JP2006083091A - トレハロース型二糖類及びその誘導体の製造方法並びに新規トレハロース型二糖類誘導体 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明では、トレハロース型二糖類及びその誘導体を得ること及びその製造方法を構築すること並びに前記新規トレハロース型二糖類誘導体を提供することを解決すべき課題とする。
【解決手段】本発明者らは、新たな糖供与体の脱離基と活性化剤の組み合わせを見いだした。その新規グリコシル化法を用いることにより立体配置を制御したトレハロース型二糖類及びその誘導体を得、その製造方法を構築した。また新規なトレハロース型二糖類誘導体を得た。
【選択図】なし

Description

本発明は、ガラクトース誘導体とグルコース誘導体とから、グリコシル化反応を行い、Ｇａｌ（α１−β１）Ｇｌｃ骨格を持つトレハロース型二糖類若しくはその誘導体を製造する方法、また前記製造方法を用いることによって得られた新規のトレハロース型二糖類誘導体に関するものである。

トレハロースは、二糖類の一つであって、２分子のＤ−グルコースがその還元性基同士で結合した構造を有する。そのため酵素による加水分解に対する耐性が強く、人体において代謝を受けにくい。また、紫外線による分解からＤＮＡを保護したり、特定の悪臭を消す等の性質を有することが明らかにされている。上記性質を持つため、薬品や化粧品の原材料としての、今後の展開が望まれている。

一方、近年病原性微生物が生産するタンパク質毒素（志賀毒素、コレラ毒素など）やウイルス（インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルスなど）による感染症が大きな社会問題となっている。これらのタンパク質毒素や病原細菌及び病原ウイルスは、ホスト細胞の表面に発現している糖鎖と特異的な相互作用をおこす。それにより、細胞の表面に付着し、細胞内に侵入することが知られている。このことは糖鎖が毒素の感染を予防する薬剤や捕捉剤として機能し得ることを示唆している。つまりこの菌や毒素が認識する糖鎖の構造を模倣して化合物を設計することで、菌や毒素と細胞表層の糖鎖レセプターとの結合を競争的に阻害し、感染を防ぐという考え方である。

しかしながら、天然に存在している糖を模倣して合成したオリゴ糖鎖は、消化液中に含まれる糖加水分解酵素による分解を受けやすいため、糖鎖をベースとする薬剤の開発はされていない。

病原性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ−７が生産する志賀毒素（Stx−Ｉ、Stx−ＩＩ）は、グロ
ボ系糖脂質であるＧｂ₂やＧｂ₃がその化学構造中に有するα（１−４）ガラクト二糖構造を認識することで、細胞内への侵入することが報告されている。このため、単純な構造を有し且つ高い親和性を持つ人工のStxリガンドの開発を目的として、グロボ系糖脂質の化学修飾に関する研究が数多く行われている。それらの研究では、脂質部分の改変やクラスターモデルの構築に焦点が置かれている。現在までグロボ系糖脂質類自体の開発においてα（１−４）ガラクト二糖構造を改変した例は、本発明者らの報告以外見あたらない。例えば本発明者らの出願にかかる特許文献１には、２分子のグルコースが結合された構造のトレハロースを出発物質とし、その一方のグルコース部における４位の水酸基を反転して、アキシャル型配置にすることにより、ガラクトース構造を導入したガラクト型トレハロース若しくはその誘導体を製造する方法が示されている。合成したガラクト型トレハロースは、志賀毒素と結合したことを見いだした。
特開２００３−７３３９１号公報

上記のように菌や毒素が認識する糖鎖の構造（例えばグロボ系糖鎖）を模倣して化合物を設計することが注目されている。特に、本発明者らは、長年にわたって蓄積された研究結果に基づき、Ｇａｌ（α１−β１）Ｇｌｃ骨格を持つトレハロース型二糖類について、高いタンパク質毒素との相互作用や、高い生理作用の発現などが期待できることを予測した。しかし、Ｇａｌ（α１−β１）Ｇｌｃ骨格を持つ立体配座が適切なトレハロース型二糖類及びその誘導体は、化学的に合成することが困難であった。

そこで本発明では、簡便な方法で、立体配座が適切なＧａｌ（α１−β１）Ｇｌｃ骨格を持つトレハロース型二糖類及びその誘導体を製造する方法を提供することを解決すべき課題とする。

また、新規化合物であるＧａｌ（α１−β１）Ｇｌｃ骨格を持つトレハロース型二糖類誘導体を提供することも解決すべき課題とする。

本発明者らは、新規グリコシル化法を用いることにより、立体配置を制御したトレハロース型二糖類及びその誘導体を得られることを見いだした。

グリコシル化反応は、アノマー位に脱離基を有する糖（糖供与体）と遊離の水酸基を持つ糖（糖受容体）との縮合を行うことである。通常糖鎖の合成では、グリコシル化により得られた新たな糖のアノマー位の保護基を除去し、脱離基を導入して糖供与体とした後、次の糖受容体と縮合を行うか、又は、新たな糖の水酸基の保護基を除去して糖受容体とし、次の糖供与体と縮合を行う。これらの工程を繰り返し行うことによって、糖鎖を伸張する。

またｏｎｅ−ｐｏｔグリコシル化は、糖供与体あるいは糖受容体の反応性の違いを利用し、糖供与体の脱離基と活性化剤の組み合わせを複数用いることにより、一つの反応容器内で連続的にグリコシド結合を形成させる反応である。

本発明者らは、ｏｎｅ−ｐｏｔグリコシル化法を検討した。そこで新たな糖供与体の脱離基と活性化剤の組み合わせを見いだし、新規グリコシル化法を開発した。本発明者らの発明したその新規グリコシル化法を用いることにより通常要求される厳密な無水条件を必要とせず、活性化剤として重金属やハロゲン含有有機溶媒を用いず、活性種を精製することなく、グリコシル化法を行うことが出来る。

本発明は、新規グリコシル化法を用いることにより、一つの反応容器内で連続して製造することも出来る。

（第１手段）
すなわち上記第１課題を解決する本発明のトレハロース型二糖類及びその誘導体の製造方法は、下記一般式（１）にて表されるガラクトース誘導体と活性化剤とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとを混合する活性化工程と、前記混合物に下記一般式（２）にて表されるグルコース誘導体を添加してグリコシル化反応を行い下記一般式（３）にて表されるトレハロース型二糖類誘導体を形成するグリコシル化工程とを有することを特徴とする。

（一般式（１）から（３）におけるＸ、ＹはＯＨ基を保護する保護基であり、それぞれ独立して選択される。Ｂｎはベンジル基である。）

従来のグリコシル化法を用いた反応で、二糖を合成しようとすると、糖供与体側の立体配置及び糖受容体の立体配置は、それぞれα型と、β型との混合物となっている。従って、合成された二糖は、４種類の立体異性体の混合物となる。これらの異性体は、極性がほとんど同じであるため、シリカゲルカラムなどによる常用する分離方法では分離困難であった。

新グリコシル化法を用いると、活性化工程において活性化剤、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びガラクトース誘導体のグリコシド結合が平衡状態を生じる。その平衡状態に達した系中にグルコース誘導体を加えてグリコシル化工程に供する。この平衡状態においてガラクトース誘導体は、α型グリコシド結合のガラクトース誘導体がβ型に比べ存在比は高い。しかしα型に比べ、β型グリコシド結合のガラクトース誘導体の方が不安定であり、反応性が高い。そこで次のグリコシル化工程では、このβ型に対し、グルコースの水酸基が攻撃する。この反応はＳ_N２的に進むため、生成物においてβ型からα型に反転が起こり、生成物のガラクトース側のグリコシド結合がα型に制御される。従って得られる二糖類の立体異性体は、グルコース骨格側のグリコシド結合が示すα型（一般式（４））及びβ型（一般式（３））の２種類であり、本発明の製造方法によると、それらの混合物として得ることができる。

Ｙが保護基のままの一般式（３）又は（４）で表されるα型又はβ型グリコシド結合のトレハロース型二糖類誘導体（即ち、α，α型又はα，β型）の混合物は、極性や結晶性にさほど差が無いので分離が困難である。しかしα，α型又はα，β型の混合物のまま保護基Ｙを脱保護基反応を行い水酸基にすると、α，α型とα，β型の結晶性に差が生じ、再結晶でα，β型トレハロース型二糖類誘導体のみを単離することが出来る。

（一般式（４）におけるＸ、ＹはＯＨ基を保護する保護基であり、それぞれ独立して選択される。Ｂｎはベンジル基である。）

従来、Ｇａｌ（α１−α１）Ｇｌｃ骨格を持つトレハロース型二糖類及びその誘導体は、化学的、又酵素的に合成する方法が確立されている。本発明では今まで合成出来なかったＧａｌ（α１−β１）Ｇｌｃ骨格を持つトレハロース型二糖類及びその誘導体を合成できる。

（第２手段）
また上記第２課題を解決する本発明のトレハロース型二糖類及びその誘導体は、下記一般式（５）にて表される。

（一般式（５）におけるＡは、アミノ基、ハロゲン、カルボキシル基、−Ｎ₃、並びにペプチド鎖、ビニル重合体を介して結合した高分子化合物から選択される。）

志賀毒素（Stx−Ｉ、Stx−ＩＩ）は、グロボ系糖脂質であるＧｂ₂やＧｂ₃がその化学
構造中に有するα（１−４）ガラクト二糖構造グロボ系糖鎖を認識する。本発明のトレハロース型二糖類又はその誘導体は、前記構造を模倣して設計されたものであり、菌や毒素と細胞表層の糖鎖レセプターとの結合を競争的に阻害し、感染を防ぐ医薬品組成物として利用できる可能性がある。

これまで化学的に合成が困難であった、菌や毒素が認識する糖鎖（例えばグロボ系糖鎖）の構造模倣化合物を化学合成できた。具体的には本発明では、新規グリコシル化法を用い、トレハロース型二糖類及びその誘導体を得た。またその製造方法を構築した。また、新規トレハロース型二糖類誘導体を提供できた。

（第１実施形態）
本発明のトレハロース型二糖類及びその誘導体の製造方法は、上記一般式（１）にて表されるガラクトース誘導体と活性化剤とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとを混合する活性化工程と、前記混合物に上記一般式（２）にて表されるグルコース誘導体を添加してグリコシル化反応を行い上記一般式（３）にて表されるトレハロース型二糖類誘導体を形成するグリコシル化工程とを有する。

前記ガラクトース誘導体を、ガラクトースの１位と６位の水酸基以外の水酸基に常法に従って保護基であるベンジル基を導入し、また６位の水酸基に常法に従って適当な保護基を導入し、作製する。例えば、下記の方法が挙げられる。なお下記の方法に限定されるものではない。はじめにＤ−ガラクトースにＴＭＳＣｌ（トリメチルクロロシラン）とメタノールを用い、１位の水酸基にメチル基を導入する。次いでＤＭＦ、ＮａＨ、ＢｎＢｒ（ベンジルブロミド）を用い、２、３、４及び６位の水酸基にベンジル基を導入する。更に無水酢酸と硫酸を用いて、１位と６位の基をアセチル基に変える。最後にＴＨＦとベンジルアミンを用いて、１位の基を水酸基に戻す。これで１位に水酸基、６位にアセチル基を持ち、それ以外の水酸基にベンジル基を導入したガラクトース誘導体を得ることが出来る。

前記ガラクトース誘導体の６位を保護する基（上記一般式（１）におけるＸ）は、水酸基を除くあらゆる官能基を用いることが出来る。例えばＸ＝ＯＡｃ基、ＯＢｎ基、ＯＴＭＳ基、ＯＴＢＤＭＳ基、ＯＭｓ基、Ｎ₃基等である。（Ａｃはアセチル基、ＴＭＳはトリメチルシリル基、ＴＢＤＭＳはｔ−ブチルジメチルシリル基、Ｍｓはメシル基、Ｎ₃はアジド基である）中でもＸ＝ＯＡｃ基、ＯＢｎ基、ＯＴＭＳ基が好ましく、特にＸ＝ＯＢｎ基が好ましい。以上のように常用される保護基のほかに、糖、アミノ酸及びペプチド等も考えられる。ただしこれらの化合物の水酸基やアミノ基等は保護され、反応に関与しないようにすることが必須である。

前記グルコース誘導体を、グルコースの１位と６位の水酸基以外の水酸基に常法に従って保護基であるベンジル基を導入し、また６位の水酸基に常法に従って適当な保護基を導入し、作製する。例えば、下記の方法が挙げられる。なお下記の方法に限定されるものではない。はじめにα−メチル−Ｄ−グルコシドにＤＭＦ、ＮａＨ、ＢｎＢｒを用い、２、３、４及び６位の水酸基にベンジル基を導入する。更に無水酢酸と硫酸を用いて、１位と６位の基をアセチル基に変える。最後にＴＨＦとベンジルアミンを用いて、１位の基を水酸基に戻す。これで１位に水酸基、６位にアセチル基を持ち、それ以外の水酸基にベンジル基を導入したグルコース誘導体を得る。

前記グルコース誘導体の６位を保護する基（上記一般式（２）におけるＹ）は、水酸基を除くあらゆる官能基を用いることが出来る。例えばＹ＝ＯＡｃ基、ＯＢｎ基、ＯＴＭＳ基、ＯＴＢＤＭＳ基、ＯＭｓ基、Ｎ₃基等である。中でもＹ＝ＯＡｃ基、ＯＢｎ基、ＯＴＭＳ基が好ましく、特にＹ＝ＯＡｃ基が好ましい。以上のように常用される保護基のほかに、糖、アミノ酸及びペプチド等も考えられる。ただしこれらの化合物の水酸基やアミノ基等は保護され、反応に関与しないようにすることが必須である。

特に前記ガラクトース誘導体のＸと前記グルコース誘導体のＹとは、異なる基が望ましい。上記一般式（５）を得る反応を行う場合、同じ基を用いると、反応がうまくいかないことがある。特にＸ＝ＯＢｎ、Ｙ＝ＯＡｃの組み合わせが望ましい。

前記活性化剤は、ＰＰｈ₃（トリフェニルホスフィン）又は高分子に固定化されたＰＰｈ₃（トリフェニルホスフィン）と、Ｃ_nＨ_(2n+2-m)Br_m (n=1〜3の整数、ｍ＝１〜（２ｎ＋２）の整数）とである。特にトリフェニルホスフィン及び四臭化炭素の組み合わせが好ましい。高分子に固定化されたトリフェニルホスフィンとは、トリフェニルホスフィンを高分子担体に固定化したものである。ＰＰｈ₃は、活性化反応後ＰＰｈ₃＝Ｏ（フォスフィンキサイド）となって結晶化しやすくなるので、高分子担体に固定化されたＰＰｈ₃が、反応混合物との分離や再利用が容易な点で好ましい。

活性化工程において活性化剤及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの存在下で、ガラクトース誘導体の活性化された１位の立体がα型とβ型の平衡状態を生じる。その平衡状態に達した系中に受容体としてのグルコース誘導体を加えてグリコシル化工程に供する。この平衡状態は、活性化されたガラクトース誘導体と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び活性化剤であるハライドイオンとの接触を介して起こる。α型にハライドとしてＢｒ置換されたガラクトース誘導体、α型にイミデート（−ＯＣＨ＝Ｎ⁺Ｈ（ＣＨ₃）₂）置換されたガラクトース誘導体及びβ型にＢｒ置換されたガラクトース誘導体の平衡状態である。ガラクトース誘導体は、α型グリコシド結合のガラクトース誘導体がβ型に比べ存在比は高い。しかしα型に比べ、β型グリコシド結合のガラクトース誘導体の方が不安定であり、反応性が高い。そこで次のグリコシル化工程では、このβ型に対し、グルコース誘導体の水酸基が攻撃する。この反応はＳ_N２的に進むため、生成物においてβ型からα型に反転が起こり、生成物のガラクトース側のグリコシド結合がα型に制御される。従って得られるトレハロース型二糖類誘導体は、ガラクトース誘導体のグリコシド結合はα型のみで、グルコース誘導体の結合はα型とβ型とが混在する二糖類である。

Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いる場合、ベンゼン、キシレン、ヘキサン等の炭化水素系の溶媒又はそれらの水素原子の一部乃至全部をハロゲンにて置換したハロゲン系溶媒と一緒に用いても良い。ＤＭＦは、従来のグリコシル化法には用いられない。本発明のグリコシル化反応においては、ＤＭＦは反応の活性化剤の役割を合わせ持つ。更にＤＭＦは溶媒としても使用できる。ＤＭＦを用いることによって反応時間が大幅に短縮される。他の溶媒を用いては反応時間が長くなり、最終的に反応は完結しないこともある。

活性化工程は、前記ガラクトース誘導体と前記活性化剤とＤＭＦとを混合し、反応させる。例えば室温で３時間の条件を採用することが出来る。前記ガラクトース誘導体の１位の水酸基がα位にブロミド化される。

ブロミド化されたガラクトース誘導体は、ＤＭＦと反応し、更に活性の高いｏ−グリコシド中間体と平衡状態となる。

グリコシル化工程は、活性化工程後、前記混合物に前記グルコース誘導体を加え、反応させる。例えば室温で約４８時間の条件を採用することも出来る。α，α−型、α，β−型のトレハロース型二糖類誘導体の混合物が得られる。上記一般式（３）に示した化合物は、α，β−型のトレハロース型二糖類誘導体である。

一般式（３）又は（４）で表されるα型又はβ型グリコシド結合のトレハロース型二糖類誘導体（即ち、α，α型又はα，β型）の混合物は、Ｙが保護基のままなので極性や結晶性にさほど差が無く分離が困難である。しかしα，α型又はα，β型の混合物のまま脱保護基反応を行い保護基Ｙを脱離させて水酸基にすると、α，α型とα，β型の結晶性に差が生じ、α，β型トレハロース型二糖類誘導体のみを再結晶で単離することが出来る。

（第２実施形態）
その他の本発明のトレハロース型二糖類及びその誘導体は、上記一般式（５）にて表される。（Ａは、アミノ基、ハロゲン、カルボキシル基、−Ｎ₃、並びにペプチド鎖、ビニル重合体を介して結合した高分子化合物から選択される。）
上記一般式（５）で表されるトレハロース型二糖類及びその誘導体は、第１実施形態で得られた上記一般式（３）で表されるトレハロース型二糖類誘導体のＹを常法に従ってＡに置換し、Ａ以外の保護基を常法に従って水酸基に置換することによって得られる。

この物質は、α，β−型のトレハロース型二糖類誘導体である。これまで化学法、酵素法を用いても合成できなかった、新規化合物である。

更に上記一般式（５）で表される有機残基を持つトレハロース型二糖類誘導体をモノマーとして用い、それを単独重合若しくは他の不飽和モノマーと共重合せしめて得られる重合体を作成できる。

ここで、志賀毒素（Stx−Ｉ、Stx−ＩＩ）は、グロボ系糖脂質であるＧｂ₂やＧｂ₃が
その化学構造中に有するα（１−４）ガラクト二糖構造グロボ系糖鎖を認識する。本発明のトレハロース型二糖類及びその誘導体は、前記構造を模倣して設計されたものであり、菌や毒素と細胞表層の糖鎖レセプターとの結合を競争的に阻害し、感染を防ぐ医薬品組成物として利用できる可能性がある。

次に実施例をあげて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

まず、（Ａ）保護基を導入した一般式（１）に示される前記ガラクトース誘導体を作製する。（糖供与体（ドナー）の合成）次いで（Ｂ）保護基を導入した一般式（２）で示される前記グルコース誘導体を作製する。（糖受容体（アクセプター）の合成）さらに（Ｃ）前記ガラクトース誘導体と前記活性化剤とＤＭＦを混合し、室温で３時間ほど反応させる。その後前記グルコース誘導体を上記反応物と混合し、室温で反応させ、トレハロース二糖類誘導体を合成する。（活性化工程及びグリコシル化工程）最後に（Ｄ）得られたトレハロース二糖類誘導体の保護基Ｙの除去を行い、再結晶させる。（保護基Ｙ除去及び再結晶）またその後必要に応じ、（Ｅ）官能基を導入することができる。以下の操作によって具体的に示す。

表１にガラクトース誘導体の保護基Ｘ、グルコース誘導体の保護基Ｙ及び使用した溶媒の種類、またグリコシル化工程の反応時間、収率（ガラクトース誘導体の消費量で表す）及びグルコース誘導体側の立体配置について記載した。

図１にガラクトース誘導体の合成するための反応式を、図２にグルコース誘導体の合成するための反応式を示す。さらに図３に、トレハロース二糖類誘導体の保護基Ｙの除去、再結晶工程及び新たな官能基を導入するための反応式を示す。各化合物の下に示した番号で各化合物を表す。

なおα，βの構造の同定法は、¹ＨＮＭＲ法を用いた。一般式（３）又は（４）で表されるα型又はβ型グリコシド結合のトレハロース型二糖類誘導体（即ちα，α型又はα，β型）の混合物をカラムで精製した段階で、¹ＨＮＭＲ法を用いて構造と、α，α型とα，β型の生成比を求めた。

（Ａ）糖共与体（ドナー）の合成 （図１における化合物４及び５の合成）
Ｄ−ガラクトース（１０．０ｇ，５６ｍｍｏｌ)をメタノール（５０ｍL）に溶かし、トリメチルクロロシラン（ＴＭＳＣＬ，２５ｍＬ）を加え室温で約１０時間攪拌した。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、クロロホルム：メタノール＝１：１）で確認した。

反応溶液に、トルエン：メタノール＝１０：１溶液を加えて、共沸させた。３回目からメタノールの割合を増やし、合計５回共沸させた。真空乾燥し白色結晶である化合物１を得た。収量は、１１．７ｇ（６０ｍｍｏｌ）、収率は９９％以上であった。

化合物１（１０．８ｇ，５６ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶かし、氷浴で６当量のＮａＨ（１３．３ｇ，３３３ｍｍｏｌ）を加え、３０分攪拌した。反応溶液に６当量のベンジルブロミド（４０．８ｍＬ）を加え室温で約１７時間攪拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、氷浴中でメタノール（４１ｍＬ）を加え、未反応のベンジルブロミドを分解するため３日間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、メタノールを除いた後、酢酸エチルを加え目的物を抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、水で２回、食塩水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムを加えて、一晩乾燥させた。硫酸マグネシウムをガラスフィルターで除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１→６：１）で精製した。溶液を減圧濃縮後、真空乾燥して無色透明なシロップ状の化合物２を得た。収量は、２１．７ｇ（３９．１ｍｍｏｌ）、収率は７０％であった。

化合物２（２１．７ｇ，３９．１ｍｍｏｌ）を無水酢酸（３００ｍＬ）に溶かし、氷浴で冷やしながら硫酸（１０ｍｏｌ％，０．２１３ｍＬ）を加え約４時間室温で攪拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、氷浴中で粉末炭酸水素ナトリウムとメタノール（３００ｍＬ）を加え、未反応の試薬を分解させるために２日間放置した。反応溶液に酢酸エチルと飽和食塩水を加え振り、目的物を有機層に抽出した。有機層が中性になるまで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、水で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムをガラスフィルターで除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１→３：１）で精製した。溶液を減圧濃縮後、真空乾燥して無色透明なシロップ状の化合物３を得た。収量は、７．５ｇ（１４．１ｍｍｏｌ）、収率は３５％であった。

化合物３（７．５ｇ、１４．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（７０ｍＬ）に溶かし、１．２当量のベンジルアミン（１．８５ｍＬ）を加えて室温で約１週間攪拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、反応溶液に０．５Ｍ塩酸と酢酸エチルとを加え目的物を抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で各２回洗浄後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥した。硫酸マグネシウムをガラスフィルターで除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製した。溶液を減圧濃縮後、真空乾燥して白色固体である化合物４を得た。収量は、４．６ｇ（９．３ｍｍｏｌ）、収率は６６％であった。

化合物２（５．７ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（７３ｍＬ）、１Ｍ塩酸（２３ｍＬ）に溶かし、時々塩酸を加えながら９５℃〜１００℃で約４８時間還流した。反応後、水とクロロホルムを加え目的物を抽出した。クロロホルム層を、炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で２回洗浄した。その後硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムをガラスフィルターで除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）で精製した。溶液を減圧濃縮後、真空乾燥して白色固体である化合物５を得た。収量は、３．０５ｇ（５．６５ｍｍｏｌ）、収率は５５％であった。

（Ｂ）糖受容体（アクセプター）の合成 （図２における化合物８，１０及び１１の合成）
市販のα−メチル−Ｄ−グルコシド（１０．８ｇ，５５．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４００ｍＬ）に溶かし、氷浴で６当量のＮａＨ（１３．３ｇ，３３３．４ｍｍｏｌ）を加え、３０分攪拌した。反応溶液に６当量のベンジルブロミド（４１ｍＬ）を加え室温で約３時間攪拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、氷浴中でメタノール（４２ｍＬ）を加え、未反応のベンジルブロミドを分解するため５日間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、メタノールを除いた後、酢酸エチルを加え目的物を抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムを加えて、一晩乾燥させた。硫酸マグネシウムをガラスフィルターで除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１→６：１）で精製した。溶液を減圧濃縮後、真空乾燥して無色透明なシロップ状の化合物６を得た。収量は、２３．８ｇ（４３．０ｍｍｏｌ）、収率は７８％であった。

化合物６（２３．８ｇ，４３．０ｍｍｏｌ）を無水酢酸（３００ｍＬ）に溶かし、氷浴で冷やしながら硫酸（１０ｍｏｌ％，０．２３４ｍＬ）を加え約４時間室温で攪拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、氷浴中で粉末炭酸水素ナトリウムとメタノール（３００ｍＬ）を加え、未反応の試薬を分解させるために３日間放置した。反応溶液に酢酸エチルと飽和食塩水とを加え振り、目的物を有機層に抽出した。有機層が中性になるまで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、水で２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで一晩乾燥した。硫酸マグネシウムをガラスフィルターで除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１→３：１）で精製した。溶液を減圧濃縮後、真空乾燥して無色透明なシロップ状の化合物７を得た。収量は、１７．１ｇ（３１．９ｍｍｏｌ）、収率は７４％であった。

化合物７（５．０ｇ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶かし、１．２当量のベンジルアミン（１．２２ｍＬ）を加えて室温で約１週間攪拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、反応溶液に０．５Ｍ塩酸と酢酸エチルとを加え目的物を抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥した。硫酸マグネシウムをガラスフィルターで除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製した。溶液を減圧濃縮後、真空乾燥して白色固体である化合物８を得た。収量は、３．８０ｇ（７．６ｍｍｏｌ）、収率は８２％であった。

化合物７（５．１ｇ、９．５ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍＬ）に溶かし、２当量のＫ₂ＣＯ₃（２．６ｇ）を加えて室温で約２時間攪拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、反応溶液に０．５Ｍ塩酸と酢酸エチルとを加え目的物を抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で各２回洗浄後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥した。硫酸マグネシウムをガラスフィルターで除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１→１：１）で精製した。溶液を減圧濃縮後、真空乾燥して白色固体である化合物９を得た。収量は、３．８０ｇ（８．２ｍｍｏｌ）、収率は８６％であった。

化合物９（２７７ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶かし、ＰＰｈ₃とＣＢｒ₄とをそれぞれ３当量加え、室温で攪拌した。２３時間後、トルエン：酢酸エチル＝８：１の溶液を加えて抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥した。その後順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１→５：１）で精製した。溶液を減圧濃縮後、粘性を持った茶色い溶液である化合物１０を得た。収量は、１６２ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ）、収率は５１％であった。

化合物６（６．９ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）を８０％酢酸（１３４ｍＬ）、１Ｍ塩酸（４４ｍＬ）に溶かし、時々塩酸を加えながら９５℃〜１００℃で約２４時間還流した。反応後、水とクロロホルムを加え目的物を抽出した。クロロホルム層を、炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水とで２回、洗浄した。その後硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥後、エーテル−ヘキサンで再結晶させることで白色結晶である化合物１１を得た。収量は、３．１７ｇ（５．８５ｍｍｏｌ）、収率は４７％であった。

（Ｃ）トレハロース二糖類誘導体の合成。（活性化工程及びグリコシル化工程）
糖共与体（ドナー）をＤＭＦに溶かし、ＰＰｈ₃とＣＢｒ₄とをそれぞれ３モル当量加え、室温で攪拌する。３時間後、糖受容体（アクセプター）を３当量加える。反応終了後、トルエン：酢酸エチル＝８：１の溶液を加えて抽出する。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回、水で１回洗浄する。硫酸マグネシウムを加えて乾燥させる。その後順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。

（Ｄ）得られたトレハロース二糖類誘導体の保護基Ｙの除去及び再結晶。（図３における化合物１３の合成）
（Ｃ）の手法で合成したグリコシル化生成物１２のα，α−型とα，β−型の混合物（１．３９ｇ）をメタノール（４．６ｍＬ）とＣＨ₂Ｃｌ₂（９．２ｍＬ）に溶かし、目的物の１当量のＫ₂ＣＯ₃（１８５ｍｇ）を加え室温で攪拌した。約２時間後イオン交換樹脂（オルガノ（株）製、陽イオン交換樹脂（Ｒ）アンバーリスト）を加え中和し、濾過した。ヘキサン−酢酸エチルで再結晶し、白色結晶である化合物１３を得た。収量は７８６ｍｇ（０．８１ｍｍｏｌ）であった。

（Ｅ）官能基の導入（図３における化合物１８、１９の合成）
化合物１３（７８６ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（５．４ｍｌ）に溶かし、Ｅｔ₃Ｎ（１００μＬ）を加え、氷浴中でＭｓＣｌ（１８８μＬ、３当量）を滴下した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、室温に戻し、氷水を加えて過剰の試薬を分解した。クロロホルムを加え目的物を抽出し、有機層を０，５Ｍ塩酸で２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回、水で１回洗浄した。硫酸マグネシウムを加えて乾燥後、濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝８：１）で精製した。真空乾燥して。薄黄色の固体である化合物１４を得た。収量は８３９ｍｇ（０．８０ｍｍｏｌ）、収率は９９％であった。

化合物１４（８３９ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１６ｍＬ）に溶かし、７５℃に温めた中にＮａＮ₃（２６０ｍｇ、５当量）を加え，約５時間反応させた。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、冷却した。トルエン：酢酸エチル＝８：１の溶液を加えて抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回、水で２回洗浄した。硫酸マグネシウムを加えて乾燥後、濃縮、真空乾燥した。無色のシロップ状の化合物１５が得られた。収量は８２７ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）、収率は９９％以上であった。

化合物１５（２００ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍｌ）、メタノール（０．７ｍｌ）に溶かし、トリフェニルホスフィン（５３ｍｇ、１当量）を加えた。約２４時間反応させた。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、反応溶液をそのまま濃縮、真空乾燥し、化合物１６を得た。収量は２４０ｍｇ（Ｐｈ₃Ｐ＝Ｏを含む）であった。

化合物１６（２４０ｍｇ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）に溶かし、Ｅｔ₃Ｎ（２５０μＬ、１０当量）を加え、０℃に冷やしながらアセチルクロリド（１４．３μＬ、１当量）を滴下した。反応途中でアセチルクロリド（０．５当量）を追加し、約９時間反応させた。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応終了を確認後、クロロホルムで抽出した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄した。硫酸マグネシウムを加えて乾燥後、濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製した。真空乾燥し、無色シロップ状の化合物１７を得た。収量は１７２．４ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）、収率は８５％であった。

化合物１７（１３３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）中に分散させ、３５％濃度の塩酸を１滴加えた中に、Ｐｄ（ＯＨ）₂／Ｃを加え水素添加した。反応終了をＴＬＣ（酢酸エチル：酢酸：メタノール：水＝４：３：３：１）で確認後、濾過し目的物をトルエンで共沸した。濃縮し、真空乾燥し化合物１８を得た。収量は７８ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）、収率は９９％以上であった。

化合物１５（２０５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）中に分散させ、３５％濃度の塩酸を１滴加えた中に、Ｐｄ（ＯＨ）₂／Ｃを加え水素添加した。反応終了をＴＬＣ（酢酸エチル：酢酸：メタノール：水＝４：３：３：１）で確認後、濾過し目的物をトルエンで共沸した。濃縮し、真空乾燥し化合物１９を得た。収量は７０．２ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）、収率は９９％以上であった。

＜実施例１＞
ドナーとなる化合物４とアクセプターとなる化合物８を上記手法で合成した。

ドナーとなる化合物４をＤＭＦに溶かし、ＰＰｈ₃とＣＢｒ₄をそれぞれ３モル当量加え、室温で攪拌した。３時間後、アクセプターとなる化合物８を３当量加えた。１４時間の反応終了後、トルエン：酢酸エチル＝８：１の溶液を加えて抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回、水で１回洗浄した。硫酸マグネシウムを加えて乾燥後、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。グリコシル化生成物であるα，α型及びα，β型トレハロース型二糖類誘導体を得た。

上記誘導体のα，α−型とα，β−型の混合物（１．３９ｇ）をメタノール（４．６ｍＬ）とＣＨ₂Ｃｌ₂（９．２ｍＬ）に溶かし、目的物の１当量のＫ₂ＣＯ₃（１８５ｍｇ）を加え室温で攪拌した。約２時間後イオン交換樹脂（オルガノ（株）製、陽イオン交換樹脂（Ｒ）アンバーリスト）を加え中和し、濾過した。

上記反応混合物を室温で少量の酢酸エチルに溶かし、そこにヘキサンを加えると白色結晶が析出した。これを濾過し、結晶とろ液に分離した。得られた結晶からα，β型、ろ液からα，α型及び少量のα，β型トレハロース型二糖類誘導体を得た。グルコース誘導体側の立体配置はα型とβ型との比がモル比で２６：７４であった。収率はドナーの消費量から求め、収率は９０％以上であった。

＜実施例２＞
ドナーとなる化合物を化合物４に代えて化合物５を用いたこと、グリコシル化工程の反応時間を１４時間から２日間としたこと以外は、実施例１と同様にして、α，α型及びα，β型トレハロース型二糖類誘導体である化合物１２を得た。グルコース誘導体側の立体配置はα型とβ型との比がモル比で３０：７０であった。収率は９０％以上であった。

＜実施例３＞
アクセプターとなる化合物を化合物８に代えて化合物１１を用いたこと、グリコシル化工程の反応時間を１４時間から２日間としたこと以外は、実施例１と同様にして、α，β型及びα，α型トレハロース型二糖類誘導体を得た。グルコース誘導体側の立体配置はα型とβ型との比がモル比で２３：７７であった。収率は８０％であった。

実施例１〜３において、グルコース誘導体側はα型に比べβ型の方が生成量が多かった。この理由は、グルコース誘導体は反応溶液中でα型とβ型との存在比はほぼ等しいが、１位の水酸基においてβ型の水酸基の方が反応性が大きいため、グルコース誘導体側がβ型である二糖が優先的に出来たと考えられる。

＜比較例１＞
活性化剤ＤＭＦに代えて二塩化メタン及びＴＭＵ（テトラメチルウレア）を用いたこと、グリコシル化工程の反応時間を１４時間から８５時間としたこと以外は、実施例１と同様にして、α，β型及びα，α型トレハロース型二糖類誘導体を得た。反応速度が遅いので、反応を８５時間で中断し、そのため収率は６０％となった。反応を中断したため、グルコース誘導体側のα型とβ型の比は、確認していない。

ＤＭＦは反応の活性化剤の役割を合わせ持つ。ＤＭＦが入っていなかったので反応速度が遅くなったと考えられる。

＜比較例２＞
アクセプターとなる化合物を化合物８に代えて化合物１０を用いたこと、グリコシル化工程の反応時間を１４時間から２日間としたこと以外は、実施例１と同様にしたが、目的とするα，β型及びα，α型トレハロース型二糖類誘導体を得られなかった。ドナーの消費量は７０％であったが、目的物が全く得られなかったので、収率は０％である。

化合物８の保護基Ｙはアセチル基、化合物１０の保護基は、ブロモ基である。目的物が得られなかった理由として、ブロモ基の求電子性のため、グルコース誘導体の１位の水酸基の電子密度が下がり求核性が低下した、また立体的に大きなブロモ基による立体障害のため、反応に与らなかった等が考えられる。

＜比較例３＞
アクセプターとなる化合物を化合物８に代えて化合物１０を用いたこと、グリコシル化工程反応時間を１４時間から２日間としたこと、ＤＭＦ中にモレキュラーシーブスを用いたこと以外は、実施例１と同様にしたが、目的とするα，β型及びα，α型トレハロース型二糖類誘導体を得られなかった。ドナーの消費量は７０％であったが、目的物が全く得られなかったので、収率は０％である。

目的物が得られなかった理由としては上記比較例２と同様のことが考えられる。また比較例３では、ＤＭＦ中にモレキュラーシーブスを脱水剤として用いたが反応は進行しなかったので水による影響ではないと考えられる。

＜実施例４＞（一般式（５）においてＡがＮＨ₂基である化合物）
実施例２で得られたα，β型トレハロース型二糖類誘導体（化合物１２）を用いて、上記方法により化合物１３、化合物１４を経て、化合物１５を得た。その後化合物１５を用いて上記方法により化合物１９を得た。収量は７０．２ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）、収率は９９％以上であった。

化合物１９は、一般式（５）においてグルコース誘導体側の６位にアミノ基を導入した新規トレハロース型二糖類誘導体である。この誘導体は、アミノ基と水酸基の反応性の違いに基づいてアミノ基のみに他の化合物を導入することが出来る。したがってこの誘導体をモノマーとして用い、それを単独重合若しくは他の不飽和モノマーと共重合させ、重合体を得ることができる。

ガラクトース誘導体の合成するための反応式を示す。 グルコース誘導体の合成するための反応式を示す。 トレハロース二糖類誘導体の保護基Ｙの除去、再結晶工程及び新たな官能基を導入するための反応式を示す。

Claims (8)

1. 下記一般式（１）にて表されるガラクトース誘導体と活性化剤とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとを混合する活性化工程と、
   前記混合物に下記一般式（２）にて表されるグルコース誘導体を添加してグリコシル化反応を行い下記一般式（３）にて表されるトレハロース型二糖類誘導体を形成するグリコシル化工程と、
   を有することを特徴とするトレハロース型二糖類又はその誘導体の製造方法。
   

   

   （一般式（１）から（３）におけるＸ、ＹはＯＨ基を保護する保護基であり、それぞれ独立して選択される。Ｂｎはベンジル基である。）
2. 前記グリコシル化工程後、得られた前記一般式（３）に記載のトレハロース型二糖類誘導体と下記一般式（４）に記載のトレハロース型二糖類誘導体との混合物における、前記Ｘを−ＯＢｎ基に前記Ｙを水酸基にした後、前記Ｘが−ＯＢｎ基で前記Ｙが水酸基である前記一般式（３）記載のトレハロース型二糖類誘導体を再結晶により分離する再結晶工程を有する請求項１に記載のトレハロース型二糖類又はその誘導体の製造方法。
   

   

   （一般式（４）におけるＸ、ＹはＯＨ基を保護する保護基であり、それぞれ独立して選択される。Ｂｎはベンジル基である。）
3. 前記一般式（３）のＸ、Ｙにて表される保護基及びベンジル基を加水分解により除去する保護基除去工程を有する請求項１又は２に記載のトレハロース型二糖類又はその誘導体の製造方法。
4. 前記活性化剤は、トリフェニルホスフィン又は高分子に固定化されたトリフェニルホスフィンと、Ｃ_nＨ_(2n+2-m)Br_m (n=1〜3の整数、ｍ＝１〜（２ｎ＋２）の整数）とを含む請求項１〜３いずれかに記載のトレハロース型二糖類又はその誘導体の製造方法。
5. 前記Ｘがベンジル基、前記Ｙがアセチル基である請求項１〜４のいずれかに記載のトレハロース型二糖類又はその誘導体の製造方法。
6. 前記Ｘがベンジル基、前記Ｙがアセチル基であり、前記活性化剤はトリフェニルホスフィン及び四臭化炭素である請求項１〜３のいずれかに記載のトレハロース型二糖類又はその誘導体の製造方法。
7. 下記一般式（５）にて表されるトレハロース型二糖類誘導体。
   

   

   （一般式（５）におけるＡは、アミノ基、ハロゲン、カルボキシル基、−Ｎ₃、並びにペプチド鎖、ビニル重合体を介して結合した高分子化合物から選択される。）
8. 前記Ａは水酸基である請求項７に記載のトレハロース型二糖類。
   

Images