CN116217633A - 一种双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及糖类物质的合成方法，具体涉及一种双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法。采用三氯乙腈将原料为2‑脱氧三氯乙氧甲酰基‑4,5,6‑三‑氧‑乙酰基‑α,β‑D‑葡萄糖的C‑1位修饰为三氯乙酰亚胺酯基保护基，获得糖基供体G1；将糖基供体G1与糖基受体G6进行偶联反应，获得中间产物G2；将中间产物G2脱除半乳糖C‑4,6位苄叉保护基，制得中间产物G3；将中间产物G3与糖基供体G1进行偶联反应，制得中间产物G4；将中间产物G4的C‑2位三氯乙氧甲酰基保护基脱除，再将C‑2位采用乙酰基保护，然后将羟基的保护基脱除，制得核心四糖G5。本发明不仅能够避免使用糖基转移酶，而且收率高，能够实现大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及糖类物质的合成方法，具体涉及一种双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
人乳寡糖(Human Milk Oligosaccharides，HMOs)作为母乳中仅次于脂类和乳糖的第三大固体营养物质，是一组结构复杂多样的聚糖，其许多重要的生物学功能已经被报道。比如，HMOs作为益生元，促进婴儿肠道菌群中有益菌群的建立、调节肠道菌群、抵抗病原菌的黏附、免疫调节以及促进大脑发育等。
通过色谱法和质谱法，已在母乳中鉴定出超过200种HMOs结构。HMOs总体可以分为两类:以Galβ1-3GlcNAc构型的重复二糖单元连接到乳糖上的Ⅰ型结构和以Galβ1-4GlcNAc构型的重复二糖单元连接到乳糖上的Ⅱ型结构。除可以形成单分支HMOs外，还可以形成双分支、三分支、四分支等更复杂的核心结构；在乳糖或者延伸链所形成的核心结构上可以进行更加复杂的岩藻糖基化和唾液酸化修饰。这些结构复杂的HMOs由五个核心组成:半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、岩藻糖和N-乙酰神经氨酸。
据发明人研究了解，目前包括双分支在内的多分支HMOs的策略是通过酶催化得到，但是目前只能进行微克级的合成，无法大规模制备分支结构HMOs用于后期大批量生产。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，不仅能够避免使用糖基转移酶，而且各步骤的收率高，能够实现大规模生产，从而降低HMOs的成本。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，包括如下步骤：
采用三氯乙腈将原料为2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-葡萄糖的C-1位修饰为三氯乙酰亚胺酯基保护基，获得糖基供体G1；
将糖基供体G1与糖基受体G6进行偶联反应，获得中间产物G2；
将中间产物G2脱除半乳糖C-4,6位苄叉保护基，制得中间产物G3；
将中间产物G3与糖基供体G1进行偶联反应，制得中间产物G4；
将中间产物G4的C-2位三氯乙氧甲酰基保护基脱除，再将C-2位采用乙酰基保护，然后将羟基的保护基脱除，制得核心四糖G5，即双分支人乳寡糖核心四糖；
其中，三氯乙腈将原料为2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-葡萄糖的化学结构式为：
糖基供体G1的化学结构式为：
糖基受体G6的化学结构式为：
中间产物G2的化学结构式为：
中间产物G3的化学结构式为：
中间产物G4的化学结构式为：
核心四糖G5的化学结构式为：
本发明中C-2位采用Troc-保护，更有利于与G6进行偶联反应，操作简便，选择性高，收率高，有利于后续反应。同时，本发明各中间产物中羟基采用乙酰基保护，操作更加简单，后续脱保护操作也易操作。
进一步地，糖基供体G1的具体制备方法为：将2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-葡萄糖溶于二氯甲烷中，加入1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯、三氯乙腈，冰浴至室温条件下搅拌反应。
具体地，2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-葡萄糖、1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯和三氯乙腈的摩尔比为1.5～2.5:1:10.0～15.0。
具体地，冰浴至室温条件下搅拌反应的时间为3～7小时。
具体地，冰浴至室温条件下搅拌反应后，旋蒸浓缩，硅胶柱分离纯化。
进一步地，中间产物G2的具体制备方法为：糖基供体G1、糖基受体G6与
型分子筛均匀加入至干燥的二氯甲烷中，在室温及惰性气氛保护的条件下搅拌均匀后，降温至-25～-15℃，加入三氟甲磺酸三甲基硅脂，保温搅拌均匀，然后升温至室温。
本发明所述的惰性气氛例如氩气气氛、氮气气氛等。
具体地，糖基供体G1与糖基受体G6的摩尔比为1.1～5.0:1。
具体地，三氟甲磺酸三甲基硅脂与糖基受体G6的摩尔比为0.01～1.3:1。
具体地，中间产物G2的过程中，升温至室温反应完全后，用三乙胺中和，干燥，浓缩分离。
具体地，糖基受体G6的制备方法为：甲氧基苯基2-氧-乙酰基-3-氧-对甲氧基苄基-4,6-二-氧-苄叉-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷加入至二氯甲烷与饱和碳酸氢钠溶液的混合溶液中，室温条件下，加入3-二氯-5,6-二氰基苯醌，搅拌反应。其中，二氯甲烷与饱和碳酸氢钠溶液的体积比为19～21:1。甲氧基苯基2-氧-乙酰基-3-氧-对甲氧基苄基-4,6-二-氧-苄叉-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷与3-二氯-5,6-二氰基苯醌的摩尔比为1:4.5～5.0。
进一步地，中间产物G3的具体制备方法为：将中间产物G2溶于75～85％乙酸中，70～80℃下搅拌回流。采用75～85％乙酸选择性脱除苄叉的操作更简单。
进一步地，中间产物G4的具体制备方法为：将糖基供体G1、中间产物G3与
型分子筛均匀加入至干燥的二氯甲烷中，在室温及惰性气氛保护的条件下搅拌均匀后，降温至-80～-75℃，加入三氟甲磺酸三甲基硅脂，保温搅拌均匀，然后升温至室温。由于G3脱除半乳糖C-4,6位苄叉保护基后，存在两个羟基，即C-4位羟基和C-6为羟基，均能与糖基供体G1进行偶联，采用该中间产物G4的具体制备方法能够提高C-6为羟基与糖基供体G1偶联的选择性，从而大大提高中间产物G4的收率。
具体地，糖基供体G1与中间产物G3的摩尔比为1.1～5.0:1。
具体地，糖基供体G1与三氟甲磺酸三甲基硅脂的摩尔比为1:0.01～1.5。
具体地，中间产物G4的纯化过程为：反应完全后，用三乙胺中和，干燥，浓缩分离。
进一步地，核心四糖G5的具体制备方法为：将中间产物G4、锌粉溶于乙酸酐溶液中，在惰性气氛和室温条件下反应12～16小时，获得化合物1；将化合物1与硝酸铈铵加入至乙腈、甲苯和水的混合液中，室温反应11～13小时，获得化合物2；将化合物2溶解在甲醇溶液中，在搅拌条件下加入甲醇钠-甲醇溶液调节pH至9～11，室温下搅拌12～16小时，然后采用盐酸中和。
具体地，中间产物G4与锌粉的摩尔比为1:25.0～35.0。
具体地，中间产物G4与硝酸铈铵的摩尔比为1:7.5～8.0。
具体地，乙腈、甲苯和水的体积比为1.9～2.1:1.4～1.6:1。
具体地，化合物1的纯化过程为，反应完全后，抽滤、旋蒸浓缩，硅胶柱分离纯化。本发明中制备化合物1的过程中，通过薄层色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)检测反应是否完全。
具体地，化合物2的纯化过程为，反应完全后，抽滤、旋蒸浓缩，硅胶柱分离纯化。本发明中制备化合物2的过程中，通过薄层色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)检测反应是否完全。
另一方面，一种上述双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法在制备双分支人乳寡糖的应用。
具体地，将制备的核心四糖G5与糖基供体G1连续进行偶联反应。
本发明的有益效果为：
本发明提供的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法能够合成出核心四糖G5，并以此为中间体能够与糖基供体G1连续偶联反应制成更为复杂的双分支人乳寡糖，避免了使用糖基转移酶，从而解决了哺乳动物来源的糖基转移酶价格昂贵的问题。另外，本发明的合成方法中各步骤中的反应效率高，产物收率高，不仅能够进一步降低成本，而且有利于大批量工业化生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中化合物G6的1H NMR谱图；
图2为本发明实施例中化合物G6的13C NMR谱图。
图3为本发明实施例中化合物G2的1H NMR谱图；
图4为本发明实施例中化合物G2的13C NMR谱图。
图5为本发明实施例中化合物G3的1H NMR谱图；
图6为本发明实施例中化合物G3的13C NMR谱图。
图7为本发明实施例中四糖G4的1H NMR谱图；
图8为本发明实施例中四糖G4的13C NMR谱图。
图9为本发明实施例中核心骨架四糖G5的1H NMR谱图；
图10为本发明实施例中核心骨架四糖G5的13C NMR谱图。
图11为本发明实施例中化合物G的1H NMR谱图；
图12为本发明实施例中化合物G的13C NMR谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明中的室温一般指25℃±2℃。
本发明中，-Ac代表乙酰基，-OMP代表对甲氧基苯氧基，-PMB代表对甲氧基苄基，-Ph代表苯基，-Troc代表三氯乙氧甲酰基，1H NMR代表核磁共振氢谱，13C NMR代表核磁共振碳谱，HRMS代表高分辨质谱。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例
本实施例双分支人乳寡糖核心四糖(2-脱氧乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[2-脱氧乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基]-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-α,β-D-吡喃葡萄糖(G5))的合成路线如下：
(1)三氯乙酰亚胺酯基2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-半乳糖苷(G1)的合成：
向50mL圆底烧瓶中加入2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-葡萄糖(3.2g,6.66mmol)在冰水浴不断搅拌下溶解在干燥的二氯甲烷溶液中，缓慢滴加1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯(0.5mL,3.33mmol)、三氯乙腈(4.0mL,39.9mmol)，冰浴至室温条件下搅拌3h。按照相同的反应条件，平行开5组。薄层色谱检测(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)反应完全后，旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，得到白色固体化合物G1(18.3g,总收率88％)。
(2)对甲氧基苯基2-氧-乙酰基-4,6-二-氧-苄叉-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(G6)的合成：
将对甲氧基苯基2-氧-乙酰基-3-氧-对甲氧基苄基-4,6-二-氧-苄叉-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷G(1.7g,2.06mmol，制备过程如上所示，结构表征如图11～12所示)溶解在40mL二氯甲烷和饱和2.0mL碳酸氢钠溶液中，室温不断搅拌下加入3-二氯-5,6-二氰基苯醌(2.2g,9.7mmol)，磁力搅拌至4h。薄层色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)检测反应完全后，抽滤、旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，得到白色固体化合物G6(1.3g,总收率90％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.44–7.39(m,2H),7.34–7.27(m,3H),6.90–6.85(m,2H),6.78–6.73(m,2H),δ5.44(d,J＝3.3Hz,1H),5.21(t,J＝9.4Hz,1H),5.11(dd,J＝9.7,7.9Hz,1H),4.94–4.86(m,2H),4.46(dd,J＝12.0,2.1Hz,1H),4.34(d,J＝8.0Hz,1H),4.20–4.16(m,1H),4.14(dd,J＝11.8,6.0Hz,1H),4.06(d,J＝3.8Hz,1H),3.99–3.90(m,1H),3.81–3.73(m,1H),3.68(s,3H),3.61(dd,J＝10.0,3.7Hz,1H),3.35(d,J＝2.2Hz,1H).2.97(s,1H),2.06(s,3H),2.03(s,6H),2.01(s,6H),1.98(s,3H),1.92(s,3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ170.45,170.30,170.29,169.68,155.67,150.96,150.28,137.58,129.31,128.30,126.53,126.49,118.52,118.07,114.62,114.54,101.38,100.90,100.07,77.51,77.30,77.09,76.13,75.34,73.01,72.47,71.47,71.33,68.46,66.57,62.19,55.61,20.83,20.75,20.68,20.65；HRMS(ESI)m/z calcd for C34H40O16Na[M+Na]+
727.2208,found 727.2284。核磁谱图如图1～2所示。
(3)对甲氧基苯基2-脱氧三氯乙氧甲酰基-3,4,5-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-2-氧-乙酰基-4,6-二-氧-苄叉-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(G2)的合成：
取步骤(1)制备的单糖供体G1(120mg,0.19mmol)、步骤(2)制备的二糖受体G6(90mg,0.13mmol)、
分子筛(200mg)溶于10mL无水二氯甲烷溶液中，室温、氩气保护下搅拌30分钟后，将反应液降至-20℃，加入催化量三氟甲磺酸三甲基硅酯(3.5μL,0.019mmol)，在该温度下继续搅30分钟后，将反应液缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和反应液，过滤，蒸干，粗品经硅胶柱分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得到白色固体中间产物G2(111mg,总收率73％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.45(d,J＝7.3Hz,2H),7.35(m,3H),7.36–7.34(m,3H),6.89(m,2H),6.77(m,2H),δ5.63(dd,J＝8.8,2.9Hz,0H),5.49(s,1H),5.42–5.29(m,21H),5.22(d,J＝9.2Hz,1H),5.18–5.09(m,2H),5.02–4.94(m,2H),4.91(d,J＝7.8Hz,1H),4.75(dd,J＝12.3,3.4Hz,1H),4.58(d,J＝12.1Hz,1H),4.49–4.40(m,1H),4.35(d,J＝7.7Hz,1H),4.25(d,J＝13.1Hz,2H),4.15–4.11(m,2H),4.01(d,J＝12.2Hz,1H),3.77(dd,J＝14.1,8.5Hz,1H),3.73(s,3H),3.71–3.60(m,2H),3.36(d,J＝13.7Hz,2H)；2.06(s,3H),2.05(s,3H),2.04(s,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),1.98(s,3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ170.54,170.47,170.21,169.87,169.69,169.49,169.18,155.65,153.74,150.96,137.56,129.24,128.31,126.47,126.25,118.48,117.96,114.61,114.52,101.34,101.18,100.15,100.01,95.35,78.25,75.82,75.61,74.38,72.99,72.39,71.71,71.49,71.33,70.93,69.83,68.59,68.48,66.67,62.19,61.60,56.41,55.64,29.65,20.81,20.72,20.67,20.60,20.56,20.51；HRMS(ESI)m/z calcd for C49H58Cl3NO25Na[M+Na]+1188.2363,found 1188.2372。核磁谱图如图3～4所示。
(4)对甲氧基苯基2-脱氧三氯乙氧甲酰基-3,4,5-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-2-氧-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(G3)的合成：
取步骤(3)制备的中间体产物G2(800mg,0.69mmol)溶于80％乙酸(10mL)中，75℃回流6h，薄层色谱检测反应完全后，蒸干，粗品经硅胶柱分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶3)得到白色固体化合物G3(663mg,总收率89％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.62–6.59(m,2H),6.51–6.48(m,2H),4.96(dd,J＝10.7,9.2Hz,1H),4.90(t,J＝9.2Hz,1H),4.80–4.78(m,1H),4.78–4.75(m,2H),4.68(d,J＝3.6Hz,1H),4.66(d,J＝5.4Hz,1H),4.65–4.61(m,2H),4.41(d,J＝8.4Hz,1H),4.21(d,J＝12.1Hz,1H),4.15(dd,J＝11.9,2.2Hz,1H),4.07(d,J＝8.0Hz,1H),3.89(dd,J＝5.5,3.3Hz,1H),3.88–3.84(m,1H),3.80–3.78(m,1H),3.60(t,J＝9.4Hz,1H),3.50–3.45(m,2H),3.44(s,3H),3.35(dd,J＝10.0,3.1Hz,1H),3.27(dd,J＝10.6,8.3Hz,1H),3.19–3.15(m,1H),3.02–3.00(m,1H)；1.79(s,3H),1.78(s,3H),1.77(s,3H),1.76(s,3H),1.74(s,3H),1.70(s,3H),1.66(s,3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ175.15,175.03,174.77,174.54,174.11,173.93,173.89,159.61,158.98,154.84,122.21,118.47,118.36,105.83,105.02,103.59,99.46,85.37,79.62,78.87,78.28,76.95,76.76,75.80,75.60,75.40,74.26,72.83,72.15,66.19,65.88,64.58,64.47,59.70,59.20,24.27,24.16,24.14,24.04,23.98,23.95,23.90；HRMS(ESI)m/z calcd for C42H54Cl3NO25Na[M+Na]+1100.2050,found 1100.2048。核磁谱图如图5～6所示。
(5)对甲氧基苯基2-脱氧三氯乙氧甲酰基-3,4,5-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-2-氧-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2,3,6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(G4)的合成：
取步骤(4)制备的中间产物G3(50mg,0.05mmol)、糖基供体G1(30.4mg,0.049mmol)、
型分子筛(200mg)溶于5mL无水二氯甲烷溶液中，室温、氩气保护下搅拌30分钟后，将反应液降温至-60℃，加入三氟甲磺酸三甲基硅脂(1.0μL,0.005mmol)，-60℃条件下继续搅拌反应30分钟后，将反应温度缓慢升至室温，反应完全后用三乙胺中和反应液，抽滤、蒸干，粗品经硅胶柱分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得到白色固体中间产物G4(66mg,总收率87％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.93–6.87(m,2H),6.81–6.75(m,2H),6.13(d,J＝8.4Hz,1H),5.63(d,J＝7.9Hz,1H),5.45–5.32(m,4H),5.20(t,J＝9.0Hz,1H),5.13(t,J＝8.6Hz,1H),5.04(t,J＝9.1Hz,2H),4.99(t,J＝9.6Hz,1H),4.95(d,J＝7.6Hz,1H),4.91(dd,J＝11.0,5.5Hz,2H),4.78(dd,J＝10.5,5.4Hz,2H),4.66(dd,J＝17.7,12.0Hz,2H),4.40(d,J＝11.9Hz,1H),4.35(d,J＝7.9Hz,1H),4.27(dd,J＝12.8,4.7Hz,1H),4.22(d,J＝12.4Hz,1H),4.06(dd,J＝10.9,5.3Hz,1H),4.01(s,1H),3.83(d,J＝9.0Hz,1H),3.75(s,3H),3.71(t,J＝7.6Hz,1H),3.62–3.50(m,4H),3.42(d,J＝9.3Hz,1H),2.89(s,1H)；2.09(s,3H),2.08(s,3H),2.07(s,3H),2.06(s,3H),2.05(s,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H)2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.99(s,3H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ170.86,170.74,170.69,170.60,170.43,170.11,169.78,169.56,169.48,169.43,155.57,154.33,153.83,150.85,118.41,114.47,100.66,100.54,100.48,99.69,95.80,95.27,81.07,75.09,74.45,74.11,73.31,73.05,72.74,71.79,71.62,71.42,71.02,70.81,70.42,68.76,68.64,68.22,68.17,67.88,62.31,62.00,61.89,58.35,56.40,56.24,55.63,21.05,20.97,20.83,20.80,20.78,20.73,20.66,20.63,20.60,20.51；HRMS(ESI)m/z calcd forC57H72Cl6N2O34Na[M+Na]+1561.2098,found 1561.2135。核磁谱图如图7～8所示。
(6)2-脱氧乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[2-脱氧乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)]-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-α,β-D-吡喃葡萄糖(G5)的合成：
将步骤(5)制备的中间产物G4(125mg,0.08mmol)和锌粉(160mg,2.43mmol)溶解在1.0mL乙酸酐中，将混合物在氩气气氛、室温下搅拌12小时，薄层色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)检测反应完全后，抽滤、旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，获得白色固体化合物；将所得化合物和硝酸铈铵(0.35g,0.63mmol)溶解在4.0mL乙腈、3.0mL甲苯和2.0mL水中，室温下搅拌12小时，薄层色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)检测反应完全后，抽滤、旋蒸浓缩，快速硅胶柱分离纯化，获得白色固体化合物；将收集到的化合物溶解在甲醇溶液中，不断搅拌下加入甲醇钠-甲醇溶液调节至pH 9-11，室温下搅拌12小时。薄层色谱(乙酸乙酯∶甲醇∶水∶冰醋酸＝8∶3∶1∶0.2)检测反应完全后，用1mol/L盐酸中和反应，旋蒸浓缩，粗产品经聚丙酰胺凝胶P2柱纯化得到目标产物G5(27mg,总收率90％)。1H NMR(600MHz,D2O)4.69–4.64(m,2H),4.61(dd,J＝8.5,2.9Hz,1H),4.42(d,J＝7.9Hz,1H),4.13(d,J＝3.3Hz,1H),4.02–3.65(m,13H),3.64–3.51(m,5H),3.50–3.39(m,5H),2.05(s,3H),2.02(s,3H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ174.86,174.49,102.88,102.72,100.99,95.59,81.60,78.74,75.74,75.54,74.62,74.26,73.76,73.44,73.34,71.29,71.08,69.73,69.55,68.61,68.29,60.56,60.36,55.56,55.39,22.30,22.08；HRMS(ESI)m/z calcd for C28H48N2O21Na[M+Na]+771.2642,found 771.2665。核磁谱图如图9～10所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，其特征是，包括如下步骤：
采用三氯乙腈将原料为2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-葡萄糖的C-1位修饰为三氯乙酰亚胺酯基保护基，获得糖基供体G1；
将糖基供体G1与糖基受体G6进行偶联反应，获得中间产物G2；
将中间产物G2脱除半乳糖C-4,6位苄叉保护基，制得中间产物G3；
将中间产物G3与糖基供体G1进行偶联反应，制得中间产物G4；
将中间产物G4的C-2位三氯乙氧甲酰基保护基脱除，再将C-2位采用乙酰基保护，然后将羟基的保护基脱除，制得核心四糖G5，即双分支人乳寡糖核心四糖；
其中，三氯乙腈将原料为2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-葡萄糖的化学结构式为：
糖基供体G1的化学结构式为：
糖基受体G6的化学结构式为：
中间产物G2的化学结构式为：
中间产物G3的化学结构式为：
中间产物G4的化学结构式为：
/>
核心四糖G5的化学结构式为：
2.如权利要求1所述的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，其特征是，糖基供体G1的具体制备方法为：将2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-葡萄糖溶于二氯甲烷中，加入1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯、三氯乙腈，冰浴至室温条件下搅拌反应。
3.如权利要求2所述的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，其特征是，2-脱氧三氯乙氧甲酰基-4,5,6-三-氧-乙酰基-α,β-D-葡萄糖、1,8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十一烯和三氯乙腈的摩尔比为1.5～2.5:1:10.0～15.0；
或，冰浴至室温条件下搅拌反应的时间为3～7小时；
或，冰浴至室温条件下搅拌反应后，旋蒸浓缩，硅胶柱分离纯化。
4.如权利要求1所述的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，其特征是，中间产物G2的具体制备方法为：糖基供体G1、糖基受体G6与
型分子筛均匀加入至干燥的二氯甲烷中，在室温及惰性气氛保护的条件下搅拌均匀后，降温至-25～-15℃，加入三氟甲磺酸三甲基硅脂，保温搅拌均匀，然后升温至室温。
5.如权利要求4所述的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，其特征是，糖基供体G1与糖基受体G6的摩尔比为1.1～5.0:1；
优选地，三氟甲磺酸三甲基硅脂与糖基受体G6的摩尔比为0.01～1.3:1；
优选地，中间产物G2的过程中，升温至室温反应完全后，用三乙胺中和，干燥，浓缩分离。
6.如权利要求1所述的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，其特征是，中间产物G3的具体制备方法为：将中间产物G2溶于75～85％乙酸中，70～80℃下搅拌回流。
7.如权利要求1所述的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，其特征是，中间产物G4的具体制备方法为：将糖基供体G1、中间产物G3与
型分子筛均匀加入至干燥的二氯甲烷中，在室温及惰性气氛保护的条件下搅拌均匀后，降温至-80～-75℃，加入三氟甲磺酸三甲基硅脂，保温搅拌均匀，然后升温至室温。
8.如权利要求7所述的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，其特征是，糖基供体G1与中间产物G3的摩尔比为1.1～5.0:1；
或，糖基供体G1与三氟甲磺酸三甲基硅脂的摩尔比为1:0.01～1.5；
或，中间产物G4的纯化过程为：反应完全后，用三乙胺中和，干燥，浓缩分离。
9.如权利要求1所述的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法，其特征是，核心四糖G5的具体制备方法为：将中间产物G4、锌粉溶于乙酸酐溶液中，在惰性气氛和室温条件下反应12～16小时，获得化合物1；将化合物1与硝酸铈铵加入至乙腈、甲苯和水的混合液中，室温反应11～13小时，获得化合物2；将化合物2溶解在甲醇溶液中，在搅拌条件下加入甲醇钠-甲醇溶液调节pH至9～11，室温下搅拌12～16小时，然后采用盐酸中和；
优选地，中间产物G4与锌粉的摩尔比为1:25.0～35.0；
优选地，中间产物G4与硝酸铈铵的摩尔比为1:7.5～8.0；
优选地，乙腈、甲苯和水的体积比为1.9～2.1:1.4～1.6:1。
10.一种权利要求1～9任一所述的双分支人乳寡糖核心四糖的合成方法在制备双分支人乳寡糖的应用。
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