JP2003073391A - ガラクト型トレハロース若しくはその誘導体の製造方法及びそれによって得られるトレハロース由来のベロ毒素用リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安価なトレハロースを利用して、その構造を
変化させることにより、ベロ毒素を捕捉するリガンドを
提供すること。 【解決手段】 ２分子のグルコースが結合されてなる構
造のトレハロースを出発物質とし、その一方のグルコー
ス部における４位の水酸基を反転せしめて、アキシャル
型配置と為すことにより、ガラクトース構造を導入せし
めてなるガラクト型トレハロース若しくはその誘導体を
製造する。また、そのようなガラクト型トレハロース若
しくはその誘導体又はそれを主鎖中に導入したポリマー
をベロ毒素用リガンドとして用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、ガラクト型トレハロース若しく
はその誘導体の製造方法及びそれによって得られるトレ
ハロース由来のベロ毒素用リガンドに係り、特に、安価
なトレハロースを利用して、ガラクト型トレハロース若
しくはその誘導体を製造せしめ、そしてそれを、ベロ毒
素の非天然型糖鎖リガンドとして用いる技術に関するも
のである。

【０００２】

【背景技術】トレハロースは、二糖類の一つであって、
２分子のＤ−グルコースがその還元性基同士で結合した
構造を有するものであるが、最近、かかる糖鎖の酵素法
による大量合成法が確立され、大量に且つ安価に入手可
能となっている。また、そのようなトレハロースは、酵
素による加水分解に対する耐性が強く、人体において代
謝されないことや、紫外線によるＤＮＡの分解を保護し
たり、特定の悪臭を消す等の性質を有することが明らか
にされ、そしてその性質の１つを利用して、ダイエット
甘味料として工業的な利用が図られている等、糖資源と
して有望視されているが、更にその他にも、薬品や化粧
品の原料乃至は材料としての、今後の展開も、望まれて
いる。

【０００３】一方、病原性大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ−７が
生産するベロ毒素（Ｓｔｘ−Ｉ、Ｓｔｘ−II）は、グロ
ボ系糖脂質であるＧｂ₂ やＧｂ₃ が有するα（１−４）
ガラクト二糖構造を認識することで、細胞内へ侵入する
ことが報告されている。このため、単純な構造を有し且
つ高い親和性を持つ人工のＳｔｘリガンドの開発を目的
として、グロボ系糖脂質の化学修飾に関する研究が数多
く行なわれてきているが、それらの研究では、脂質部分
の改変やクラスターモデルの構築に焦点がおかれている
に過ぎない。現在まで、グロボ系糖脂質類自体の開発に
おいては、多段階の合成を必要とするにも拘わらず、α
（１−４）ガラクト二糖構造を改変した例は見当たらな
い。

【０００４】また、かかるＧｂ₂ 等のグロボ系糖脂質
は、上述の如く、ベロ毒素の糖鎖受容体である等、生化
学的・医学的に非常に利用価値の高い糖鎖であるが、そ
の合成は、酵素法・化学法の何れの方法においても困難
であって、効率的な合成法が確立されていないところか
ら、それらＧｂ₂ 等の天然型糖質リガンドは、高価なも
のとなっているのである。

【０００５】

【解決課題】ここにおいて、本発明は、かかる事情を背
景にして為されたものであって、その解決課題とすると
ころは、安価なトレハロースを利用して、その構造を変
化させることにより、ベロ毒素を捕捉するリガンドを提
供することにあり、またそのようなベロ毒素用リガンド
等の薬剤の基本骨格として利用し得る、ガラクト型トレ
ハロース若しくはその誘導体を製造する方法を、提供す
ることにある。

【０００６】

【解決手段】そして、本発明は、かかる課題の解決のた
めに、２分子のグルコースが結合されてなる構造のトレ
ハロースを出発物質とし、その一方のグルコース部にお
ける４位の水酸基を反転せしめて、アキシャル型配置と
為すことにより、ガラクトース構造を導入することを特
徴とするガラクト型トレハロース若しくはその誘導体の
製造方法を、その要旨とするものである。

【０００７】要するに、このような本発明に従う製造手
法によって、安価なトレハロースから、ガラクトース構
造を導入してなる形態のガラクト型トレハロース若しく
はその誘導体を有利に形成せしめて、ベロ毒素用リガン
ド等の薬剤の基本骨格を与える化合物を有利に得ること
が出来ることとなったのである。

【０００８】また、本発明にあっては、上述せる如き課
題の解決のために、ガラクトースの１分子とグルコース
の１分子とが結合してなる構造の、下記化４：

【化４】 にて表わされるガラクト型トレハロース若しくはその誘
導体からなることを特徴とするトレハロース由来のベロ
毒素用リガンドをも、その要旨としているのである。

【０００９】すなわち、本発明者らの検討によれば、分
子力場計算によって、上記の化４に示される構造におい
て、Ｒ₁ 及びＲ₂ が何れもＯＨ基であるガラクト型トレ
ハロースがα（１−４）ガラクト二糖の分子アナログと
なり得ることが明らかとなったのであり、そしてそれに
よって、そのようなガラクト型トレハロース若しくはそ
の誘導体がＧｂ₂ 糖鎖類似体として機能し、ベロ毒素の
非天然リガンドとなるのである。

【００１０】さらに、本発明は、ガラクトースの１分子
とグルコースの１分子とが結合してなる構造の、下記化
５：

【化５】 にて表わされるガラクト型トレハロース誘導体をも、そ
の要旨とするものであって、それは、また、ベロ毒素用
リガンドとして、或いはその他の薬剤の中間体となり得
るものである。

【００１１】なお、本発明にあっては、かかる化５にて
表わされるガラクト型トレハロース誘導体において、Ｒ
₃ 又はＲ₄ として採用される基である重合性二重結合を
有する有機残基としては、有利には、下記化６：

【化６】 にて示される（Ｉ）乃至（VI）の何れかの基が選択され
ることとなる。

【００１２】そして、本発明にあっては、上記した化５
にて示され、更に有利には化６にて示される有機残基を
有するガラクト型トレハロース誘導体をモノマーとして
用いて、それを単独重合若しくは他の不飽和モノマーと
共重合せしめて得られる重合体からなることを特徴とす
るトレハロース由来のベロ毒素用リガンドをも、その要
旨とするものである。このように、ポリマーに対象とな
る糖をクラスター化せしめることにより、ベロ毒素を捕
捉するリガンドとして、有利に用いられ得ることとなる
のである。

【００１３】

【発明の実施の形態】ところで、かくの如き本発明にお
いて用いられるトレハロースは、よく知られているよう
に、二糖類の１つであって、２分子のＤ−グルコースが
その還元性基同士で結合してなる構造を有するものであ
って、有利には、Ｄ−ガラクトースよりも安価な市販品
として入手し得るものである。

【００１４】そして、本発明にあっては、そのような２
分子のグルコースが結合されてなる構造のトレハロース
を出発物質として用い、その一方のグルコース部におけ
る４位の水酸基を反転せしめて、アキシャル型配置と為
すことによりガラクトース構造を導入せしめることによ
って、目的とするガラクト型トレハロース若しくはその
誘導体が合成されるようにしたものである。

【００１５】具体的には、そのようなガラクト型トレハ
ロース若しくはその誘導体は、例えば図１や図２に示さ
れる如き合成工程に従って、容易に製造され得るのであ
る。そこでは、先ず、トレハロースの一方のグルコース
部における４位の水酸基以外の水酸基に対して、常法に
従って適当な保護基や目的とする誘導体を構成する所定
の置換基を導入せしめた後、或いはそのような保護基や
置換基を導入せしめることなく、かかる一方のグルコー
ス部における４位の水酸基を酸化して、カルボニル基へ
と変換した後、還元操作を実施して、かかるカルボニル
構造を還元することによって、アキシャル型の水酸基が
グルコース部の４位の炭素原子に導入せしめられ得るの
である。そして、そのようなアキシャル型の水酸基を導
入した後、必要に応じて保護基を外したり、或いは必要
な置換基を他の水酸基に対して導入せしめることによ
り、目的とするガラクト型トレハロース若しくはその誘
導体を得ることが出来るのである。

【００１６】因みに、図１に示される合成操作によれ
ば、先ず、トレハロース（１）とベンズアルデヒドジメ
チルアセタールとを反応せしめ、更に、ｔｅｒｔ−ブチ
ルジフェニルクロロシランを反応せしめて、水酸基に保
護基を導入せしめた構造の化合物（３）を合成し、そし
てこの化合物（３）から、一方のグルコース部における
４位の炭素原子に水酸基（エカトリアル型）を導入して
なる構造の化合物（４）を得た後、オキザリルクロリド
を用いて酸化を行ない、該一方のグルコース部の４位の
水酸基をカルボニル基へと変換してなる構造の化合物
（５）を合成する。次いで、かかる化合物（５）を水素
化ホウ素ナトリウムを用いて還元せしめることにより、
一方のグルコース部の４位にアキシャル型の水酸基が導
入せしめられてなる（エカトリアル型水酸基がアキシャ
ル型水酸基に反転せしめられてなる）構造の化合物
（６）が得られるのである。その後、そのような化合物
（６）は、他方のグルコース部における６位の保護基が
水酸基に変換せしめられてなる構造の化合物（７）とさ
れた後、アジド化（８）、更には不飽和基の導入
（９）、更にはポリマー化（１０）の工程に移行せしめ
られるのである。

【００１７】また、図２に示される合成工程において
は、トレハロース（１）から図１におけるモノマー
（９）に至る、簡略化された合成操作が明らかにされて
おり、そこでは、トレハロース（１）に対して、６−ア
ジド−１−ブロモヘキサンを反応せしめて、α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−（１−１）−６−Ｏ−（６−アジド
ヘキシル）−α−Ｄ−グルコピラノシド（１１）を合成
し、そして、この化合物（１１）を（ｎ−Ｂｕ₃ Ｓｎ）
₂ ＯとＢｒ₂ を用いて酸化することにより、一方のグル
コース部の４位の水酸基を酸化せしめて、カルボニル基
と為すことにより、化合物（１２）を合成し、更にそれ
を、Ｐｄ（ＯＨ）₂ ／Ｃ、Ｈ₂ を用いて還元せしめるこ
とにより、α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−１）−
６−Ｏ−６−アミノヘキシル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ド（１３）を合成した後、かかる化合物（１３）とアク
リロイルクロリドを反応せしめることにより、目的とす
る化合物（９）を得ることが出来るのである。

【００１８】そして、上述の如くして、トレハロースに
おける一方のグルコース部の４位の水酸基をアキシャル
型に反転せしめて、ガラクトース構造を導入し、また他
方のグルコース部における４位の水酸基や６位の水酸基
に所望の置換基を導入せしめてなる構造の、前記化４に
て示されるガラクト型トレハロース若しくはその誘導体
が、本発明者らの検討により、Ｇｂ₂ 類似体として機能
し、ベロ毒素の非天然リガンドとなることが明らかとな
ったのである。要するに、かかる化４にて示されるガラ
クト型トレハロース若しくはその誘導体においては、そ
のガラクトース構造と他方のトレハロース部における２
位及び３位の水酸基が設けられてなる構造部分が、グロ
ボ系糖脂質であるＧｂ₂ が有するα（１−４）ガラクト
二糖構造に類似しており、それによって、ベロ毒素を捕
捉するリガンドとして機能することとなるのである。

【００１９】また、本発明にあっては、前記化４にて示
されるガラクト型トレハロース若しくはその誘導体の中
でも、特に、前記化５にて示される重合性のガラクト型
トレハロース誘導体が有用であって、特に、それは、ベ
ロ毒素用リガンド等の薬剤の基本骨格として有利に用い
られ得るのである。

【００２０】なお、そのような化５にて示されるガラク
ト型トレハロース誘導体において、Ｒ₃ 基又はＲ₄ 基と
して導入される重合性二重結合を有する有機残基として
は、ラジカル重合等によって重合せしめられ得る、エチ
レン性二重結合を有する有機の基であれば、公知の如何
なる有機基をも採用し得るものであるが、ここでは、特
に、前記化６にて示される（Ｉ）乃至（VI）の何れかの
基が、有利に採用されることとなる。このような化６に
て示される各基において、Ｒ₅ としての低級アルキル基
は、一般に、炭素数が６程度までのものが対象とされ、
更にｎとしては、２０程度までの整数が採用される。

【００２１】そして、本発明にあっては、上述の如き化
５にて示される重合性のガラクト型トレハロース誘導体
をモノマーとして用いて、それを単独重合せしめること
により、或いはそれと他の不飽和モノマーとの共重合に
より、得られるポリマー（重合体）中に、目的とするガ
ラクト型トレハロース誘導体（対象とする糖）をクラス
ター化して導入せしめ、以てグロボ系糖脂質（Ｇｂ₂ ）
類似体として機能させることにより、ベロ毒素用リガン
ドとして、ベロ毒素の無毒化乃至は解毒用の薬剤とし
て、有利に用いることが出来るのである。

【００２２】ここで、かかる重合性ガラクト型トレハロ
ース誘導体と共重合せしめられる他の不飽和モノマーと
しては、ラジカル重合等が可能な重合性の二重結合を有
する公知の有機化合物の何れもが、適宜に用いられ得る
が、中でも、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−
メチルアクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ジイ
ソプロピルアクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド
類及びそれらの誘導体類；アクリル酸、メタクリル酸、
ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−ヒドロキシ
エチルメタクリレート等の（メタ）アクリル酸及びそれ
らの誘導体類；Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカプ
ロラクタム等のＮ−ビニルラクタム類の如き親水性モノ
マーが有利に用いられ、そのような他の不飽和モノマー
との共重合によって、水可溶性の重合体として形成せし
められることとなる。

【００２３】また、このような重合性ガラクト型トレハ
ロース誘導体の重合、或いはそれと他の不飽和モノマー
との共重合に際しては、従来と同様なラジカル重合操作
等の公知の重合手法が採用され、そして公知の重合触媒
を用いて、適当な媒体中或いは無溶媒下において重合せ
しめられて、目的とする重合体が形成されることとな
る。

【００２４】このように、本発明に従えば、安価なトレ
ハロースを用いて、ベロ毒素用リガンド等の薬剤とし
て、或いはそのような薬剤を与える中間体としてのガラ
クト型トレハロース若しくはその誘導体が有利に製造さ
れ得ると共に、そのようにして得られたガラクト型トレ
ハロース若しくはその誘導体、或いはそれを重合して得
られるポリマーを、ベロ毒素用リガンドとして有利に用
い得るのであり、そこに大きな工業的乃至は実用的な意
義を見出すことが出来るのである。

【００２５】

【実施例】以下に、本発明の実施例を示し、本発明を更
に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、その
ような実施例の記載によって、何等の制約をも受けるも
のでないことは言うまでもないところである。また、本
発明には、以下の実施例の他にも、更には上記した発明
の実施の形態における記述以外にも、本発明の趣旨を逸
脱しない限りにおいて、当業者の知識に基づいて、種々
なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが理
解されるべきである。

【００２６】先ず、トレハロース（１）を出発物質とし
て、図１に示される合成工程に従って、所定のガラクト
型トレハロース誘導体（９）を製造し、更にこのトレハ
ロース誘導体（９）を共重合によって主鎖中に導入せし
めてなる構造の糖鎖高分子（１０）を、以下の操作に従
って得た。

【００２７】Ａ）２´，３´−ジ−Ｏ−ベンジル−４
´，６´−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１−１）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−６
−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−α−Ｄ−グ
ルコピラノシド（３）の合成 トレハロース（１）の二水和物（１０．０ｇ、２６．４
ｍｍｏｌ）とベンズアルデヒドジメチルアセタール
（６．０３ｍＬ、３９．６ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド（２００ｍＬ）に溶解し、ｐ−トルエ
ンスルホン酸一水和物（１．５１ｇ、７．９２ｍｍｏ
ｌ）を加えて、室温で１時間、磁気攪拌した。次いで、
その得られた反応混合物を、トリエチルアミンで中和し
た後、減圧下で溶媒を流去した。そして、その残渣にピ
リジン（１００ｍＬ）、トリエチルアミン（１６．３ｍ
Ｌ、１１９ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルク
ロロシラン（１０．２ｍＬ、３９．８ｍｍｏｌ）を加
え、窒素雰囲気下、室温で、８時間、磁気攪拌した。更
に、その反応混合物を、クロロホルムで希釈した後、有
機層を１規定塩酸水溶液で１回、飽和炭酸水素ナトリウ
ム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄・抽出し、無水
硫酸マグネシウムで乾燥した。有機層をガラスフィルタ
で濾別し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（展
開溶媒：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で分離
・精製して、白色固体である４´，６´−Ｏ−ベンジリ
デン−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−１）−６−Ｏ
−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシド（２）（６．７５ｇ、３８％、二段階におけ
る収率）を得た。

【００２８】その後、かかる得られた化合物（２）
（６．００ｇ、８．９７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド（２０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。
水素化ナトリウム（１．５０ｇ、３７．４ｍｍｏｌ、６
０％ ｉｎ ｏｉｌ）とベンジルブロミド（４．４４ｍ
Ｌ、３７．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間磁気攪
拌した。反応混合物に過剰のメタノールを加え、酢酸エ
チルで希釈した。有機層を飽和食塩水で２回洗浄・抽出
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。更に、かかる有
機層をガラスフィルターで濾別し、減圧濃縮した。残渣
をシリカゲルカラム（展開溶媒：トルエン／酢酸エチル
＝２０／１）で分離・精製して、無色でシロップ状の化
合物（３）（９．４４ｇ、９４％）を得た。

【００２９】Ｂ）２´，３´，６´−トリ−Ｏ−ベンジ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−１）−２，３，
４−トリ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジ
フェニルシリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４）の合
成 前記化合物（３） (５.００ ｇ、４.４７ｍｍｏｌ) と
トリエチルシラン (３.５６ｍＬ、２２.３ｍｍｏｌ）を
ジクロロメタン(１００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し
た後、トリフルオロ酢酸 (１.７０ｍＬ、２２.３ｍｍｏ
ｌ) を加え、２時間磁気撹拌した。反応をトリエチルア
ミンで停止した後、得られた有機層を飽和炭酸水素ナト
リウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回、洗浄・抽出
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。そして、その得
られた有機層を、ガラスフィルターでろ別し、減圧濃縮
した。残渣をシリカゲルカラム (展開溶媒：トルエン／
酢酸エチル＝１０／１) で分離・精製して、無色でシロ
ップ状の、目的とする化合物（４）(３.５６ｇ、７１
％）を得た。

【００３０】Ｃ）２´，３´，６´−トリ−Ｏ−ベンジ
ル−４−オキソ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−
１）−２, ３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−ｔｅ
ｒｔ−ブチルジフェニルシリル−α−Ｄ−グルコピラノ
シド（５）の合成 上記の化合物（４） (３．００ｇ，２．６８ｍｍｏｌ)
とオキザリルクロリド(４６０ｍＬ, ５．３６ｍｍｏｌ)
をジクロロメタン (１００ｍＬ) に溶解し、−６９℃
に冷却した。ジメチルスルホキシド (９５２ｍＬ, １
３．４ｍｍｏｌ)のジクロロメタン溶液 (１０ｍＬ) を
−６０℃を越えないように徐々に滴下し、３０分磁気撹
拌した。トリエチルアミン (２．５７ｍＬ, １８．８ｍ
ｍｏｌ) を滴下し、温度を徐々に室温にしながら、２時
間、磁気撹拌した。水を加え、反応を停止した後、得ら
れた有機層を、飽和食塩水で２回洗浄・抽出し、更に無
水硫酸マグネシウムで乾燥した。そして、この得られた
有機層を、ガラスフィルターでろ別し、減圧濃縮した。
残渣をシリカゲルカラム (展開溶媒：トルエン／酢酸エ
チル＝１５／１) で分離・精製して、無色でシロップ状
の化合物（５） (２．９１ｇ、９７％) を得た。

【００３１】Ｄ）２´，３´，６´−トリ−Ｏ−ベンジ
ル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−１）−２,
３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチ
ルジフェニルシリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（６）
の合成 上記で得られた化合物（５）（２．９１ｇ，２．６０ｍ
ｍｏｌ) をジクロロメタン (２０ｍＬ) とエタノール
(２０ｍＬ) の混合溶媒に溶解し、−７８℃に冷却した
後、水素化ホウ素ナトリウム (４９ｍｇ，２．６０ｍｍ
ｏｌ) を加え、３０分、磁気撹拌した。得られた反応混
合物をクロロホルムに希釈した後、有機層を、水で２
回、洗浄・抽出し、更に無水硫酸マグネシウムで乾燥し
た。かくして得られた有機層を、ガラスフィルターでろ
別し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (展開溶
媒：トルエン／酢酸エチル＝３０／１) で分離・精製し
て、無色でシロップ状の化合物（６） (１．６６ｇ，５
７％) を得た。

【００３２】Ｅ）２´，３´，４´，６´−テトラ−Ｏ
−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−１）
−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシド（７）の合成 上記の化合物（６） (１．５０ｇ，１．３４ｍｍｏｌ)
を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド (１００ｍＬ)に 溶
解し、０℃に冷却した後、水素化ナトリウム (６５ｍ
ｇ，１．６１ｍｍｏｌ) とベンジルブロミド (１９１ｍ
Ｌ，１．６１ｍｍｏｌ) を加え、１２時間、磁気撹拌し
た。得られた反応混合物に、過剰のメタノールを加えた
後、酢酸エチルにて希釈した。有機層を、飽和食塩水で
２回、洗浄・抽出し、その後、無水硫酸マグネシウムで
乾燥した。かくして得られた有機層をガラスフィルター
でろ別し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (展
開溶媒：トルエン／酢酸エチル＝１０／１) で分離・精
製して、無色でシロップ状の４−Ｏ−ベンジル化体
(１．３０ｇ，８０％) を得た。

【００３３】さらに、かかる４−Ｏ−ベンジル化体
(１．２０ｇ，０．９９ｍｍｏｌ) をテトラヒドロフラ
ンに溶解し、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム
(１．９８ｍＬ，１．９８ｍｍｏｌ) を加え、室温で２
４時間、磁気撹拌した。得られた反応混合物を減圧濃縮
した後、残渣をクロロホルムに希釈せしめた。有機層
を、飽和食塩水で２回、洗浄・抽出し、更に無水硫酸マ
グネシウムで乾燥した。かくして得られた有機層を、ガ
ラスフィルターでろ別し、減圧濃縮した。残渣をシリカ
ゲルカラム (展開溶媒：トルエン／酢酸エチル＝５／
１) で分離・精製して、無色でシロップ状の化合物
（７）（１．０７ｇ，８２％）を得た。

【００３４】Ｆ）２´，３´，４´，６´−テトラ−Ｏ
−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−１）
−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−（６−ア
ジドヘキシル）−α−Ｄ−グルコピラノシド（８）の合
成 上記の化合物（７） (５００ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ)
を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド (２０ｍＬ) に溶解
し、水素化ナトリウム (２４ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ)
、ヨウ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム (２２ｍ
ｇ，０．０６ｍｍｏｌ) 、６−アジド−１−ブロモヘキ
サン (１３４μＬ，０．６１ｍｍｏｌ) を加え、室温で
１２時間、磁気撹拌した。得られた反応混合物に、過剰
のメタノールを加えた後、混合物を酢酸エチルに希釈し
た。有機層を、飽和食塩水で２回、洗浄・抽出し、その
後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。かくして得られ
た有機層を、ガラスフィルターでろ別し、減圧濃縮し
た。残渣をシリカゲルカラム (展開溶媒：トルエン／酢
酸エチル＝１０／１) で分離・精製して、無色でシロッ
プ状の化合物（８） (４７０ｍｇ，８４％) を得た。

【００３５】Ｇ）α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−
１）−６−Ｏ−（６−Ｎ−アクリロイルアミドヘキシ
ル）−α−Ｄ−グルコピラノシド（９）の合成 上記で得られた化合物（８） (９７ｍｇ，０．０９ｍｍ
ｏｌ) を、テトラヒドロフラン (５ｍＬ) とメタノール
(５ｍＬ) の混合溶媒に溶解し、１０％水酸化パラジウ
ム炭素 (１０ｍｇ) を加えた後、水素雰囲気下で１．５
時間、激しく磁気撹拌した。得られた反応混合物をセラ
イトろ過し、そのろ液を減圧濃縮した。残渣をメタノー
ル (５ｍＬ) に溶解し、トリエチルアミン (６０μＬ，
０．４４１ｍｍｏｌ) を加えた後、０℃に冷却した。更
に、アクリル酸クロリド（９μＬ, ０．１０６ｍｍｏ
ｌ）のジクロロメタン溶液 (５００μＬ) を滴下し、室
温で２時間、磁気撹拌した。かくして得られた反応混合
物を減圧濃縮し、その残渣をＴＳＫゲルＨＷ−４０Ｓ
（展開溶媒：水) で分離・精製して、無色で液晶状の固
体である目的とする糖鎖モノマー化合物（９）（５１ｍ
ｇ，９１％）を得た。

【００３６】Ｈ）糖鎖高分子（１０）の合成 上記で得られた糖鎖モノマー化合物（９） (３０ｍｇ，
６４μｍｏｌ）とアクリルアミド (１９ｍｇ，２５６μ
ｍｏｌ) を、脱気水 (１００μＬ) に溶解し、２，２−
アゾビス (２−アミジノプロパン) 二塩酸塩 (３．２μ
ｍｏｌ) を加えた。その混合物に対して、凍結脱気を減
圧下で３回行ない、重合試験管内に収容して、減圧下で
封管し、６０℃で１２時間、インキュベートした。その
後、重合試験管を開封し、次いで、反応混合物をイオン
交換水に希釈して、透析チューブ(ＭＷ８０００ ｃｕ
ｔ ｏｆｆ) 内で三日間透析した。水を減圧下で留去し
た後、凍結乾燥して、白色固体である糖鎖高分子（１
０：Ｔｒｅ−Ｇｂ₂ ） (３５ｍｇ，８９．７％）を得
た：

【００３７】数平均分子量Ｍｎ＝３．５×１０⁵ ，(Ｓ
ＥＣ により同定、スタンダード：プルラン、展開溶
媒：ＰＢＳ）。高分子中の糖鎖導入率＝０．１７（ ¹Ｈ
ＮＭＲスペクトルによって決定）。 ¹ＨＮＭＲ（δｐｐ
ｍ，５００ＭＨｚ，Ｄ₂ Ｏ，５０℃）：５．６２ (δ，
２Ｈ，Ｈ−１及びＨ−１´），３．８５−４．５３
（ｍ，１２Ｈ，糖リングのＨ），１．５８，１．９２−
２．０５，ａｎｄ ３．６０（ｂｒ，アルキルスペーサ
のＨ），２．５５−２．８０（ｂｒ，主鎖のメチレング
ループ），２．１０−２．４２（ｂｒ，主鎖のメチレン
グループ）。ＩＲ（ｃｍ ^-1）：３２４８（ＯＨ）, １６
６２（アミド）。

【００３８】Ｉ）赤血球凝集阻害試験 以上のようにして得られた糖鎖高分子（１０：Ｔｒｅ−
Ｇｂ₂ 、Ｇｂ₃ ）に対して、赤血球凝集阻害試験を行な
い、ベロ毒素（Ｓｔｘ−Ｉ、Ｓｔｘ−II）の赤血球に対
する接着阻害能によって、生理活性を評価した。その活
性を、Ｇｂ₂ 、Ｇｂ₃ 又はα−ガラクトースクラスター
を有するアクリルアミド型共重合体と比較した。また、
かかる試験は、多価結合効果を調べるために、各共重合
体に対するモノマーであるｐ−ニトロフェニル（ｐＮ
Ｐ）配糖体（Ｇｂ₂ 、Ｇｂ₃ 、α−ガラクトース）につ
いても行なった。

【００３９】なお、かかる赤血球凝集阻害試験は、ベロ
毒素（Ｓｔｘ）のＰＢＳ溶液（２０μＬ）を、９６穴マ
イクロタイタープレート上で、２倍ずつ希釈し、各穴へ
赤血球のＰＢＳ懸濁液（２０μＬ，１％ｖｏｌ）を加
え、１時間インキュベートした。赤血球を凝集するため
に必要なＳｔｘの最小濃度を決定し、その４倍濃度のＳ
ｔｘ溶液を、以下の阻害試験に使用した。糖鎖又は糖鎖
高分子（Ｇｂ₂ 、Ｇｂ₃、Ｔｒｅ−Ｇｂ₂ 、ラクトー
ス、α−ガラクトース）のＰＢＳ溶液（２０ｍＬ）を、
９６穴マイクロタイタープレートに加え、２倍ずつ希釈
した。そこへＳｔｘのＰＢＳ溶液（２０μＬ）を各穴へ
加え、１時間インキュベートした。各穴へ赤血球のＰＢ
Ｓ懸濁液（２０μＬ）を加え、１時間インキュベートし
た。そして、赤血球の凝集を注意深く観察し、赤血球の
凝集を阻害する糖類又は糖鎖高分子の最小濃度を決定し
た。

【００４０】かかる結果よりして、本発明に従うＴｒｅ
−Ｇｂ₂ として示される糖鎖高分子（１０）がベロ毒素
（Ｓｔｘ−Ｉ、Ｓｔｘ−II）に対して、天然型のＧｂ₂
型共重合体と略同じ阻害能を示すことが、明らかとなっ
た。また、Ｇｂ₃ 型共重合体が最も高い活性を示した
が、本発明に従うＴｒｅ−Ｇｂ₂ の阻害能は、α−ガラ
クトース型共重合体に比べて、明らかに高いものであっ
た。モノメリックなｐＮＰ配糖体は何れも、活性を示さ
なかった（ＭＩＣ＞１０μＬ）ことから、ベロ毒素に対
する結合には、糖鎖クラスターが重要な役割を果たして
いることが示唆された。そして、以上の結果から、ガラ
クト型トレハロースがＧｂ₂ 類似体として機能し、ベロ
毒素の非天然型リガンドとなることは、明らかである。

【００４１】Ｊ）ベロ毒素（Ｓｔｘ−Ｉ）中和活性試験 各Ｓｔｘ−ＩのＰＢＳ溶液に、各糖鎖又は糖鎖高分子
（Ｇｂ₂ 、Ｇｂ₃ 、Ｔｒｅ−Ｇｂ₂ 、ラクトース、α−
ガラクトース）をそれぞれ等モル量加え、３７℃で１時
間、プレインキュベートした。その混合溶液を、Ｈｅｌ
ａ細胞の入ったシャーレに加え、３７℃で３日間、イン
キュベートした。そして、その培地の蛍光強度を測定し
て、細胞の生存率と各糖鎖高分子のＣＤ₅₀（細胞を５０
％生存させるために必要な濃度）を決定し、その結果
を、コントロールとの対比において、図４に示した。

【００４２】かかる図４の結果からも明らかな如く、本
発明に従う糖鎖高分子（１０）であるＴｒｅ−Ｇｂ₂ を
用いた場合であっても、天然型のＧｂ₂ やＧｂ₃ と同様
なベロ毒素（Ｓｔｘ−Ｉ）を捕捉する能力を有し、ベロ
毒素の無毒化の機能を有するリガンドとして利用し得る
ことが、認められるのである。

【００４３】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、安価なトレハロースから有用なガラクト型ト
レハロース若しくはその誘導体を、有利に得ることが出
来るのであり、またそのようなガラクト型トレハロース
若しくはその誘導体は、ベロ毒素を捕捉して、それを無
毒化し得るベロ毒素用リガンドとしての機能を有すると
共に、また、その他の薬剤の出発物質（中間体）として
も、使用され得、更にはそのようなガラクト型トレハロ
ース誘導体を、重合体中に導入して、クラスター化する
ことにより、ベロ毒素用リガンドとして、更に有利に用
いられ得ることとなるのである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に従うガラクト型トレハロース若しくは
その誘導体の製造方法の一つを示す合成工程図である。

【図２】本発明に従うガラクト型トレハロース若しくは
その誘導体の製造方法の他の一つを示す合成工程図であ
る。

【図３】実施例において得られた赤血球凝集阻害試験結
果を示すグラフであって、（ａ）はＳｔｘ−Ｉに対する
結果を示し、また（ｂ）はＳｔｘ−IIに対する結果を示
すものである。

【図４】実施例において得られたベロ毒素中和活性試験
結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古田 有希 愛知県名古屋市昭和区山里町36−15 スタ ーハイツ山里202 (72)発明者 小林 一清 愛知県愛知郡東郷町和合ヶ丘３−13−10 Ｆターム(参考） 4C057 BB03 DD02 JJ09 JJ23 NN10 4C086 AA01 AA02 AA03 EA04 FA03 MA04 NA14 ZC37

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２分子のグルコースが結合されてなる構
   造のトレハロースを出発物質とし、その一方のグルコー
   ス部における４位の水酸基を反転せしめて、アキシャル
   型配置と為すことにより、ガラクトース構造を導入する
   ことを特徴とするガラクト型トレハロース若しくはその
   誘導体の製造方法。
2. 【請求項２】 ガラクトースの１分子とグルコースの１
   分子とが結合してなる構造の、下記化１： 【化１】 にて表わされるガラクト型トレハロース若しくはその誘
   導体からなることを特徴とするトレハロース由来のベロ
   毒素用リガンド。
3. 【請求項３】 ガラクトースの１分子とグルコースの１
   分子とが結合してなる構造の、下記化２： 【化２】 にて表わされるガラクト型トレハロース誘導体。
4. 【請求項４】 前記重合性二重結合を有する有機残基
   が、下記化３： 【化３】 にて示される（Ｉ）乃至（VI）の何れかの基である請求
   項３に記載のガラクト型トレハロース。
5. 【請求項５】 請求項３または請求項４に示されるガラ
   クト型トレハロース誘導体をモノマーとして用いて、そ
   れを単独重合若しくは他の不飽和モノマーと共重合せし
   めて得られる重合体からなることを特徴とするトレハロ
   ース由来のベロ毒素用リガンド。