69 (m, 2H, H4+H5); 3.79 (s, 3H, OMe); 3.42 (pseudo s, 1 H, H-5’); 2.09, 2.07, 2.03, 2.02, 2.00 (6xCOCH3).
<13>C NMR (CDCI3, 75 MHz): δ ppm 170.8, 170.4, 170.1 , 169.6, 168.93, 168.89 (6xCOCH3); 160.3, 130.1 , 127.9, 113.7 (Ph); 101.3 (CHPh); 101.1 (C-1 ’); 91.8 (C-1); 75.5, 73.8, 73.2, 72.4, 72.1 , 70.5, 69.0, 68.4 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2\C-3', C-4', C-5’); 66.5 (C-6'); 61.8 (C-6), 55.4 (OMe); 20.9-20.6 (6xCOCH3).
Rf (AcOEt:esano=1 :1 , UV-vis e H2S04/Me0H)= 0.2
ESEMPIO 5
Preparazione di 1.2.3.6.2’.3’-esa-0-acetil-B-D-lattosio
Lo sciroppo contenente 100 g (0.15 moli) di 1 ,2, 3,6,2’, 3’-esa-0-acetil-4’,6’-0-benzilidenlattosio, ottenuto come da esempio 2, è disciolto in 400 mi di acido acetico glaciale. Si scalda la miscela di reazione a 80°C, si aggiungono 100 mi di acqua preriscaldata a 80°C e si tiene in agitazione a tale temperatura per 1.5 ore. La miscela di reazione viene quindi raffreddata rapidamente a temperatura ambiente, si aggiungono 500 mi di toluene e 350 mi di acqua e si procede all’estrazione. La fase acquosa è nuovamente estratta con 150 mi di toluene. Le fasi tolueniche riunite contengono I’ 1 ,2, 3,6,2’, 3’-esa-0-acetil-4’,6’-0-benzilidenlattosio non reagito, che può essere impiegato in un’altra reazione. La fase acquosa, che contiene l’1 ,2,3,6,2’,3’-esa-0-acetil-p-D-lattosio, viene estratta successivamente con 500 mi e con 150 mi di cloruro di metilene; gli estratti organici sono lavati con 3x150 mi di acqua demineralizzata, seccati su solfato di sodio anidro e concentrati a residuo oleoso. Per cristallizzazione da 580 mi di isopropile acetato preriscaldato a 50-55°C si ottengono dopo essiccamento 30.8 g di 1 ,2,3,6,2’,3’-esa-0-acetil-p-D-lattosio (0.05 mol) come solido bianco farinoso. Considerando che nelle fasi tolueniche riunite vengono recuperati 20.2 g di 1,2,3,6,2’,3’-esa-0-acetil-4’,6’-0-benzilidenlattosio (0.03 mol) non reagito, la resa è del 42%.
Pf: 188-190°C.
<1>H NMR (CDCI3I300 MHz): δ ppm 5.68 (d, J1-2= 8.1 Hz, 1 H, H-1), 5.24 (pseudo t,
J3-2=J3-4= 9 3 Hz, 1 H, H-3), 5.19 (dd, J2-3'= 10.2 Hz e J2,r=7.8 Hz, 1 H, H-2’), 5.05 (dd, J2.3= 9.3 Hz e J2-1= 8.1 Hz, 1 H, H-2), 4.88 (dd, J3'.2= 10.2 Hz e J3.4'= 3.3 Hz, 1H, H-3’), 4.49 (d, Jr.2.= 7.8 Hz, 1 H, H-1 ’), 4.49 (dd, J6a-6b= 11.1 Hz e J6a-5= 1.8 Hz, 1H, H-6a), 4.15-4.05 (m, 2H, H-4’+H-6b), 4.00-3.70 (m, 4H, H-4+H-5+H-6’a+H-6’b), 3.56 (pseudo t, J= 5.4 Hz, 1 H, H-5’), 2.96 (d, JOH-4 = 4.2 Hz, C4’-OH), 2.59 (dd, JOH-6 = 7.5 e 4.8 Hz, C6’-OH), 2.11 , 2.09, 2.08, 2.07 2.04, 2.03 (6xCOC hk).
<13>C NMR (CDCI3, 75 MHz): δ ppm 170.6, 170.4, 170.3, 169.7, 169.6, 169.0 (6XCOCH3); 101.2 (C-1 ’), 91.7 (C-1), 75.9 (C-4), 74.6 (C-5’), 73.7 (C-3’), 73.6 (C-5), 73.1 (C-3), 70.7 (C-2), 69.7 (C-2’), 67.8 (C-4’), 62.1 , 62.0 (C-6, C-6’), 20.9, 20.8, 20.7 (6XCOCH3).
Rf (AcOEt, UV-vis e H2S04/Me0H)= 0.4
ESEMPIO 6
Preparazione di 1.2.3.6.2’.3’-esa-0-acetil-B-D-lattosio
Lo sciroppo contenente 100 g (0.14 moli) di 1 ,2, 3,6,2’, 3’-esa-0-acetil-4’,6’-0-pmetossibenzilidenlattosio, ottenuto come da esempio 4, è disciolto in 400 mi di acido acetico glaciale, quindi si aggiungono 100 mi di acqua e la miscela è lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 4.5 ore. Si aggiungono 500 mi di toluene e 350 mi di acqua e si procede all’estrazione. La fase acquosa è nuovamente estratta con 150 mi di toluene. Le fasi tolueniche riunite contengono Γ 1 ,2,3,6,2’,3’-esa-0-acetil-4’,6’-0-p-metossibenzilidenlattosio non reagito, che può essere impiegato in un’altra reazione. La fase acquosa, che contiene ri ,2,3,6,2’,3’-esa-0-acetil-p-D-lattosio, viene estratta successivamente con 500 mi e con 150 mi di cloruro di metilene; gli estratti organici sono lavati con 3x150 mi di acqua demineralizzata, seccati su solfato di sodio anidro e concentrati a residuo oleoso. Per cristallizzazione da 580 mi di isopropile acetato preriscaldato a 50-55°C si ottengono dopo essiccamento 40.6 g di 1 ,2, 3,6,2’, 3’-esa-0-acetil-p-D-lattosio (0.07 mol, resa 50%) come solido bianco farinoso, le cui caratteristiche sono analoghe al solido ottenuto da esempio 5.
ESEMPIO 7
Preparazione di (methyl 5-acetamido-4.7.8.9-tetra-Q-acetyl-3.5-dideoxy-D-qlvceroa-D-qalacto-non-2-ulopyranosylonateH2→61-2.3-di-Q-acetyl-B-D-qalactopyranosyl-n→4l-1.2.3.6-tetra-Q-acetyl-B-D-qlucopyranose
100 g (0.168 mol) di 1 ,2,3,6,2’,3’-esa-0-acetil-p-D-lattosio, ottenuto come da esempio 3, sono disciolti in 600 mi di diclorometano; alla soluzione sono aggiunti 250 g di setacci molecolari 3À, si attendono 5-10 min, quindi si aggiungono 38.0 g di argento carbonato (0.14 mol). Alla sospensione mantenuta in vigorosa agitazione si aggiunge una soluzione di 128.5 g (0.252 mol) (1.5 eq) di cloro derivato di formula (II) in cui P è acetile, X è cloro e R1 è metile, in 500 mi di diclorometano. La sospensione è mantenuta in energica agitazione a 30°C per 7 giorni fino a scomparsa del cloro derivato (TLC, CH2CI2: MeOH = 10:1), quindi la miscela di reazione è filtrata su dicalite ed il solvente allontanato al rotavapor, ottenendo un residuo solido friabile (circa 230 g), contenente una miscela di prodotto di condensazione, 1 ,2,3,6,2’,3’-esa-0-acetil-p-D-lattosio e prodotto di eliminazione 2,3 di (II), oltre ad una traccia di 4,7,8,9-tetra-O-acetil-NANA. Da<13>C NMR si valuta una conversione di circa 90% mol.
Un campione analitico del prodotto condensato è stato ottenuto per cristallizzazione da etanolo : etere isopropilico = 1 :3 v/v come solido bianco amorfo:
<1>H NMR (CDCI3I300 MHz):<?ppm 5.66 (d, J1-2= 8.4 Hz, 1H, H-1); 5.42-5.10 (m, 5H, H-3+H-2’+H-7”+H-8”+NH); 5.01 (pseudo t, J2-1= 8.4 Hz, 1H, H-2); 4.94-4.78 (m, 2H, H-3’+H-4”); 4.53-4.27 (m, 3H, H-1'+H-6a+H-9”); 4.24-3.92 (m, 5H, H-6b+H-4’+H-5”+H-6”+H-9”b); 3.92-3.50 (m, 5H, H-4+H-5+H-5'+H-6'a+H-6'b); 3.80 (s, 3H, COOC hk), 2.93 (broad s, 1H, OH); 2.55 (dd, J3-eq-3'ax= 12.6 e Jyeq-4'= 4.5 Hz, 1 H, H-3”eq); 2.17-1.97 (31H, 10x Ctf3CO e H-3”ax), 1.86 (s, 3H, NHCOCtf3).
<13>C NMR (CDCI3, 75 MHz): δ ppm 171.05, 170.98, 170.5, 170.4, 170.29, 170.28, 170.24, 170.0, 169.6, 169.4, 169.0, 168.0 (OAc, NHAc, COOMe); 100.8 (C-1 ’); 99.1 (C-2”); 91.7 (C-1); 75.7, 73.7, 73.6, 72.94, 72.90, 72.4, 70.7, 69.7, 68.95, 68.87, 67.4, 66.3 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5\ C-4”, C-6”, C-7”, C-8”); 62.6, 62.4, 62.1 (C-6, C-6', C-9”); 53.2 (OCH3); 49.4 (C-5”); 37.4 (C-3”); 23.2 (NHCOCH3), 21.1 , 20.9, 20.8, 20.74, 20.67 (10xCH3CO).
ESEMPIO 8
Preparazione di (methyl 5-acetamido-3.5-dideoxy-D-alvcero-a-D-galacto-non-2-ulopyranosylonateH2→61-B-D-qalactopyranosyl-n →4Ha/B)-D-alucopyranose 230 g del grezzo, ottenuto come da esempio 7, sono disciolti in 1.4 I di MeOH, quindi si aggiungono 29.6 mi di soluzione di metossido di sodio in metanolo al 25% in peso. La soluzione è mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 12h; a controllo TLC positivo (farmacopea) si neutralizza con 39 g di IR120(H<+>) secca. Si filtra la resina e si allontana il solvente al rotavapor, ottenendo 143 g di residuo, impiegato come tale nella reazione successiva. La resa è quantitativa.<1>H NMR (D20, 300 MHz): <? ppm 5.21 (d, J1 -23.6Hz, 1 H, H-1a), 4.66 (d, J1-27.8Hz, 1H, H-1P), 4.42 (d, Jr.2·: 7.5Hz, 1 H, H-1 ’), 4.15-3.45 (m, 19H), 3.89 (s, 3H, COOC hk), 3.29 (m, 1 H), 2.70 (dd, Jreq-yax 12.9 e JTeq-4· 4.8 Hz, H-3”eq), 2.03 (s, 3H, NHCOC/-/3), 1.88 (pseudo t, J3'ax-3'eq = Jrax-4' 12.9 Hz, Η-3'ax).
<13>C NMR (D20, 75 MHz): tf ppm 175.5 (NHCOCH3), 170.4 (COOMe), 103.9 (C-1 ’), 99.6 (C-2”), 96.3 (C- 1 β) , 92.5 (C-1 a), 80.5, 80.4, 75.2 (2C), 74.4, 74.0, 73.5, 73.0, 72.2, 71.7, 71.3, 71.2, 70.5, 69.0 (2C), 67.9 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3', C-4', C-5’, C-4”, C-6”, C-7”, C-8”), 64.0 (C-6'), 63.8 (C-9”), 60.8 e 60.7 (C-θα+β), 54.1 (COOCH3), 52.3 (C-5”), 39.6 (C-3”), 22.8 (NHCOCH3).
ESEMPIO 9
Preparazione di sodium 5-acetamido-3.5-dideoxy-D-qlvcero-a-D-qalacto-non-2-ulopyranosylonate-(2→61-B-D-qalactopyranosyl-n→4Ha/B)-D-alucopyranose 143 g del grezzo di deacetilazione, ottenuto come da esempio 8, sono disciolti in 715 mi di acqua e la soluzione è raffreddata a 4°C; il pH viene portato a neutralità mediante l’aggiunta di 23 mi di NaOH 30% mantenendo la temperatura della soluzione inferiore a 10°C. Terminata l’aggiunta la soluzione è mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 24h. A controllo TLC positivo (farmacopea) la soluzione è passata su IR120(H<+>) / IRA96(OH ). L’eluato viene portato a pH 9 con NaOH, concentrato a sciroppo e strippato più volte con EtOH assoluto fino all’ottenimento di un solido bianco friabile che viene ricristallizzato da EtOH al 96%. Ottenuti 77.3 gr.
I dati<1>H e<13>C NMR per questo composto sono in accordo con quelli riportati in letteratura (L. Dorland et al., Eur. J. Biochem. 1978, 87, 323; J.P. Kamerling et al., Carbohydr. Res. 1982, 100, 331).
<1>H NMR (D20, 300 MHz): δ ppm 5.22 (d, J1 -23.8Hz, 1H, H-1a), 4.66 (d, J1 -27.8Hz, 1H, H-1 β), 4.43 (d, J1 -2·: 7.6Hz, 1H, H-1 ’), 4.02-3.48 (m, 19H), 3.31 (m, 1H), 2.71 (dd, J3"eq-3”ax 12.5 e J3-eq-4' 4.7 Hz, H-3”eq), 2.03 (s, 3H, NHCOCtf3), 1.74 (pseudo
t, J3”ax-3”eq<=>J3”ax-4” 12.5 Hz, H-3 3X).
<13>C NMR (D20, 75 MHz, rif. esterno acetone): δ ppm 175.6 (NHCOCH3), 174.1 (COO ), 103.9 (C-1 ’), 100.9 (C-2”), 96.3 (C- 1 β) , 92.5 (C-1a), 80.4, 80.3, 75.30, 75.26, 74.4, 74.3, 73.2, 73.0, 72.4, 72.3, 71.7, 71.4, 70.6, 69.2, 69.04, 69.01 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2', C-3’, C-4\ C-5', C-4”, C-6”, C-7”, C-8”), 64.2 (C-6'), 63.3 (C-9”), 60.9 e 60.8 (C-θα+β), 52.4 (C-5”), 40.7 (C-3”), 22.7 (NHCOCH3).
[CX]D<2>°<°c>: 9,3° (C:1 %,H20)
ESEMPIO 10
Preparazione di calcium 5-acetamido-3.5-dideoxy-D-olvcero-a-D-oalacto-non-2-ulopyranosylonate-(2→61-B-D-qalactopyranosyl-n→4Ha/B)-D-alucopyranose
100 g del grezzo di deacetilazione, ottenuto come da esempio 8, sono disciolti in 500 mi di acqua e la soluzione è raffreddata a 4°C; il pH viene portato a neutralità mediante l'aggiunta di 23 mi di NaOH 30% mantenendo la temperatura della soluzione inferiore a 10°C. Terminata l'aggiunta, la soluzione è mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 24h. A controllo TLC positivo (farmacopea) la soluzione è passata su IR1200-0 ! IRA96(OH ). L’eluato viene portato a pH 8,7 con Ca(OH)2, filtrato e quindi concentrato a sciroppo a 65° brix. Questo sciroppo viene gocciolato in 540 mi di metanolo a T 50°C. Si mantiene in energica agitazione a T 50°C per 1 ora, quindi a temperatura ambiente 1 ora e si filtra sotto vuoto. Si lava con 160 mi di metanolo. Si essicca in stufa sotto vuoto a T: 50÷55°C.
Ottenuti: 46,2 g
<1>H NMR (D20, 300 MHz): δ ppm 5.22 (d, J1-23.8Hz, 1H, H-1a), 4.66 (d, J1-27.8Hz, 1H, H-1 β), 4.43 (d, Jr.2·: 7.8Hz, 1H, H-1'), 4.02-3.48 (m, 19H), 3.31 (m, 1H), 2.71 (dd, J3"eq-3”ax 12.0 6 J3-eq-4' 4.5 Hz, Η-3'eq), 2.03 (s, 3H, NHCOCtf3), 1.74 (pseudo t, J3”ax-3”eq<=>J3”ax-4” 12.0 Hz, H-3 3X).
<13>C NMR (D20, 75 MHz, rif. interno acetonitrile): δ ppm 175.5 (NHCOCH3), 174.1 (COO ), 103.8 (C-1 '), 100.9 (C-2”), 96.2 (C- 1 β) , 92.4 (C-1a), 80.3, 80.2, 75.26, 75.22, 74.4, 74.3, 73.1 , 73.0, 72.4, 72.2, 71.7, 71.4, 70.5, 69.1 , 69.0, 68,9 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2’, C-3’, C-4', C-5', C-4”, C-6”, C-7”, C-8”), 64.2 (C-6'), 63.2 (C-9”), 60.9 e 60.7 (C-θα+β), 52.4 (C-5”), 40.7 (C-3”), 22.7 (NHCOCH3).
Titolo come Ca<2+>: 98,3%
[a]D<20 C>: 10° (c:1%,H20)
IR v<KBr>max : 3400, 1612, 1380, 1033 cm<'1>.
ESEMPIO 11
Preparazione di potassium 5-acetamido-3.5-dideoxy-D-alvcero-a-D-galacto-non-2-ulopyranosylonate-(2→61-B-D-aalactopyranosyl-n→4Ha/B)-D-olucopyranose
100 g del grezzo di deacetilazione, ottenuto come da esempio 8, sono disciolti in 500 mi di acqua e la soluzione è raffreddata a 4°C; il pH viene portato a neutralità mediante l’aggiunta 23 mi di NaOH 30% mantenendo la temperatura della soluzione inferiore a 10°C. Terminata l’aggiunta, la soluzione è mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 24h. A controllo TLC positivo (farmacopea) la soluzione è passata su IR120(H<+>) / IRA96(OH ). L’eluato viene portato a pH 10 con KOH e concentrato a sciroppo, strippato più volte con EtOH assoluto fino all’ottenimento di un solido bianco friabile che viene ricristallizzato da EtOH assoluto.
Si essicca in stufa sotto vuoto a T: 50÷55°C.
Ottenuti: 35,7 g
<1>H NMR (D20, 200 MHz): δ ppm 5.22 (d, J1-23.8Hz, 1H, H-1a), 4.66 (d, J1-27.8Hz, 1H, H-1 β), 4.43 (d, Jy.2·: 7.6Hz, 1H, H-1’), 4.02-3.48 (m, 19H), 3.31 (m, 1H), 2.71 (dd, J3"eq-3"ax 12.0 e J3"eq-4' 4.4 Hz, H-3”eq), 2.03 (s, 3H, NHCOCtf3), 1.74 (pseudo t, J3”ax-3”eq<=>Ù3”ax-4” 12.0 Hz, H-3 3X).
<13>C NMR (D20, 75 MHz, rif. esterno acetone): δ ppm 175.5 (NHCOCH3), 174.0 (COO ), 103.8 (C-1 '), 100.9 (C-2”), 96.2 (C- 1 β) , 92.4 (C-1a), 80.3, 80.2, 75.22, 75.19, 74.4, 74.3, 73.1 , 72.9, 72.4, 72.2, 71.7, 71.4, 70.5, 69.1 , 69.04, 68.9 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2’, C-3’, C-4', C-5', C-4”, C-6”, C-7”, C-8”), 64.1 (C-6'), 63.2 (C-9”), 60.8 e 60.7 (C-θα+β), 52.4 (C-5”), 40.7 (C-3”), 22.6 (NHCOCH3).
[a]D<20°c>: 9,8° (c: 1%, H20)
IR v<KBr>: 3391 , 1612, 1379, 1034 cnf<1>.
ESEMPIO 12
Preparazione di magnesium 5-acetamido-3.5-dideoxy-D-alvcero-a-D-galacto-non-2-ulopyranosylonate-(2→61-B-D-qalactopyranosyl-n →4Ha/ Bl-D-glucopyranose
100 g del grezzo di deacetilazione, ottenuto come da esempio 8, sono disciolti in 500 mi di acqua e la soluzione è raffreddata a 4°C; il pH viene portato a neutralità mediante l’aggiunta di 23 mi di NaOH 30% mantenendo la temperatura della soluzione inferiore a 10°C. Terminata l’aggiunta, la soluzione è mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 24h. A controllo TLC positivo (farmacopea) la soluzione è passata su IR1200-0 ! IRA96(OH ). L’eluato viene portato a pH 9,8 con MgO concentrato a residuo strippato più volte con EtOH assoluto fino all’ottenimento di un solido bianco friabile che viene ricristallizzato da EtOH assoluto.
Ottenuti: 50,8 g
<1>H NMR (D20, 300 MHz): δ ppm 5.22 (d, J1-23.6Hz, 1 H, H-1a), 4.66 (d, J1-28.1 Hz, 1H, H-1 β), 4.43 (d, Jy.2·: 7.5Hz, 1 H, H-1 ’), 4.02-3.48 (m, 19H), 3.31 (m, 1 H), 2.71 (dd, J3"eq-3"ax 12.3 e J3"eq-4' 4.5 Hz, H-3”eq), 2.03 (s, 3H, NHCOC/-/3), 1.74 (pseudo t, J3”ax-3”eq<=>Ù3”ax-4” 12.3 Hz, H-3 3X).
<13>C NMR (D20, 75 MHz, rif. interno acetonitrile): δ ppm 175.5 (NHCOCH3), 174.1 (COO ), 103.8 (C-1 ’), 100.9 (C-2”), 96.3 (C- 1 β) , 92.4 (C-1a), 80.3, 80.2, 75.26, 75.23, 74.4, 74.3, 73.1 , 73.0, 72.4, 72.2, 71.7, 71.4, 70.6, 69.1 , 69.00, 68.96 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-2’, C-3’, C-4’, C-5’, C-4”, C-6”, C-7”, C-8”), 64.2 (C-6’), 63.3 (C-9”), 60.9 e 60.7 (C-θα+β), 52.4 (C-5”), 40.7 (C-3”), 22.7 (NHCOCH3).
Titolo come Mg<2+>: 97,5%
[CX]D<2>°°<c>: 9,8° (c: 1%, H20)
IR v<KBr>max: 3391, 1634, 1379, 1035 cm<'1>.
Claims (4)
- RIVENDICAZIONI 1 Processo per la sintesi di composti a-sialil-oligosaccaridi di formula (I)in cui R è un residuo mono-, di- o oligosaccaridico con gli ossidrili liberi; detto processo comprendente: a) accoppiamento mediante reazione di Koenigs-Knorr di un donatore sialico di formula (II)in cui P è un opportuno gruppo protettore; Ri è alchile, e X è un alogeno; con un accettore di formula R’OH in cui R’ è un residuo mono-, di- o oligosaccaridico opportunamente protetto con gruppi protettori P’ e contenente zero, uno o più gruppi ossidrilici liberi; in cui detti gruppi protettori P’ possono essere uguali o diversi tra loro e da quelli presenti sul donatore; detta reazione di Koenigs-Knorr caratterizzata dal fatto che il promotore metallico a base di Ag(l) è impiegato in quantità molari comprese fra 0.5 e 2.0 eq rispetto alle moli di accettore; per ottenere un intermedio di formula (Ili)in cui P, R1 ed R’ sono come definiti sopra.
- 2. Processo secondo la rivendicazione 4 comprendente inoltre, dopo il passaggio (a), il seguente passaggio: b) rimozione dei gruppi protettivi P, P’ ed Ri per ottenere i composti di formula (I) come definiti nella rivendicazione 4.
- 3. Processo per la preparazione di 6’SL secondo una qualunque delle rivendicazioni 4-5 in cui R è 6’-lattosio.
- 4. Un processo per la sintesi di composti di formula (Ib)in cui M<n+>è Na<+>, K<+>, Fe<2+>o Al<3+>detto processo comprendente la preparazione di 6’SL mediante il processo secondo la rivendicazione 6.
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| WO2010116317A1 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | Inalco S.P.A. | 6"-sialyllactose salts and process for their synthesis and for the synthesis of other a-sialyloligosaccharides |
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| WO2010116317A1 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | Inalco S.P.A. | 6"-sialyllactose salts and process for their synthesis and for the synthesis of other a-sialyloligosaccharides |
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| Title |
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| PAZYNINA G ET AL: "Simple stereoselective synthesis of alpha2-6 sialooligosaccharides", TETRAHEDRON LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 43, no. 45, 4 November 2002 (2002-11-04), pages 8011 - 8013, XP004387177, ISSN: 0040-4039, DOI: 10.1016/S0040-4039(02)01983-4 * |
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