JP2894293B2 - ガラクタナーゼｓ−３９及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−３９ - Google Patents
ガラクタナーゼｓ−３９及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−３９Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規ガラクタナーゼ
及びこれを産生する新規微生物に関する。
及びこれを産生する新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、食物繊維等の分解には酸分解、ア
ルカリ分解又は酵素分解等が用いられてきたが、これら
の方法では単糖類の生成が多く、食物繊維等を改質（例
えば可溶化、低分子化等）やオリゴ糖を目的とする場合
にはその収率が下がる欠点を有している。
ルカリ分解又は酵素分解等が用いられてきたが、これら
の方法では単糖類の生成が多く、食物繊維等を改質（例
えば可溶化、低分子化等）やオリゴ糖を目的とする場合
にはその収率が下がる欠点を有している。
【０００３】食物繊維のなかでも、かんきつ類、じゃが
いも、大豆等の植物由来の繊維はβ−１，４ガラクトシ
ド結合した主鎖を有し、このβ−１，４ガラクトシド結
合を加水分解する酵素としてβ−１，４ガラクタナーゼ
が知られているが、従来知られているβ−１，４ガラク
タナーゼも単糖（ガラクトース）まで分解してしまう。
いも、大豆等の植物由来の繊維はβ−１，４ガラクトシ
ド結合した主鎖を有し、このβ−１，４ガラクトシド結
合を加水分解する酵素としてβ−１，４ガラクタナーゼ
が知られているが、従来知られているβ−１，４ガラク
タナーゼも単糖（ガラクトース）まで分解してしまう。
【０００４】一方、β−１，４ガラクタナーゼを産生す
る微生物としてカビ（例えば、Penicillium citrinum起
源のもの）、バクテリア（例えば Bacillus属起源のも
の）が知られているが、いずれもβ−１，４ガラクトシ
ド結合を加水分解して単糖類（ガラクトース）を生成
し、ガラクトオリゴ糖の生成が少ないものである。
る微生物としてカビ（例えば、Penicillium citrinum起
源のもの）、バクテリア（例えば Bacillus属起源のも
の）が知られているが、いずれもβ−１，４ガラクトシ
ド結合を加水分解して単糖類（ガラクトース）を生成
し、ガラクトオリゴ糖の生成が少ないものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前述したように食物繊
維を酸、アルカリ、酵素等による加水分解を行うと単糖
が多く生成しオリゴ糖の収率が低下する問題があった。
維を酸、アルカリ、酵素等による加水分解を行うと単糖
が多く生成しオリゴ糖の収率が低下する問題があった。
【０００６】本発明者等は(1)食物繊維を加水分解して
も単糖（ガラクトース等）の生成が極めて少なく、高収
率でオリゴ糖（ガラクトオリゴ糖等）を得ることができ
る新規なガラクタナーゼ及び(2)かかるガラクタナーゼ
を産生する新規微生物を目的とした。
も単糖（ガラクトース等）の生成が極めて少なく、高収
率でオリゴ糖（ガラクトオリゴ糖等）を得ることができ
る新規なガラクタナーゼ及び(2)かかるガラクタナーゼ
を産生する新規微生物を目的とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は前記目的を
達成すべく鋭意研究の結果、自然界の土壌から前記目的
に適合した酵素を産生するバチルス属に属する微生物を
スクリーニングでき（表１にBacillus subtilis との相
違点を示す）、目的とするガラクタナーゼを生成・分離
・同定することができ（表〓２にカビ由来及びBacillus
subtilis 由来のガラクタナーゼとの相違点を示す）、
本発明を完成するに至った。
達成すべく鋭意研究の結果、自然界の土壌から前記目的
に適合した酵素を産生するバチルス属に属する微生物を
スクリーニングでき（表１にBacillus subtilis との相
違点を示す）、目的とするガラクタナーゼを生成・分離
・同定することができ（表〓２にカビ由来及びBacillus
subtilis 由来のガラクタナーゼとの相違点を示す）、
本発明を完成するに至った。
【０００８】即ち、本発明は、次の酵素学的性質を有す
るガラクタナーゼＳ−３９である。 a.作用：大豆繊維に作用してガラクトオリゴ糖を生成し
単糖（ガラクトース）を殆ど遊離しない。b.基質特異
性：β−１，４ガラクタンに作用するがβ−１，３ガラ
クタンには作用しない。c.作用ｐＨは３〜12。d.作用温
度は２０〜６５℃。e.最適ｐＨが4.0。f.ｐＨ安定性が
４〜10.5。g.温度安定性が６０℃未満。h.分子量が約3.
6 万。
るガラクタナーゼＳ−３９である。 a.作用：大豆繊維に作用してガラクトオリゴ糖を生成し
単糖（ガラクトース）を殆ど遊離しない。b.基質特異
性：β−１，４ガラクタンに作用するがβ−１，３ガラ
クタンには作用しない。c.作用ｐＨは３〜12。d.作用温
度は２０〜６５℃。e.最適ｐＨが4.0。f.ｐＨ安定性が
４〜10.5。g.温度安定性が６０℃未満。h.分子量が約3.
6 万。
【０００９】又、本発明は、バチルス属に属しガラクタ
ナーゼを産生する次の菌学的性質を有するバチルス エ
スピーＳ−39（微工研菌寄第１１２３０号）。a.生理学
的性質等：(1)脱窒素反応が陰性。(2)グルコースからの
ガス発生性が陽性。
ナーゼを産生する次の菌学的性質を有するバチルス エ
スピーＳ−39（微工研菌寄第１１２３０号）。a.生理学
的性質等：(1)脱窒素反応が陰性。(2)グルコースからの
ガス発生性が陽性。
【００１０】(3)クエン酸の利用においてコーサ培地は
陰性。(4)生育のｐＨ範囲がｐＨ６．８以上。b.(1)嫌気
的生育が陰性、(2)ＶＰテストが陽性、(3)カゼイン加水
分解が陽性。c.硝酸塩の還元が陰性、食塩５〜10％で生
育しない。
陰性。(4)生育のｐＨ範囲がｐＨ６．８以上。b.(1)嫌気
的生育が陰性、(2)ＶＰテストが陽性、(3)カゼイン加水
分解が陽性。c.硝酸塩の還元が陰性、食塩５〜10％で生
育しない。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下はスクリーニングした菌の性
質の内公知のBacillus subtilis と異なる主な性質を表
にしたものである。
質の内公知のBacillus subtilis と異なる主な性質を表
にしたものである。
【００１２】
【表１】菌学的性質 但し、＊1 はBacillus subtilis(バージーズマニュアル
より引用)。
より引用)。
【００１３】＊2はBacillus sp. S-39。 又、以下は、Bacillus sp. S-39 から得たガラクタナー
ゼの酵素的性質の内公知のカビ(Penicillium)由来のも
の、Bacillus subtilis K-50由来のもの、Bacillus sub
tilis var amylosacchariticus、Bacillus subtilis W
T168由来のものとの比較表である。
ゼの酵素的性質の内公知のカビ(Penicillium)由来のも
の、Bacillus subtilis K-50由来のもの、Bacillus sub
tilis var amylosacchariticus、Bacillus subtilis W
T168由来のものとの比較表である。
【００１４】
【表２】酵素的性質 ---------------------------------------------------- 性質 ＊1 ＊2 ＊3 ＊4 ＊5 ---------------------------------------------------- 最適pH 4.0 4.5 6.0 7.0 6.0 pH安定性 4-10.5 4-10 5-9.5 5.5-11 4-8 最適温度℃ 40 55 55 60 50 温度安定性℃ <60 <55 <50 <60 <50 等電点pH 7.1 4.2 8.4 6.9 ー 分子量 (万) 3.6 3.7 3.7 3.5 4.0 ---------------------------------------------------- 尚、基質特異性はβ1,4 ガラクタンで、 ＊1 の反応生成物はGal<<Gal2,Gal3 ＊2の反応生成物はGal,Gal2 ＊3 の反応生成物はGal,Gal2 ＊4 の反応生成物はGal 〜 Gal4 ＊5 の反応生成物はGal 〜 Gal4 又、＊1 はガラクタナーゼS-39、 ＊2 はカビ(Penicillium) 由来のガラクタナーゼ(Agri
c.Biol.Chem,49,3445(1986)引用。
c.Biol.Chem,49,3445(1986)引用。
【００１５】＊3はBacillus subtilis K-50 由来のガ
ラクタナーゼ(Agric.Biol.Chem,35,1891 (1971) 引用。
ラクタナーゼ(Agric.Biol.Chem,35,1891 (1971) 引用。
【００１６】＊4 はBacillus subtilis var amylosacc
harilium由来のガラクタナーゼ (Agric.Biol.Chem,36,1
946(1972) 引用。
harilium由来のガラクタナーゼ (Agric.Biol.Chem,36,1
946(1972) 引用。
【００１７】＊5はBacillus subtilis WT168 由来のガ
ラクタナーゼ J.Biol.Chem.,251,5904(1976)である。
ラクタナーゼ J.Biol.Chem.,251,5904(1976)である。
【００１８】先ず本発明のガラクタナーゼについて説明
する。本発明のガラクタナーゼの酵素学的性質は次の通
りである。a.作用は、大豆繊維に作用してガラクトオリ
ゴ糖を生成し単糖（ガラクトース）を殆ど遊離しない。
b.基質特異性は、β−１，４ガラクタンに作用するがβ
−１，３ガラクタンには作用しない。c.最適温度が４０
℃である。又、ａ最適ｐＨは4.0 、ｐＨ安定性は４〜1
0.5、温度安定性は６０℃未満、等電点ｐＨは7.1 、分
子量は約３．６万（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による）である。又、反応生成物はGal が極めて
少なく( ほとんどない)、Gal2、Gal3を主に生成する。
又、ｐＨ3.5 〜10.0の間でも最適ｐＨの約５０％以上の
相対活性を有し、３０〜６０℃において最適温度での約
５０％以上の相対活性を有する。
する。本発明のガラクタナーゼの酵素学的性質は次の通
りである。a.作用は、大豆繊維に作用してガラクトオリ
ゴ糖を生成し単糖（ガラクトース）を殆ど遊離しない。
b.基質特異性は、β−１，４ガラクタンに作用するがβ
−１，３ガラクタンには作用しない。c.最適温度が４０
℃である。又、ａ最適ｐＨは4.0 、ｐＨ安定性は４〜1
0.5、温度安定性は６０℃未満、等電点ｐＨは7.1 、分
子量は約３．６万（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による）である。又、反応生成物はGal が極めて
少なく( ほとんどない)、Gal2、Gal3を主に生成する。
又、ｐＨ3.5 〜10.0の間でも最適ｐＨの約５０％以上の
相対活性を有し、３０〜６０℃において最適温度での約
５０％以上の相対活性を有する。
【００１９】尚、酵素活性の測定方法及びこれに用いた
緩衝液は次の通りである。 〔酵素活性の測定方法〕１％精製大豆繊維を含有する次
表に示す0.1 Ｍ緩衝液0.5 ｍｌに酵素溶液0.1ｍｌを混
合し、40℃で６０分間反応させた。反応後遠心分離（1
5,000R.P.M.×１分）して得た上澄液中の全糖量をフェ
ノール硫酸法により測定する。この条件下で１分間に１
μmol のガラクトースに相当する糖を生成する酵素量を
１単位と定義する。
緩衝液は次の通りである。 〔酵素活性の測定方法〕１％精製大豆繊維を含有する次
表に示す0.1 Ｍ緩衝液0.5 ｍｌに酵素溶液0.1ｍｌを混
合し、40℃で６０分間反応させた。反応後遠心分離（1
5,000R.P.M.×１分）して得た上澄液中の全糖量をフェ
ノール硫酸法により測定する。この条件下で１分間に１
μmol のガラクトースに相当する糖を生成する酵素量を
１単位と定義する。
【００２０】〔緩衝液〕 ---------------------------------------- ｐＨ範囲 緩衝液 ---------------------------------------- ３〜４ クエン酸緩衝液 ４〜６ 酢酸緩衝液 ６〜８ リン酸緩衝液 8.5〜10.5 グリシン-NaCl-NaOH緩衝液 11〜12 KCL-NaOH緩衝液 ---------------------------------------- 次に本発明の、)ガラクタナーゼを産生する微生物につ
いて説明する。
いて説明する。
【００２１】この微生物の菌学的性質は以下の通りであ
る。 1.形態の顕微鏡観察によれば桿菌である。菌体の大きさ
は0.5 〜0.6 μｍ×3.0 〜4.0 μｍである。菌体の片端
は卵形の内性胞子（0.5 〜1.0 μｍ×1.0 〜2.0 μｍ）
を作る。周鞭毛もあり、運動性を有する。
る。 1.形態の顕微鏡観察によれば桿菌である。菌体の大きさ
は0.5 〜0.6 μｍ×3.0 〜4.0 μｍである。菌体の片端
は卵形の内性胞子（0.5 〜1.0 μｍ×1.0 〜2.0 μｍ）
を作る。周鞭毛もあり、運動性を有する。
【００２２】2.グラム染色性は陽性。 3.抗酸性はない。b.生育状態等（以下数値は重量％）は
以下の通りである。
以下の通りである。
【００２３】(1)肉汁寒天平板培地（Difco Nutrient br
oth0.8 、寒天1.5 、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）での生育
状態は普通。コロニーの形状は、円形又は不規則。表面
は粗野で、周縁は不規則又は波状。色調はやや白色の不
透明で、光沢はやや鈍い。
oth0.8 、寒天1.5 、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）での生育
状態は普通。コロニーの形状は、円形又は不規則。表面
は粗野で、周縁は不規則又は波状。色調はやや白色の不
透明で、光沢はやや鈍い。
【００２４】(2)肉汁寒天斜面培地（肉汁寒天平板培地
と同組成）での生育は普通で、拡布状で、光沢はやや鈍
く、白色の不透明なものである。
と同組成）での生育は普通で、拡布状で、光沢はやや鈍
く、白色の不透明なものである。
【００２５】(3)肉汁液体培地（Difco Nutrient broth
0.8Na2CO3 1.0、pH 10 .0）で生育するが、やや上面に
生育する。
0.8Na2CO3 1.0、pH 10 .0）で生育するが、やや上面に
生育する。
【００２６】次に、c.生理学的性質等はつぎの通りであ
る。 １培地（KNO3０．１、DifcoNutrient broth 0.
8、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）による硝酸塩の還元は、陰
性である。
る。 １培地（KNO3０．１、DifcoNutrient broth 0.
8、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）による硝酸塩の還元は、陰
性である。
【００２７】同培地による脱窒素反応は陰性。 2.培地（ペプトン１．０、ブドウ糖０．５、Na2CO3１．
０、pH１０．０）によるＶＰテストは、バチルス エス
ピーＳ−３９は陽性である。
０、pH１０．０）によるＶＰテストは、バチルス エス
ピーＳ−３９は陽性である。
【００２８】3.培地（ペプトン1.0 、NaCL 0.5、Na2CO3
1.0、pH 10.0 ）によるインドールの生成は陰性。
1.0、pH 10.0 ）によるインドールの生成は陰性。
【００２９】4.培地（Difco Nutrient broth 0.8、Na2C
O31.0 、pH 10.0 ）及び培地（Difco SIM medium指示
量、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）による酢酸鉛紙法、及びSI
M 培地での硫化水素の生成は共に陰性。
O31.0 、pH 10.0 ）及び培地（Difco SIM medium指示
量、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）による酢酸鉛紙法、及びSI
M 培地での硫化水素の生成は共に陰性。
【００３０】5.培地（可溶性澱粉1.0 、ポリペプトン0.
5 、酵母エキス0.5 、K2HPO4 0.1、MgSO4 ・７H2O 0.0
2、寒天1.5 、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）による澱粉の 分
解は陽性。
5 、酵母エキス0.5 、K2HPO4 0.1、MgSO4 ・７H2O 0.0
2、寒天1.5 、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）による澱粉の 分
解は陽性。
【００３１】6.培地（Difco Nutrient broth 0.8、ゼラ
チン0.4 、寒天1.5 、NaOHにてpH10.0に調整）によるゼ
ラチン分解活性は陽性。
チン0.4 、寒天1.5 、NaOHにてpH10.0に調整）によるゼ
ラチン分解活性は陽性。
【００３２】7.培地（スキムミルク 1.0、ポリペプトン
0.5、酵母エキス 0.5、K2HPO4 0.1、MgSO4 ・7H2O 0.0
2、寒天1.5 、Na2CO3 1.0 pH 10.0) によるカゼイン分
解は、陽性である。
0.5、酵母エキス 0.5、K2HPO4 0.1、MgSO4 ・7H2O 0.0
2、寒天1.5 、Na2CO3 1.0 pH 10.0) によるカゼイン分
解は、陽性である。
【００３３】8.クエン酸の利用に関して、(1)コーサ培
地（NH4H2PO4 0.1 、K2HPO4 0.1、クエン酸0.2 、NaCL
0.5 、MgSO4 ・７H2O 0.02、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）は
陰性。しかし、(2)クリステンセン培地（酵母エキス0.0
5、システイン塩酸塩0.01、クエン酸ナトリウム0.3 、N
aCL 0.5、ブドウ糖0.02、KH2PO4 0.1、寒天1.5 、Na2CO
3 1.0、pH 10.0 ）は陽性である。
地（NH4H2PO4 0.1 、K2HPO4 0.1、クエン酸0.2 、NaCL
0.5 、MgSO4 ・７H2O 0.02、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）は
陰性。しかし、(2)クリステンセン培地（酵母エキス0.0
5、システイン塩酸塩0.01、クエン酸ナトリウム0.3 、N
aCL 0.5、ブドウ糖0.02、KH2PO4 0.1、寒天1.5 、Na2CO
3 1.0、pH 10.0 ）は陽性である。
【００３４】9.培地（ブドウ糖1.0 、NaCL 0.5、MgSO4
・７H2O 0.02、K2HPO4 0.1、NH4H2PO4又はKNO3 0.1、Na
HCO3 1.0、pH 9.2）による無機窒素源の利用は硝酸塩、
アンモニウム塩共に陰性。
・７H2O 0.02、K2HPO4 0.1、NH4H2PO4又はKNO3 0.1、Na
HCO3 1.0、pH 9.2）による無機窒素源の利用は硝酸塩、
アンモニウム塩共に陰性。
【００３５】10.培地（可溶性澱粉1.0 、ポリペプトン
0.5 、酵母エキス0.5 、K2HPO4 0.4、MgSO4 ・７H2O 0.
02、寒天1.5 、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）による色素の生
成は陰性。
0.5 、酵母エキス0.5 、K2HPO4 0.4、MgSO4 ・７H2O 0.
02、寒天1.5 、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）による色素の生
成は陰性。
【００３６】11.培地（KH2PO4 0.1、Na2HPO4 0.1 、尿
素2.1、酵母エキス0.01、0.02％フェノールレッド溶液
5.0 、pH7.0 ）によるウレアーゼは陰性。
素2.1、酵母エキス0.01、0.02％フェノールレッド溶液
5.0 、pH7.0 ）によるウレアーゼは陰性。
【００３７】12.培地（可溶性澱粉1.0 、ポリペプトン
0.5 、酵母エキス0.5 、K2HPO4 0.1、MgSO4 ・７H2O 0.
02、寒天1.5 、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）によるオキシダ
ーゼは、陽性である。
0.5 、酵母エキス0.5 、K2HPO4 0.1、MgSO4 ・７H2O 0.
02、寒天1.5 、Na2CO3 1.0、pH 10.0 ）によるオキシダ
ーゼは、陽性である。
【００３８】13.培地（可溶性澱粉１．０、ポリペプト
ン０．５酵母エキス０．５、K2HPO4０．１、MgSO4 ・７
H2O０．０２、寒天１．５、Na2CO3１．０、pH１０．
０）によるカタラーゼは陽性。
ン０．５酵母エキス０．５、K2HPO4０．１、MgSO4 ・７
H2O０．０２、寒天１．５、Na2CO3１．０、pH１０．
０）によるカタラーゼは陽性。
【００３９】14,生育の温度範囲は２５〜４５℃、生育
最適温度範囲は３０〜４０℃が適当である。 (2)生育最適ｐＨ範囲はｐＨ７．５〜９．５が適当であ
り、生育ｐＨ範囲は６．０〜９．５、生育最適ｐＨ範囲
は７．５〜９．５が適当である。
最適温度範囲は３０〜４０℃が適当である。 (2)生育最適ｐＨ範囲はｐＨ７．５〜９．５が適当であ
り、生育ｐＨ範囲は６．０〜９．５、生育最適ｐＨ範囲
は７．５〜９．５が適当である。
【００４０】15.糖類からの酸及びガスの生成の有無は
表３の通りである。
表３の通りである。
【００４１】
【表３】 ---------------------------------------- 糖類 酸生成 ガス生成 ---------------------------------------- (1)Ｌ−アラビノース ＋ ＋ (2)Ｄ−キシロース ＋ ＋ (3)Ｄ−グルコース ＋ ＋ (4)Ｄ−マンノース ＋ ＋ (5)Ｄ−フラクトース ＋ ＋ (6)Ｄ−ガラクトース ＋ ＋ (7)麦芽糖 ＋ ＋ (8)しょ糖 ＋ ＋ (9)乳糖 ＋ ＋ (10)トレハロース ＋ ＋ (11)Ｄ−ソルビット ± ± (12)Ｄ−マンニット ＋ ＋ (13)イノシット ± ± (14)グリセリン ± ± (15)澱粉 ＋ ＋ ---------------------------------------- 16.食塩含有培地における生育は、食塩２％まで生育す
る。
る。
【００４２】17,ジハイドロキシアセトンの生成は陰
性。 以上の菌学的性質についてバージーズ マニュアル（Be
rgy's Manual of Determinative Bacteriology）第８版
を参考にして比較・探索した結果これらの菌は有胞子桿
菌のバチルス（Bacillus）属の一種であると認められる
ものの、公知のバチルス属の菌株の中には一致するもの
がなく、この菌は新菌株であると判断した。これらの菌
株をバチルスエスピーＳ−３９と命名し、微生物工業技
術研究所に奇託した。それは微工研菌寄第１１２３０号
である。
性。 以上の菌学的性質についてバージーズ マニュアル（Be
rgy's Manual of Determinative Bacteriology）第８版
を参考にして比較・探索した結果これらの菌は有胞子桿
菌のバチルス（Bacillus）属の一種であると認められる
ものの、公知のバチルス属の菌株の中には一致するもの
がなく、この菌は新菌株であると判断した。これらの菌
株をバチルスエスピーＳ−３９と命名し、微生物工業技
術研究所に奇託した。それは微工研菌寄第１１２３０号
である。
【００４３】本発明のバチルス属微生物を培地を用いて
培養してガラクタナーゼを産生せしめることができる。
培養してガラクタナーゼを産生せしめることができる。
【００４４】培地に用いる炭素源、窒素源等は資化し得
るものであればいずれも利用できる。例えば炭素源とし
て大豆粕、小麦ふすま等の植物繊維質、廃糖密、澱粉、
各種糖類等、又窒素源として、各種アミノ酸、コーンス
ティープリカー、大豆粉、ペプチド、酵母エキス、尿素
等の窒素含有物を利用することができる。
るものであればいずれも利用できる。例えば炭素源とし
て大豆粕、小麦ふすま等の植物繊維質、廃糖密、澱粉、
各種糖類等、又窒素源として、各種アミノ酸、コーンス
ティープリカー、大豆粉、ペプチド、酵母エキス、尿素
等の窒素含有物を利用することができる。
【００４５】その他必要に応じミネラル、ビタミン等を
適宜用いることができる。本発明のバチルス属微生物を
培養した後、菌体を遠心分離、ろ過等の公知の手段によ
り除去して粗酵素液とすることができる。又、塩析、透
析、限外ろ過等の手段を用い、乾燥等して粗酵素を得る
こともできる。さらに精製して精製酵素とすることもで
きる。
適宜用いることができる。本発明のバチルス属微生物を
培養した後、菌体を遠心分離、ろ過等の公知の手段によ
り除去して粗酵素液とすることができる。又、塩析、透
析、限外ろ過等の手段を用い、乾燥等して粗酵素を得る
こともできる。さらに精製して精製酵素とすることもで
きる。
【００４６】
【実施例】以下実施例により本発明の実施態様を説明す
る。 実施例１ 大阪府泉佐野市付近から採取した土壌約０．５ｇを滅菌
水に懸濁し、分離用寒天培地（＊１）に塗布し、３７℃
で１〜２日間培養しコロニーを形成させた。コロニー周
辺にガラクタンの分解に基づく透明帯（ハロー）を形成
するものを選出し、ガラクタナーゼ生産菌を取得した。
菌学的性質は前記発明の詳細な説明の項に記載した通り
であった。
る。 実施例１ 大阪府泉佐野市付近から採取した土壌約０．５ｇを滅菌
水に懸濁し、分離用寒天培地（＊１）に塗布し、３７℃
で１〜２日間培養しコロニーを形成させた。コロニー周
辺にガラクタンの分解に基づく透明帯（ハロー）を形成
するものを選出し、ガラクタナーゼ生産菌を取得した。
菌学的性質は前記発明の詳細な説明の項に記載した通り
であった。
【００４７】次に、これら取得菌を更に液体培地（＊
２）に接種し３７℃にて２日間振とう培養し、遠心分離
（10,000R.P.M.×１０分）して得た上澄について次の方
法でガラクタナーゼ活性を測定（＊３）した。
２）に接種し３７℃にて２日間振とう培養し、遠心分離
（10,000R.P.M.×１０分）して得た上澄について次の方
法でガラクタナーゼ活性を測定（＊３）した。
【００４８】以上の方法にてガラクターゼ活性の強い菌
をスクリーニングし、その一つバチルス エスピーＳ−
３９を得た。
をスクリーニングし、その一つバチルス エスピーＳ−
３９を得た。
【００４９】 ＊１（寒天培地）・・・ｐＨ１０．０ オカラ〔不二製油〓製「プロプラスＳＡ」〕１％ 酵母エキス ０．５％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０２％ Ｎａ2 ＣＯ3 １％ 寒天 １．５％ ＊２（液体培地）・・・ｐＨ１０．０ オカラ（不二製油〓製「プロプラスＳＡ」）２％ ポリペプトン ０．５％ 酵母エキス ０．５％ ＮａＣｌ ０．５％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０２％ Ｎａ2 ＣＯ3 １％ ＊３（ガラクタナーゼ活性の測定法は前述の酵素活性測
定法） 実施例２ 実施例１で得たバチルス エスピーＳ−３９株を液体培
地（実施例１の＊２と同様）に接種し３７℃で４０日間
振とう培養し、菌体を遠心分離して得た上澄液を粗酵素
ガラクタナーゼＳ−３９とした。ｐＨ４におけるガラク
タナーゼ活性（実施例１の＊３の方法による）は１単位
／ｍｌであった。
定法） 実施例２ 実施例１で得たバチルス エスピーＳ−３９株を液体培
地（実施例１の＊２と同様）に接種し３７℃で４０日間
振とう培養し、菌体を遠心分離して得た上澄液を粗酵素
ガラクタナーゼＳ−３９とした。ｐＨ４におけるガラク
タナーゼ活性（実施例１の＊３の方法による）は１単位
／ｍｌであった。
【００５０】次に、オカラ（「プロプラスＳＡ」，不二
製油〓製）１ｇに前記粗酵素ガラクタナーゼＳ−３９を
２５単位加え、ｐＨ４．０（５ｍＭの酢酸緩衝液で反応
液量は５０ｍｌ）で６時間反応させた。
製油〓製）１ｇに前記粗酵素ガラクタナーゼＳ−３９を
２５単位加え、ｐＨ４．０（５ｍＭの酢酸緩衝液で反応
液量は５０ｍｌ）で６時間反応させた。
【００５１】反応後１００℃で３分間加熱して酵素失活
させ、エタノール１５０ｍｌ加え、沈澱画分を遠心分離
（６０００Ｒ．Ｐ．Ｍ．×１０分）して除き、上澄を減
圧濃縮し４６％の収率でガラクトオリゴ糖を得た。
させ、エタノール１５０ｍｌ加え、沈澱画分を遠心分離
（６０００Ｒ．Ｐ．Ｍ．×１０分）して除き、上澄を減
圧濃縮し４６％の収率でガラクトオリゴ糖を得た。
【００５２】得られたガラクトオリゴ糖をＨＰＬＣ（高
速液体クロマトグラフィー）にて下記条件にて分析した
ところ、ガラクトビオース２８％、ガラクトトリオース
５４％、ガラクトテトラオース１５％、ガラクトペンタ
オース３％でガラクトースは認められなかった。
速液体クロマトグラフィー）にて下記条件にて分析した
ところ、ガラクトビオース２８％、ガラクトトリオース
５４％、ガラクトテトラオース１５％、ガラクトペンタ
オース３％でガラクトースは認められなかった。
【００５３】（ＨＰＬＣ条件） カラム：センシューパック（ＮＨ2 −１２５１Ｎ）¢
４．６×２５０ｍｍ カラム温度：室温 溶出液：アセトニトリル／水＝２／１（V/V ） 流 速：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：示差屈折計 比較例１ 市販セルラーゼ（Sigma 社製のPenicillium 属起源のも
の）及び市販セルラーゼ（協和醗酵工業〓製Polyporus
属起源のもの）をそれぞれ２５単位づつ実施例２と同様
にしてオカラに加え、ｐＨ４.５にて６時間反応させ、
オリゴ糖を得た。
４．６×２５０ｍｍ カラム温度：室温 溶出液：アセトニトリル／水＝２／１（V/V ） 流 速：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：示差屈折計 比較例１ 市販セルラーゼ（Sigma 社製のPenicillium 属起源のも
の）及び市販セルラーゼ（協和醗酵工業〓製Polyporus
属起源のもの）をそれぞれ２５単位づつ実施例２と同様
にしてオカラに加え、ｐＨ４.５にて６時間反応させ、
オリゴ糖を得た。
【００５４】ＨＰＬＣにより分析した結果、前者は収率
５４％、糖としてガラクトースがほぼ１００％であっ
た。後者は収率５７％、糖はガラクトース４４％、ガラ
クトビオース２６％、ガラクトトリオース２４％、ガラ
クトテトラオース６％であった。 実施例３ β−１，３ガラクタンには作用しない例。
５４％、糖としてガラクトースがほぼ１００％であっ
た。後者は収率５７％、糖はガラクトース４４％、ガラ
クトビオース２６％、ガラクトトリオース２４％、ガラ
クトテトラオース６％であった。 実施例３ β−１，３ガラクタンには作用しない例。
【００５５】実施例１と同様にしで得られたガラクタナ
ーゼＳ−３９をβ−１，３ガラクタン（Sigma 社製）に
それぞれ実施例２と同様の条件で作用させたが分解しな
かった。 実施例４ （最適ｐＨ及びｐＨ安定性）前記〔酵素活性測定法〕に
より、実施例１と同様にして得られたガラクタナーゼＳ
−３９の最適ｐＨを調べた。結果を図１に示す。
ーゼＳ−３９をβ−１，３ガラクタン（Sigma 社製）に
それぞれ実施例２と同様の条件で作用させたが分解しな
かった。 実施例４ （最適ｐＨ及びｐＨ安定性）前記〔酵素活性測定法〕に
より、実施例１と同様にして得られたガラクタナーゼＳ
−３９の最適ｐＨを調べた。結果を図１に示す。
【００５６】又、各々のｐＨで20℃、15時間保持した後
の残存活性を測定してｐＨ安定性を調べた結果を図２に
示す。 実施例５ （最適温度度及び温度安定性）実施例１と同様にして得
られたガラクタナーゼＳ−３９の最適温度及び温度安定
性（各温度で15分間処理した後の残存活性を測定) を前
記〔酵素活性測定法〕により調べた。結果を図３、図４
に示す。 実施例６ 実施例１と同様にして得られたガラクタナーゼＳ−３９
を次記クロマトグラフィー法により精製し、ＳＤＳポリ
クリルアミドゲル電気泳動法によりマーカーと共に電気
泳動したところ図５に示すように単一ピークを示した。
これよりガラクタナーゼＳ−３９は分子量約３．６万で
あることがわかった。 〔クロマトグラフィー法による精製〕 (1)ガラクタナーゼS-39の場合。
の残存活性を測定してｐＨ安定性を調べた結果を図２に
示す。 実施例５ （最適温度度及び温度安定性）実施例１と同様にして得
られたガラクタナーゼＳ−３９の最適温度及び温度安定
性（各温度で15分間処理した後の残存活性を測定) を前
記〔酵素活性測定法〕により調べた。結果を図３、図４
に示す。 実施例６ 実施例１と同様にして得られたガラクタナーゼＳ−３９
を次記クロマトグラフィー法により精製し、ＳＤＳポリ
クリルアミドゲル電気泳動法によりマーカーと共に電気
泳動したところ図５に示すように単一ピークを示した。
これよりガラクタナーゼＳ−３９は分子量約３．６万で
あることがわかった。 〔クロマトグラフィー法による精製〕 (1)ガラクタナーゼS-39の場合。
【００５７】ガラクタナーゼ粗酵素液500mｌに硫安80％
飽和となるように硫安を加え、生じた沈澱を8,000R.P.
M. ×10分遠心分離して集め、20 mｌの水に溶解した。2
0mMリン酸緩衝液(pH 7.0)に対して、4 ℃で24時間透析
をした後、同緩衝液で平衡化したDEAEToyopearl （東ソ
ー製）カラム（Φ1.6 ×21 cm)にかけ、同緩衝液で溶出
した。
飽和となるように硫安を加え、生じた沈澱を8,000R.P.
M. ×10分遠心分離して集め、20 mｌの水に溶解した。2
0mMリン酸緩衝液(pH 7.0)に対して、4 ℃で24時間透析
をした後、同緩衝液で平衡化したDEAEToyopearl （東ソ
ー製）カラム（Φ1.6 ×21 cm)にかけ、同緩衝液で溶出
した。
【００５８】非吸着画分を集め、分画分子量が１万以下
の限外濾過膜（アミコン社製）で濃縮し、20mM酢酸緩衝
液(pH 5.0)に対して4 ℃で24時間透析した。この後、同
緩衝液で平衡化したCM Toyopearl( 東ソー製) カラム(
Φ1.6 ×21 cm)にかけ、吸着させた。同緩衝液で洗浄し
た後、同緩衝液と塩化ナトリウムを用いたイオン強度0
〜0.4 のリニアグラディエント法により溶出を行い、1.
8mｌづつ分取し、前記酵素活性測定法にて酵素活性を測
定してガラクタナーゼ活性画分を得た。この酵素液を蒸
留水に対して４℃で24時間透析し、凍結乾燥して約２mg
の精製酵素を得た。
の限外濾過膜（アミコン社製）で濃縮し、20mM酢酸緩衝
液(pH 5.0)に対して4 ℃で24時間透析した。この後、同
緩衝液で平衡化したCM Toyopearl( 東ソー製) カラム(
Φ1.6 ×21 cm)にかけ、吸着させた。同緩衝液で洗浄し
た後、同緩衝液と塩化ナトリウムを用いたイオン強度0
〜0.4 のリニアグラディエント法により溶出を行い、1.
8mｌづつ分取し、前記酵素活性測定法にて酵素活性を測
定してガラクタナーゼ活性画分を得た。この酵素液を蒸
留水に対して４℃で24時間透析し、凍結乾燥して約２mg
の精製酵素を得た。
【００５９】
【発明の効果】以上説明したように、本発明により、
(1)β−１，４ガラクタンに作用してガラクトースを殆
ど生成せず高収率でガラクトオリゴ糖を生成する新規な
ガラクタナーゼが可能になり、又(2)かかるガラクタナ
ーゼを産生する新規微生物が可能になったものである。
(1)β−１，４ガラクタンに作用してガラクトースを殆
ど生成せず高収率でガラクトオリゴ糖を生成する新規な
ガラクタナーゼが可能になり、又(2)かかるガラクタナ
ーゼを産生する新規微生物が可能になったものである。
【図面の簡単な説明】 「
【 図１】」はガラクタナーゼＳ−３９の最適ｐＨを示
す図面である 「
す図面である 「
【 図２】」はガラクタナーゼＳ−３９のｐＨ安定性を
示す図面である 「
示す図面である 「
【 図３】」はガラクタナーゼＳ−３９の最適温度を示
す図面である 「
す図面である 「
【図４】」はガラクタナーゼＳ−３９の温度安定性を示
す図面である 「
す図面である 「
【図５】」はガラクタナーゼＳ−３９のＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動パターンを示す図面である。
リルアミドゲル電気泳動パターンを示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (2)
- 【請求項１】次の酵素学的性質を有するガラクタナーゼ
Ｓ−３９ a.作用 大豆繊維に作用してガラクトオリゴ糖を生成し単糖（ガ
ラクトース）を殆ど遊離しない。 b.基質特異性 β−１，４ガラクタンに作用するがβ−１，３ガラクタ
ンには作用しない。 c.作用ｐＨは３〜12。 d.作用温度は２０〜６５℃。 e.最適ｐＨが4.0 f.ｐＨ安定性が４〜10.5 g.温度安定性が６０℃未満 h.分子量が約3.6 万 - 【請求項２】バチルス属に属しガラクタナーゼを産生す
る次の菌学的性質を有するバチルス エスピーＳ−39
（微工研菌寄第１１２３０号）。 a.生理学的性質等 (1)脱窒素反応が陰性。 (2)グルコースからのガス発生性が陽性。 (3)クエン酸の利用においてコーサ培地は陰性。 (4)生育のｐＨ範囲がｐＨ６．８以上。 b.(1)嫌気的生育が陰性、 (2)ＶＰテストが陽性、 (3)カゼイン加水分解が陽性。 c.硝酸塩の還元が陰性、食塩５〜10％で生育しない。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8244364A JP2894293B2 (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | ガラクタナーゼｓ−３９及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−３９ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8244364A JP2894293B2 (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | ガラクタナーゼｓ−３９及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−３９ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2040627A Division JP2615236B2 (ja) | 1990-02-20 | 1990-02-20 | ガラクタナーゼｓ―１及びこれを産生するバチルスエスピーｓ―１ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121853A JPH09121853A (ja) | 1997-05-13 |
| JP2894293B2 true JP2894293B2 (ja) | 1999-05-24 |
Family
ID=17117603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8244364A Expired - Fee Related JP2894293B2 (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | ガラクタナーゼｓ−３９及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−３９ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2894293B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
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|---|---|---|---|---|
| WO2001059083A1 (en) * | 2000-02-08 | 2001-08-16 | Novozymes A/S | Bacterial galactanases and use thereof |
| JP4384656B2 (ja) | 2003-06-30 | 2009-12-16 | クラサド インコーポレイテッド | 新規のガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせるビフィドバクテリウムビフィダムの新規株 |
| GB0525857D0 (en) | 2005-12-20 | 2006-02-01 | Product and process | |
| GB0601901D0 (en) | 2006-01-31 | 2006-03-08 | Product and Process | |
| GB0606112D0 (en) | 2006-03-28 | 2006-05-03 | Product and process | |
| BRPI0925002A2 (pt) | 2009-05-27 | 2016-06-21 | Clasado Inc | uso de uma composição para a prevenção de diarréia |
-
1996
- 1996-09-17 JP JP8244364A patent/JP2894293B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH09121853A (ja) | 1997-05-13 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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