JPH09299093A - ビートアラビナンよりアラビノースを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】ビートアラビナンを高分解限度で分解する
ビートアラビナン分解酵素を高力価で生産するバチルス
・サブチリス(Bacillus subtilis) 種菌を培養してビー
トアラビナン分解酵素を得、この酵素を用いてビートア
ラビナンを分解してアラビノースを製造する方法。 【効果】ビートアラビナンを高分解限度で分解して高い
収率で二糖水解酵素阻害活性を有するアラビノースを生
成することができ、その工業的有用性は大きい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ビートアラビナンを
高分解限度で分解して、高い収率でアラビノースを製造
する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アラビノースは蔗糖（砂糖）の８割程の
甘味強度を持つ、上品な甘味質の糖質であり、殆ど脹管
粘膜からは吸収されず、また僅かに吸収されても大部分
は尿中へ排泄され、代謝系へ取り込まれてエネルギー源
とはならないことが知られているが、特に最近アラビノ
ースの機能として蔗糖やマルトース等の二糖類と共に摂
取すると、蔗糖やマルトースはアラビノースによって消
化吸収が妨げられ、単に甘味物質として味蕾に作用する
だけでエネルギー源とはならない、即ち二糖水解酵素阻
害活性が存在することが明らかとなった。

【０００３】このため、アラビノースは糖質食品として
大いに注目されており、その工業的な製造方法の開発が
望まれている。

【０００４】Ｌ−アラビノースはヘミセルロース中にア
ラビナン、アラビノキシラン、ガムアラビック、アラビ
ノガラクタムとして高濃度に存在している。

【０００５】一方、ビートから蔗糖を回収した後に排出
されるパルプ中には、乾物重量当たりアラビノースが12
〜13% 程度存在するが、これらビートパルプ中における
アラビノースはその多数が鎖状に結合した多糖類である
アラビナンとして存在する。

【０００６】これらアラビナンのうちその３割はその主
成分がアラビノースの1,5 結合の主鎖に一分子おきに別
のアラビノースが一分子だけ1,3 結合している、所謂
「櫛の歯状」の形状を持つＬ−アラビノースであり、他
の７割は構造未同定のアラビナンである。

【０００７】これらビートパルプからアラビノースを回
収可能な方法としては、多糖類をアルカリ抽出し、抽出
された多糖類を酸で分解する、所謂「アルカリ抽出−酸
分解法」と多糖類をアルカリ抽出し、抽出された多糖類
を酵素で分解する、所謂「アルカリ抽出−酵素分解法」
が考えられる。

【０００８】「アルカリ抽出−酸分解法」は一般に構造
解析などの研究目的のために多糖類からオリゴ糖や単糖
類を製造する際に用いられている。

【０００９】「アルカリ抽出−酵素分解法」としてはビ
ートパルプ中のアラビナンを酵素で分解する研究につい
てA.Kaji,H.Taki,A.Shimazaki,T.Shinkai(Tech.Bull.Fa
c.Aga.Kagawa Univ.,15,34(1963)または日下部、安井、
小林（日本農芸化学会誌，49,295(1975)) 、L.Weinstei
n,P.Albersheim(Plant Physiol 63,425(1979))等による
報告がなされている。

【００１０】上記二方法のうち、「アルカリ抽出−酸分
解法」は極ｐＨ，高温等の強い条件が必要であり、装置
的、または取扱操作上において反応条件の設定が難し
く、従って工業的規模において行うには難点がある。

【００１１】また、回収されたアラビナン中に、用いた
多量の酸やアルカリが残留し、そのために精製工程にお
いて大きなコストアップとなる等の難点もある。

【００１２】一方、「アルカリ抽出−酵素分解法」はｐ
Ｈが中性近傍、温度が室温付近での穏和な反応が可能で
工業的に条件の設定が容易であり、精製負荷が軽いなど
ビートパルプを原料とするアラビノース抽出には最適で
あると考えられる。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】これら「アルカリ抽出
−酵素分解法」では各種の微生物から得られた酵素が使
用されている。

【００１４】例えば、A.Kajiら(Tech.Bull.Fac.Aga.Kag
awa Univ.,15,34(1963))はアスペルギルス・ニガー(Asp
ergillus niger) の酵素を用いた反応について報告して
いるが、ビートアラビナンの分解率が53% と低い。

【００１５】またA.Kajiら(Biochica et Biophysica Ac
ta,410,354(1945)) 、或はS.Kanekoら(Appl.Environ.Mi
crobiol.,60,3425(1994)) はバチルス・サブリス(Bacil
lussubtilis) の酵素を用いて反応について報告してい
るが、ビートアラビナンの分解率がそれぞれ3.3%又は15
% と低い。

【００１６】他方、日下部ら( 日本農芸化学会誌,49,29
5(1975))はアスペルギルス・ニガー(Aspergillus nige
r) の酵素を用いた反応で100%の分解限度に達したと報
告されている。

【００１７】しかし、この酵素は分解限度が高いもの
の、酵素活性が8mg アラヒ゛ノース/5ml酵素液・30min反応であ
り、１分間に１マイクロモルのアラビノースを生成する
酵素量を１単位と定義すると、0.3 単位/ml に換算さ
れ、非常に低い。

【００１８】このように、従来知られている酵素は、ビ
ートパルプを原料とする総アラビナンから工業的にアラ
ビノースを回収するためには分解限度、或は酵素活性に
おいて満足できるものではなかった。

【００１９】これに対して、本願発明者はビートアラビ
ナンを高分解限度で分解するビートアラビナン分解酵素
を高力価で生産する菌株を広く自然界より検索を行った
結果、北海道常呂郡置戸町常元地区の原生林から採取さ
れた土壌中から分離されたバチラス・サブチリス(Bacil
lus subtilis) Ｈ−４と同定された菌株及び微生物分類
学的に同族、同種に属するバチラス・サブチリス種菌株
が目的に適うことを見出した。

【００２０】

【課題を解決するための手段】そこで、この発明では上
記知見に基づいてビートアラビナンを高分解限度で分解
するビートアラビナン分解酵素を高力価で生産するバチ
ルス・サブチリス種菌を培養してビートアラビナン分解
酵素を得、該酵素を用いてビートアラビノンを分解して
アラビノースを得る方法を提案するものである。

【００２１】この発明で使用するバチルス・サブチリス
種菌の代表例として挙げられるＨ−４菌株は、次のよう
な菌学的性質を有する。なお菌学的性質の試験及び分類
は「バージェーズ マニュアル オブ システマティッ
ク バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology)(1986)」に基づいて行った。

【００２２】Ａ．形態 １．細胞の形 桿菌 ２．細胞の大きさ 0.8×1.9 μm ３．運動性の有無 ＋ ４．胞子の有無 ＋ ５．グラム染色 ＋

【００２３】Ｂ．生理学的性質 １．カゼイン分解性 ＋ ２．澱粉分解性 ＋ ３．ＤＮＡse分解性 − ４．尿素分解性 − ５．ゼラチン ＋

【００２４】Ｃ．酸生成 １．デキストロース ＋ ２．セロビオース ＋ ３．ガラクトース − ４．マンノース ＋ ５．メリビオース ＋ ６．ラフィノース − ７．サリシン ＋ ８．キシロース ＋ ９．ＯＮＰＧ ＋

【００２５】 Ｄ．10% 食塩中での生育 − Ｅ．嫌気状態下での生育 − Ｆ．Voges-Proskauer test ＋ Ｇ．酸化反応 − Ｈ．ＮＧＫＧ培地での生育 − Ｉ．馬尿酸塩の分解 ＋ Ｊ．50℃での生育 ＋

【００２６】Ｋ．炭水化物の代謝 １．グリセリン ＋ ２．エリスリトール − ３．Ｄ−アラビノース − ４．Ｌ−アラビノース ＋ ５．リボース ＋ ６．Ｄ−キシロース ＋ ７．Ｌ−リキソース − ８．アドニトール − ９．β−メチル−Ｄ−キシロシド − １０．ガラクトース − １１．グルコース ＋ １２．フラクトース ＋ １３．マンノース ＋ １４．ソルボース − １５．ラムノース − １６．ダルシトール − １７．イノシトール ＋ １８．マンニトール ＋ １９．ソルビトール ＋ ２０．α−メチル−Ｄ−マンノシド − ２１．α−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ ２２．Ｎ−アセチルグルコサミン − ２３．アミグダリン ＋ ２４．アルブチン ＋ ２５．エスクリン ＋ ２６．サリシン ＋ ２７．セロビオース ＋ ２８．マルトース ＋ ２９．ラクトース − ３０．メリビオース ＋ ３１．シュークロース ＋ ３２．トレハロース ＋ ３３．イヌリン ＋ ３４．メレチトース − ３５．ラフィノース ＋ ３６．澱粉 ＋ ３７．グリコゲン ＋ ３８．キシリトール − ３９．ゲンチオビオース ＋ ４０．Ｄ−ツラノース ＋ ４１．Ｄ−リキソース − ４２．Ｄ−タガトース − ４３．Ｄ−フコース − ４４．Ｌ−フコース − ４５．Ｄ−アラビトール − ４６．Ｌ−アラビトール − ４７．グルコンサン塩 − ４８．２−ケト−グルコンサン塩 − ４９．５−ケト−グルコンサン塩 −

【００２７】生物学的性状 １．β−ガラクトシダーゼ ＋ ２．アルギニンジヒドラーゼ − ３．リジンデカルボキシラーゼ − ４．オルニチンデカルボキシラーゼ − ５．硫化水素産性 − ６．ウレアーゼ − ７．トリプトファンデアミナーゼ − ８．インドール産性 − ９．ＶＰ反応 ＋

【００２８】以上の菌学的な性質より上記菌株はバチラ
ス・サブチリス(Bacillus subtilis) Ｈ−４と同定さ
れ、この菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託し、その寄託番号はバチルス・サブチリスＨ−４(FER
M P-15482 ) であった。

【００２９】なお、この発明に使用するに適するビート
アラビナンを高分解限度で分解するビートアラビナン分
解酵素を高力価で生産するバチルス・サブチリス種菌と
しては上記Ｈ−４菌株が最も好ましいが、これ以外同
族、同種に属する、IFO(財団法人 発酵研究所, 以下同
じ）3007、IFO3108、IFO3134、IFO3335、IFO3336、IFO14140
またはATCC( アメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン，以下同じ）6633、ATCC6984、ATCC7003、ATCC7058、ATCC
7060、ATCC7067 等のバチルス・サブチリス種菌株を使用
することができる。

【００３０】また、この発明では高い分解限度でビート
アラビナンを分解する酵素を高活性で産生する能力を有
する上記菌株以外のバチルス・サブチリス種菌株及びこ
れらの菌株の天然または人為的変異法によって得られた
変異菌株を使用することができる。

【００３１】上記微生物の培養にあたっては、通常用い
られる固体培地あるいは液体培地の何れを用いてもよい
が、液体培地の方が好ましい。微生物の培養に使用され
る培地は、炭素源としては微生物が利用できる炭素源を
用いることができるが、好ましくはアラバン、澱粉、シ
ュークロース、またはグルコースであり、窒素源として
は酵母エキス、カゼイン、コーンスチープリカー、ペプ
トン、肉エキスなどの天然窒素源や硫安、塩安、尿素あ
るいは硝酸ナトリウム等の無機窒素化合物を用いること
ができる。

【００３２】炭素源の濃度は1 〜20% 、窒素源は1 〜5%
の範囲で、培養温度は20〜35℃、培養時間は24〜72時間
程度であり、通気撹拌培養あるいは振盪培養、何れの方
法でも行うことができる。

【００３３】以下、この発明を実施例について具体的に
説明するが、この発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００３４】実施例１ （Ａ）総アラビナンの調製 ビートパルプ3.7Kg に2.5%水酸化カルシウム溶液12L を
加えて90〜100 ℃で12時間加熱し、冷却後酢酸でpH6.0
に調製してから濾布で濾過する。得られた濾液にエタノ
ールを加えて沈殿を生成させ、この沈殿を濾集した後、
水に溶解させてから再度エタノール沈殿を行い、粗アラ
ビナンを得た。粗アラビナンは陽イオン交換樹脂ダイヤ
イオンＰＫ２１６と陰イオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ
３０を用いて脱塩した後乾燥して、総アラビナン55g を
得た。

【００３５】（Ｂ）培養 培地 総アラビナン 10g ペプトン 10g 酵母エキス 5g 硝酸ナトリウム 5g リン酸二カリウム 1g 硫酸マグネシウム七水塩 0.5g 水道水 1000ml pH 7.0

【００３６】500ml 容三角フラスコに上記組成の培地を
それぞれ100ml 取り、予め同培地で前培養しておいたバ
チルス・サブチリスＨ−４の培養液2ml を接種し、30℃
で72時間、220 回転で振盪培養を行った。培養終了後、
培養液を遠心分離（1000RPM)して菌体を除去し、酵素液
とした。2%総アラビナン溶液450 μl(pH6.5,0.1Mリン酸
バッファー）を基質とし、これに酵素液50μl を添加し
て40℃で10分間反応を行って酵素活性を測定したところ
10u /ml であった。ここで酵素活性1uとは、基質の総ア
ラビナンを分解して、１分間に1 μM のアラビノースを
生成する酵素量をいう。

【００３７】（Ｃ）アラビナンの分解例１ 2%総アラビナン液（アラビノース純度72%,0.1Mリン酸バ
ッファー、pH6.5)1.0ml に酵素0.08U を添加して40℃で
18Hr反応後、更に酵素を0.08U 再添加して74Hrまで反応
を継続した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで分
析したところ、総アラビノースの83.3% が遊離生成して
いた。

【００３８】（Ｄ）アラビナンの分解例２ 2.5%総アラビナン液（アラビノース純度71.8%,0.1Mリン
酸バッファー，pH6.5)1.0ml に酵素0.1Uを添加して40℃
で18Hr反応後、更に酵素を0.1U再添加して74Hrまで反応
を継続した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで分
析したところ、総アラビノースの74.5% が遊離生成して
いた。

【００３９】実施例２ 実施例１と同様に培養・除菌して得た培養上澄みに75%
飽和になるように硫安を添加し、4 ℃で一夜放置した
後、生じた沈殿を遠心分離して集めた。この沈殿画分を
pH6.5,0.1Mリン酸バッファーに溶解し、更に同バッファ
ーに対して透析脱塩して粗酵素液を得た。粗酵素液は同
バッファーで酵素活性が15u /ml になるように希釈、調
整した。

【００４０】（Ｅ）アラビナンの分解例３ 2%総アラビナン液（アラビノース純度72%,0.1Mリン酸バ
ッファー，pH6.5)1.0ml に実施例２で調整した粗酵素0.
08U を添加して40℃で18Hr反応後、更に酵素を0.08U 再
添加して74Hrまで反応を継続した。反応液を高速液体ク
ロマトグラフィーで分析したところ、総アラビナン中の
アラビノースの80.2% が遊離生成した。

【００４１】実施例３ （Ｇ）酵素液の調製 財団法人 発酵研究所より購入したIFO3007 株を実施例
１の（Ｂ）と同じ方法で培養し、酵素液を調製し、実施
例１の方法で酵素活性を測定したところ5.3u/ml であっ
た。

【００４２】（Ｈ）アラビナンの分解例４ 2%アラビナン液450 μＬ（アラビノース純度72%,0.1Mリ
ン酸バッファー，pH6.5)に酵素0.07u を添加して45時間
反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し
たところ、総アラビノースの82% が遊離生成した。

【００４３】実施例４ （Ｉ）酵素液の調製 財団法人 発酵研究所より購入したIFO3108 株を実施例
３の（Ｇ）と同様に酵素液を調製した。酵素活性は4.7u
/ml であった。

【００４４】（Ｊ）アラビナンの分解例５ 実施例３の（Ｈ）と同様に2%アラビナン液450 μＬに酵
素0.06u を添加して45時間反応後、反応液を高速液体ク
ロマトグラフィーで分析したところ、総アラビノースの
81% が遊離生成した。

【００４５】実施例５ （Ｉ）酵素液の調製 財団法人 発酵研究所より購入したIFO14140株を実施例
３の（Ｇ）と同様に酵素液を調製した。酵素活性は1.8u
/ml であった。

【００４６】（Ｊ）アラビナンの分解例５ 実施例３の（Ｈ）と同様に2%アラビナン液450 μＬに酵
素0.06u を添加して68時間反応後、反応液を高速液体ク
ロマトグラフィーで分析したところ、総アラビノースの
81% が遊離生成した。

【００４７】実施例６ （Ｉ）酵素液の調製 アメリカタイプカルチャーコレクションより購入したAT
CC6633株を実施例３の（Ｇ）と同様に酵素液を調製し
た。酵素活性は1.7u/ml であった。

【００４８】（Ｊ）アラビナンの分解例５ 実施例３の（Ｈ）と同様に2%アラビナン液450 μＬに酵
素0.06u を添加して72時間反応後、反応液を高速液体ク
ロマトグラフィーで分析したところ、総アラビノースの
82% が遊離生成した。

【００４９】

【発明の効果】以上要するに、この発明はバチルス・サ
ブチリス種菌から得られたビートアラビナン分解酵素を
用いて、ビートパルプ中の総アラビナンを高い分解限度
で分解するものであり、その工業的有用性は大きい。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ビートアラビナンを高分解限度で分解す
   るビートアラビナン分解酵素を高力価で生産するバチル
   ス・サブチリス種菌を培養してビートアラビナン分解酵
   素を得、該酵素を用いてビートアラビノンを分解してア
   ラビノースを得ることを特徴とするビートアラビナンよ
   りアラビノースを製造する方法。
2. 【請求項２】 ビートアラビナンを高分解限度で分解す
   るビートアラビナン分解酵素を高力価で生産するバチル
   ス・サブチリス種菌がバチルス・サブチリス(Bacillus
   subtilis) Ｈ−４（FERM P-15482）、IFO3007、IFO3108、
   IFO3134、IFO3335、IFO3336、IFO14440またはATCC6633、ATC
   C6984、ATCC7003、ATCC7058、ATCC7060、ATCC7067 菌株から
   選ばれた１種または２種以上である請求項１記載の方
   法。