JP2003160594A - 新規なα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖及びそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】食品への添加や保存においてアミノ酸やタンパ
ク質が損なわれることがなく、食品素材や医薬素材とし
て期待できる新規なα−ガラクトシル基を含む非還元性
二糖及びその簡便な製造方法を提供すること。 【解決手段】下記式（１）及び（２）で表されるα−ガ
ラクトシル基を含む非還元性二糖。 【化１】 【化２】 また、ガラクトース又はガラクトースを含む物質にα−
ガラクトシダーゼを作用させて得られたα−ガラクトシ
ル基を含むオリゴ糖中の還元糖の分解、分離操作からな
る上記（１）のα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖
の製造方法及びガラクトースとグルコースを含む物質に
前記と同様にして得られるα−ガラクトシル基を含むオ
リゴ糖中に混在するＧａｌ１α−１βＧａｌの加水分
解、還元糖の分解、分離操作からなる上記（２）のα−
ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なα−ガラク
トシル基を含む非還元性二糖及びそれらの製造方法に関
し、詳細には、非還元性二糖のＧａｌα１−１βＧａｌ
とＧａｌα１−１βＧｌｃ及びそれらの製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、非還元性二糖の一種であるトレハ
ロース（Ｇｌｃα１−１αＧｌｃ）は非還元性で耐熱・
耐酸性に優れ、アミノ化合物と還元糖との反応に起因す
るメイラード反応によりアミノ酸やタンパク質が損なわ
れることがないなど、食品の加工や保存において他の素
材への悪影響が少ないことが知られている。また、デン
プンの老化、タンパク質の変性、脂質の酸化を抑制する
作用も強い等、食品素材として優れた性質を有してい
る。一方、α−ガラクトシル基を非還元末端に有する糖
質は、天然には三糖のラフィノースやメリビオースが知
られ、強いビフィズス菌選択増殖活性や抗う蝕性の他
に、免疫細胞活性化作用、制がん効果、アトピー性皮膚
炎の改善効果などの様々な生理機能が報告されている。
従って、α−ガラクトシル基を含む非還元性二糖を合成
できれば、叙述のトレハロースの有する諸性質あるいは
ラフィノースやメリビオースなどの有する諸機能を備
え、ひいては優れた食品素材や医薬品素材の提供が期待
できる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、α−ガ
ラクトシル基を含む非還元性二糖は、従来、特開平１０
−３０４８８１号公報に記載されるＧａｌα１−１αＧ
ｌｃがあるのみであり、その他の糖質については知られ
ていない。そこで、本発明は、有用な食品素材や医薬品
素材として期待される新規なα−ガラクトシル基を含む
非還元性二糖を提供すること及びその簡便な製造方法を
提供することを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討し、本発明に想到した。すなわ
ち、本発明は、下記式（１）で表される非還元性二糖に
関する。

【０００５】

【化３】

【０００６】上記非還元性二糖は、ガラクトース又はガ
ラクトースを含む物質に微生物に由来するα−ガラクト
シダーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクト
シル基を含むオリゴ糖を生成させ、該オリゴ糖中の還元
糖の分解後、分離操作することにより製造できる。この
製造方法において、α−ガラクトシダーゼは、脱水縮合
反応の活性に優れるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄
託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）由来のものを用い
ることができる。

【０００７】また、本発明は、下記式（２）で表される
非還元性二糖に関する。

【０００８】

【化４】

【０００９】上記非還元性二糖は、ガラクトースとグル
コースを含む物質に微生物に由来するα−ガラクトシダ
ーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル
基を含むオリゴ糖を生成させ、混在するＧａｌα１−１
βＧａｌの加水分解、さらに前記オリゴ糖中の還元糖の
分解後、分離操作することにより製造できる。この製造
方法において、α−ガラクトシダーゼは、脱水縮合反応
の活性に優れるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番
号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）由来のものを用いるこ
とができる。

【００１０】

【発明の実施の形態】式（１）で表される非還元性二糖
の製造は、まずガラクトース又はガラクトースを含む物
質にα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水縮合反応に
よりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を製造する。ま
た、式（２）で表される非還元性二糖の製造は、まずガ
ラクトースとグルコースを含む物質にα−ガラクトシダ
ーゼを作用させ、脱水縮合反応によりα−ガラクトシル
基を含むオリゴ糖を製造する。

【００１１】α−ガラクトシダーゼを生産する微生物と
しては、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などのカビ
類、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
属などの酵母類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属に属する細菌類等が挙げられるが、アスペルギル
ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物由来の
α−ガラクトシダーゼが好ましい。

【００１２】上記微生物の内、アスペルギルス属カビ類
としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス
・プルベルレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｕｌ
ｖｅｒｕｌｅｎｔｕｓ）、ペニシリウム属カビ類として
は、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ペニシリウム・マルチカラー
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）、
トリコデルマ属カビ類としては、トリコデルマ・ビリデ
（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）が好まし
く、これらの中でもアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）がより好ましい。

【００１３】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中でも、本出願人らにより寄
託されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−７６８０）が特に好ましい。この菌株が生
産するα−ガラクトシダーゼは、脱水縮合反応の活性が
極めて高く、従来α−ガラクトシダーゼの中でも脱水縮
合反応の触媒活性が最も高いことで知られるカンジダ・
ギリエルモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅ
ｒｍｏｎｄｉｉ）Ｈ−４０４株（寄託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１１０６２）の生産するα−ガラクトシダーゼより
α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖が高収量で製造でき
（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６８４８参照）、これに対応し
て式（１）又は式（２）の非還元性二糖を高収量で製造
できる。

【００１４】また、サッカロマイセス属酵母としては、
サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、バチルス属細菌として
は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）が好ましい。

【００１５】上記の各微生物からα−ガラクトシダーゼ
を生産する方法は、通常、固体培養又は液体培養が用い
られる。固体培養の培地としては、小麦ふすま単独ある
いは小麦ふすまに種々の添加物、例えば、きな粉、大豆
粉、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、グルタミン酸、ア
スパラギン酸、ポリペプトン、コーンスティープリカ
ー、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物など
の有機及び無機の窒素化合物などを適宜添加して用いる
ことができる。さらに、適当な無機塩類を加えることも
できる。また、液体培養の培地としては、当該微生物が
良好に成育し、酵素を順調に生産するために必要な炭素
源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培
地又は天然培地が挙げられる。例えば、炭素源として
は、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱
粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα−澱粉あるいはガ
ラクトースを含む物質等の炭水化物が使用できる。具体
例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱
粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロ
ース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース等が挙
げられ、これらを単独で、もしくは２種以上を組み合わ
せて用いることができる。窒素源としては、ポリペプト
ン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカーあるいは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機
窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
の無機塩窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙
げられ、これらを単独で、もしくは２種以上を組み合わ
せて使用できる。無機塩類としては、リン酸１カリウ
ム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム
等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム
塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等を単独で、ある
いは２種以上を組み合わせて用いられる。

【００１６】固体培養の場合には、静置培養で行い、培
地のｐＨを３〜７、好ましくは４〜７に調整したものに
本菌を接種し、１０〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃
で１〜１０日間培養を行う。培養後、その培養抽出物か
らα−ガラクトシダーゼをエタノール沈降などの手段に
より、粗酵素沈殿物として得ることができる。また、液
体培養の場合、培養は振盪培養もしくは通気撹拌培養等
の好気的条件下に行い、培地をｐＨ４〜１０の範囲、好
ましくはｐＨ５〜８の範囲に調整し、温度１０〜４０℃
の範囲、好ましくは、２５〜３７℃で、２４〜９６時間
培養する。培養後、遠心分離、その他の適当な固−液分
離手段で菌体を除去し、培養上清液を得ることができ
る。また、菌体を物理的あるいは酵素的に処理し、菌体
内抽出液を得ることができる。

【００１７】次いで、これらの粗酵素液から硫安塩析処
理法、ゲル濾過処理、疎水クロマトグラフィー処理など
を適宜組み合わせることにより、高純度のα−ガラクト
シダーゼが得られる。

【００１８】α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖の製造
に用いる酵素としては、上記のようにして得た酵素標品
の他に、固体培養の場合は、その抽出液を、液体培養の
場合は、培養上清液又は菌体内抽出液を、そのまま酵素
剤として用いることができる。また、必要に応じて、既
知の方法で精製した酵素も使用できる。また、菌体をそ
のまま酵素剤として利用することも可能である。あるい
は市販酵素剤、例えばセルラーゼ剤やプロテアーゼ剤等
に混在したα−ガラクトシダーゼも使用でき、その場
合、酵素剤をそのまま使用するか、あるいは酵素剤の中
からα−ガラクトシダーゼを種々の既知方法で精製して
使用することもできる。また、これら酵素あるいは酵素
を生産する菌体は、固定化して連続式で、あるいはバッ
チ式で繰り返し反応に利用することも可能である。

【００１９】式（１）の非還元性二糖を製造するために
α−ガラクトシダーゼの反応に供する原料は、ガラクト
ース又はガラクトースを含む物質である。具体的には、
ガラクトース、ガラクトースと他の乳糖などのガラクト
ースを含む化合物の加水分解物などを挙げることがで
き、これらを単独で、もしくは組み合わせて使用でき
る。ガラクトースとしては市販のガラクトースはもちろ
ん、メリビオース、マンニノトリオース、ラフィノー
ス、スタキオース、プランテオース、ベルバスコース、
ガラクタン、ガラクトマンナン、アラビノガラクタン、
ラムノガラクタン、ガラクトリピド、フェルラ酸化ガラ
クトース、ガラクトピニトール、ガラクトシルグリセロ
ール、ガラクチノール、乳糖、ラクチトール、ラクチュ
ロース、ガラクトオリゴ糖などのα−ガラクトシル基あ
るいはβ−ガラクトシル基を含む天然あるいは合成オリ
ゴ糖、配糖体あるいは多糖を酵素（β−ガラクタナー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼな
ど）あるいは酸を使用して加水分解したものから調製し
たガラクトースを使用できる。

【００２０】ガラクトースを含む化合物の加水分解物と
しては、メリビオース、マンニノトリオース、ラフィノ
ース、スタキオース、プランテオース、ベルバスコー
ス、ガラクタン、ガラクトマンナン、アラビノガラクタ
ン、ラムノガラクタン、ガラクトリピド、フェルラ酸化
ガラクトース、ガラクトピニトール、ガラクトシルグリ
セロール、ガラクチノール、乳糖、ラクチトール、ラク
チュロース、ガラクトオリゴ糖などのα−ガラクトシル
基あるいはβ−ガラクトシル基を含む天然あるいは合成
オリゴ糖、配糖体あるいは多糖を酵素（β−ガラクタナ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼな
ど）あるいは酸を使用して加水分解したものをそのまま
使用できる。

【００２１】式（２）の非還元性二糖を製造するために
α−ガラクトシダーゼの反応に供する原料は、ガラクト
ースとグルコースを含む物質が挙げられ、具体的にはガ
ラクトースとグルコースの混合物を適当な比率に混合し
たものや乳糖などのガラクトースとグルコースを含む化
合物を挙げられ、安価な乳糖をβ−ガラクトシダーゼあ
るいは酸によって加水分解した乳糖加水分解物をそのま
ま利用することが好ましい。ガラクトースとグルコース
の比率は特に制限されない。

【００２２】ガラクトースとの結合の相手となるグルコ
ースは、市販のグルコースはもちろん、澱粉、マルトオ
リゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、コージ
オリゴ糖、シクロデキストリン、トレハロース、マルチ
トール、セルロース、セロオリゴ糖、ソホロオリゴ糖、
ラミナリオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖などのα−グルコ
シル基あるいはβ−グルコシル基を含む天然あるいは合
成オリゴ糖、配糖体あるいは多糖を酵素（アミラーゼ、
グルコアミラーゼ、セルラーゼ、α−グルコシダーゼ、
β−グルコシダーゼなど）あるいは酸を使用して加水分
解したものから調製したグルコースを使用できる。

【００２３】α−ガラクトシダーゼは本来加水分解酵素
であるが、基質たる原料のガラクトース濃度を高めれ
ば、加水分解反応の逆反応の脱水縮合反応も触媒するよ
うになる。従って、高濃度のガラクトースにα−ガラク
トシダーゼを作用させた場合、α−（Ｇａｌ）ｎ（ｎは
通常２〜１０の整数、Ｇａｌはガラクトース）の構造式
を有する２糖、３糖、４糖等の多数のオリゴ糖が混在し
た組成物のα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を生成す
る。

【００２４】本発明の式（１）の非還元性二糖のＧａｌ
α１−１βＧａｌは、上記で得られたオリゴ糖中の還元
糖の分解及び分離操作を行うことにより製造できる。オ
リゴ糖中の還元糖の分解は、アルカリ分解により行うこ
とができ、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムな
どのアルカリをオリゴ糖に添加して行うことができ、こ
の分解操作により、Ｇａｌα１−１βＧａｌ以外のオリ
ゴ糖が分解される。アルカリの添加量は、終濃度０．１
〜６．０Ｎが好ましい。また、分離操作は、イオン交換
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、活性炭
カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグ
ラフィーなど既知の分離手段を用いて行うことができる
が、活性炭クロマトグラフィーが好ましい。

【００２５】ガラクトース以外に反応系にグルコースが
存在すれば、ガラクトースとグルコースが結合したα−
（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ（ｎは通常１〜９の整数、Ｇｌｃ
はグルコース）の構造式を有するα−ガラクトシル基を
含むオリゴ糖が生成し、またＧａｌα１−１βＧａｌも
混在する。

【００２６】本発明の式（２）で表される非還元性二糖
のＧａｌα１−１βＧｌｃは、混在するＧａｌα１−１
βＧａｌを加水分解し、さらに上記で得られたα−（Ｇ
ａｌ）ｎ−Ｇｌｃのオリゴ糖中の還元糖の分解及び分離
操作を行うことにより製造できる。Ｇａｌα１−１βＧ
ａｌの加水分解は、酵素を用いて行うことができ、酵素
はβ−ガラクトシダーゼが好ましい。β−ガラクトシダ
ーゼの添加量は、酵素の起源、活性などそれぞれの酵素
に応じた条件を考慮して適宜決定する。また、オリゴ糖
中の還元糖の分解は、アルカリ分解により行うことがで
き、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのア
ルカリをオリゴ糖に添加して行うことができ、この分解
操作により、Ｇａｌα１−１βＧｌｃ以外のオリゴ糖が
分解される。アルカリの添加量は、終濃度０．１〜６．
０Ｎが好ましい。分離操作は、イオン交換クロマトグラ
フィー、逆相クロマトグラフィー、活性炭カラムクロマ
トグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなど
既知の分離手段を用いて行うことができるが、活性炭ク
ロマトグラフィーが好ましい。

【００２７】 なお、上記（１）及び（２）の非還元性
二糖の製造において、酵素反応が進むにつれ、脱水縮合
反応によって合成されたα−ガラクトシル基を含むオリ
ゴ糖が再度α−ガラクトシダーゼによって分解され、糖
転移反応も並行して起こるため、糖転移反応もα−ガラ
クトシル基を含むオリゴ糖の合成に寄与している。ま
た、生成した化合物のガラクトースの結合位置、結合
数、あるいはこれらの化合物の比率は原料のガラクトー
スとグルコースの組成、用いた酵素の由来や反応条件に
より影響を受ける。α−ガラクトシダーゼの反応条件
は、用いる酵素により異なるが、反応ｐＨは３．０〜１
０．０、好ましくは４．０〜９．０の範囲である。反応
温度は、溶解度や反応速度の点から高い方が望ましく、
通常２０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃の範囲であ
る。反応時間は、酵素の使用量によって異なるが、通常
１〜１５０時間である。しかしながら、以上の条件、あ
るいは反応形態のみに限定されるものではない。さら
に、α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を製造するに
は、原料のガラクトースの濃度は高い程良く、ガラクト
ースやグルコースは反応系に析出しても、また、ガラク
トースやグルコースが過飽和状態でも良く、通常５〜１
１０％（ｗ／ｖ）の濃度で用い、好ましくは５０〜１１
０％（ｗ／ｖ）の濃度である。

【００２８】

【実施例】次いで、本発明を実施例を挙げて説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【００２９】参考例１（パラニトロフェニルα−ガラク
トシドを基質とするα−ガラクトシダーゼの活性測定
法） １０ｍＭパラニトロフェニルα−ガラクトシド０．２ｍ
ｌと４０ｍＭの緩衝液（ｐＨは酵素の至適ｐＨに準じ
る）０．２ｍｌにα−ガラクトシダーゼ溶液０．０５ｍ
ｌを添加して、４０℃にて１０分間反応させた。反応
後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム０．５ｍｌを加えて反応を
停止し、遊離したパラニトロフェノール量を分光光度計
にて４００ｎｍの吸光度を計ることにより測定した。酵
素活性１単位（Ｕ）は、この条件で１分間に１マイクロ
モルのパラニトロフェノールを遊離する酵素量とした。

【００３０】参考例２（メリビオースを基質とするα−
ガラクトシダーゼの活性測定法） １０ｍＭメリビオース０．２ｍｌと４０ｍＭの緩衝液
（ｐＨは酵素の至適ｐＨに準じる）０．２ｍｌにα−ガ
ラクトシダーゼ溶液０．０５ｍｌを添加して、４０℃に
て１０分間反応させた。次いで、１００℃で１０分間加
熱して反応を停止させ、生じたグルコース量をロシュ・
ダイアグノスティックス（株）製のＦ−キット（グルコ
ース／フルクトース）あるいは高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）により定量した。酵素活性１単位（Ｕ
^Ｍ）は、この条件下で１分間に１マイクロモルのグルコ
ースを生成する酵素量とした。

【００３１】製造例（α−ガラクトシダーゼの製造） ５％の小麦ふすまを含む液体培地（ｐＨ６．０）９０ｍ
ｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、常法によりオー
トクレーブで殺菌後、アスペルギルス・ニガーＡＰＣ−
９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）を
接種して、２５℃で３日間、前培養（種培養）を行っ
た。ふすま５００ｇに水４００ｍｌを添加して殺菌後、
前培養液１０ｍｌを接種して良く撹拌した後、２５℃に
て４日間、本培養を行った。培養後、ふすま麹を細かく
砕き、水を８Ｌ添加して４℃で一夜抽出した後、濾紙に
て濾過して抽出濾過液を得た。得られた抽出濾過液のα
−ガラクトシダーゼ活性を測定したところ、抽出濾過液
１ｍｌ当たり３単位（Ｕ）であった。抽出濾過液６Ｌを
限外濾過膜（旭化成（株）製ＳＩＰ）で１Ｌまで濃縮
し、７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し
て塩析を行った。続いて、沈殿を遠心分離にて集め、５
００ｍｌの水に溶解し、限外濾過膜で１００ｍｌまで濃
縮し、更に５００ｍｌの水を加えて１００ｍｌまで濃縮
し、この操作を３回繰り返し、脱塩を行った。脱塩後、
凍結乾燥を行い、凍結乾燥粉末（２５０Ｕ／ｇ）を得
た。

【００３２】上記で得られた抽出濾過液に７０％飽和に
なるように硫酸アンモニウムを添加して撹拌した後、４
℃にて一晩放置した。その沈殿を遠心分離にて集め、１
０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した後、限
外濾過膜（旭化成（株）製ＳＩＰ）で濃縮し、再度同緩
衝液を添加して濃縮した。この操作を３回繰り返し、脱
塩を行った。

【００３３】次に、イオン交換クロマトグラフィーを行
うために、同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ル６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラムに供した。続い
て、疎水クロマトグラフィーを行うために、５０％飽和
硫酸アンモニウム中で、ブチル−トヨパール６５０Ｍ
（東ソー（株）製）カラムに供した。活性画分を集め
て、ゲル濾過クロマトグラフィーを行うために、０．３
Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．５）にて平 衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓ（東
ソー（株）製）カラムに供した。これらのカラムクロマ
トによりタンパク質的に均一なα−ガラクトシダーゼを
得た。

【００３４】上記で得られたα−ガラクトシダーゼは、
以下の理化学的性質を有する。 作用 α−ガラクトシド結合を加水分解してＤ−ガラクトース
を遊離する反応を触媒する。 Ｇａｌα１−ＯＲ＋Ｈ_２Ｏ→Ｇａｌ−ＯＨ＋Ｒ−ＯＨ （式中、Ｇａｌα１−ＯＲはα−ガラクトシル基を含む
糖質を、Ｇａｌ−ＯＨは遊離のガラクトースを、Ｒ−Ｏ
Ｈは種々の糖、アルコール及びフェノール類などのヒド
ロキシル基を有する化合物を示す。） 基質特異性 非還元末端にα−ガラクトシル基を有するメリビオー
ス、ラフィノース、スタキオースなどや、パラニトロフ
ェニルα−ガラクトシドに作用する。パラニトロフェニ
ルα−ガラクトシドを基質とした場合の分解速度を１０
０とした場合、メリビオースを分解する相対速度は約９
である 。 至適ｐＨ及びｐＨ安定性 至適ｐＨは２．５〜６．０である。また、４０℃で１時
間放置した場合、ｐＨ３．５〜８．０の範囲で安定であ
る。 至適温度及び温度安定性 ｐＨ４．５（酢酸緩衝液）における至適温度は６０℃で
ある。また、ｐＨ４．５（酢酸緩衝液）で１５分間放置
した場合、６０℃まで安定である。 分子量及び等電点 ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−２００カラム（（株）ワ
イエムシィ製）を用いたゲル濾過法で測定した分子量は
２１７，０００で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量
は１１７，０００である（図１及び図２）。また、等電
点電気泳動法により測定した等電点は４．２である。本
酵素は、これまでに報告されているアスペルギルス・ニ
ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の生産す
るα−ガラクトシダーゼの７２，０００及び６９，００
０（いずれもＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に比べ、分子量が大き
いことに特徴を有する。

【００３５】実施例１（式（１）のＧａｌα１−１βＧ
ａｌの製造） ガラクトース（和光純薬工業（株）製）６０ｇと製造例
で得られたα−ガラクトシダーゼ２，１００Ｕ^Ｍを含む
ｐＨ４．５の酢酸緩衝液１００ｍｌ（ガラクトース濃度
６０％（ｗ／ｖ）、酵素濃度３５Ｕ^Ｍ−ガラクトース）
を調製し、５０℃にて３０時間反応させた。反応の経時
変化を図３に示す。反応液を活性炭カラムに負荷し、水
にてガラクトース、エチルアルコール０〜３０％の濃度
勾配にてオリゴ糖を溶出した。オリゴ糖溶出画分を濃縮
乾燥してα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を２４ｇ得
た。このオリゴ糖は、α−ガラクトシダーゼあるいは酸
で加水分解すると、ガラクトースのみ生成した。なお、
α−ガラクトシダーゼの中でも脱水縮合反応の触媒活性
が最も高いことで知られるカンジダ・ギリエルモンディ
ー（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）
Ｈ−４０４株の生産するα−ガラクトシダーゼを用いて
上記と同様の条件でオリゴ糖を製造したところ、収量は
１４ｇで製造例で得られたα−ガラクトシダーゼの収量
が優れていた。

【００３６】次いで、上記で得られたオリゴ糖１０ｇを
脱塩水９０ｍｌに溶解後、２．０Ｎ水酸化ナトリウムを
１０ｍｌ添加し、１００℃で３０分処理し還元糖のみを
分解させた。塩酸で中和後、その処理液を活性炭カラム
に供し、ピークａを検出・分取した。得られたピークａ
画分を^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲで構造解析を行っ
たところ、ピークａは非還元性二糖のＧａｌα１−１β
Ｇａｌであることが確認された。帰属データを表１に示
す。なお、数値はＴＰＳを内部標準とした時の化学シフ
ト値（δ）を、括弧内の数値は結合定数を記した。

【００３７】

【表１】

【００３８】実施例２（式（２）のＧａｌα１−１βＧ
ｌｃの製造） 乳糖（和光純薬（株）製）１００ｇを市販のβ−ガラク
トシダーゼ（ノボザイム（株）製ラクトザイム）によっ
て加水分解し、ガラクトースとグルコースの等量混合物
を得た。このガラクトースとグルコースの等量混合物８
５ｇと上記の製造例で得られたα−ガラクトシダーゼ
１，５００Ｕ^Ｍを含むｐＨ４．５の酢酸緩衝液１００ｍ
ｌ（糖度８５％（ｗ／ｖ）、酵素濃度３５Ｕ^Ｍ／ｇ−ガ
ラクトース）を調製し、５０℃にて８７時間反応させ
た。反応液から活性炭カラムクロマトグラフィーにより
α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖２７ｇを得た（カン
ジダ・ギリエルモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌ
ｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｈ−４０４由来のα−ガラクト
シダーゼの場合は１６ｇ）。このα−ガラクトシル基を
含むオリゴ糖は、酸やα−ガラクトシダーゼにより加水
分解すると、ガラクトースとグルコースのみ生成した。

【００３９】次いで、上記で得られたオリゴ糖はＧａｌ
α１−１βＧａｌが混在していることから、精製を容易
にするため本オリゴ２０ｇを１００ｍｌの２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、４５，０００ＬＡＵ
（ノボザイム（株）ラクターゼ単位）となるようにβ−
ガラクトシダーゼ（ノボザイム（株）製ラクトザイム）
を添加し、さらに液量が１８０ｍｌとなるように２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を添加した。この溶液を
４０℃で２４時間処理し、Ｇａｌα１−１βＧａｌをＤ
−ガラクトースに加水分解した。さらに、β−ガラクト
シダーゼ処理液に２．０Ｎ水酸化ナトリウムを２０ｍｌ
添加し、１００℃で３０分し還元糖のみを分解させた。
塩酸で中和後、その処理液を活性炭カラムに供し、ピー
クａを検出・分取した。得られたピークａ画分を^１Ｈ−
ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲで構造解析を行ったところ、ピ
ークａは非還元性二糖のＧａｌα１−１βＧｌｃである
ことが確認された。帰属データを表２に示した。なお、
数値はＴＰＳを内部標準とした時の化学シフト値（δ）
を、括弧内の数値は結合定数を記した。

【００４０】

【表２】

【００４１】

【発明の効果】本発明の式（１）及び式（２）で表され
る新規な非還元性二糖は、アミノ化合物と還元糖との反
応に起因するメイラード反応によりアミノ酸やタンパク
質が損なわれることがないので、食品の加工や保存にお
いて他の素材への悪影響が少ない食品素材として期待さ
れ、また、医薬素材として期待される。また、本発明の
新規な非還元性二糖の製造方法は、アスペルギルス・ニ
ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰＣ−
９３１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８０）に由来するα
−ガラクトシダーゼを用いることにより、上記の各非還
元性二糖を高収量で製造でき、しかもこの酵素は有機発
酵や種々の食品用酵素剤の給源として利用されており安
全性にも優れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】製造例で得られたα−ガラクトシダーゼの分子
量をＨＰＬＣで測定した際の検量線を示す図である。

【図２】製造例で得られたα−ガラクトシダーゼの分子
量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した結果を示す図である。

【図３】ガラクトースを原料とする脱水縮合反応の経時
変化を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 橋本 博之 大阪府三島郡島本町水無瀬２−８−２− 404 (72)発明者 藤田 孝輝 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13−46 株式 会社横浜国際バイオ研究所内 (72)発明者 原 耕三 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13−46 株式 会社横浜国際バイオ研究所内 (72)発明者 岡田 正通 岐阜県各務原市須衛町４丁目179番35 天 野エンザイム株式会社岐阜研究所内 (72)発明者 森 茂治 岐阜県各務原市須衛町４丁目179番35 天 野エンザイム株式会社岐阜研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AF03 BH04 BH05 CA21 CD09 CE10 DA10 4C057 AA02 BB03

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式（１）で表されるα−ガラクトシル
   基を含む非還元性二糖。 【化１】
2. 【請求項２】ガラクトース又はガラクトースを含む物質
   に微生物に由来するα−ガラクトシダーゼを作用させ、
   脱水縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖
   を生成させ、該オリゴ糖中の還元糖の分解後、分離操作
   することを特徴とする請求項１記載のα−ガラクトシル
   基を含む非還元性二糖の製造方法。
3. 【請求項３】α−ガラクトシダーゼが、アスペルギルス
   ・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由
   来のものである請求項２記載のα−ガラクトシル基を含
   む非還元性二糖の製造方法。
4. 【請求項４】α−ガラクトシダーゼが、アスペルギルス
   ・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＡＰ
   Ｃ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８
   ０）由来のものである請求項３記載のα−ガラクトシル
   基を含む非還元性二糖の製造方法。
5. 【請求項５】オリゴ糖中の還元糖の分解が、アルカリを
   用いることを特徴とする請求項２〜請求項４のいずれか
   記載のα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製造方
   法。
6. 【請求項６】アルカリが、水酸化ナトリウムである請求
   項５記載のα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の製
   造方法。
7. 【請求項７】下記式（２）で表されるα−ガラクトシル
   基を含む非還元性二糖。 【化２】
8. 【請求項８】ガラクトースとグルコースを含む物質に微
   生物に由来するα−ガラクトシダーゼを作用させ、脱水
   縮合反応によりα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖を生
   成させ、混在するＧａｌα１−１βＧａｌの加水分解、
   さらに前記オリゴ糖中の還元糖の分解後、分離操作する
   ことを特徴とする請求項７記載のα−ガラクトシル基を
   含む非還元性二糖の製造方法。
9. 【請求項９】α−ガラクトシダーゼが、アスペルギルス
   ・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由
   来のものである請求項８記載のα−ガラクトシル基を含
   む非還元性二糖の製造方法。
10. 【請求項１０】α−ガラクトシダーゼが、アスペルギル
    ス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）Ａ
    ＰＣ−９３１９株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７６８
    ０）由来のものである請求項９記載のα−ガラクトシル
    基を含む非還元性二糖の製造方法。
11. 【請求項１１】混在するＧａｌα１−１βＧａｌの加水
    分解が、β−ガラクトシダーゼにより行うことを特徴と
    する請求項８〜請求項１０のいずれか記載のα−ガラク
    トシル基を含む非還元性二糖の製造方法。
12. 【請求項１２】オリゴ糖中の還元糖の分解が、アルカリ
    を用いることを特徴とする請求項８〜請求項１１のいず
    れかに記載のα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖の
    製造方法。
13. 【請求項１３】アルカリが、水酸化ナトリウムである請
    求項１２記載のα−ガラクトシル基を含む非還元性二糖
    の製造方法。