JP4392488B2 - 新規キシラナーゼ、該キシラナーゼを産生するフリゴリバクテリウム属細菌、及び該キシラナーゼの産生方法 - Google Patents
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(1)フリゴリバクテリウム属sp.SOL−U1(FERM P−19528)又はフリゴリバクテリウム属sp.TDL−K01(FERM P−19529)であるキシラン分解性細菌。
(2)上記(1)に記載のキシラン分解性細菌を、キシラン 0.5%、ポリペプトン 0.5%、酵母エキス 0.5%、MgSO4・7H2O 0.02%、K2HPO4 0.1%からなる液体培地100mlにK2CO3 10%水溶液を10ml添加し、その後pHをおよそ10.0に調整した増殖培地に、1白金耳植菌し、27℃で60時間往復振盪培養した後、4℃にて遠心分離(10000rpm×10分)して培養上清を分離して得られるキシラナーゼ粗酵素であって、4から12のいずれのpHでも作用することを特徴とするキシラナーゼ粗酵素。
(3)上記(1)に記載のキシラン分解性細菌を培養することを含むことを特徴とするキシラナーゼ粗酵素の産生方法。
(4)上記(1)に記載のキシラン分解性細菌又は上記(2)等に記載のキシラナーゼ粗酵素を含有することを特徴とするキシラン又はキシランを構成要素とする多糖を含む材料を処理するためのキシラン処理剤。
(5)上記(1)に記載のキシラン分解性細菌、上記(2)等に記載のキシラナーゼ粗酵素、又は上記(4)等に記載のキシラン処理剤をパルプに作用させることを特徴とするパルプの処理方法。
(菌株について)
本発明の微生物は、キシラナーゼの生産能を有するフリゴリバクテリウム属の細菌であり、好ましくは当該キシラナーゼが、4から12のいずれのpHでも作用すること、更にはpH9.0、45℃で1時間処理した後の残存キシラナーゼ活性が、処理前活性の少なくとも60%であるキシラナーゼを産生する細菌である。
本発明の微生物は、好ましくはFERM P-19528又はFERM P-19529である。本発明の微生物は更に、FERM P-19528又はFERM P-19529から得られた、配列番号6又は7に規定される配列と少なくとも95%、好ましくは少なくとも99%の相同性を有する配列を16SrDNAとして有することを特徴とするフリゴリバクテリウム属細菌とすることもできる。
本発明は、4から12の何れのpHでも作用することを特徴とするキシラナーゼを提供するものである。ここで「作用」とは、キシラナーゼが、キシラン、又はキシランを構成要素とする多糖を基質として分解することを意味し、より具体的には、例えば下記の「キシラン分解活性測定」に示される方法における活性を有していることを意味する。本発明のキシラナーゼは、公知のキシラナーゼが作用する中性領域のみならず、アルカリ性の条件下でも作用することが可能であり、少なくとも4から12の範囲内においては有意な活性を有している。更に本発明のキシラナーゼは、少なくとも5〜60℃の範囲内において活性を示し、55℃前後において高い活性を有している。
本発明のキシラナーゼは更に、pH9.0、45℃で1時間処理した後の残存キシラナーゼ活性が、処理前活性の少なくとも60%、好ましいものでは少なくとも80%であり、公知のキシラナーゼと比較してアルカリにおける安定性が非常に高いものとなっている。
本発明のキシラナーゼは、本願に開示される細菌に限らず、どのような手段によって産生してもよいが、本発明のフリゴリバクテリウム属細菌、より具体的には、FERM P-19528又はFERM P-19529により産生させるか、或いは、FERM P-19528又はFERM P-19529から得られた、配列番号6又は7に規定される配列と少なくとも95%、好ましくは少なくとも99%の相同性を有する配列を16SrDNAとして有することを特徴とするフリゴリバクテリウム属細菌により産生させることも可能である。
本発明は更に、本発明のキシラナーゼを含有し、キシラン、又はキシランを構成要素とする多糖を含む材料を処理するためのキシラン処理剤をも提供する。ここで、「処理する」とは、キシラン、又はキシランを構成要素とする多糖を基質として分解する工程にかけることを意味し、より具体的には、例えば下記の「キシラン分解活性測定」に示される方法において示されるような活性を利用してキシラン等を含有する材料を分解することを意味する。
本発明のパルプの処理方法においては、本発明のキシラナーゼ、及び本発明のキシラン処理剤を使用することができる。本発明のパルプ処理方法の具体的用途としては、古紙再生方法におけるパルプの漂白を挙げることができる。
パルプの処理方法においては、例えば
(1)印刷古紙に水を加える工程;
(2)印刷古紙をパルパーにかけて当該古紙を離解する工程;
(3)パルパー処理物の水分濃度を65乃至90%の範囲にまで濃縮する工程;
(4)パルパー処理物のpHを4乃至12、好ましくは5乃至11、更に好ましくは6乃至10.5、最も好ましくは8乃至10の範囲にする工程;
(5)本発明のキシラナーゼ又はキシラン処理剤を添加する工程;
を行うことによりパルプ漂白を行うことができる。
本発明のフリゴリバクテリウム属菌株は、次のようにして分離した。
スクリーニング源として甲虫幼虫を選び、甲虫幼虫の糞及び生息する腐葉土を下記表1に示す選択培地組成のうち寒天を除いた液体培地に加えて30℃の恒温振盪機にて2〜3日間集積培養後、表1に示す選択培地を用い30℃の恒温機にて培養しキシラン分解菌の単離を行った。この選択培地は、キシラン以外の炭素源が最小限に抑えられており、キシラン分解性の細菌が選択的に増殖するものとなっている。
B.菌学的性質
上記の寄託された二つの菌株の菌学的性質は以下のとおりであった。
フリゴリバクテリウム属sp.SOL-U1を、上記表1の増殖培地において28℃で生育させ、非特許文献13乃至15に記載された方法に基づいて調べた。
(ア)細胞の形及び大きさ:桿菌で大きさは1μm以下
細胞の多形性:なし
(ウ)運動性:なし
(エ)胞子形成能:なし
(オ)グラム染色性:陽性。
(ア)肉汁寒天平板培養:通常条件のpH 7.2では生育状態不良、pH10.0で良く生育し、以下の生育状況を示す。
表面状態 平滑
色 黄色の半透明
周縁 全縁
(イ)肉汁寒天斜面培養:通常条件のpH7.2では生育不良、pH10.0では良く生育し、以下の生育状況を示す。
なめらかなつやつやとして帯状に生育する
(ウ)肉汁液体培養:pH7.2では混濁無し、液面の生育無し、沈殿無し。
pH10.0では培地全体の生育及び沈殿が認められる。
表面被膜の形成はない。
(エ)肉汁ゼラチン穿刺培養:試験用培地pH7.2に生育せず、液化しない。(−)
pH10.0の培地では生育し、液化する。(+)
(オ)リトマスミルク:生育しない。
生育範囲:pHアルカリ性(pH9〜10)付近で生育し、中性では生育しない。温度4〜37℃で生育する
酸素に対する態度:絶対好気性。
コロニー形態:コロニー表面形状は平滑、コロニーの形は円形、コロニーの隆起は凸状、コロニー周辺の形状は全縁
(イ)細胞壁組成:糖組成・・・ラムノース、ガラクトース
ジアミノ酸・・・ジアミノピメリン酸−
アシル型・・・アセチル型:N-アセチルムラミン酸
リン脂質・・・PG=PE>PS>UN(3種)
(*)PG:フォスファチジルグリセロール、PE:フォスファチジルエタノールアミン、PS:フォスファチジルセリン、UN:未知物質
(ウ)キノン分析:メジャーキノン・・・MK-10
マイナーキノン・・・MK-12、MK-13、MK-11、MK-9、MK-8
(エ)GC含量:0.667
(ア)細胞の形及び大きさ: 桿菌で大きさは1μm以下
細胞の多形性:なし
運動性:なし
胞子形成能:なし。
グラム染色性:陽性。
(ア)肉汁寒天平板培養:通常条件のpH 7.2では生育状態不良、pH10.0で良く生育し、以下の生育状況を示す。
表面状態 平滑
色 黄色の半透明
周縁 全縁
(イ)肉汁寒天斜面培養:通常条件のpH7.2では生育不良、pH10.0では良く生育し、以下の生育状況を示す。
なめらかなつやつやとして帯状に生育する
(ウ)肉汁液体培養:pH7.2では混濁無し、液面の生育無し、沈殿無し。
pH10.0では培地全体の生育及び沈殿が認められる。
表面被膜の形成はない。
(エ)肉汁ゼラチン穿刺培養:試験用培地pH7.2に生育せず、液化しない。(−)
pH10.0の培地では生育し、液化する。(+)
(オ)リトマスミルク:生育しない。
(ア)生育範囲:pHアルカリ性(pH9〜10)付近で生育し、中性では生育しない。温度4〜37℃で生育する
(イ)酸素に対する態度: 絶対好気性。
(ア)コロニー形態:コロニー表面形状は平滑、コロニーの形は円形、コロニーの隆起は凸状、コロニー周辺の形状は全縁
(イ)細胞壁組成:糖組成・・・ラムノース、ガラクトース
ジアミノ酸・・・ジアミノピメリン酸−
アシル型・・・アセチル型:N-アセチルムラミン酸
リン脂質・・・PG=PE>PS>UN(3種)
(ウ)キノン分析:メジャーキノン・・・MK-10
マイナーキノン・・・MK-12、MK-13、MK-11、MK-9、MK-8
(エ)GC含量:0.685
上記の二つの寄託済菌株についての、キシラナーゼ活性の測定方法及び結果は以下のとおりであった。
キシラナーゼ粗酵素液の調製
キシラン 0.5%、ポリペプトン 0.5%、酵母エキス 0.5%、MgSO4・7H2O 0.02%、K2HPO4 0.1%、からなる液体培地を300ml容三角フラスコに100ml仕込み、シリコン栓をした後、121℃で20分間オートクレーブ殺菌した。冷却後、別殺菌したK2CO3 10%水溶液をクリーンベンチ内で10ml添加(培地中1%濃度に相当)し、培地pHをおよそ10.0に調整した(表1に記載の増殖培地のうち寒天を除いたものに相当)。その後フリゴリバクテリウム属sp.SOL-U1株(FERM−19528)を1白金耳植菌し、27℃で往復振盪培養した。60時間培養終了後、冷却付遠心分離機にて4℃にて遠心分離(10000rpm×10分)して培養上清を分離し、キシラナーゼU1粗酵素液を得た。
同様の方法により、フリゴリバクテリウム属sp.TDL-KO1株(FERM−19529)を用いてキシラナーゼKO1粗酵素液を得た。
尚、本明細書においては、上記フリゴリバクテリウム属sp.SOL-U1及びフリゴリバクテリウム属sp.TDL-KO1により生産されるキシラナーゼを各々キシラナーゼU1及びキシラナーゼKO1と呼ぶ。
上記のようにして得た二種類のキシラナーゼ粗酵素液について、キシラン分解活性を以下の条件、方法で調べた。
活性測定条件(酵素反応液 1mL)
基質濃度:0.5%還元β−1,4−キシラン(キシランの還元末端をNaBH4で還元してバックグラウンドを低く抑えた基質)
緩衝液:25mM GTA緩衝液、pH9.0
酵素添加量:50μg(1mg・mL水溶液50μL)
反応温度:30℃
反応時間:15min以上18時間までの適当な時間
定量方法:Somogyi−Nelson法またはDNS法
酵素活性1Uは1分間に1マイクロモル(μmol)に相当する還元糖を生成する酵素量をいうものとする。
30℃で一定時間酵素反応後Somogyi−Nelson法の銅試薬を1ml加えて反応を停止させ、100℃で15分間加熱後、5分間氷冷し、Nelson試薬を1ml加え、よく撹拌してから室温で15分間放置し発色させた。3000rpm、15分間の遠心で未反応のキシランを沈殿させ、上澄みの吸光度を500nmで測定した。反応時間ゼロで銅試薬を添加した反応液を対照試験として用い、標準物質としてはキシロース100μgを使用し、キシランの代わりにキシロースを添加した反応液の発色を基準にユニット数を計算した。
<酵素活性>
キシラナーゼ粗酵素液のキシラン分解活性を測定した結果、60時間培養液のキシラナーゼU1粗酵素の活性は約0.24mU/mgであり、キシラナーゼKO1粗酵素の活性は約0.23mU/mgであった。
<作用>
キシランまたはキシラン系多糖に作用し、そのβ−1,4−キシロシド結合を加水分解してキシロースを生成した。
<至適pH範囲>
キシラナーゼU1はpH4未満から12の間で活性があった。キシラナーゼKO1は、pH4未満から12の間で活性があった。(図1及び2)。双方共に、特にpHが8〜10の範囲で活性が高かった。
<作用温度及び至適温度範囲>
キシラナーゼU1及びKO1はともに55℃で最も高い活性を示した。30℃での活性を100%として各温度での比活性を比較すると50〜55℃の間で250%という高い活性を示した(図3及び4)。
<安定性>
キシラナーゼU1及びKO1はともにpH9.0、45℃、1時間の加熱ではほとんど失活せず、特にキシラナーゼKO1では80%以上の高活性を維持していた(図5及び6)。
キシラナーゼU1及びKO1はともにpH4〜12の間でほとんど失活せず、pH4〜10.5の間で80%以上の高活性を維持していた(図7及び8)。
pH9.0のGTA緩衝液または炭酸水素ナトリウム緩衝液を用いて45℃以下で1時間保持した後の残存キシラナーゼ活性を測定した場合、60%以上、特にすぐれたものは80%以上の活性を維持した。特にキシラナーゼU1では30℃で100%以上の活性を維持し、37℃では90%以上の活性を維持し、45℃では80%以上の活性を維持した。一方、キシラナーゼKO1は30℃で98%以上の活性を維持し、37℃では90%以上の活性を維持し、45℃では85%以上の活性を保持していた。
寄託した二つの菌株よりDNAを取得し、これをテンプレートとしてPCRにより16SrDNAの配列を増幅させた。PCRに使用したプライマーの配列を配列番号1乃至5に示した。配列番号1の配列は、16SrDNAの最後の部分(約1500bp付近)から前方へ向かうものであり、配列番号2の配列は、0bpから後方へ向かうものであり、配列番号3の配列は、338bp付近から後方へ向かうものであり、配列番号4の配列は、786bp付近から前方へ向かうものであり、配列番号5に記載の配列は、786bp付近から後方へ向かうものである。
PCRは、95℃で10分間処理した後、95℃で1分間、58℃で1分間、72℃で2分間の処理を35サイクル行い、72℃で10分間処理した後、4℃で試料を保存した。
PCR後、増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動にかけ、目的とするバンドを切り出し、GENE CLEAN(Bio 101 Systems社製)をマニュアルに記載されているようにして使用してDNAを精製した。
精製したDNA試料を用いて配列を決定した。まずDNA試料を100℃で8分間煮沸してから反応液に入れた。配列決定反応条件は、96℃ホットスタート、96℃で30秒間、50℃で15秒間、60℃で4分間を24サイクル行い、4℃で保存した。これをシークエンサーにかけて配列を決定した。得られた結果を配列番号6及び7に示した。
上記の菌学的性質から、両菌株の分類学的地位を非特許文献13乃至15に従い検索し、両菌株とも黄色のコロニーをつくるグラム陽性桿菌であること、好気性であること、胞子を形成しないこと等の観点から、そして、キシラナーゼ産生能、及び上記の16SrDNAの解析結果から、更に特許文献10乃至12に記載の公知のフリゴリバクテリウム属の種の特徴との比較から、我々出願人は、本発明において同定された菌株がフリゴリバクテリウム属(Frigoribacterium)に属する細菌であると定義した。
<223>
この配列を有する菌株の菌学的性質を非特許文献13乃至15に従い検索し、黄色のコロニーをつくるグラム陽性桿菌であること、好気性であること、胞子を形成しないこと等の観点から、そして、キシラナーゼ産生能を有するという観点から、更に特許文献10乃至12に記載の公知のフリゴリバクテリウム属の種の特徴との比較から、我々出願人は、この配列を16SrDNAの配列として有する菌株がフリゴリバクテリウム属(Frigoribacterium)に属する細菌であるとした。
<210> SEQ ID NO: 7
<223>
この配列を有する菌株の菌学的性質を非特許文献13乃至15に従い検索し、黄色のコロニーをつくるグラム陽性桿菌であること、好気性であること、胞子を形成しないこと等の観点から、そして、キシラナーゼ産生能を有するという観点から、更に特許文献10乃至12に記載の公知のフリゴリバクテリウム属の種の特徴との比較から、我々出願人は、この配列を16SrDNAの配列として有する菌株がフリゴリバクテリウム属(Frigoribacterium)に属する細菌であるとした。
Claims (8)
- フリゴリバクテリウム属sp.SOL−U1(FERM P−19528)又はフリゴリバクテリウム属sp.TDL−K01(FERM P−19529)であるキシラン分解性細菌。
- フリゴリバクテリウム属sp.SOL−U1(FERM P−19528)又はフリゴリバクテリウム属sp.TDL−K01(FERM P−19529)から選ばれるキシラン分解性細菌を、
キシラン 0.5%、ポリペプトン 0.5%、酵母エキス 0.5%、MgSO4・7H2O 0.02%、K2HPO4 0.1%からなる液体培地100mlにK2CO3 10%水溶液を10ml添加し、その後pHをおよそ10.0に調整した増殖培地に、1白金耳植菌し、27℃で60時間往復振盪培養した後、4℃にて遠心分離(10000rpm×10分)して培養上清を分離して得られるキシラナーゼ粗酵素であって、
4から12のいずれのpHでも作用することを特徴とするキシラナーゼ粗酵素。 - pH9.0、45℃で1時間保持した後の残存キシラナーゼ活性が、処理前活性の少なくとも60%である請求項2に記載のキシラナーゼ粗酵素。
- 請求項1に記載のキシラン分解性細菌を培養することを含むことを特徴とするキシラナーゼ粗酵素の産生方法。
- 請求項1に記載のキシラン分解性細菌又は請求項2もしくは3に記載のキシラナーゼ粗酵素を含有することを特徴とするキシラン又はキシランを構成要素とする多糖を含む材料を処理するためのキシラン処理剤。
- 前記材料がパルプである請求項5に記載のキシラン処理剤。
- 請求項1に記載のキシラン分解性細菌、請求項2もしくは3に記載のキシラナーゼ粗酵素、又は請求項5もしくは6に記載のキシラン処理剤をパルプに作用させることを特徴とするパルプの処理方法。
- 前記キシラン分解性細菌、キシラナーゼ粗酵素又はキシラン処理剤をパルプに作用させる前に、パルプのpHを4乃至12の範囲に調整する工程を含む請求項7に記載のパルプの処理方法。
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