JP2879682B2

JP2879682B2 - バンコマイシンまたはリストセチン耐性変異株及びその製法

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Publication number: JP2879682B2
Application number: JP63077846A
Authority: JP
Inventors: 進伊藤; 正治下岡; 裕一太田; 美喜雄高岩; 足立　　重仁
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1987-03-30
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1999-04-05
Anticipated expiration: 2014-04-05
Also published as: JPH01222771A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はバチルス属に属する、セルラーゼ、プロテア
ーゼ、アミラーゼ等の菌体外酵素生産菌の新規なバンコ
マイシンまたはリストセチン耐性変異株及びその製法に
関し、更に詳細には菌体外酵素高生産性のバチルス属に
属する菌体外酵素生産菌の新規なバンコマイシンまたは
リストセチン耐性変異株及びその製法に関する。

〔従来の技術〕

セルラーゼはセルロースをグルコース、又はセロビオ
ース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵素反応を触媒
する複雑な酵素群として理解されており、その作用機構
により、C₁酵素、C_x酵素とβ−グルコシダーゼ、或いは
エキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナー
ゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素を含有する
と言われる。

従来、セルラーゼの研究は専らバイオマス資源の有効
利用を図るという観点から、例えばトリコデルマ属、ア
スペルギルス属、アクレモニウム属、フミコーラ属等の
カビの類にその供給源を求めてきた。

近年、セルラーゼの新規な用途として衣料用洗浄剤の
添加成分等としての用途が開発されつつあり、この目的
に適したアルカリpHで最高活性を示し、且つ安定ないわ
ゆるアルカリセルラーゼの提供が求められていた。

最近まで、このようなアルカリセルラーゼを生産する
方法としては、好アルカリ性バチルスに属する細菌を培
養して培地よりセルラーゼＡを生産する方法（特公昭50
−28515号公報）、セルロモナスに属する細菌を培養し
てアルカリセルラーゼ301−Ａを生産する方法（特開昭5
8−224686号公報）、好アルカリ性バチルスNo.1139株を
培養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する方法
（Fukumori F.,Kubo T.and Horikoshi K.,J. Gen. Mi
crobiol.,131巻,3339頁,1985年）及びストレプトマイセ
ス属の一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方法
（特開昭61−19483号公報）等が知られていたが、これ
ら方法で用いる菌株はいずれもアルカリセルラーゼ生産
性が低く、工業的生産に適していなかった。

斯る現状において、本発明者らは優れたアルカリセル
ラーゼ生産菌を得べく鋭意検索をおこなった結果、バチ
ルス・エスピー KSM−635（微工研菌寄第8872号）を始
め、いくつかの新規菌株が優れたアルカリセルラーゼ生
産性を有することを見出し、先に特許出願した（特願昭
61−257775号ほか）。

一方、洗浄剤へのプロテアーゼの配合は、以前より行
われてきているが、当初洗浄剤へ配合されていたプロテ
アーゼはパパインや膵臓トリプシンといった中性付近に
最適反応pHを有しているものが用いられていた。しか
し、セルラーゼ同様、洗浄用プロテアーゼもアルカリ側
に最適反応pHを有し、界面活性剤中において安定なもの
が望まれ、開発されてきた。

現在、洗浄酵素として用いられている代表的なアルカ
リプロテアーゼは、アルカラーゼ、サビナーゼ、エスペ
ラーゼ（ノボインダストリー製）、マキサターゼ（ギ
ストプロカーデイス製）等であり、これらの酵素の最
適反応温度は60℃付近にあり欧米諸国の洗濯様式にかな
ったものである。

しかしながら、日本の洗濯様式は、室温付近で洗浄を
行うことが一般的であるため、より低い温度領域におい
て従来のプロテアーゼより活性の強いプロテアーゼの提
供が求められている。更に、従来知られているように、
ケラチン等の不溶性蛋白をよく分解する能力のあるプロ
テアーゼが洗浄に寄与すること〔皆川基：繊消誌,26巻,
322頁,1985年〕から、ケラチン等の不溶性蛋白質に対す
る優れた分解作用を有するアルカリプロテアーゼの提供
が求められていた。

そこで本発明者らは、ケラチンを分解する能力を有
し、かつ最適反応温度の低い（低温域においても活性の
高い）アルカリプロテアーゼを得べく、プロテアーゼ生
産菌について鋭意検索をおこなった結果、バチルス・エ
スピー KSM−2001（微工研菌寄第9449号）を始め、一
群の微生物が上記条件を満足するアルカリプロテアーゼ
を産生することを見出し、先に特許出願した（特願昭62
−261487号）。

また、デンプン質を加水分解するアミラーゼも、食品
等の汚れにはデンプン質が多く含まれることから洗浄剤
の成分として注目されており、中性アミラーゼ〔例えば
バチルス・アミロリクイファシエンス（Bacillus amylo
liquefaciens）が生産するアミラーゼ:N.E.Welker and
L.L.Campbell,J. Bacteriol.,94巻,1124頁,1967年〕、
耐熱性アミラーゼ〔例えばバチルス・リケニホルミス
（Bacillus licheniformis）が生産するアミラーゼ：
特開昭61−37094号〕、アルカリアミラーゼ〔例えばバ
チルス・オーベンシス（Bacillus ohbensis）が生産す
るアミラーゼ：特公昭52−31949号〕などが知られてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の新規菌株等によって、一応実用に足る菌体外酵
素の生産が可能になったが、工業的に有利な生産のため
には、前記菌株以外の菌体外酵素生産菌を含め、更に菌
株の菌体外酵素生産性を向上させる必要があった。

〔課題を解決するための手段〕

叙上の実情に鑑み本発明者らは菌体外酵素の生産性向
上に関し、特に突然変異の手法について鋭意研究をおこ
なった結果、バチルス属に属する菌体外酵素生産菌にバ
ンコマイシンまたはリストセチン耐性を付与した新規な
菌株が、菌体外酵素生産性が著しく向上したものである
ことを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、バチルス・スピシーズ KSM−6
35v（FERM P−9084）、バチルス・スピシーズ KSM−20
02v（FERM P−9939）、バチルス・アミロリクイファシ
エンス KSM−22v（FERM P−9937）と命名されたバンコ
マイシン耐性株、及びバチルス・スピシーズ KSM−635
r（FERM P−9085）、バチルス・スピシーズ KSM−2002
r（FERM P−9938）及びバチルス・アミロリクイファシ
エンス KSM−22r（FERM P−9936）と命名されたリスト
セチン耐性株並びにその製法を提供するものである。

本発明において用いるバンコマイシンまたはリストセ
チンは、微生物の細胞膜合成に係わるリピッドサイクル
を阻害する。さらに詳しくは、リピッド中間体のウンデ
カプレノール・ピロリン酸・Ｎ−アセチルムラミン酸
（−Ｎ−アセチルグルコサミン）−ペプチド（undecapr
enol−PP−MurNAc（−GlcNAc）−peptide）がポリマー
化して直鎖状のグリコペプチドを合成する重合反応を阻
害するものである。Anderson,J.S.等，Proc, Natl. Acad.
Sci. U.S.A.,53巻,881頁,1965年 Lugtenberg,E.J.J.
等，J.Bacteriol.,108巻,20頁,1971年田中信雄著「抗生物質の作用メカニズム」本発明のセルラーゼ生産菌等の新規なバンコマイシン
またはリストセチン耐性変異株（以下「膜耐性株」と略
称する）は、バチルス・スピシーズ KSM−635（FERM P
−8872）等（以下「親株」と略称する）に突然変異剤を
作用させるか、または紫外線若しくは放射線等を照射す
る等の一般的手法によって親株に突然変異を惹起せし
め、次いで、これら菌株をバンコマイシンやリストセチ
ンを高濃度で含有する培地中で培養し、当該バンコマイ
シンまたはリストセチン耐性を有する菌株を選択するこ
とにより調製される。

親株としては、本発明者らが先に栃木県芳賀群の土壌
から見出したセルラーゼ生産菌であるバチルス・エスピ
ー KSM−635（Bacillus sp. KSM−635,特願昭61−257
775号）、同じく栃木県芳賀群の土壌から見出したプロ
テアーゼ生産菌であるバチルス・エスピー KSM−2002
（Bacillus sp. KSM−2002）、アミラーゼ生産菌とし
ては、バチルス・アミロリクイファシエンス KSM−22
（Bacillus amyloliquefaciens KSM−22（ATCC 2384
5））である。

突然変異を惹起させるために用いる薬剤としては、塩
基類似性物質（５−ブロモウラシル、ブロモデオキシウ
リジン等）、アクリジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミ
ン、アルキル化試剤（エチルメタンスルフォネート（EM
S）,N−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン（NTG），マスタードガス等）が挙げられる。また放
射線照射の例としては、電離放射線照射、紫外線照射等
が挙げられる。

本明細書中において、「膜耐性」とは、ある微生物
が、親株の最小阻止濃度（MIC）以上のバンコマイシン
またはリストセチンの存在する環境下で生育できる性質
を獲得したことをいう。したがって、突然変異株中から
膜耐性株を選択するには親株のMICを測定し、該濃度以
上のバンコマイシンまたはリストセチンを含有する培地
中で突然変異株を培養し、コロニーを生成した菌株を集
めれば良い。

斯くして得られる本発明の膜耐性株のうち、セルラー
ゼ生産菌であり、バチルス・エスピー KSM−635を親株
とし、これから導かれるバンコマイシン耐性のバチルス
・スピシーズ KSM−635v（FERM P−9084）及びリスト
セチン耐性のバチルス・スピシーズ KSM−635r（FERM
P−9085）の菌学的性状はいずれも次の通りである。

菌学的性状：（１）顕微鏡的観察菌の大きさは、0.5〜1.2μｍ×1.5〜4.0μｍの桿菌
で、菌体の一端に内生胞子（0.7〜1.2μｍ×1.0〜2.0μ
ｍ）を形成する。周鞭毛を有し運動性があり、グラム染
色は陽性である。

（２）各種培地における生育状態生育のpH範囲は８〜11にあり、通常、炭酸ソーダ（Na
₂CO₃）が0.5〜1.0％添加された培地で生育が最も良好で
ある。以下に示した諸性質は、全て1.0重量％のNa₂CO₃
存在下での菌学的性状である。

肉汁寒天培地集落の形状は円形、表面は扁平である。集落の色調は
白色乃至黄色の半透明であり、光沢がある。

肉汁液体培地生育し、混濁する。培地のpHを中性にすると生育しな
い。

７％食塩肉汁液体培地で生育し、混濁する。

肉汁ゼラチン穿刺培養生育しない。

リトマスミルク培地ミルクの凝固、ペプトン化は陰性。

（３）生理学的性質硝酸還元能は有するが、脱窒反応はしない。

MR反応は不明であるがVP反応は陽性。

インドールを生成しない。

硫化水素の生成は認められない。

澱粉の加水分解、資化性は無い。

クエン酸を利用する。

硝酸、亜硝酸を資化する。塩化アンモニウムの利用性
は微弱であるが、リン酸アンモニウムは利用する。

キングＢ培地で淡黄色を示すが蛍光性はない。

ウレアーゼは陰性。

オキシダーゼは凝陽性。

カタラーゼは陽性。

生育の範囲。

生育の温度範囲は20〜45℃にあり、生育最適温度は29
〜37℃。

生育pH範囲は８〜11にあり、生育最適pHは9.5〜10.
2。

酸素に対する態度は好気的である。

糖の利用性Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、
マルトース、シュークロース、トレハロース、Ｄ−マン
ニットール、イノシトール、グリセロールを資化する。
Ｄ−ガラクトース、ラクトース、Ｄ−ソルビトール、ス
ーターチ、デキストリン、ラフイーノースは利用できな
い。

カゼイン、ゼラチンの加水分解性は陰性。

ビオチン（又はデスチオビオチン）を生育に必要とす
る。

叙上の膜耐性変異株バチルス・エスピー KSM−635_v
とバチルス・エスピー KSM−635_rの菌学的性状は、親
株バチルス・エスピー KSM−635のそれと同一である。
しかしながら、両膜耐性株は親株のMIC以上のバンコマ
イシン又はリストセチン存在下でも生育し、しかもアル
カリセルラーゼ生産能の点では、親株の２〜４倍の生産
能を有するのでこの点で著しく異なっている。

上記の膜耐性株と親株との類似からこの菌株も親株と
同様堀越と秋葉（“Alkalophilic Microorganisms",Jap
an Scientific Society Press（Tokyo）,1982年刊）の
提唱する「pH8以上のアルカリ培地で生育し、これ以下
の中性領域では生育できない」バチルス所謂、好アルカ
リ性（Alkalophilic）バチルスのグループに入るもので
ある。

又、プロテアーゼ生産菌であり、バチルス・エスピー
KSM−2002を親株とし、これから導かれるバンコマイ
シン耐性のバチルス・スピシーズ KSM−2002v（FERM P
−9939）及びリストセチン耐性のバチルス・スピシーズ
KSM−2002r（FERM P−9938）の菌学的性状はいずれも
次の通りである。

菌学的性状：（１）顕微鏡的観察菌の大きさは、0.5〜0.8μｍ×1.5〜3.0μｍの桿菌
で、菌体の中央準端に円形又は卵円形の内生胞子（0.4
〜0.8μｍ×0.4〜0.8μｍ）を形成する。周鞭毛を有
し、運動性があり、グラム染色は陽性である。

（２）各種培地における生育状態肉汁寒天平板培地円形、凸円状、円滑波状のコロニーを形成する。大き
さは直径1.0〜5.0mm表面は円滑で露滴状、淡黄色〜乳白
色を呈する。また半透明であり、脂状のコロニーであ
る。

肉汁寒天斜面培地 pH7.0において帯状の弱い生育を示し、乳白色、半透
明のコロニーを形成する。pH10.0において拡帯状に生育
する。

肉汁液体培地 pH7.0にて僅かに生育するが菌膜は形成しない。

10％塩化ナトリウム存在下で生育する。

肉汁ゼラチン穿刺培養 pH7.0においてゼラチンを液化する。

リトマスミルク培地僅かに生育するが、ミルクの凝固、リトマスの色調変
化は認められない。

（３）生理学的性質硝酸還元能、脱窒反応は共に陰性。

MRテスト、VP反応は共に陰性。

インドールを生成しない。

硫化水素の生成は認められない。

澱粉を加水分解しない。

クエン酸を利用しない。（Christensen,Simonsの培
地）硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムを利用しない。

色素を生成しない。

ウレアーゼは陰性。

オキシダーゼは陽性。

カタラーゼは陽性。

生育の範囲 20℃〜30℃で生育良好。但し、10℃〜37℃の範囲内で
生育可能。

生育pH範囲 pH6.0〜11.0で生育する。

酸素に対する態度好気性及び嫌気性下で生育可能。

糖の利用性いずれの耐性株も、以下の糖類から酸及びガスを生成
しない。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトー
ス、ラクトース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトー
ル、スーターチは資化する。Ｄ−マンノース、シューク
ロース、トレハロース、イノシトール、グリセロールは
利用出来ない。

糖類からの酸及びガスの生成いずれの耐性株も、以下の糖類から酸及びガスを生成
しない。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクト
ース、マルトース、シュークロース、ラクトース、トレ
ハロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、イノ
シトール、グリセロール、スターチ。

叙上の膜耐性株バチルス・エスピー KSM−2002_vとバ
チルス・エスピー KSM−2002_rの菌学的性状は、親株バ
チルス・エスピー KSM−2002のそれと同一である。し
かしながら、両膜耐性株は親株のMIC以上のバンコマイ
シン又はリストセチン存在下でも生育し、しかもアルカ
リプロテアーゼ生産能の点では親株の２〜３倍の生産能
を有するので、この点で著しく異なっている。

さらに、すでに公知のバチルス・アミロリクイファシ
エンス KSM−22（ATCC23845:N.E.Welker and L.L.Camp
bell,J.Bacteriol.,94巻,1124頁、1967年）を親株と
し、これから誘導されるバンコマイシン耐性のバチルス
・アミロリクイファシエンス KSM−22v（FERM P−993
7）及びリストセチン耐性のバチルス・アミロリクイフ
ァシエンス KSM−22r（FERM P−9936）の菌学的性状は
親株であるバチルス・アミロリクイファシエンス KSM
−22のそれと同一である。しかしながら両膜耐性株は親
株のMIC以上のバンコマイシン又はリストセチン存在下
でも生育し、しかもアミラーゼ生産能の点では親株の1.
3〜４倍の生産能を有するので、この点で著しく異なっ
ている。

本発明の膜耐性株の培養は、通常の液体培地に接種
し、常法に従って好気培養すれば良い。培地中には、資
化しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくこ
とが好ましい。炭素源及び窒素源について特に制限はな
いが、例えば炭素源としては、籾殻、麩、紙、一般紙
類、おが屑などの繊維質、廃糖蜜、転化糖、CMC、アビ
セル、セルロース粉末、キシラン、ペプチン、可溶性デ
ンプンに加え、資化しうる炭素源、例えば、リボース、
アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、
フラクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトー
ス、シュークロース、トレハロース、ソルビトース、マ
ンニトール、イノシトール、グリセロールや有機酸のク
エン酸や酢酸などがあげられる。一方、窒素源として
は、無機態の硝安、硫安、塩安、リン酸アンモニウム、
硝酸ソーダやコーングルテンミール、大豆粉、大豆カ
ス、コーン・スチーブリカー、カザミノ酸、酵母エキ
ス、ファーマメディア、ソイビーンミール、イワシミー
ル、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コー
ンソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベ
ータ、アミフレックス、アジプロン、ゼスト、アジック
スなどが挙げられる。その他、リン酸、Ma²⁺、Ca²⁺、Mn
²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Na⁺、K⁺などの塩類や、必要であれば
無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもで
きる。

本発明の膜耐性株はその菌体外にセルラーゼ、プロテ
アーゼ、アミラーゼなどの酵素を産生するので、該酵素
の採取及び精製は、例えば、一般の採取及び精製の手段
を用いれば良く、培養液そのもの自体をも酵素液として
使用できる。すなわち培養物から遠心分離又は、濾過等
によって菌体を分離し、その菌体および培養濾液から通
常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈
澱法によって蛋白を沈澱させたり、限外濾過法により濃
縮して酵素液とすることができる。脱塩の方法として
は、透析又は、ゲル濾過法の一般的な方法が用いられ
る。これらのものをそのまま、酵素として使用できる
が、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、DEAE−セファデックス又はDEAE−セルロース等のイ
オン交換クロマトグラフィーや分子篩ゲルクロマトグラ
フィーなどの手段を適宜組みあわせて分別した後、精製
品として使用することもできる。

〔発明の効果〕

本発明の膜耐性株は親株の約２〜４倍の菌体外酵素生
産性を有するので、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミラ
ーゼ等の工業的生産に極めて有利に利用されるものであ
る。

〔実施例〕

次に実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明する。なお、実施例中における酵素活性の測定法は次
の通りである。

（１）CMCアーゼ活性 CMC（25％）0.2ml、0.5Mグリシン緩衝液（pH9.0）0.1
ml、及び脱イオン水0.1mlからなる反応溶液に適当希釈
した酵素液0.1mlを加え、40℃で20分間反応する。反応
後、3,5−ジニトロ−サリチル酸（DNS）法にて還元糖の
定量を行う。すなわち還元糖生産量を測定するために、
反応溶液0.5mlにDNS試薬1mlを加え、５分間100℃で加熱
発色させ冷却後、4.5mlの脱イオン水で希釈し、これを
波長535nmで比色定量する。

酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのグル
コースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と
し、培養液１あたりの酵素単位をもって発酵生産性を
表示する。

（２）プロテアーゼ活性アンソンの方法に従い（Anson,A.L.:J. Ger. Physi
ol.,22巻,79頁,1938年）尿素を用いて牛血清ヘモグロビ
ンを変性させ、苛性ソーダにてpH10.5とする。この基質
溶液（ヘモグロビンとして2.2％）を0.5mlに酵素液0.1m
l（1.0×10^-5〜1.0×10^-3μA.U.^*）を添加し、25℃にて
10分間反応を行い、4.9％トリクロル酢酸1.0mlを加えて
反応を停止する。反応終了後、遠心分離（3000rpm 10
分間）を行い、その上清液中に含まれる蛋白分解物をフ
ォーリン・ローリー法（O.H.Lowryら、J. Biol. Che
m. 193巻,265頁,1951年）によって定量する。

1A.U.は、上記反応条件下において１分間に1mmoleの
チロシンを遊離する酵素量とする。

＊A.U.はアンソン単位の略記号（３）アミラーゼ活性可溶性デンプン（1.25％）0.4ml、1Mトリス・塩酸緩
衝液（pH7.0）0.025ml、0.2M塩化カルシウム0.05ml、及
び脱イオン水0.425mlからなる反応溶液に適当に希釈し
た酵素液0.1mlを加え、30℃で５分間反応する。反応
後、3,5−ジニトロ−サリチル酸（DNS）法にて還元糖の
定量を行う。すなわち還元糖生産量を測定するために、
反応溶液1mlにDNS試薬1mlを加え、５分間100℃で加熱発
色させ冷却後、4mlの脱イオン水で希釈し、これを波長5
35nmで比色定量する。

酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのマル
トースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とす
る。

参考例１バチルス・エスピー KSM−635（FERM P−8872）を、
各濃度のバンコマイシンを含有せしめた下記培地Ａに塗
布し、バンコマイシンの最小生育阻止濃度を求めた。す
なわちバンコマイシンを添加した培地Ａに上記バチルス
・エスピー KSM−635を塗布した後、30℃で３日間放置
し、該菌株の表面生育を目視で観察した。この結果を第
１表に示す。

この結果から明らかなように、バチルス・エスピー
KSM−635に対するバンコマイシンの最小生育阻止濃度は
約0.2γであった。

参考例２参考例１と同様にして、バチルス・エスピー KSM−6
35（FERM P−8872）を、各濃度のリストセチンを添加し
た培地Ｂに塗布し、該抗生物質の最小生育阻止濃度を求
めた。その結果、バチルス・エスピー KSM−635に対す
るリストセチンの最小生育阻止濃度は約0.1γであっ
た。

実施例１バチルス・エスピー KSM−635（FERM P−8872）を液
体培地Ｃに接種し、30℃で20時間培養した時点で、EMS
を濃度0.5〜３％（通常１％）になるように添加した
後、30℃で20分間放置した。しかる後、同液体培地に３
％宛処理培養液を接種し、30℃で一晩培養を継続した。

この培養液を、バンコマイシンを0.2γ以上添加した
培地Ａに塗布し、30℃で２日間培養した。該培地表面上
で生育したコロニーを取り、上記した培養操作を５回繰
り返し、18個のバンコマイシン耐性株を得た。

このバンコマイシン耐性株群をそれぞれ坂口コルベン
中100mlの液体培地Ｄに接種し、30℃で３日間培養して
アルカリセルラーゼの力価を検定した。この結果、第２
表に示す高力価バンコマイシン耐性株を得た。このう
ち、最も力価の高い菌株No.3215をバチルス・エスピー
KSM−635vと命名し、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第9084号（FERM P−9084）として寄託し
た。

実施例２バチルス・エスピー KSM−635（FERM P−8872）を液
体培地Ｃに接種し、更に30℃で20時間培養した時点でEM
Sを濃度0.5〜３％（通常１％）になるように添加した
後、30℃で20分間放置した。しかる後、同液体培地に３
％宛、処理培養液を接種し、30℃で一晩振盪培養を継続
した。

この培養液をリストセチンを0.1γ以上添加した培地
Ｂに塗布し、30℃で２日間培養した。該培地表面上で生
育したコロニーを採り、上記した培養操作を５回繰り返
し14個のリストセチン耐性株を得た。

このリストセチン耐性株群をそれぞれ坂口コルベン中
100mlの液体培地Ｄに接種し、実施例１に従ってアルカ
リセルラーゼの力価を検定した。この結果、第３表に示
す４株の高力価リストセチン耐性株を得た。このうち、
最も力価の高い菌株No.4021をバチルス・エスピー KSM
−635_rと命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第9085号（FERM P−9085）として寄託した。

実施例３実施例１で得たバチルス・エスピー KSM−635_v（FER
M P−9084）を庶糖２％、アミノ酸混合液12％、酵母エ
キス0.05％、KH₂PO₄ 0.1％及びNa₂CO₃ 0.5％からなる液
体培地中（500ml坂口コルベン中30ml注入）で、30℃で
３日間振盪培養した。アルカリセルラーゼ生産量を定量
したところ、21520単位/lであった。

実施例４実施例２で得たバチルス・エスピー KSM−635_r（FER
M P−9085）について、実施例３に従ってそのアルカリ
セルラーゼの生産量を検定したところ、20290単位/lで
あった。

参考例３バチルス・エスピー KSM−2002（FERM P−9450）
を、各濃度のバンコマイシンまたはリストセチンを添加
した下記培地Ｅに塗布し、バンコマイシン、リストセチ
ンの最小生育阻止濃度を求めた。すなわち、バンコマイ
シンまたはリストセチンを添加した培地Ｅに上記バチル
ス・エスピー KSM−2002を塗布した後、30℃で３日間
放置し、該菌株の表面生育を目視で観察した。この結果
を第４表に示す。

この結果から明らかなように、バチルス・エスピー
KSM−2002に対する最小生育阻止濃度は、バンコマイシ
ン約0.02γ、リストセチン約0.03γであった。

実施例５バチルス・エスピー KSM−2002（FERM P−9450）を
液体培地Ｆに接種し、30℃で18時間培養した時点でNTG
を濃度30〜100γになるように添加した後、20℃で30〜6
0分間放置した。しかる後、同液体培地に１％宛処理培
養液を接種し、30℃で一晩培養を継続した。

この培養液を、バンコマイシンを0.02γ以上またはリ
ストセチンを0.03γ以上添加した培地Ｅに塗布し、30℃
で３日間培養した。該培地表面上で生育したコロニーを
取り、上記した培養操作を５回繰り返し、７個のバンコ
マイシン耐性株及び４個のリストセチン耐性株を得た。

この耐性株群をそれぞれ試験管中、5mlの液体培地Ｇ
に接種し、30℃で３日間培養してアルカリプロテアーゼ
力価を検定した。この結果、第５表に示す高力価耐性株
を得た。このうち、それぞれの阻害剤耐性株群の中で最
も力価の高い菌株、すなわちバンコマイシン耐性株とし
てNo.2016をバチルス・エスピー KSM−2002_v、リスト
セチン耐性株としてNo.2014をバチルス・エスピー KSM
−2002_rと命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に
それぞれ微工研菌寄第9939号（FERM P−9939）、第9938
号（FERM P−9938）として寄託した。

参考例４バチルス・アミロリクイファシエンス KSM−22（ATC
C23845）を、各濃度のバンコマイシンまたはリストセチ
ンを添加した培地Ｅに塗布し、参考例３に従ってバンコ
マイシン、リストセチンの最小生育阻止濃度を求めた。
この結果を第６表に示す。

実施例６バチルス・アミロリクイファシエンス KSM−22（ATC
C23845）を液体培地Ｆに接種し、30℃で16時間培養した
時点でNTGを濃度30〜100γになるように添加した後、20
℃で30〜60分間放置した。しかる後、同液体培地に１％
宛処理培養液を接種し、30℃で一晩培養を継続した。

この培養液を、バンコマイシンを0.3γ以上、または
リストセチンを0.9γ以上添加した培地Ｅに塗布し、30
℃で３日間培養した。該培地表面上で生育したコロニー
を取り、上記した培養操作を５回繰り返し、５個のバン
コマイシン耐性株及び４個のリストセチン耐性株を得
た。

この耐性株群をそれぞれ試験管中、5mlの液体培地Ｆ
に接種し、30℃で２日間培養してアミラーゼ力価を検定
した。この結果、第７表に示す高力価耐性株を得た。こ
のうち、それぞれの阻害剤耐性株群の中で最も力価の高
い菌株、すなわちバンコマイシン耐性株としてNo.4591
をバチルス・アミロリクイファシエンス KSM−22_v、リ
ストセチン耐性株としてNo.4551をバチルス・アミロリ
クイファシエンス KSM−22_rと命名し、工業技術院微生
物工業技術研究所にそれぞれ微工研菌寄第9937号（FERM
P−9937）、第9936号（FERM P−9936）として寄託し
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 1/00 - 7/08 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス・スピシーズ（Bacillus sp.）
KSM−635v（FERM P−9084）と命名されたバンコマイシ
ン耐性株。
【請求項２】バチルス・スピシーズ KSM−635r（FERM
P−9085）と命名されたリストセチン耐性株。
【請求項３】バチルス・スピシーズ KSM−2002v（FERM
P−9939）と命名されたバンコマイシン耐性株。
【請求項４】バチルス・スピシーズ KSM−2002r（FERM
P−9938）と命名されたリストセチン耐性株。
【請求項５】バチルス・アミロリクイファシエンス（Ba
cillus amyloliquefacience） KSM−22v（FERM P−993
7）と命名されたバンコマイシン耐性株。
【請求項６】バチルス・アミロリクイファシエンス KS
M−22r（FERM P−9936）と命名されたリストセチン耐性
株。