CN103665054B

CN103665054B - 异乳糖的制备方法

Info

Publication number: CN103665054B
Application number: CN201310608662.2A
Authority: CN
Inventors: 张建军; 姜锐; 梁晓梅; 王道全
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: CN103665054A

Abstract

本发明公开了一种异乳糖的制备方法。本发明方法所用的起始原料为1,2-O-(1-甲基亚乙基)-3-O-乙酰基-α-D-呋喃葡萄糖，通过3步反应得到糖基受体1,2-O-(1-甲基亚乙基)-3-O-乙酰基-5-O-苯甲酰基-α-D-呋喃葡萄糖中间体，每步反应的收率和纯度都很高（收率分别为97%、100%、95%，纯度分别为99.5%、99.2%、99.8%），因此，大量制备时中间体Ⅳ和Ⅴ都不需要纯化即可直接用于下一步的反应；本发明由中间体式Ⅵ与式Ⅲ偶联得到化合物式Ⅶ，通过优选所得上述说明的反应条件，产率高（80%），立体选择性好（检测不到异构体），易于纯化，上述由化合物式Ⅱ通过四步反应制备得到双糖式Ⅶ的总收率为74%，纯度为99.8%；（3）本发明最终产物的纯度高，纯度不低于98%。

Description

异乳糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种异乳糖的制备方法。

背景技术

异乳糖是乳糖的异构体，化学结构为β-D-半乳糖基-(1→6)-D-葡萄糖，是一种还原性双糖。在β-半乳糖苷酶的作用下乳糖可以转变成异乳糖，异乳糖是乳糖操纵子的诱导物，在细菌的代谢过程中有着非常重要的生物学作用。例如，在大肠杆菌中异乳糖参与调节乳糖操纵子的活性，乳糖操纵子包含3种结构基因（LacZ、LacY及LacA），主要负责吸收和水解乳糖而作为大肠杆菌生命活动的碳源。如果在细菌生长环境中缺乏乳糖，阻遏蛋白会紧密地与位于启动子下游接近LacZ的短DNA序列(称为乳糖操纵基因)结合。与操纵基因结合的阻遏蛋白会干扰RNA聚合酶与启动子的结合，所以mRNA可以在很低水平的情况下为LacZ及LacY编码。当细胞在有乳糖的环境下成长时，在代谢过程中乳糖被β-半乳糖苷酶催化水解产生异乳糖(AlloLactose)，异乳糖能和调节基因产生的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白改变构象，不能在和操纵基因结合，失去阻遏作用，结果RNA聚合酶便与启动基因结合，并使结构基因活化，转录出mRNA，翻译出酶蛋白。

由于异乳糖具有重要的生物学作用，简洁有效的合成方法一直是人们研究的重点。文献中已经报道的获得异乳糖的方法主要有两种：其一为化学合成，通过制备溴代、氯代半乳糖供体与六位为羟基的葡萄糖受体经偶联得到(J.Mol.Biol.,1972,69,397–408.)，或者通过结构相近的天然产物经一系列化学反应转化得到异乳糖(J.Carbohydr.Chem.,2003,22,267–274)，例如2003年Sergio Riva课题组以天然产物Amygdalin为起始原料，经过化学反应将葡萄糖环上4位平伏键羟基转换为直立建羟基，从而完成异乳糖的合成；其二是酶合成方法(Can.J.Biochem.,1975,53,1035–1038;J.Am.Chem.Soc.,1958,80,119–121.)，即模仿异乳糖的天然合成法—利用β-半乳糖苷酶催化水解乳糖而得到异乳糖。

上述文献公开的合成方法存在如下问题：其一、现有文献报道的化学合成方法都，路线长（8～15步反应）、收率较低（总收率最高为12%）、重现性不好（采用的溴代半乳糖或氯代半乳糖供体稳定性不高、不能够纯化）、分离纯化困难（杂质含量太大），不适宜于异乳糖的大量制备；其二，现有酶法合成的异乳糖产量极低，拿到的异乳糖在毫克级别，无法用于异乳糖的大量合成。

本发明设计了一条成本低廉、操作简单、收率良好的异乳糖合成方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种异乳糖的制备方法，本发明的方法成本低廉、操作简单、收率良好。

本发明首先提供了1,2-O-(1-甲基亚乙基)-3-O-乙酰基-6-O-烯丙氧羰基-α-D-呋喃葡萄糖，其结构式如式Ⅳ所示；

式Ⅳ中，AllOC=O表示烯丙氧羰基，Me表示甲基；Ac表示乙酰基。

本发明还提供了式Ⅳ所示呋喃葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：

在碱存在的条件下，式Ⅱ所示化合物与烯丙氧羰基氯经烯丙氧羰基化反应即得式Ⅳ所示呋喃葡萄糖；

式Ⅱ中，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；

所述碱可为三乙胺或吡啶；

式Ⅱ所示化合物、所述碱与所述烯丙氧羰基氯的摩尔比可为1.0：1.2～5.0：1.1，具体可为1.0：5.0：1.1；

在-15℃～-25℃的条件下，将所述烯丙氧羰基氯滴加至式Ⅱ所示化合物中，如在-10℃的条件下将所述烯丙氧羰基氯滴加至式Ⅱ所示化合物中；

所述烯丙氧羰基化反应的温度可为20℃～25℃，时间可为0.5～4.0小时，如在20℃下反应2小时。

本发明还提供了1,2-O-(1-甲基亚乙基)-3-O-乙酰基-5-O-苯甲酰基-6-O-烯丙氧羰基-α-D-呋喃葡萄糖，其结构式如式Ⅴ所示；

式Ⅴ中，AllOC=O表示烯丙氧羰基，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；

R²为乙酰基或苯甲酰基。

本发明进一步提供了式Ⅴ所示呋喃葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：

式Ⅳ所示呋喃葡萄糖与R²Cl经酰化反应即得式Ⅴ所示呋喃葡萄糖；

式Ⅳ中，AllOC=O表示烯丙氧羰基，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；

R²Cl中R可为乙酰基或苯甲酰基；

式Ⅳ所示呋喃葡萄糖与R²Cl的摩尔比可为1.0：1.2～1.8，具体可为1.0：1.2；

在-5℃～-10℃的条件下，将R²Cl滴加至式Ⅳ所示呋喃葡萄糖中，如在0℃的条件下将R²Cl滴加至式Ⅳ所示呋喃葡萄糖中；

所述酰化反应的温度可为20℃～25℃，时间可为2.0～8.0小时，如在25℃下反应5小时。

本发明提供的1,2-O-(1-甲基亚乙基)-3-O-乙酰基-5-O-苯甲酰基-α-D-呋喃葡萄糖，其结构式如式Ⅵ所示；

式Ⅵ中，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；

R为乙酰基或苯甲酰基。

本发明提供的式Ⅵ所示呋喃葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：

在铵盐、钯盐和硼氢化钠的作用下，式Ⅴ所示呋喃葡萄糖经烯丙氧羰基脱除反应即得式Ⅵ所示呋喃葡萄糖；

R²为乙酰基或苯甲酰基；

所述铵盐可为甲酸铵或乙酸铵；

所述钯盐可为氯化钯或者醋酸钯；

式Ⅴ所示呋喃葡萄糖、所述铵盐、所述钯盐和所述硼氢化钠的摩尔比可为1.0：10～20：0.01～0.1：1.5～4.0，具体可为1.0：20：0.01：2；

所述烯丙氧羰基脱除反应的温度可为-20～20℃，时间可为0.1～2.0小时，具体可在-10℃下反应1小时。

本发明提供了式Ⅶ所示双糖；

式Ⅶ中，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；

R¹和R²均为乙酰基或苯甲酰基。

本发明提供的式Ⅶ所示双糖的制备方法，包括如下步骤：

式Ⅵ所示呋喃葡萄糖与式Ⅲ所示化合物经偶联反应，即得式Ⅶ所示双糖；

式Ⅵ中，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；R²为乙酰基或苯甲酰基；

式Ⅲ中，R¹可为乙酰基或苯甲酰基；

所述偶联反应的催化剂可为N-碘代丁二酰亚胺与三氟甲磺酸的混合物（质量比可为1:1）、三氟甲磺酸化二甲基硫盐、三氟甲磺酸化二甲基硫基硫盐、N-哌啶基苯甲亚砜与三氟甲磺酸酐的混合物（质量比可为1:1）或三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯；

所述偶联反应的溶剂可为二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、甲苯、氯仿、乙腈、乙醚、DMF、THF和DME中至少一种；

所述偶联反应的温度可为-45℃～15℃，时间可为0.5～4.0小时，如先在-10℃下反应0.5小时，再在15℃下反应3小时；

式Ⅵ所示呋喃葡萄糖与式Ⅲ所示化合物的摩尔比可为1.0：1.1～1.5，具体可为1.0：1.1。

本发明提供了式Ⅰ所示β-D-半乳糖基-(1→6)-D-葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：

式Ⅶ所示双糖在酸的作用下脱除异丙叉基；然后继续在碱的作用下脱除酰基，末端呋喃糖环异构化成为吡喃环后，即得式Ⅰ所示β-D-半乳糖基-(1→6)-D-葡萄糖。

上述的方法中，所述酸可为乙酸水溶液（其中乙酸的质量百分含量可为60%～90%）或三氟乙酸水溶液（其中三氟乙酸的质量百分含量可为60%～90%）；脱除异丙叉基在60～80℃的温度下进行；

所述碱可为氨、氢氧化钠、甲醇钠或乙醇钠；

脱除酰基可在-15～40℃的温度下进行，如在20℃～25℃的条件下进行。

本发明具有以下优点：

（1）本发明所用的起始原料为1,2-O-(1-甲基亚乙基)-3-O-乙酰基-α-D-呋喃葡萄糖（式Ⅱ），通过3步反应得到糖基受体1,2-O-(1-甲基亚乙基)-3-O-乙酰基-5-O-苯甲酰基-α-D-呋喃葡萄糖（式Ⅵ）中间体，每步反应的收率和纯度都很高（收率分别为97%、100%、95%，纯度分别为99.5%、99.2%、99.8%），因此，大量制备时中间体Ⅳ和Ⅴ都不需要纯化即可直接用于下一步的反应，在已有文献报道的方法由于采用的合成途径不同，无法实现这一点；

（2）本发明由中间体式Ⅵ与式Ⅲ偶联得到化合物式Ⅶ，通过优选所得上述说明的反应条件，产率高（80%），立体选择性好（检测不到异构体），易于纯化，上述由化合物式Ⅱ通过四步反应制备得到双糖式Ⅶ的总收率为74%，纯度为99.8%；

（3）本发明最终产物的纯度高，纯度不低于98%。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、式Ⅳ所示化合物的合成

将式Ⅱ所示化合物(7.86g,30.0mmol)溶解在100mL干燥的CH₂Cl₂中，加入Py(12mL，150.0mmol)，冰浴冷却至–10℃，30分钟内滴加AllocCl(3.55mL，33mmol)的40mLCH₂Cl₂溶液.滴加完毕撤去冰浴，室温搅拌2h，TLC(3:1，石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全。反应体系依次用1M盐酸和饱和NaHCO₃溶液、饱和食盐水洗涤，CH₂Cl₂萃取、无水Na₂SO₄干燥、浓缩，柱层析(4:1，石油醚-乙酸乙酯)分离得式Ⅳ所示化合物(10g，收率97%)。

结构确证数据：

[α]_D ²⁵=+108°(1g/100mL,CHCl₃),¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ:1.31,1.51(2s,6H,CMe₂),2.13(s,3H,COCH₃),2.94(d,J=4.5Hz,1H,OH),3.90(m,1H,H-5),4.18～4.28(m,2H,H-6),4.45(dd,J_3,4=2.4Hz,J_4,5=11.4Hz,1H,H-4),4.54(d,J_1,2=3.6Hz,1H,H-2),4.62,4.64(2t,J=1.3Hz,2H,CH₂CHCH₂O),5.24～5.40(m,3H,H-3,CH₂CHCH₂),5.86～5.99(m,2H,H-1,CH₂CHCH₂);¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:170.48,154.89,131.30,118.76,112.21,104.76,82.85,78.43,76.08,69.40,68.46,66.59,26.46,26.04,20.58;HRMS(ESI)calcd for C₂₂H₂₆O₁₀(M＋H)^＋347.13366,found347.13339.

经表征，结构正确，得到了目标化合物。

实施例2、化合物2（属于通式化合物Ⅴ的一种）的合成

将式Ⅳ所示化合物(10.4g,30mmol)溶解于60mL干燥吡啶中，冰浴下滴加BzCl(4.2mL,36mmol)，滴加完毕后冰浴下搅拌30分钟，然后将体系移置室温下反应5小时，TLC(3:1，石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全。将反应体系用CH₂Cl₂稀释，依次用1M盐酸、饱和NaHCO₃溶液、饱和食盐水洗涤，CH₂Cl₂萃取、无水Na₂SO₄干燥、浓缩柱层析(4:1，石油醚-乙酸乙酯)分离得浅黄色粘稠状液体2(13.5g,收率100%).

结构确证数据：

[α]_D ²⁵=+120°(1g/100mL,CHCl₃),¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ:1.31,1.52(2s,6H,CMe₂),2.01(s,3H,COCH₃),4.40(dd,J=5.0Hz,12.2Hz,1H,H-4),4.51(d,J_1,2=3.6Hz,1H,H-2),4.57(t,J=1.3Hz,1H,CH₂CHCH₂O),4.59(t,J=1.3Hz,1H,CH₂CHCH₂O),4.63～4.71(m,2H,H-6),5.18～5.28(m,2H,CH₂CHCH₂O),5.32～5.34(m,1H,H-3),5.49～5.55(m,1H,H-5),5.80～5.93(m,1H,CH₂CHCH₂O),5.96(d,J_1,2=3.6Hz,1H,H-1),7.40～7.56(m,3H,Ar-H),7.96～8.00(m,2H,Ar-H);¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:169.36,165.10,154.66,133.31,131.36,129.69,128.34,118.83,112.51,105.10,83.17,75.10,68.56,68.18,66.59,26.72,26.14,20.51;HRMS(ESI)calcd for C₂₂H₂₆O₁₀(M＋H)^＋451.15987,found451.15887.

经表征，结构正确，得到了目标化合物。

实施例3、化合物3（属于通式化合物Ⅵ的一种）的合成

于250mL圆底烧瓶中，将化合物2(9g,20mmol)溶于200mL甲醇-乙酸乙酯(体积比,1/2)溶液中，向体系中加入CH₃COONH₄(30.8g,400mmol)，冰浴冷却至–10℃，向体系中快速加入PdCl₂(35mg,0.2mmol)、NaBH₄(1.52g,40mmol)。TLC(2:1，石油醚-乙酸乙酯)检测至反应完全，共需1小时。将反应液减压浓缩，除去甲醇、四氢呋喃。将反应体系用CH₂Cl₂稀释，饱和食盐水萃取、无水Na₂SO₄干燥、浓缩柱层析(4:1，石油醚-乙酸乙酯)分离得浅黄色粘稠状液体3（6.9g,收率95%）。

结构确证数据：

[α]_D ²⁵=+88°(1g/100mL,CHCl₃),¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ:1.32,1.55(2s,6H,CMe₂),2.01(s,3H,COCH₃),3.96(dd,J_5,6a=4.3Hz,J_6a,6b=12.4Hz,1H,H-6a),4.07(dd,J_5,6b=3.0Hz,J_6a,6b=12.4Hz,1H,H-6b),4.52(d,J_1,2=3.6Hz,1H,H-2),4.67(dd,J_3,4=3.0Hz,J_4,5=9.3Hz,1H,H-4),5.31～5.37(m,2H,H-3,H-5),5.95(d,J_1,2=3.6Hz,1H,H-1),7.40～7.59(m,3H,Ar-H),7.98～8.00(m,2H,Ar-H);¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:169.37,165.57,133.26,131.36,129.60,128.33,112.39,104.97,83.11,75.25,71.09,62.69,26.60,26.03,20.46;HRMS(ESI)calcd for C₁₈H₂₂O₈(M＋H)^＋367.13874,found367.13849.

经表征，结构正确，得到了目标化合物。

实施例4、化合物4（属于通式化合物Ⅶ的一种）的合成

将化合物3(11g,30mmol)、化合物1(24g,33mmol)和分子筛（8g）溶于200mL干燥二氯甲烷中,冰浴冷却至–10℃，氮气保护下搅拌0.5小时，加入三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯（TMSOTf）80μL，保持–10℃反应0.5小时，撤去冰浴使反应物自然升温到15℃，3小时后TLC(2:1，石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全，加160μL三乙胺结束反应。抽滤反应液，滤液减压下浓缩，柱层析分离(6:1石油醚-乙酸乙酯)得白色固体双糖4(22.7g，收率80%)。

结构确证数据：

[α]_D ²⁵=+114°(1g/100mL,CHCl₃),¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ:1.28,1.54(2s,6H,CMe₂),2.00(s,3H,COCH₃),4.08(dd,J_5',6'=4.3Hz,J_6a',6b'=12.0Hz,1H,H-6b'),4.31～4.39(m,3H,H-6a,H-6b,H-6a'),4.48～4.55(m,2H,H-2',H-5'),4.74(dd,J_3,4=3.0Hz,J_4,5=9.3Hz,1H,H-4'),5.00(d,J_1,2=8.0Hz,1H,H-1),5.23(d,J_3,4=3.0Hz,1H,H-3'),5.40～5.45(m,1H,H-5),5.58(dd,J_2,3=10.5Hz,J_3,4=3.5Hz,1H,H-3),5.84(dd,J_1,2=8.0Hz,J_2,3=10.5Hz,1H,H-2),5.90(d,J=3.5Hz,1H,H-1'),5.97(dd,J_3,4=J_4,5=3.5Hz,1H,H-4),7.18～8.07(m,25H,Ar-H);¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:169.45,165.93,165.46,165.45,165.03,133.51,133.19,133.09,132.94,129.97,129.77,129.72,129.49,129.41,129.15,129.06,128.75,128.59,128.32,128.28,128.21,128.19,112.48,105.11,101.22,83.28,76.37,75.06,71.62,71.35,69.74,69.40,68.12,67.71,26.76,26.11,20.58;HRMS(ESI)calcd for C₅₂H₄₈O₁₇(M＋NH₄)^＋962.32298,found962.32025.

经表征，结构正确，得到了目标化合物。

实施例5、式Ⅰ所示化合物的合成

将化合物4(14.1g,5mmol)溶于200mL90%三氟乙酸水溶液中，室温下反应,TLC(1:1石油醚-乙酸乙酯)追踪检测至反应完全，减压浓缩，用3×20mL甲苯共蒸除尽溶剂。将浓缩物溶于60mL甲醇，向体系中滴加新制甲醇钠溶液，调体系pH值至10，室温下反应，TLC(1:2，石油醚-乙酸乙酯)追踪检测至反应完全。向体系中加入酸性离子树脂调节体系pH至中性，抽滤除去树脂，滤液浓缩至剩余约15mL溶剂，乘热加入30mL无水乙醇和6mL水，冷冻放置析出白色粉末状固体，抽滤烘干得到式Ⅰ所示化合物(4.5g，收率90%)。

结构确证数据：

[α]_D ²⁵=+67°(1g/100mL,H₂O),¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ:105.38,98.07,94.23,76.99,76.14,73.52,72.88,72.57,71.61,70.80,63.09,51.00;HRMS(ESI)calcd forC₁₂H₂₂O₁₁(M＋NH₄)^＋360.15004,found360.15051.[文献数据^[21]:100MHz,D2O:δ106.1(C-1'),98.8(C-1b),94.9(C-1a),78.5(C-3b),78.0(C-5');77.7(C-5b),76.9(C-2b),75.5(C-3'and C-3a),74.2(C-2a),73.6(C-2'),73.3(C-5a),72.3(C-4a and C-4b),71.5(C-4',C-6aand C-6b),63.8(C-6')]。

经表征，结构正确，得到了目标化合物。

Claims

1.式Ⅰ所示β-D-半乳糖基-(1→6)-D-葡萄糖的制备方法，包括如下步骤：

式Ⅶ中，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；R¹和R²均为乙酰基或苯甲酰基；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述酸为乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液；脱除异丙叉基在60～80℃的温度下进行；

所述碱为氨、氢氧化钠、甲醇钠或乙醇钠；

脱除酰基在-15～40℃的温度下进行。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：权利要求1中所述式Ⅶ所示化合物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：

式Ⅲ中，R¹为乙酰基或苯甲酰基；

所述偶联反应的催化剂为N-碘代丁二酰亚胺与三氟甲磺酸的混合物、三氟甲磺酸化二甲基硫盐、三氟甲磺酸化二甲基硫基硫盐、N-哌啶基苯甲亚砜与三氟甲磺酸酐的混合物或三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯；

所述偶联反应的溶剂为二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、甲苯、氯仿、乙腈、乙醚、DMF、THF和DME中至少一种；

所述偶联反应的温度为-45℃～15℃，时间为0.5～4.0小时；

式Ⅵ所示呋喃葡萄糖与式Ⅲ所示化合物的摩尔比为1.0：1.1～1.5。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述式Ⅵ所示呋喃葡萄糖是按照包括如下步骤的方法制备得到的：

式Ⅴ中，AllOC＝O表示烯丙氧羰基，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；

R²为乙酰基或苯甲酰基；

所述铵盐为甲酸铵或乙酸铵；

所述钯盐为氯化钯或者醋酸钯；

式Ⅴ所示呋喃葡萄糖、所述铵盐、所述钯盐和所述硼氢化钠的摩尔比为1.0：10～20：0.01～0.1：1.5～4.0；

所述烯丙氧羰基脱除反应的温度为-20～20℃，时间可为0.1～2.0小时。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述式Ⅴ所示呋喃葡萄糖是按照包括如下步骤的方法制备得到的：

式Ⅳ中，AllOC＝O表示烯丙氧羰基，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；

R²Cl中R²为乙酰基或苯甲酰基；

式Ⅳ所示呋喃葡萄糖与R²Cl的摩尔比为1.0：1.2～1.8；

在-5℃～-10℃的条件下，将R²Cl滴加至式Ⅳ所示呋喃葡萄糖中；

所述酰化反应的温度为20℃～25℃，时间为2.0～8.0小时。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述式Ⅳ所示呋喃葡萄糖是按照包括如下步骤的方法制备得到的：

式Ⅱ中，Me表示甲基；Ac表示乙酰基；

所述碱为三乙胺或吡啶；

式Ⅱ所示化合物、所述碱与所述烯丙氧羰基氯的摩尔比为1.0：1.2～5.0：1.1；

在-15℃～-25℃的条件下，将所述烯丙氧羰基氯滴加至式Ⅱ所示化合物中；

所述烯丙氧羰基化反应的温度为20℃～25℃，时间为0.5～4.0小时。