JP3656762B2 - ラミナリトリオースの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
食品の甘味剤、増量剤、賦形剤、包括剤として食品、医薬品及び種々の工業製品に利用可能であり、抗腫瘍活性、抗細菌感染症作用、免疫系に及ぼす作用等を有する医農薬品の中間体として有用なラミナリトリオースを製造することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでラミナリトリオース（グルコースがβ−１，３グリコシド結合で３糖つながっている糖）は、グルコースがβ−１，３位で結合している部分を有する多糖、例えばパキマンやラミナリンを酸で加水分解した後クロマト的に分離する方法により得られている。しかしこのように分解したものはオリゴ糖混合物となり、この中からラミナリトリオースを得るには、現在最も有効とされる活性炭クロマトグラフィーにより分画する方法によっても、分離に手間がかかる上、高純度のオリゴ糖を得ようとすると回収のロスが多いという欠点がある。
【０００３】
例えば、酸による加水分解は特開平２−２４３６９７号公報に開示されているように制限条件下においても、単一のオリゴ糖純度を２０％以上にすることは困難である。
【０００４】
一方、本願発明者を含む発明者によるレバウディオサイドＡの製造法（特開昭６２−１４６５９９号公報）において、ラミナリペンタオース （グルコースがβ−１，３グリコシド結合で５糖つながっている糖）にエキソタイプのβ−１，３グルカナーゼを作用させることでグルコースとラミナリトリオースが生成されることは知られているが、そこからラミナリトリオースを単独で採取することは開示されておらず、ラミナリペンタオースにエキソ型β−１，３グルカナーゼを作用させる方法は、あらかじめラミナリペンタオースを得る操作が必要な上、反応速度が遅いので効率的ではない。
【０００５】
又、酵素による選択的な方法としては高純度のラミナリビオースの製造法（特開昭５９−１６２８９７号公報）やラミナリペンタオースの製造法（特公平４−３７７１９号公報）が公知となっているがこれらの酵素からはラミナリトリオースは生成されない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、高純度のラミナリトリオースを効率的に製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、効率的にラミナリトリオースを製造する方法を鋭意研究した結果、糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物に、これらの糖化合物に作用して糖鎖が４糖以上のオリゴ糖を生成させるβ−１，３グルコシル糖分解酵素を作用させた後か、もしくは同時にエキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素を作用させると速やかに最終分解物としてグルコースとラミナリトリオースを蓄積するため、簡便な方法でラミナリトリオースを分離精製できることを見いだし本発明を完成した。
【０００８】
即ち本発明は、糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物に、これら糖化合物に作用してグルコースを遊離させる能力を有するエキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素及び、４糖以上のオリゴ糖を遊離する能力を有するβ−１，３グリコシル糖分解酵素を作用させて得る事をと特徴とするラミナリトリオースの製造方法を提供するものである。
【０００９】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明で言う糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物（以下単にβ−１，３グリコシル糖化合物と称する）とは、β−１，３位で結合されたグルコース（即ちβ−１，３グルコシド結合をしたグルコース）の重合度が少なくとも５糖以上、好ましくは６糖以上の糖化合物であれば、β−１，３グリコシル糖鎖が主鎖にあるものでも、側鎖にあるものでも良い。例えばβ１，３−グリコシル結合を有するオリゴ糖類、多糖類、配糖体、糖脂質、糖蛋白等が挙げられ、またこれらの部分分解物も用いる事ができる。本目的のためにはβ−１，３グリコシル糖を主鎖又は側鎖に有するオリゴ糖または多糖が好ましい。オリゴ糖としては例えば、β−１，３グルコシド糖鎖のみからなるいわゆるラミナリオリゴ糖がより好ましい。多糖類としては、重合度が５糖以上、好ましくは６糖以上のβ−１，３グルコシル結合を有するものであればいずれの多糖類であっても良いが、例えば、カードラン、ラミナリン、パキマン、酵母細胞壁等が比較的長いβ−１，３グルコシド結合を有しているのでより好ましい。
【００１０】
次に、本発明に使用する酵素について説明する。本発明で用いるエキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素（以下単にエキソ型分解酵素と称する）とは、上記で述べたβ−１，３グリコシル糖化合物に作用してグルコースを遊離させる能力を有し、しかもラミナリトリオースに対しては作用しないか非常に作用しにくい酵素であればいかなる酵素でも良く、微生物、動物及び植物のいずれの起源からのものであっても良い。好ましくはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が生産する酵素が挙げられ、特に好ましくはストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）が生産する酵素が挙げられる。
【００１１】
又、他の好ましいものとしては上記の菌株を人工的に変異処理即ち化学、物理的手段による変異誘発処理を行うことにより得られる人為的突然変異株、あるいは自然変異株等から得られる酵素もすべて含まれる。
【００１２】
糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物に作用して４糖以上のオリゴ糖を生成する能力を有するβ−１，３グルコシル糖分解酵素（以下オリゴ糖生成酵素と称する）は、このような能力を有する酵素であればエンド型であってもエキソ型であってもいずれでも良く、微生物、動物及び植物のいずれの起源のものからであっても本発明を完成することができる。オリゴ糖分解酵素は分解の対象となるβ−１，３グリコシル糖化合物の重合度より小さい糖に分解する酵素であり、４糖に近い重合度のオリゴ糖を遊離する能力を有するものが効率的にラミナリトリオースを製造できるため好ましい。好ましくは５糖に分解する酵素が挙げられ、特にストレプトマイセス属に属する微生物が生産する酵素が好ましく、その中でもストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）より生産される酵素が特に好ましい。
【００１３】
又、他の好ましいものとしては上記の菌株を人工的に変異処理即ち化学、物理的手段による変異誘発処理を行うことにより得られる人為的突然変異株、あるいは自然変異株等から得られる酵素もすべて含まれる。
【００１４】
このストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）は、本発明に適したエキソ型糖分解酵素（以下エキソグルカナーゼＳＴと呼ぶ）とオリゴ糖生成酵素（この酵素はカードラン等に作用してラミナリペンタオース（Ｇ５）を遊離させる能力を有する酵素であり、以下Ｇ５生成酵素と呼ぶ）を同時に菌体外に生産するので本発明では好ましく用いられるが、本発明に使用できる酵素はこれに限定されるものではない。
【００１５】
本発明で特に好ましく用いられるエキソグルカナーゼＳＴ及びＧ５生成酵素の性質を以下に示す。
〔エキソグルカナーゼＳＴの酵素学的性質〕
（１） 作用；β−１，３グリコシル糖化合物、例えばカードラン、ラミナリン、パキマン、酵母細胞壁及びそれらの部分加水分解物に作用して、グルコースを遊離させる。ラミナリオリゴ糖に作用させたときの最終生産物はグルコースとラミナリトリオースである。
（２） 作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ； ｐＨ３〜９まで作用し、最適作用ｐ Ｈは６である。
（３） 作用温度範囲及び最適作用温度； 約２０℃〜約７０℃まで作用し、最 適作用温度は約６０℃である。
（４） 熱安定性； ０．０１Ｍ酢酸緩衝液中では４５℃、１時間の熱処理で完 全に失活するが、０．１Ｍリン酸緩衝液中では６０℃、１時間の熱処理 で約６０％失活する。
（５） 精製方法； 本酵素は菌体除去後の培養濾液より限外濾過膜（分画分子量１万）で濃縮後、ＤＥＡＥセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）を行い、塩化ナトリウム濃度０．１Ｍで溶出される画分を集める。脱塩後ＣＭセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を行って塩化ナトリウム０．２Ｍ溶液で溶出される画分を集めることにより活性的にほぼ単一な酵素を得ることができる。
（６） 分子量；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による分子量は約５５０００である。
【００１６】
〔Ｇ５生成酵素の酵素学的性質〕
（１） 作用； β−１，３グリコシル糖化合物、例えばカードラン、ラミナリン、パキマン、酵母細胞壁又はその部分分解物等よりラミナリペンタオースを生成する。
（２） 作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ； ｐＨ３〜９の範囲に作用し、最適ｐＨは５付近である。
（３） 作用温度範囲及び最適作用温度； 約７０℃まで作用し、最適作用温度は約６０℃である。
（４） 精製方法； 本酵素は菌体除去後の培養濾液より限外濾過膜（分画分子量１万）で濃縮後ＤＥＡＥセルロファインカラムクロマトグラフィー （０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）を行い、その未吸着画分を集める。次いでＣＭセルロファインカラムクロマトグラフィー （０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を行い、０．１Ｍで溶出される画分を集めることにより活性的に単一な酵素を得ることができる。
（５） 熱安定性； ０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中では７０℃、９０時間の加熱で完全に失活するが、５０℃では３０％の失活である。
（６） 分子量； ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は約４００００と推定できる 。
【００１７】
本発明で好ましく使用される前述のストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）菌株の菌学的性質は特開昭５９−１７９９６号公報に既に記載されているが、詳細には以下のような性質を有するものである。なお本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、微工研条寄第２５３号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３）として国際寄託されている。
【００１８】
〔ストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８の菌学的性質〕
（１） 形態的特徴
使用した培地（ＩＳＰ培地を含む）上での栄養菌糸の生育は優れており 、デンプン無機塩、オートミール寒天、イースト麦芽寒天培地上で豊富 な気菌糸を形成する。胞子形成気菌糸は直状又は直曲状である。胞子は 楕円体で大きさは、短径×長径０．７〜０．８μ×１．０〜１．２μで ある。走査型電子顕微鏡による観察では胞子の表面構造はイボ状（Ｗａ ｒｔｙ）である。
【００１９】
（２） 各種培地における生育状態
（ａ）シュークロース硝酸塩寒天培地（３７℃）
薄茶色の基生菌糸状に灰色の気菌糸を形成し、溶解性色素は認められない。
（ｂ）グルコース・アスパラギン寒天培地（３７℃）
薄黄白色の生育で気菌糸の形成は認められない。又溶解性色素は認められない。
（ｃ）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地−Ｎｏ．５ ３７℃）薄黄色の生育で気菌糸の着生は認められない。又、溶解性色素は認められない。
（ｄ）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ培地 ３７℃）
無色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
（ｅ）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地−７ ３７℃）
薄茶色の生育上に培養７日目では気菌糸は着生せず、１４日目で白灰色の気菌糸を着生する。溶解性色素は認められない。
（ｆ）栄養寒天培地（３７℃）
緑灰黒色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
（ｇ）イースト麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地−２ ３７℃）
薄茶色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生する。水溶性色素の生成は認められない。<
（ｈ）オートミール寒天培地（ＩＳＰ培地−３ ３７℃）
無色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生し、水溶性色素の生成は認められない。
【００２０】
（３） 生理的性質
（ａ）生育温度範囲
酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験では、３０〜５０℃で生育するが、至適温度は３７〜４５℃である。
（ｂ）ゼラチンの液化：陰性
（ｃ）脱脂乳の凝固及び脱脂乳のペプトン化：陰性
（ｄ）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・鉄寒天培地 ＩＳＰ培地６）：陰性
（ｅ）デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白いリングを形成）
（ｆ）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地−９ ３７℃）
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ガラクトースをよく利用して生育し、シュクロース、ラフィノース、サリシンは利用しない。
（ｇ）細胞壁組成
ＩＳＰに記載されている糖組成Ｔｙｐｅとしては、Ｔｙｐｅ１に属する。
【００２１】
本発明に使用する酵素生産のための該菌株の培養は、通常の個体培地又は液体培地が使用され、液体培養のための炭素源としては例えばグルコースやフラクトース等が用いられるが、酵素誘導炭素源としてはβ−１，３グルコシル糖化合物が望ましい。例えばカードラン、パキマン、ラミナリン、リケナン、酵母細胞壁又はその部分分解物、リュウコシン、カロース、パラミロン等があげられ、又窒素源としては、硫酸、塩酸、リン酸等のそれぞれアンモニウム塩や硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、カゼイン等、有機窒素、無機窒素のいずれも利用できる。天然栄養源としては、例えば各種糖蜜、コーンスティープリカー、オートミール、味液、魚粉、肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキス、麦芽エキス等があげられる。
【００２２】
無機物としては、例えばリン酸２カリウム、リン酸１ナトリウム、硫酸マグネシウム、微量金属類等があげられる。その他必要に応じてビタミン類を添加することもできる。これらの使用濃度としては０．１〜４０重量％が用いられる。又発酵中の発泡を抑制するため、０．０００１〜１．０重量％の消泡剤を添加してもよい。消泡剤としてはシリコーン、大豆油、界面活性剤等通常の消泡剤を用いる。培養方法は、振とう培養、通気培養等の好気的液体培養が適しており、ｐＨ５〜９、培養温度２０℃〜５０℃で１日〜６日、望ましくはｐＨ６〜８で３５℃〜４０℃で２日前後培養する。
【００２３】
本発明に使用できる酵素は、該菌体外に生産される酵素であるので、培養終了後、濾過又は遠心分離して除菌し、上清液を回収する。そして必要に応じて濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムによる塩析、又はイオン交換やゲル濾過等のクロマト手法により精製し、又凍結乾燥等で乾燥後保存することができる。
【００２４】
本発明の製造法としては、例えば重合度が大きいカードラン等の多糖に、５糖に分解するオリゴ糖生成酵素と、エキソ型分解酵素を順次又は好ましくは同時に作用させる事で、オリゴ糖成分がグルコースとラミナリトリオースのみからなる反応液を得る事が出来る。その後、常法によりラミナリトリオースを分離精製することで、効率よくラミナリトリオースを製造することができる。
【００２５】
重合度の大きい多糖やラミナリペンタオースのようなオリゴ糖に、直接エキソ型分解酵素のみを作用させてもラミナリテトラオースを製造する事が出来るが、この方法はオリゴ糖精製酵素を併用する場合と比較して反応速度の点において劣るため好ましくない。即ち本発明は２種類の酵素を併用することが特徴である。
【００２６】
本発明の製造法によりラミナリトリオースを得るには、例えばまず水又は緩衝液に溶解させた前述の５糖以上のβ−１，３グルコシル糖化合物の１〜１０重量％懸濁液に対し、Ｇ５生成酵素を０．５〜３μｇ／反応液ｍｌ加え、ｐＨ３〜９、好ましくは５〜７、反応温度３０℃〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃の反応条件で３０分〜５０時間好ましくは１０〜２４時間反応させた後、この系内にエキソグルカナーゼＳＴ１〜５μｇ／反応液ｍｌ添加して、ｐＨ４〜９、好ましくは５〜７．５、反応温度３０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃の反応条件で３〜２０日、好ましくは１０〜１８日反応させることにより得られる。この時オリゴ糖成分としてグルコースとラミナリトリオースのみが存在する。
【００２７】
好ましくは上記２種の酵素を同時に添加して反応させても本発明のラミナリトリオースを製造することができる。他の酵素を用いて反応させる場合は、その酵素に最適な温度、ｐＨに調節すれば良い。
【００２８】
本発明の方法で得られた反応液中にはラミナリトリオースとグルコースが存在しているのでその後の精製はグルコースを除去するだけでよい。グルコースを除去する方法としてはクロマトグラフィーによる方法があり、例えば活性炭クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。この中では活性炭クロマトグラフィーが大量の糖を処理できる点で優れている。この場合、ラミナリトリオースのみが活性炭に吸着され、グルコースは吸着されないので水洗浄で溶出される。活性炭に吸着されたラミナリトリオースは通常１０〜２０％のエタノール等で溶出し回収することができる。又、微生物による方法、例えばラミナリトリオースとグルコースの混合液に、適当な窒素源あるいは微量栄養源等を添加してサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属やクルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母を生育させると、通常グルコースのみを資化しラミナリトリオースはそのまま残るので菌体の除去後はイオン交換精製等により糖以外の成分を取り除くことで精製できる。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（参考例１）〔エキソグルカナーゼＳＴの調製〕
９０Ｌ容ジャーファメンター（丸菱製）を用いて酵素生産培養を行った。即ち、グルコース ０．５％、ポリペプトン ０．２％、酵母エキス ０．２％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．２％、 ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）を４７Ｌ仕込み、１２１℃で３０分殺菌後温度が４０℃まで下がった時点でカードラン０．５％を添加した。これに同培地組成で２日間、３５℃で培養したストレプトミセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（微工研条寄第２５３号）の種菌２Ｌを接種し、３５℃、攪拌３００回転／ｍｉｎ、通気量４８Ｌ／ｍｉｎ．の条件で４０時間培養した。培養終了後、培養液はボルテックスフロー式限外濾過膜装置（丸菱製）にて分画分子量１０万の膜で菌体を除去し、次いで分画分子量１万の限外濾過膜にて濃縮した。この粗酵素溶液約２Ｌのうち８００ｍｌ（蛋白量２６９．７ｍｇ）についてＤＥＡＥセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）を行い０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出される画分（蛋白量１２５ｍｇ）を集める。同上限外濾過膜装置にて脱塩後、ＣＭセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を行い、０．３Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出される画分を回収した。この画分中に主成分としてエキソグルカナーゼＳＴが含有しており、蛋白量は７５ｍｇであった。この酵素液を７０μｇ／ｍｌの濃度に調製した。
【００３０】
（参考例２）〔Ｇ５生成酵素の調製〕
参考例１で得られた粗酵素溶液の８００ｍｌ（蛋白量２６９．７ｍｇ）についてＤＥＡＥセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）を行い、未吸着画分（蛋白量４１ｍｇ）を集め、次いでＣＭセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を行い、０．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出される画分を回収した。この画分中に主成分としてＧ５生成酵素が含有しており、蛋白量は３１ｍｇであった。この酵素液を１８０μｇ／ｍｌの濃度に調製した。
【００３１】
（実施例１）〔カードランよりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、カードラン ５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ ６．８）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ、及び参考例２で得られたＧ５生成酵素を１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反応させた。反応経時の糖変化はＨＰＬＣ法により行った。
【００３２】
〔ＨＰＬＣ条件〕
カラム：アミド−８０（４．６φ×２５０ｍｍ，トーソー製）
溶媒 ：アセトニトリル：水＝６０：４０
流速： １．０ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：５０℃
検出器：ＲＩ
反応１日目ではラミナリペンタオース（Ｇ５）、ラミナリテトラオース（Ｇ４）、ラミナリトリオース（Ｇ３）、グルコースの４成分の生成が見られるが、反応１５日目にはラミナリトリオースの生成量が２２．２ｍｇ／ｍｌとグルコース２７．１ｍｇ／ｍｌのみの反応液が得られた。この時のカードランからのラミナリトリオースの収率は４４．４％であった。この反応液８ｍｌを活性炭カラム（ｖｏｌ．２５ｍｌ）に通過させ、蒸留水１００ｍｌで洗浄した。洗浄液中にはグルコースが検出された。次いで１０％ｖ／ｖのエタノール溶液５０ｍｌで吸着されたラミナリトリオースを溶出し、エバポレータでエタノールを留去後凍結乾燥した。得られたラミナリトリオースは純度９８％、収量１７５ｍｇ（カードランからの収率は４３．８％）であった。
【００３３】
（実施例２）〔カードランよりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、カードラン５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９ｍｌ、参考例２で得られたＧ５生成酵素を１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で９．５ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で１日反応させた。生成糖の変化を実施例１に示したＨＰＬＣによる方法で測定したところ、ラミナリペンタオース（Ｇ５）が３０．１ｍｇ／ｍｌ生成されていた。この反応系に参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ添加して再び５５℃の恒温機中で反応させたところ、反応１５日目にはラミナリトリオースとグルコースのみとなった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様に活性炭カラムクロマトグラフィーを行い、純度９９％のラミナリトリオース１７０ｍｇ（カードランからの収率は４２．５％）を得た。
【００３４】
（実施例３）〔高度ラミナリオリゴ糖よりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、ラミナリオリゴ糖（１０糖３７％、１１糖６０％）２００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ及び参考例２で得られたＧ５生成酵素１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反応させた。糖変化は実施例１と同様の方法で測定した。反応２日目でグルコース、ラミナリトリオース及びラミナリテトラオースがそれぞれ１２ｍｇ／ｍｌ、２．７ｍｇ／ｍｌ及び２．７ｍｇ／ｍｌであった。その後１０日目にはグルコース１４ｍｇ／ｍｌとラミナリトリオース３．８ｍｇ／ｍｌとなった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の方法で活性炭クロマトを行い、純度９９％のラミナリトリオース２８．２ｍｇ（ラミナリオリゴ糖からの収率は１７．６％）を得た。
【００３５】
（実施例４）〔パキマンよりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、パキマン（ブクリョウより常法にて調製）５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ及び、参考例２で得られたＧ５生成酵素１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反応させた。糖変化をＨＰＬＣにて測定したところ、反応１５日目でラミナリトリオースとグルコースのみの反応液が得られ、ラミナリトリオースの生成量は１１．５ｍｇ／ｍｌであった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の方法で活性炭クロマトを行い、純度９８．２％のラミナリトリオース９０ｍｇ（パキマンからの収率は２２．５％）を得た。
【００３６】
（実施例５）〔酵母細胞壁よりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、酵母細胞壁（パン酵母より常法にて調製）５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ及び、参考例２で得られたＧ５生成酵素１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反応させた。糖変化をＨＰＬＣにて測定したところ、反応１５日目でラミナリトリオースとグルコースのみの反応液が得られ、ラミナリトリオースの生成量は４．８ｍｇ／ｍｌであった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の方法で活性炭クロマトを行い、純度９９％のラミナリトリオース３７．５ｍｇ（酵母細胞壁からの収率は９．４％）を得た。
【００３７】
（比較例１）〔ラミナリペンタオースよりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶にラミナリペンタオース ５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）９ｍｌ、実施例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機で反応させた。糖変化は実施例１と同様の方法で測定したところ、反応１５日目でまだラミナリテトラオース（Ｇ４）が１．４ｍｇ／ｍｌ存在しており、結局ラミナリテトラオースが消滅するまで反応２４日目を要した。そのときラミナリトリオースとグルコースの生成量は２５．３ｍｇ／ｍｌと２２．３ｍｇ／ｍｌであった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の方法で活性炭クロマトを行い、純度９９％のラミナリトリオース１９５ｍｇ（ラミナリペンタオースからの収率は４８．８％）を得た。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の製造法によると、従来の酸による加水分解と比べ、反応系内にオリゴ糖成分としてグルコースとラミナリトリオース以外は存在しないため、オリゴ糖同士を分離する煩雑な精製方法を行う事なく、簡便な精製法で高純度のラミナリトリオースを得ることが出来る。また、エキソ型分解酵素とオリゴ糖分解酵素を併用することにより、エキソ型分解酵素のみを使用した場合に比べて、速やかにラミナリトリオースを得る事ができる。
【産業上の利用分野】
食品の甘味剤、増量剤、賦形剤、包括剤として食品、医薬品及び種々の工業製品に利用可能であり、抗腫瘍活性、抗細菌感染症作用、免疫系に及ぼす作用等を有する医農薬品の中間体として有用なラミナリトリオースを製造することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでラミナリトリオース（グルコースがβ−１，３グリコシド結合で３糖つながっている糖）は、グルコースがβ−１，３位で結合している部分を有する多糖、例えばパキマンやラミナリンを酸で加水分解した後クロマト的に分離する方法により得られている。しかしこのように分解したものはオリゴ糖混合物となり、この中からラミナリトリオースを得るには、現在最も有効とされる活性炭クロマトグラフィーにより分画する方法によっても、分離に手間がかかる上、高純度のオリゴ糖を得ようとすると回収のロスが多いという欠点がある。
【０００３】
例えば、酸による加水分解は特開平２−２４３６９７号公報に開示されているように制限条件下においても、単一のオリゴ糖純度を２０％以上にすることは困難である。
【０００４】
一方、本願発明者を含む発明者によるレバウディオサイドＡの製造法（特開昭６２−１４６５９９号公報）において、ラミナリペンタオース （グルコースがβ−１，３グリコシド結合で５糖つながっている糖）にエキソタイプのβ−１，３グルカナーゼを作用させることでグルコースとラミナリトリオースが生成されることは知られているが、そこからラミナリトリオースを単独で採取することは開示されておらず、ラミナリペンタオースにエキソ型β−１，３グルカナーゼを作用させる方法は、あらかじめラミナリペンタオースを得る操作が必要な上、反応速度が遅いので効率的ではない。
【０００５】
又、酵素による選択的な方法としては高純度のラミナリビオースの製造法（特開昭５９−１６２８９７号公報）やラミナリペンタオースの製造法（特公平４−３７７１９号公報）が公知となっているがこれらの酵素からはラミナリトリオースは生成されない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、高純度のラミナリトリオースを効率的に製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、効率的にラミナリトリオースを製造する方法を鋭意研究した結果、糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物に、これらの糖化合物に作用して糖鎖が４糖以上のオリゴ糖を生成させるβ−１，３グルコシル糖分解酵素を作用させた後か、もしくは同時にエキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素を作用させると速やかに最終分解物としてグルコースとラミナリトリオースを蓄積するため、簡便な方法でラミナリトリオースを分離精製できることを見いだし本発明を完成した。
【０００８】
即ち本発明は、糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物に、これら糖化合物に作用してグルコースを遊離させる能力を有するエキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素及び、４糖以上のオリゴ糖を遊離する能力を有するβ−１，３グリコシル糖分解酵素を作用させて得る事をと特徴とするラミナリトリオースの製造方法を提供するものである。
【０００９】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明で言う糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物（以下単にβ−１，３グリコシル糖化合物と称する）とは、β−１，３位で結合されたグルコース（即ちβ−１，３グルコシド結合をしたグルコース）の重合度が少なくとも５糖以上、好ましくは６糖以上の糖化合物であれば、β−１，３グリコシル糖鎖が主鎖にあるものでも、側鎖にあるものでも良い。例えばβ１，３−グリコシル結合を有するオリゴ糖類、多糖類、配糖体、糖脂質、糖蛋白等が挙げられ、またこれらの部分分解物も用いる事ができる。本目的のためにはβ−１，３グリコシル糖を主鎖又は側鎖に有するオリゴ糖または多糖が好ましい。オリゴ糖としては例えば、β−１，３グルコシド糖鎖のみからなるいわゆるラミナリオリゴ糖がより好ましい。多糖類としては、重合度が５糖以上、好ましくは６糖以上のβ−１，３グルコシル結合を有するものであればいずれの多糖類であっても良いが、例えば、カードラン、ラミナリン、パキマン、酵母細胞壁等が比較的長いβ−１，３グルコシド結合を有しているのでより好ましい。
【００１０】
次に、本発明に使用する酵素について説明する。本発明で用いるエキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素（以下単にエキソ型分解酵素と称する）とは、上記で述べたβ−１，３グリコシル糖化合物に作用してグルコースを遊離させる能力を有し、しかもラミナリトリオースに対しては作用しないか非常に作用しにくい酵素であればいかなる酵素でも良く、微生物、動物及び植物のいずれの起源からのものであっても良い。好ましくはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が生産する酵素が挙げられ、特に好ましくはストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）が生産する酵素が挙げられる。
【００１１】
又、他の好ましいものとしては上記の菌株を人工的に変異処理即ち化学、物理的手段による変異誘発処理を行うことにより得られる人為的突然変異株、あるいは自然変異株等から得られる酵素もすべて含まれる。
【００１２】
糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物に作用して４糖以上のオリゴ糖を生成する能力を有するβ−１，３グルコシル糖分解酵素（以下オリゴ糖生成酵素と称する）は、このような能力を有する酵素であればエンド型であってもエキソ型であってもいずれでも良く、微生物、動物及び植物のいずれの起源のものからであっても本発明を完成することができる。オリゴ糖分解酵素は分解の対象となるβ−１，３グリコシル糖化合物の重合度より小さい糖に分解する酵素であり、４糖に近い重合度のオリゴ糖を遊離する能力を有するものが効率的にラミナリトリオースを製造できるため好ましい。好ましくは５糖に分解する酵素が挙げられ、特にストレプトマイセス属に属する微生物が生産する酵素が好ましく、その中でもストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）より生産される酵素が特に好ましい。
【００１３】
又、他の好ましいものとしては上記の菌株を人工的に変異処理即ち化学、物理的手段による変異誘発処理を行うことにより得られる人為的突然変異株、あるいは自然変異株等から得られる酵素もすべて含まれる。
【００１４】
このストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）は、本発明に適したエキソ型糖分解酵素（以下エキソグルカナーゼＳＴと呼ぶ）とオリゴ糖生成酵素（この酵素はカードラン等に作用してラミナリペンタオース（Ｇ５）を遊離させる能力を有する酵素であり、以下Ｇ５生成酵素と呼ぶ）を同時に菌体外に生産するので本発明では好ましく用いられるが、本発明に使用できる酵素はこれに限定されるものではない。
【００１５】
本発明で特に好ましく用いられるエキソグルカナーゼＳＴ及びＧ５生成酵素の性質を以下に示す。
〔エキソグルカナーゼＳＴの酵素学的性質〕
（１） 作用；β−１，３グリコシル糖化合物、例えばカードラン、ラミナリン、パキマン、酵母細胞壁及びそれらの部分加水分解物に作用して、グルコースを遊離させる。ラミナリオリゴ糖に作用させたときの最終生産物はグルコースとラミナリトリオースである。
（２） 作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ； ｐＨ３〜９まで作用し、最適作用ｐ Ｈは６である。
（３） 作用温度範囲及び最適作用温度； 約２０℃〜約７０℃まで作用し、最 適作用温度は約６０℃である。
（４） 熱安定性； ０．０１Ｍ酢酸緩衝液中では４５℃、１時間の熱処理で完 全に失活するが、０．１Ｍリン酸緩衝液中では６０℃、１時間の熱処理 で約６０％失活する。
（５） 精製方法； 本酵素は菌体除去後の培養濾液より限外濾過膜（分画分子量１万）で濃縮後、ＤＥＡＥセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）を行い、塩化ナトリウム濃度０．１Ｍで溶出される画分を集める。脱塩後ＣＭセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を行って塩化ナトリウム０．２Ｍ溶液で溶出される画分を集めることにより活性的にほぼ単一な酵素を得ることができる。
（６） 分子量；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による分子量は約５５０００である。
【００１６】
〔Ｇ５生成酵素の酵素学的性質〕
（１） 作用； β−１，３グリコシル糖化合物、例えばカードラン、ラミナリン、パキマン、酵母細胞壁又はその部分分解物等よりラミナリペンタオースを生成する。
（２） 作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ； ｐＨ３〜９の範囲に作用し、最適ｐＨは５付近である。
（３） 作用温度範囲及び最適作用温度； 約７０℃まで作用し、最適作用温度は約６０℃である。
（４） 精製方法； 本酵素は菌体除去後の培養濾液より限外濾過膜（分画分子量１万）で濃縮後ＤＥＡＥセルロファインカラムクロマトグラフィー （０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）を行い、その未吸着画分を集める。次いでＣＭセルロファインカラムクロマトグラフィー （０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を行い、０．１Ｍで溶出される画分を集めることにより活性的に単一な酵素を得ることができる。
（５） 熱安定性； ０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中では７０℃、９０時間の加熱で完全に失活するが、５０℃では３０％の失活である。
（６） 分子量； ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は約４００００と推定できる 。
【００１７】
本発明で好ましく使用される前述のストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ・ｓｐ ＤＩＣ−１０８）菌株の菌学的性質は特開昭５９−１７９９６号公報に既に記載されているが、詳細には以下のような性質を有するものである。なお本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、微工研条寄第２５３号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３）として国際寄託されている。
【００１８】
〔ストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８の菌学的性質〕
（１） 形態的特徴
使用した培地（ＩＳＰ培地を含む）上での栄養菌糸の生育は優れており 、デンプン無機塩、オートミール寒天、イースト麦芽寒天培地上で豊富 な気菌糸を形成する。胞子形成気菌糸は直状又は直曲状である。胞子は 楕円体で大きさは、短径×長径０．７〜０．８μ×１．０〜１．２μで ある。走査型電子顕微鏡による観察では胞子の表面構造はイボ状（Ｗａ ｒｔｙ）である。
【００１９】
（２） 各種培地における生育状態
（ａ）シュークロース硝酸塩寒天培地（３７℃）
薄茶色の基生菌糸状に灰色の気菌糸を形成し、溶解性色素は認められない。
（ｂ）グルコース・アスパラギン寒天培地（３７℃）
薄黄白色の生育で気菌糸の形成は認められない。又溶解性色素は認められない。
（ｃ）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地−Ｎｏ．５ ３７℃）薄黄色の生育で気菌糸の着生は認められない。又、溶解性色素は認められない。
（ｄ）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ培地 ３７℃）
無色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
（ｅ）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地−７ ３７℃）
薄茶色の生育上に培養７日目では気菌糸は着生せず、１４日目で白灰色の気菌糸を着生する。溶解性色素は認められない。
（ｆ）栄養寒天培地（３７℃）
緑灰黒色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
（ｇ）イースト麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地−２ ３７℃）
薄茶色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生する。水溶性色素の生成は認められない。<
（ｈ）オートミール寒天培地（ＩＳＰ培地−３ ３７℃）
無色の発育上に薄緑灰色の気菌糸を着生し、水溶性色素の生成は認められない。
【００２０】
（３） 生理的性質
（ａ）生育温度範囲
酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験では、３０〜５０℃で生育するが、至適温度は３７〜４５℃である。
（ｂ）ゼラチンの液化：陰性
（ｃ）脱脂乳の凝固及び脱脂乳のペプトン化：陰性
（ｄ）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・鉄寒天培地 ＩＳＰ培地６）：陰性
（ｅ）デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白いリングを形成）
（ｆ）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地−９ ３７℃）
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ガラクトースをよく利用して生育し、シュクロース、ラフィノース、サリシンは利用しない。
（ｇ）細胞壁組成
ＩＳＰに記載されている糖組成Ｔｙｐｅとしては、Ｔｙｐｅ１に属する。
【００２１】
本発明に使用する酵素生産のための該菌株の培養は、通常の個体培地又は液体培地が使用され、液体培養のための炭素源としては例えばグルコースやフラクトース等が用いられるが、酵素誘導炭素源としてはβ−１，３グルコシル糖化合物が望ましい。例えばカードラン、パキマン、ラミナリン、リケナン、酵母細胞壁又はその部分分解物、リュウコシン、カロース、パラミロン等があげられ、又窒素源としては、硫酸、塩酸、リン酸等のそれぞれアンモニウム塩や硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、カゼイン等、有機窒素、無機窒素のいずれも利用できる。天然栄養源としては、例えば各種糖蜜、コーンスティープリカー、オートミール、味液、魚粉、肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキス、麦芽エキス等があげられる。
【００２２】
無機物としては、例えばリン酸２カリウム、リン酸１ナトリウム、硫酸マグネシウム、微量金属類等があげられる。その他必要に応じてビタミン類を添加することもできる。これらの使用濃度としては０．１〜４０重量％が用いられる。又発酵中の発泡を抑制するため、０．０００１〜１．０重量％の消泡剤を添加してもよい。消泡剤としてはシリコーン、大豆油、界面活性剤等通常の消泡剤を用いる。培養方法は、振とう培養、通気培養等の好気的液体培養が適しており、ｐＨ５〜９、培養温度２０℃〜５０℃で１日〜６日、望ましくはｐＨ６〜８で３５℃〜４０℃で２日前後培養する。
【００２３】
本発明に使用できる酵素は、該菌体外に生産される酵素であるので、培養終了後、濾過又は遠心分離して除菌し、上清液を回収する。そして必要に応じて濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムによる塩析、又はイオン交換やゲル濾過等のクロマト手法により精製し、又凍結乾燥等で乾燥後保存することができる。
【００２４】
本発明の製造法としては、例えば重合度が大きいカードラン等の多糖に、５糖に分解するオリゴ糖生成酵素と、エキソ型分解酵素を順次又は好ましくは同時に作用させる事で、オリゴ糖成分がグルコースとラミナリトリオースのみからなる反応液を得る事が出来る。その後、常法によりラミナリトリオースを分離精製することで、効率よくラミナリトリオースを製造することができる。
【００２５】
重合度の大きい多糖やラミナリペンタオースのようなオリゴ糖に、直接エキソ型分解酵素のみを作用させてもラミナリテトラオースを製造する事が出来るが、この方法はオリゴ糖精製酵素を併用する場合と比較して反応速度の点において劣るため好ましくない。即ち本発明は２種類の酵素を併用することが特徴である。
【００２６】
本発明の製造法によりラミナリトリオースを得るには、例えばまず水又は緩衝液に溶解させた前述の５糖以上のβ−１，３グルコシル糖化合物の１〜１０重量％懸濁液に対し、Ｇ５生成酵素を０．５〜３μｇ／反応液ｍｌ加え、ｐＨ３〜９、好ましくは５〜７、反応温度３０℃〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃の反応条件で３０分〜５０時間好ましくは１０〜２４時間反応させた後、この系内にエキソグルカナーゼＳＴ１〜５μｇ／反応液ｍｌ添加して、ｐＨ４〜９、好ましくは５〜７．５、反応温度３０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃の反応条件で３〜２０日、好ましくは１０〜１８日反応させることにより得られる。この時オリゴ糖成分としてグルコースとラミナリトリオースのみが存在する。
【００２７】
好ましくは上記２種の酵素を同時に添加して反応させても本発明のラミナリトリオースを製造することができる。他の酵素を用いて反応させる場合は、その酵素に最適な温度、ｐＨに調節すれば良い。
【００２８】
本発明の方法で得られた反応液中にはラミナリトリオースとグルコースが存在しているのでその後の精製はグルコースを除去するだけでよい。グルコースを除去する方法としてはクロマトグラフィーによる方法があり、例えば活性炭クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。この中では活性炭クロマトグラフィーが大量の糖を処理できる点で優れている。この場合、ラミナリトリオースのみが活性炭に吸着され、グルコースは吸着されないので水洗浄で溶出される。活性炭に吸着されたラミナリトリオースは通常１０〜２０％のエタノール等で溶出し回収することができる。又、微生物による方法、例えばラミナリトリオースとグルコースの混合液に、適当な窒素源あるいは微量栄養源等を添加してサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属やクルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母を生育させると、通常グルコースのみを資化しラミナリトリオースはそのまま残るので菌体の除去後はイオン交換精製等により糖以外の成分を取り除くことで精製できる。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（参考例１）〔エキソグルカナーゼＳＴの調製〕
９０Ｌ容ジャーファメンター（丸菱製）を用いて酵素生産培養を行った。即ち、グルコース ０．５％、ポリペプトン ０．２％、酵母エキス ０．２％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．２％、 ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）を４７Ｌ仕込み、１２１℃で３０分殺菌後温度が４０℃まで下がった時点でカードラン０．５％を添加した。これに同培地組成で２日間、３５℃で培養したストレプトミセス・エスピー ＤＩＣ−１０８（微工研条寄第２５３号）の種菌２Ｌを接種し、３５℃、攪拌３００回転／ｍｉｎ、通気量４８Ｌ／ｍｉｎ．の条件で４０時間培養した。培養終了後、培養液はボルテックスフロー式限外濾過膜装置（丸菱製）にて分画分子量１０万の膜で菌体を除去し、次いで分画分子量１万の限外濾過膜にて濃縮した。この粗酵素溶液約２Ｌのうち８００ｍｌ（蛋白量２６９．７ｍｇ）についてＤＥＡＥセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）を行い０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出される画分（蛋白量１２５ｍｇ）を集める。同上限外濾過膜装置にて脱塩後、ＣＭセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を行い、０．３Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出される画分を回収した。この画分中に主成分としてエキソグルカナーゼＳＴが含有しており、蛋白量は７５ｍｇであった。この酵素液を７０μｇ／ｍｌの濃度に調製した。
【００３０】
（参考例２）〔Ｇ５生成酵素の調製〕
参考例１で得られた粗酵素溶液の８００ｍｌ（蛋白量２６９．７ｍｇ）についてＤＥＡＥセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）を行い、未吸着画分（蛋白量４１ｍｇ）を集め、次いでＣＭセルロファインカラムクロマトグラフィー（０．０１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を行い、０．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出される画分を回収した。この画分中に主成分としてＧ５生成酵素が含有しており、蛋白量は３１ｍｇであった。この酵素液を１８０μｇ／ｍｌの濃度に調製した。
【００３１】
（実施例１）〔カードランよりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、カードラン ５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ ６．８）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ、及び参考例２で得られたＧ５生成酵素を１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反応させた。反応経時の糖変化はＨＰＬＣ法により行った。
【００３２】
〔ＨＰＬＣ条件〕
カラム：アミド−８０（４．６φ×２５０ｍｍ，トーソー製）
溶媒 ：アセトニトリル：水＝６０：４０
流速： １．０ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：５０℃
検出器：ＲＩ
反応１日目ではラミナリペンタオース（Ｇ５）、ラミナリテトラオース（Ｇ４）、ラミナリトリオース（Ｇ３）、グルコースの４成分の生成が見られるが、反応１５日目にはラミナリトリオースの生成量が２２．２ｍｇ／ｍｌとグルコース２７．１ｍｇ／ｍｌのみの反応液が得られた。この時のカードランからのラミナリトリオースの収率は４４．４％であった。この反応液８ｍｌを活性炭カラム（ｖｏｌ．２５ｍｌ）に通過させ、蒸留水１００ｍｌで洗浄した。洗浄液中にはグルコースが検出された。次いで１０％ｖ／ｖのエタノール溶液５０ｍｌで吸着されたラミナリトリオースを溶出し、エバポレータでエタノールを留去後凍結乾燥した。得られたラミナリトリオースは純度９８％、収量１７５ｍｇ（カードランからの収率は４３．８％）であった。
【００３３】
（実施例２）〔カードランよりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、カードラン５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９ｍｌ、参考例２で得られたＧ５生成酵素を１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で９．５ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で１日反応させた。生成糖の変化を実施例１に示したＨＰＬＣによる方法で測定したところ、ラミナリペンタオース（Ｇ５）が３０．１ｍｇ／ｍｌ生成されていた。この反応系に参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ添加して再び５５℃の恒温機中で反応させたところ、反応１５日目にはラミナリトリオースとグルコースのみとなった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様に活性炭カラムクロマトグラフィーを行い、純度９９％のラミナリトリオース１７０ｍｇ（カードランからの収率は４２．５％）を得た。
【００３４】
（実施例３）〔高度ラミナリオリゴ糖よりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、ラミナリオリゴ糖（１０糖３７％、１１糖６０％）２００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ及び参考例２で得られたＧ５生成酵素１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反応させた。糖変化は実施例１と同様の方法で測定した。反応２日目でグルコース、ラミナリトリオース及びラミナリテトラオースがそれぞれ１２ｍｇ／ｍｌ、２．７ｍｇ／ｍｌ及び２．７ｍｇ／ｍｌであった。その後１０日目にはグルコース１４ｍｇ／ｍｌとラミナリトリオース３．８ｍｇ／ｍｌとなった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の方法で活性炭クロマトを行い、純度９９％のラミナリトリオース２８．２ｍｇ（ラミナリオリゴ糖からの収率は１７．６％）を得た。
【００３５】
（実施例４）〔パキマンよりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、パキマン（ブクリョウより常法にて調製）５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ及び、参考例２で得られたＧ５生成酵素１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反応させた。糖変化をＨＰＬＣにて測定したところ、反応１５日目でラミナリトリオースとグルコースのみの反応液が得られ、ラミナリトリオースの生成量は１１．５ｍｇ／ｍｌであった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の方法で活性炭クロマトを行い、純度９８．２％のラミナリトリオース９０ｍｇ（パキマンからの収率は２２．５％）を得た。
【００３６】
（実施例５）〔酵母細胞壁よりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶に、酵母細胞壁（パン酵母より常法にて調製）５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）９ｍｌ、参考例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ及び、参考例２で得られたＧ５生成酵素１８μｇ／１００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機中で反応させた。糖変化をＨＰＬＣにて測定したところ、反応１５日目でラミナリトリオースとグルコースのみの反応液が得られ、ラミナリトリオースの生成量は４．８ｍｇ／ｍｌであった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の方法で活性炭クロマトを行い、純度９９％のラミナリトリオース３７．５ｍｇ（酵母細胞壁からの収率は９．４％）を得た。
【００３７】
（比較例１）〔ラミナリペンタオースよりラミナリトリオースの製造〕
２５ｍｌ容のサンプル瓶にラミナリペンタオース ５００ｍｇ、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）９ｍｌ、実施例１で得られたエキソグルカナーゼＳＴを３５μｇ／５００μｌ加えた後、蒸留水で１０ｍｌとした。これを５５℃の恒温機で反応させた。糖変化は実施例１と同様の方法で測定したところ、反応１５日目でまだラミナリテトラオース（Ｇ４）が１．４ｍｇ／ｍｌ存在しており、結局ラミナリテトラオースが消滅するまで反応２４日目を要した。そのときラミナリトリオースとグルコースの生成量は２５．３ｍｇ／ｍｌと２２．３ｍｇ／ｍｌであった。この反応液８ｍｌを実施例１と同様の方法で活性炭クロマトを行い、純度９９％のラミナリトリオース１９５ｍｇ（ラミナリペンタオースからの収率は４８．８％）を得た。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の製造法によると、従来の酸による加水分解と比べ、反応系内にオリゴ糖成分としてグルコースとラミナリトリオース以外は存在しないため、オリゴ糖同士を分離する煩雑な精製方法を行う事なく、簡便な精製法で高純度のラミナリトリオースを得ることが出来る。また、エキソ型分解酵素とオリゴ糖分解酵素を併用することにより、エキソ型分解酵素のみを使用した場合に比べて、速やかにラミナリトリオースを得る事ができる。
Claims (11)
- 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物に、これらの糖化合物に作用してグルコースを遊離させる能力を有するエキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素、及び糖鎖が４糖以上のオリゴ糖を遊離させる能力を有するβ−１，３グリコシル糖分解酵素を同じ系内で作用させて得られることを特徴とするラミナリトリオースの製造法。
- 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物に、これらの糖化合物に作用して糖鎖が４糖以上のオリゴ糖を遊離させる能力を有するβ−１，３グリコシル糖分解酵素、及びグルコースを遊離させる能力を有するエキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素を同時に作用させて得られる請求項１に記載のラミナリトリオースの製造法。
- 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物に作用して４糖以上のオリゴ糖を遊離させるβ−１，３グリコシル糖分解酵素がラミナリペンタオースを遊離させるβ−１，３グルコシル糖分解酵素である請求項１または２に記載の製造法。
- エキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素がストレプトマイセス属より得られたものである請求項３に記載の製造法。
- エキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素がストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）より得られたものである請求項４記載の製造法。
- エキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素及び４糖以上のオリゴ糖を遊離させる能力を有するβ−１，３グリコシル糖分解酵素がストレプトマイセス属より得られたものである請求項１に記載の製造法。
- エキソ型β−１，３グリコシル糖分解酵素及び４糖以上のオリゴ糖を遊離させる能力を有するβ−１，３グリコシル糖分解酵素がストレプトマイセス・エスピー ＤＩＣ−１０８菌株（微工研条寄第２５３号）より得られたものである請求項６記載の製造法。
- 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物が、β−１，３グリコシル糖を主鎖又は側鎖に有するオリゴ糖又は多糖である請求項１〜７のいずれか１に記載の製造法。
- 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物がβ−１，３グリコシル糖鎖のみからなるオリゴ糖又は多糖である請求項１〜７のいずれか１に記載の製造法。
- 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物がカードラン、パキマン、ラミナリオリゴ糖又は酵母細胞壁である請求項８記載の製造法。
- 糖鎖が５糖以上のβ−１，３グリコシル糖化合物がカードランである請求項１０記載の製造法。
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