JP3601618B2 - ラミナリペンタオース生産酵素の製造方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明はβ−1,3グルカナーゼの一種である、ラミナリペンタオース生産酵素の製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ラミナリペンタオース(以下LPと略記する)の製造方法は化学的分解法と酵素的分解法に大別される。前者の方法は、β−1,3結合を有する多糖類のβ−1,3グルカンを硫酸等の酸類により加水分解して、目的とするLPのみをクロマトグラフィー等により得る方法である。しかしこのような方法は、糖鎖をランダムに切断するために重合度の異なるオリゴ糖が大量に生成し、LPの収率は極めて低く、その精製工程も様々なクロマトグラフィーなどの手法を必要とする為、非常に煩雑で手間がかかり非効率的である。
【0003】
一方後者の方法は、重合度の異なるオリゴ糖の生成を抑制し、極めて高い収率でLPを生成できること、またそのためにLPの分離精製が容易であるとの利点を有する。β−1,3グルカンからLPを生産するLP生産酵素は、本発明者らにより特公平4−37719号公報としてストレプトマイセス(Streptomyces)属の放線菌により製造できることが知られている。該公報ではストレプトマイセス マテンシス DIC−108(Streptomyces Matensis DIC−108)菌株を所定の液体培地(pH7.0)に接種し、培養中のpH調整はせずに、培養温度35℃で3日間培養することによってLP生産酵素を得ていた。しかしこの方法によると、酵素生産量は発酵液1Lあたり397単位(酵素力価)であり、該酵素量はその定義よりβ−1,3グルカンからLPを1時間当たり2g生成する量にすぎず、工業化のためには酵素生産量を飛躍的に高める必要がある。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
LPは食品添加物、化粧品・医薬基剤などへの利用や、近年抗腫瘍活性や植物におけるエリシター活性について研究が進められており注目を集めている。またLPの誘導体が抗ウイルス活性を示すことも知られており、各種医薬品原料またはその中間体として大量かつ高純度の生産が切望されている。従って、本発明の目的は酵素法によってLPを工業規模で大量生産するために必要な、LP生産酵素を効率的に製造することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは酵素生産のための培養条件について鋭意研究を重ねた結果、菌体を培養するにあたり、特定のpH、及び/または特定の培養温度とすることにより、酵素の生産性を従来の方法よりもはるかに高いレベルにすることに成功した。
【0006】
即ち本発明は、ストレプトマイセス属に属し、ラミナリペンタオース生産酵素を生産するストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)を培養し、ラミナリペンタオース生産酵素を製造する方法であって、(1)該菌株の培養をpH7〜pH9に保ちながら行うことを特徴とする製造方法及び、(2)該菌株の培養温度を39℃〜43℃とすることを特徴とする製造方法に関する。
【0007】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明で用いるストレプトマイセス マテンシス DIC−108(Streptomyces Matensis DIC−108)菌株とは、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研条寄第253号(FERM BP−253)として国際寄託されているストレプトマイセス エスピ−DIC−108(Streptomyces sp DIC−108)と同一である。また本発明で用いる菌株としては、該菌株を人工的に変異処理、例えば化学、物理的手段による変異誘発処理又は遺伝子組み替え体の創出を行うことにより得られる人為的突然変異体、あるいは自然変異株も含まれる。以下これらをまとめて本菌株とする。
【0008】
本菌株から生産されるラミナリペンタオース生産酵素(以下LPHaseと略記する)とはβ−1,3グルカナーゼの一種であり、β−1,3グルカンを加水分解し、ラミナリペンタオース(LP)を高収率で生成する酵素である。
【0009】
ここでいうβ−1,3グルカンとは、例えばカードラン、パキマン、ラミナリン、酵母細胞壁等に含まれるグルコースがβ−1,3グリコシド結合している多糖である。またLPとはグルコースがβ−1,3グリコシド結合でつながっている重合度が5の直鎖状オリゴ糖であり、O−β−D−グルコピラノシル−(1→3)−O−β−D−グルコピラノシル−(1→3)−O−β−D−グルコピラノシル−(1→3)−O−β−D−グルコピラノシル−(1→3)−β−D−グルコピラノシドで表される化合物である。
【0010】
以下に本発明によるLP生産酵素製造のための本菌株の培養方法について述べる。
培地は通常の固体培地又は液体培地を使用することができ、培養に用いる炭素源としてはD−グルコース、D−ガラクトース、D−フルクトース、L−アラビノース、D−キシロース、イノシトール、L−ラムノース、D−マンニトール、シュークロース、ラクトース等の単糖類、少糖類及び糖アルコール類、あるいはグリセリン等の多価アルコール類等を使用することができる。また、廃糖蜜、デンプン分解物、チーズホエーなどの農産廃棄物の利用も可能である。これら炭素源の使用濃度としては、培地あたり0.1重量%〜50重量%が好ましい。
【0011】
酵素生産の為の誘導基質にはα−1,4、α−1,6グリコシル化合物であるデンプンや、β−1,4グリコシル化合物であるセルロース、あるいはそれらの部分分解物なども使用できるが、酵素生産性を高めるためにはβ−1,3グリコシル化合物が望ましい。β−1,3グリコシル化合物としては例えばラミナリビオース、ラミナリトリオース等のオリゴ糖類や、カードラン、パキマン、ラミナリン、リケナン、酵母細胞壁又はその部分分解物、リュウコシン、カロース、パラミロン等の多糖類等が挙げられ、好ましくはカードランが挙げられる。これらの使用濃度としては、培地当たり0.1重量%〜10重量%が好ましい。これらの酵素誘導基質は通常培地作製時に他の培地成分と同じように培地中に添加して加熱殺菌することができるが、カードランのように加熱時に凝固するもの、あるいは他の培地成分と反応し着色するオリゴ糖等は別殺菌してから、別途培地に添加するのが望ましい。これらの酵素誘導基質は培養開始時に添加することも、培養途中に添加することもできる。また本菌株は酵素誘導基質であるこれらのオリゴ糖類や多糖類を炭素源にして生育することも可能なので、その場合は炭素源を添加することなく酵素生産が可能となる。
【0012】
培地に用いる窒素源としてはポリペプトン、乾燥酵母、乾燥酵母エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー、麦芽エキス、カゼイン、オートミール、味液、魚粉、ポテトエキス、硫安、塩安、リン安、硝酸ナトリウム、尿素等、有機窒素、無機窒素等を使用することができる。これら窒素源の使用濃度としては0.1重量%〜10重量%の範囲が望ましい。
【0013】
無機物としてはリン酸カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム等のリン酸塩又はそのナトリウム塩、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩又はそのカリウム塩、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等の無機塩等が使用でき、これらの成分を複数用いることも可能である。その他、必要に応じてビタミン類及び重金属類等を添加することもできる。これら無機物の使用濃度としては0.05重量%〜1重量%が好ましい。また発酵中の発泡を抑制するために0.0001重量%〜0.5重量%の消泡剤を添加しても良い。消泡剤としては、ポリアルキレングリコール系、シリコーンエマルジョン系、アセチレン系、植物あるいは動物油脂系等通常の消泡剤が使用できる。
【0014】
培養は通常通気攪拌、振盪等による好気的条件下で行うのが好ましいが、静置条件下で行うこともできる。例えば液体培養の場合は振盪培養、通気攪拌培養等の好気的液体培養が適しておりジャーファーメンターを使用する場合には通気量0.2vvm〜2vvm、好ましくは0.8vvm〜1.2vvm、攪拌回転数100rpm〜1000rpm、好ましくは400rpm〜600rpmの範囲で培養を行うことが望ましい。
【0015】
本発明において培養液のpH及び/または温度管理は重要である。
本菌体を培養する際に、中性培地を用いた場合でも、通常培養液のpHは培養初期においては低下傾向にあり、pH5程度の酸性になるが、培養後期には上昇傾向にあり、最終的にはpHが8.5程度のアルカリ性になる。本菌体の培養時、培養液が酸性側に移行することは酵素の生産量が低くなり好ましくない。例えば35℃で培養した場合、酵素生産量が反応開始から36時間で頭打ちになってしまう(図1参照)。従って、培養初期にはアルカリ溶液を適宜添加して、弱アルカリ側に保つ必要がある。従って、本発明の培養は適時アルカリまたは酸溶液を添加して中性から弱アルカリ性、好ましくはpHを7〜9、より好ましくは7.5〜8.5の範囲に保ちながら行う。特に好ましくは適宜アルカリ又は酸溶液を培養液に添加して、pHを一定の値とし、できるだけpH値を変動させないように調整することが良い。従って、pH7〜9、好ましくは7.5〜8.5の間の設定値に調節しながら培養を行うことがより望ましい。このようにすることで、同じ温度でpHを無調整にした場合に比べて、酵素生産量が3倍以上になる。
【0016】
本発明で使用できる酸溶液としては、硫酸、塩酸、硝酸等の無機酸の他、酢酸、乳酸等の有機酸も使用することができる。また本発明で使用できるアルカリ溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液、アンモニア水等を使用することができる。pHを上記の範囲に保ちながら培養する場合、培養は20〜50℃で行えるが、好ましくは30〜43℃であり、より好ましくは35〜43℃、特に好ましくは39℃〜41℃である。
【0017】
更に本菌体を培養する際に、培養温度を39〜43℃、好ましくは39〜41℃の範囲に調節することにより、培養液のpHを無調整で行った場合でも、35℃で培養した場合と比べて酵素生産量が6倍以上になる。培養温度はできるだけ変動させないように調整することが望ましい。従って39℃〜43℃、好ましくは39〜41℃の間の設定値に調節しながら培養を行うことが望ましい。温度を上記の範囲で培養する場合、培養液のpHは無調整であっても良いが、好ましくはpH7〜9、より好ましくは7.5〜8.5の範囲に保ちながら、特に好ましくはこれらの範囲の間の設定値に調節しながら培養することが好ましい。
【0018】
また、培養の方法は、回分培養、連続培養、半連続培養、流加培養等のいずれの方法でも行うことができ、培養時間は培養方法や培養温度、接種菌体量、必要とするLPHase量によっても異なるが、回分培養の場合、通常1日〜5日程度、好ましくは2日〜3日である。
【0019】
培養終了後培養物からLPHaseを採取する方法としては、LPHaseが菌体外に生産される酵素であるので、培養終了後、培養液から菌体を、遠心分離又は膜濾過等の一般に用いられる方法により分離することで、その菌体及び培養濾液からLPHaseを採取することができる。酵素を菌体中からも回収する場合は超音波処理、溶菌酵素処理、ガラスビーズによる破砕処理などを行い酵素を菌体外に取り出す。このとき必要があれば、界面活性剤等を添加しLPHaseの回収率を高めることもできる。
【0020】
培養液の遠心分離上清画分及び菌体から採取した酵素は、一般に用いられる精製法、例えば塩析法、有機溶媒添加による沈殿法、限外濾過法、イオン交換樹脂による吸着法等を単独で、あるいは適宜組み合わせて精製することができる。塩析法は例えば、硫安、硫酸ナトリウム等によって塩析した沈殿を、濾別あるいは遠心分離後、脱塩して凍結乾燥品を得る。沈殿法は例えばアセトン、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の有機溶剤を加え、酵素を沈殿物として取得し、乾燥、保存する。また、限外濾過膜法は例えばボルテックスフロー濾過装置(メンブレックス社製)等を用いて濃縮し緩衝液置換後、脱塩、凍結乾燥する。イオン交換樹脂法は例えばストリームラインSP、DEAE(ファルマシア社製)等の樹脂に液中の酵素蛋白を直接吸着させる方法である。
【0021】
酵素を更に精製するためには、例えばDEAE−セルロース、CM−セルロースを用いるようなイオン交換クロマトグラフィー、あるいはセファデックスG−100(ファルマシア社製)によるゲル濾過クロマトグラフィー等を単独であるいは併用して精製すればよい。
【0022】
なお、本発明の方法によれば、酵素の濃度及び純度が高いので、特に精製することなく培養液をそのままの状態で、あるいは菌体を除去した培養液を、LP生成反応のための酵素源として使用することができる。また、遠心分離によって集菌した菌体を緩衝液に再分散して酵素源として使用することもできる。本菌株から生産されるLPHaseからLPを製造する方法は、特公平4−37719号公報に詳述されている。
【0023】
【実施例】
以下実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。文中「部」及び「%」は重量基準であるものとする。また本実施例中で測定した酵素力価の定義を以下に記載する。
(酵素力価の決定)
10mMの酢酸緩衝液(pH6.0)にカードラン1%を懸濁させ、それに適量の酵素を加えて水で5.0mlとし、45℃で反応させる。1時間に1mgのグルコースに相当する還元力を生成する酵素量を1単位とする。
【0024】
実施例1
ポリペプトン(牛乳カゼインの酵素分解物、和光純薬工業株式会社販売)0.2%、酵母エキス(オキソイド社製、関東化学株式会社販売)0.2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4・7H2O 0.1%からなる液体培地(pH7.0)2.5Lを(株)丸菱バイオエンジ製MDL−5Lジャーファーメンターに仕込み、121℃、30分湿熱殺菌した。培地の温度が常温に下がったところで同条件であらかじめ湿熱殺菌しておいたグルコース(和光純薬工業株式会社販売)と180℃、1時間の条件で乾熱殺菌しておいた酵素誘導基質であるカードラン(武田薬品工業株式会社販売)をそれぞれ0.5重量%となるように添加し、その後、35℃で2日間振盪培養しておいたストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)の培養液を2.5ml接種した。培養液のpHは培養開始時から終了時まで5Nの水酸化ナトリウム溶液及び2N硫酸水溶液を適宜添加する事により8に調整した。pH計測にはインゴールド社製pH複合電極(タイプ:405−DPAS−SC−K8S/325)を使用し、pH制御には(株)丸菱バイオエンジ製バイオプロセスコントローラー MDIACタイプS3を使用した。回転翼はバッフルタービン型を使用し攪拌回転数500rpm、空気通気量1vvm、培養温度35℃で2日間培養した。その結果得られた酵素の生産量は3186単位/L培養液であった。結果を表1に記載する。
【0025】
実施例2
実施例1において、培養温度を40℃とした以外は、実施例1と同様にストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は7938単位/L培養液であった。結果を表1に記載する。
【0026】
実施例3
実施例1において、培養pHを7とした以外は、実施例1と同様にストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は1998単位/L培養液であった。結果を表1に記載する。
【0027】
実施例4
実施例1において、培養pHを9とした以外は、実施例1と同様にストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は1188単位/L培養液であった。結果を表1に記載する。
【0028】
実施例5
実施例1において、培養温度を30℃とした以外は、実施例1と同様にストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は2376単位/L培養液であった。結果を表1に記載する。
【0029】
実施例6
実施例1において、pHを無調整、培養温度を39℃とした以外は、実施例1と同様にストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は2779単位/L培養液であった。結果を表1に記載する。
【0030】
比較例
実施例1において、pHを無調整とした以外は実施例1と同様にストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)を培養して得た培養液から酵素液を得た。その結果、得られた酵素の生産量は397単位/L培養液であった。結果を表1に記載する。
【0031】
【表1】
【0032】
【発明の効果】
本発明の製造方法によれば、従来生産量がきわめて微量であったLPHaseを大量に生産することが可能であり、LPの工業生産上きわめて有利である。
【図面の簡単な説明】
【図1】35℃、pH無調整で培養したときの、pH及び酵素生産量の経時変化を表したグラフである。
Claims (3)
- ストレプトマイセス属に属し、ラミナリペンタオース生産酵素を生産するストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)を、pH7〜pH9に保ちながら培養することを特徴とするラミナリペンタオース生産酵素の製造方法。
- 菌株の培養を30℃〜43℃の培養温度で行うことを特徴とする請求項1記載のラミナリペンタオース生産酵素の製造方法。
- ストレプトマイセス属に属し、ラミナリペンタオース生産酵素を生産するストレプトマイセス マテンシス DIC−108菌株(微工研条寄第253号)を、39℃〜43℃で培養することを特徴とするラミナリペンタオース生産酵素の製造方法。
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