JPH1088A - 酵素の製造方法 - Google Patents
酵素の製造方法Info
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- JPH1088A JPH1088A JP15445196A JP15445196A JPH1088A JP H1088 A JPH1088 A JP H1088A JP 15445196 A JP15445196 A JP 15445196A JP 15445196 A JP15445196 A JP 15445196A JP H1088 A JPH1088 A JP H1088A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】酵素、特にアルカリ性で活性を有するマンナナ
ーゼを効率よく産生させる方法を提供する。 【解決手段】酵素を生産する菌を、中性で培養した後、
培地をアルカリ性に変更して培養し、該培養物から酵素
を得ることを特徴とする酵素の製造方法。
ーゼを効率よく産生させる方法を提供する。 【解決手段】酵素を生産する菌を、中性で培養した後、
培地をアルカリ性に変更して培養し、該培養物から酵素
を得ることを特徴とする酵素の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、菌が製造する酵素
の新規製造方法に関するものである。さらに詳しくは、
アルカリ性領域で活性を有する酵素を効率よく製造する
方法に関するものである。
の新規製造方法に関するものである。さらに詳しくは、
アルカリ性領域で活性を有する酵素を効率よく製造する
方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、地球環境の保全に関心が集まり、
塩素系漂白薬品により漂白パルプを製造する際に排出さ
れる排液に、パルプの漂白反応により微量生成する有害
な有機塩素化合物が含まれているため、元素状塩素を使
用しない漂白方法であるＥＣＦ法や、塩素系漂白薬品を
使用しないＴＣＦ法が実施されてきている。元素状塩素
または塩素系漂白薬品を使用しない漂白法では、通常、
未晒パルプに酸素漂白を実施し、その後二酸化塩素漂
白、酸素過酸化水素漂白、オゾン漂白等が実施されてい
る。
塩素系漂白薬品により漂白パルプを製造する際に排出さ
れる排液に、パルプの漂白反応により微量生成する有害
な有機塩素化合物が含まれているため、元素状塩素を使
用しない漂白方法であるＥＣＦ法や、塩素系漂白薬品を
使用しないＴＣＦ法が実施されてきている。元素状塩素
または塩素系漂白薬品を使用しない漂白法では、通常、
未晒パルプに酸素漂白を実施し、その後二酸化塩素漂
白、酸素過酸化水素漂白、オゾン漂白等が実施されてい
る。
【０００３】一部では、酸素漂白後の漂白薬品の使用量
を減少させるため、酸素漂白後ヘミセルラーゼ処理し、
ヘミセルロースを加水分解して、ヘミセルロースとリグ
ニンの結合物を溶離させる工程が実施されている。酸素
漂白は一般的にアルカリ性で実施され、酸素漂白後のパ
ルプスラリーのｐＨは１１近辺にあり、高アルカリ性で
ある。しかし、現在、一般に市販されているヘミセルラ
ーゼ（キシラナーゼ、マンナナーゼ等）の至適ｐＨは、
弱酸性〜中性〜弱アルカリ性のものしか市販されていな
かった。これらのヘミセルラーゼを使用して強アルカリ
領域で使用すると、ヘミセルラーゼの活性が失われ、期
待するヘミセルラーゼの効果が得られないことになる。
アルカリ性漂白である酸素漂白に続く漂白に、アルカリ
性漂白である過酸化水素漂白等を採用する場合、ヘミセ
ルラーゼを使用して後段の漂白薬品の使用量を減少させ
るためには、酸素漂白後のパルプを中性付近まで酸で中
和する必要があり、多大な中和用薬品を必要とすること
になる。
を減少させるため、酸素漂白後ヘミセルラーゼ処理し、
ヘミセルロースを加水分解して、ヘミセルロースとリグ
ニンの結合物を溶離させる工程が実施されている。酸素
漂白は一般的にアルカリ性で実施され、酸素漂白後のパ
ルプスラリーのｐＨは１１近辺にあり、高アルカリ性で
ある。しかし、現在、一般に市販されているヘミセルラ
ーゼ（キシラナーゼ、マンナナーゼ等）の至適ｐＨは、
弱酸性〜中性〜弱アルカリ性のものしか市販されていな
かった。これらのヘミセルラーゼを使用して強アルカリ
領域で使用すると、ヘミセルラーゼの活性が失われ、期
待するヘミセルラーゼの効果が得られないことになる。
アルカリ性漂白である酸素漂白に続く漂白に、アルカリ
性漂白である過酸化水素漂白等を採用する場合、ヘミセ
ルラーゼを使用して後段の漂白薬品の使用量を減少させ
るためには、酸素漂白後のパルプを中性付近まで酸で中
和する必要があり、多大な中和用薬品を必要とすること
になる。
【０００４】このような問題を解決するため、特開平6-
62839 号公報には耐熱性アルカリキシラナーゼを生産す
る微生物およびその酵素の利用に関して公開されてお
り、アルカリキシラナーゼ（アルカリ領域に至適ｐＨが
あるキシランーゼ）については公知である。また、アル
カリ性領域に至適ｐＨを有するマンナナーゼ（アルカリ
マンナナーゼ）も数は少ないが特公平4-12707 号公報な
どに記載されている。
62839 号公報には耐熱性アルカリキシラナーゼを生産す
る微生物およびその酵素の利用に関して公開されてお
り、アルカリキシラナーゼ（アルカリ領域に至適ｐＨが
あるキシランーゼ）については公知である。また、アル
カリ性領域に至適ｐＨを有するマンナナーゼ（アルカリ
マンナナーゼ）も数は少ないが特公平4-12707 号公報な
どに記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ところで、酵素は菌体
から排出される細胞外酵素として生成されることが多
く、新規の菌は多数研究されているが、活性の高い酵素
を生成するための菌の培養条件については必ずしも十分
に研究されていない。本発明は、より活性の大きな酵素
を効率よく製造するための培養方法を提供することを目
的とする。
から排出される細胞外酵素として生成されることが多
く、新規の菌は多数研究されているが、活性の高い酵素
を生成するための菌の培養条件については必ずしも十分
に研究されていない。本発明は、より活性の大きな酵素
を効率よく製造するための培養方法を提供することを目
的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
本発明は以下の方法を採用する。即ち、本発明の第１の
発明は、「酵素を産生する菌を中性培地で培養した後、
培地をアルカリ性に変更して培養し、該培養物から酵素
を得ることを特徴とする酵素の製造方法」である。
本発明は以下の方法を採用する。即ち、本発明の第１の
発明は、「酵素を産生する菌を中性培地で培養した後、
培地をアルカリ性に変更して培養し、該培養物から酵素
を得ることを特徴とする酵素の製造方法」である。
【０００７】本発明の第２の発明は、第１の発明におい
て、酵素がアルカリ性領域で活性を有するマンナナーゼ
であることを特徴とする酵素の製造方法である。本発明
の第３の発明は、第２の発明において、酵素を産生する
菌がＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓであることを特徴
とする酵素の製造方法である。
て、酵素がアルカリ性領域で活性を有するマンナナーゼ
であることを特徴とする酵素の製造方法である。本発明
の第３の発明は、第２の発明において、酵素を産生する
菌がＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓであることを特徴
とする酵素の製造方法である。
【０００８】発明者らは、アルカリ性領域で活性を有す
るマンナナーゼ産生菌を求め、広範なスクリーニングを
行った結果、パルプ工場内の土壌からアルカリ性領域に
おいて優れた酵素活性を有するマンナナーゼを産生する
バチルス属の菌（以下、バチルス sp. RE(2)1-2 と称す
る）を見出した。本発明は、この菌が産生するマンナナ
ーゼが、培養条件を検討する過程において、特定の条件
下で、酵素活性が大きくなることが発見されたという知
見に基づいてなされたものである。
るマンナナーゼ産生菌を求め、広範なスクリーニングを
行った結果、パルプ工場内の土壌からアルカリ性領域に
おいて優れた酵素活性を有するマンナナーゼを産生する
バチルス属の菌（以下、バチルス sp. RE(2)1-2 と称す
る）を見出した。本発明は、この菌が産生するマンナナ
ーゼが、培養条件を検討する過程において、特定の条件
下で、酵素活性が大きくなることが発見されたという知
見に基づいてなされたものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】アルカリ性領域で活性を有するマ
ンナナーゼを産生する菌として分離されたバチルス sp.
RE(2)1-2 菌株の形態的観察、生理的性状、菌体内ＤＮ
ＡのＧＣ含有量の菌学的性質について、Bergy's Manual
of Systematic Bacteriology Vol.2(1986) ,The Genus
Bacillus (1973) を参考にして同定した結果、この菌
はＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓと同定された。Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓは耐熱性の胞子を形成するグラム陽性桿菌
で、土壌等の一般環境に広く分布しており、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓは土壌や食品から分離された例が
知られている。
ンナナーゼを産生する菌として分離されたバチルス sp.
RE(2)1-2 菌株の形態的観察、生理的性状、菌体内ＤＮ
ＡのＧＣ含有量の菌学的性質について、Bergy's Manual
of Systematic Bacteriology Vol.2(1986) ,The Genus
Bacillus (1973) を参考にして同定した結果、この菌
はＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓと同定された。Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓは耐熱性の胞子を形成するグラム陽性桿菌
で、土壌等の一般環境に広く分布しており、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓは土壌や食品から分離された例が
知られている。
【００１０】このＢａｃｉｌｌｕｓ属菌を中性培地また
はアルカリ性培地で培養することでアルカリマンナナー
ゼを産生することができる。炭素源、窒素源は資化して
アルカリマンナナーゼを産生することのできるものであ
ればいずれも用いることができる。たとえば炭素源とし
て、グルコマンナンやガラクトマンナンを含むコンニャ
クマンナン、ロースカトビーンガム、グアーガムなどが
使用できる。窒素源としては酵母エキス、ペプトン、各
種アミノ酸、大豆、各種無機窒素化合物などを用いるこ
とができる。培養温度は、このＢａｃｉｌｌｕｓ属が生
育し、アルカリマンナナーゼを産生する範囲であればよ
く、培養温度は２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃
が適当である。
はアルカリ性培地で培養することでアルカリマンナナー
ゼを産生することができる。炭素源、窒素源は資化して
アルカリマンナナーゼを産生することのできるものであ
ればいずれも用いることができる。たとえば炭素源とし
て、グルコマンナンやガラクトマンナンを含むコンニャ
クマンナン、ロースカトビーンガム、グアーガムなどが
使用できる。窒素源としては酵母エキス、ペプトン、各
種アミノ酸、大豆、各種無機窒素化合物などを用いるこ
とができる。培養温度は、このＢａｃｉｌｌｕｓ属が生
育し、アルカリマンナナーゼを産生する範囲であればよ
く、培養温度は２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃
が適当である。
【００１１】前記した特開平6-62839 号公報、特公平4-
12707 号公報に記載のアルカリキシラナーゼやアルカリ
マンナナーゼを生成する菌はアルカリ性の培地で培養さ
れている。しかし、本発明者らが中性及びアルカリ性い
ずれでも培養可能なＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓに
ついて研究した結果、この菌を、はじめｐＨ７近辺の中
性で培養した後、培地をｐＨ１１近辺のアルカリ性に変
更してさらに培養を継続することにより、はじめからｐ
Ｈ７近辺の中性培地による培養だけ、またはｐＨ１１近
辺のアルカリ性の培地による培養だけから得られるアル
カリマンナナーゼより、単位タンパク質当たりのアルカ
リマンナナーゼ活性が２〜３倍大きい酵素液を得ること
ができた。
12707 号公報に記載のアルカリキシラナーゼやアルカリ
マンナナーゼを生成する菌はアルカリ性の培地で培養さ
れている。しかし、本発明者らが中性及びアルカリ性い
ずれでも培養可能なＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓに
ついて研究した結果、この菌を、はじめｐＨ７近辺の中
性で培養した後、培地をｐＨ１１近辺のアルカリ性に変
更してさらに培養を継続することにより、はじめからｐ
Ｈ７近辺の中性培地による培養だけ、またはｐＨ１１近
辺のアルカリ性の培地による培養だけから得られるアル
カリマンナナーゼより、単位タンパク質当たりのアルカ
リマンナナーゼ活性が２〜３倍大きい酵素液を得ること
ができた。
【００１２】これらの酵素は菌を培養した後、菌体を分
離し、培養濾液をそのまま、または減圧濃縮などの方法
により濃縮して粗酵素液として使用することができる。
また、透析、塩析、限外濾過、凍結乾燥等の手段を単独
または組み合わせて利用することにより、粗酵素を精
製、濃縮、あるいは固体化することができる。一例とし
て、限外濾過の場合、培養液を６５００ｒｐｍで２０分
間菌体を遠心分離し、ウルトラフィルターで濃縮濾過
し、さらに２倍の水で希釈しウルトラフィルターで濃縮
する操作を２回繰り返し濃縮物を得る方法が使用でき
る。
離し、培養濾液をそのまま、または減圧濃縮などの方法
により濃縮して粗酵素液として使用することができる。
また、透析、塩析、限外濾過、凍結乾燥等の手段を単独
または組み合わせて利用することにより、粗酵素を精
製、濃縮、あるいは固体化することができる。一例とし
て、限外濾過の場合、培養液を６５００ｒｐｍで２０分
間菌体を遠心分離し、ウルトラフィルターで濃縮濾過
し、さらに２倍の水で希釈しウルトラフィルターで濃縮
する操作を２回繰り返し濃縮物を得る方法が使用でき
る。
【００１３】本発明の酵素製造方法は、上記培養条件を
参考に、アルカリマンナナーゼ産生菌以外の例えばアル
カリキシラナーゼ産生菌またはアルカリセルラーゼ産生
菌にも適用可能と考えられる。次に本発明を実施例に基
づき詳細に説明する。
参考に、アルカリマンナナーゼ産生菌以外の例えばアル
カリキシラナーゼ産生菌またはアルカリセルラーゼ産生
菌にも適用可能と考えられる。次に本発明を実施例に基
づき詳細に説明する。
【００１４】
＜実施例１＞グルコース０．５％、ポリペプトン０．５
％、酵母エキス０．０５％、K2HPO4０．１％、MgSO4・7
H2O ０．０５％、ｐＨ６．５の滅菌した液体培地１０ｍ
ｌにバチルス sp. RE(2)1-2 を植菌し、Ｌ字管で３０℃
で１日間振盪培養して、前培養液とした。前記の滅菌し
た液体培養液１８０ｍｌに、前培養液２ｍｌを加え、坂
口フラスコで３０℃で１６時間中性で振盪培養したの
ち、１mol Na2CO3 溶液２０ｍｌを加え、ｐＨ１０．５
とし、さらに２０時間アルカリ性で振盪培養した。培養
終了後、遠心分離（10000rpm ×10分）して培養上清を
分離しアルカリマンナナーゼ粗酵素液を得た。培養上清
中のアルカリマンナナーゼの活性を次の方法により測定
した。０．５％ローカストビーンガム溶液（シグマ社
製、ｐＨ１０．０、５０mM炭酸ナトリウム緩衝液）２０
０μｌに酵素溶液５０μｌを添加し、４０℃で１０分間
反応させる。反応後１０分間煮沸して酵素を失活させ、
Smogyi 試薬を２５０μｌ添加し、さらに３０分間煮沸
した後、直ちに氷冷する。その液に Nelson 試薬５００
μｌと純水３ｍｌを加えて、５００ｎｍの吸光度を測定
する。マンナナーゼ活性は上記の条件で１分間に１μmo
l の還元糖を生成する酵素量を１ユニット（Ｕ）とす
る。その結果、培養上清中のアルカリマンナナーゼ活性
は１．０Ｕ／ｍｌであった。また、培養上清のタンパク
質量を Lowry 法により定量し、単位タンパク質当たり
のアルカリマンナナーゼ活性は、２．５Ｕ／ｍｇであっ
た。
％、酵母エキス０．０５％、K2HPO4０．１％、MgSO4・7
H2O ０．０５％、ｐＨ６．５の滅菌した液体培地１０ｍ
ｌにバチルス sp. RE(2)1-2 を植菌し、Ｌ字管で３０℃
で１日間振盪培養して、前培養液とした。前記の滅菌し
た液体培養液１８０ｍｌに、前培養液２ｍｌを加え、坂
口フラスコで３０℃で１６時間中性で振盪培養したの
ち、１mol Na2CO3 溶液２０ｍｌを加え、ｐＨ１０．５
とし、さらに２０時間アルカリ性で振盪培養した。培養
終了後、遠心分離（10000rpm ×10分）して培養上清を
分離しアルカリマンナナーゼ粗酵素液を得た。培養上清
中のアルカリマンナナーゼの活性を次の方法により測定
した。０．５％ローカストビーンガム溶液（シグマ社
製、ｐＨ１０．０、５０mM炭酸ナトリウム緩衝液）２０
０μｌに酵素溶液５０μｌを添加し、４０℃で１０分間
反応させる。反応後１０分間煮沸して酵素を失活させ、
Smogyi 試薬を２５０μｌ添加し、さらに３０分間煮沸
した後、直ちに氷冷する。その液に Nelson 試薬５００
μｌと純水３ｍｌを加えて、５００ｎｍの吸光度を測定
する。マンナナーゼ活性は上記の条件で１分間に１μmo
l の還元糖を生成する酵素量を１ユニット（Ｕ）とす
る。その結果、培養上清中のアルカリマンナナーゼ活性
は１．０Ｕ／ｍｌであった。また、培養上清のタンパク
質量を Lowry 法により定量し、単位タンパク質当たり
のアルカリマンナナーゼ活性は、２．５Ｕ／ｍｇであっ
た。
【００１５】＜比較例１＞実施例１で１mol Na2CO3 溶
液２０ｍｌを加えない以外は実施例１と同様に培養し、
中性培養による粗酵素液を得た。その結果、培養上清中
のアルカリマンナナーゼ活性は０．５Ｕ／ｍｌであり、
単位タンパク質当たりのアルカリマンナナーゼ活性は、
０．７２Ｕ／ｍｇであった。
液２０ｍｌを加えない以外は実施例１と同様に培養し、
中性培養による粗酵素液を得た。その結果、培養上清中
のアルカリマンナナーゼ活性は０．５Ｕ／ｍｌであり、
単位タンパク質当たりのアルカリマンナナーゼ活性は、
０．７２Ｕ／ｍｇであった。
【００１６】＜比較例２＞実施例１で滅菌した液体培養
液１８０ｍｌに、前培養液２ｍｌを１mol Na2CO3溶液２
０ｍｌと共に加え、３６時間振盪培養し、アルカリ性だ
けの培養による粗酵素液を得た。その結果、培養上清中
のアルカリマンナナーゼ活性は０．７Ｕ／ｍｌであり、
単位タンパク質当たりのアルカリマンナナーゼ活性は、
１．９Ｕ／ｍｇであった。
液１８０ｍｌに、前培養液２ｍｌを１mol Na2CO3溶液２
０ｍｌと共に加え、３６時間振盪培養し、アルカリ性だ
けの培養による粗酵素液を得た。その結果、培養上清中
のアルカリマンナナーゼ活性は０．７Ｕ／ｍｌであり、
単位タンパク質当たりのアルカリマンナナーゼ活性は、
１．９Ｕ／ｍｇであった。
【００１７】
【発明の効果】本発明は、活性の大きなアルカリマンナ
ナーゼを多量に産生する方法を提供する。本発明によ
り、アルカリマンナナーゼは効率よく産生され、アルカ
リ性で処理する工程でのマンナナーゼの利用、特に針葉
樹パルプの漂白工程での酵素利用を効率的に行えるよう
になった。
ナーゼを多量に産生する方法を提供する。本発明によ
り、アルカリマンナナーゼは効率よく産生され、アルカ
リ性で処理する工程でのマンナナーゼの利用、特に針葉
樹パルプの漂白工程での酵素利用を効率的に行えるよう
になった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (3)
- 【請求項１】 酵素を産生する菌を中性培地で培養した
後、培地をアルカリ性に変更して培養し、該培養物から
酵素を得ることを特徴とする酵素の製造方法。 - 【請求項２】 酵素がアルカリ性領域で活性を有するマ
ンナナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の酵
素の製造方法。 - 【請求項３】 酵素を産生する菌がＢａｃｉｌｌｕｓ
ｌｅｎｔｕｓであることを特徴とする請求項２に記載の
酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15445196A JPH1088A (ja) | 1996-06-14 | 1996-06-14 | 酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15445196A JPH1088A (ja) | 1996-06-14 | 1996-06-14 | 酵素の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1088A true JPH1088A (ja) | 1998-01-06 |
Family
ID=15584515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15445196A Pending JPH1088A (ja) | 1996-06-14 | 1996-06-14 | 酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1088A (ja) |
-
1996
- 1996-06-14 JP JP15445196A patent/JPH1088A/ja active Pending
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