JP3022962B2 - 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規キシラナー
ゼ、その製造法、該キシラナーゼを産生する微生物、該
キシラナーゼによるパルプ処理方法、及び該キシラナー
ゼによるキシロースあるいはキシロオリゴ糖の製法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】キシラナーゼは主としてβ−１，４結合
キシロースからなるキシランやキシラン系多糖を加水分
解してその構成成分であるキシロースやキシロオリゴ糖
を生成する作用を有する酵素で、動植物中に広く存在し
ている。微生物にもキシラナーゼを生成するものがあ
り、これまでに細菌、放線菌、酵母、カビなどの酵素に
ついて研究がなされてきた。

【０００３】近年、バイオマス処理における酵素の利用
という観点からキシラナーゼの有用性が注目されてい
る。たとえば、アルコール燃料用農業廃棄物の酵素分
解、動物飼料中の糖を遊離させるための酵素処理、セル
ロース製造時にパルプを溶解させるための酵素処理、木
材パルプ漂白における酵素処理などにおいてキシラナー
ゼの使用が挙げられる。とりわけ、紙パルプ工業では、
パルプの白色度向上あるいは品質の向上、パルプ漂白工
程で使われる塩素系漂白剤等の化学漂白剤使用量の削
減、故紙再生工程におけるパルプフリーネスの向上など
へのキシラナーゼの応用に期待が高まっている。

【０００４】一方、キシランのキシラナーゼ分解による
生成物であるキシロースは食品、医薬品の原料として広
く使われるとともに、キシロオリゴ糖は甘味料、保湿剤
などの用途が期待されている。

【０００５】上述の目的に使用し得るキシラナーゼとし
て、安価な原料から大量に生産でき、且つ酸、アルカリ
あるいは熱に対して安定なキシラナーゼが望まれてい
る。しかしながら、現在までこれらの条件を満たすキシ
ラナーゼは見い出されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、熱に
安定でかつ広いpH範囲で安定に作用する優れた新規キシ
ラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼを産生する微生
物、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及び該キシラ
ナーゼによるキシロースあるいはキシロオリゴ糖の製造
法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者はこれらの条件
を満たすキシラナーゼを得ることを目的に、酵素及び該
酵素生産微生物の探索を広く行なった。その結果、バチ
ルス属に属する新規微生物が、従来知られていない理化
学的性質を有する新規キシラナーゼを産生することを見
い出し本発明を完成するに至った。

【０００８】本発明は、バチルス属に属し２５〜６０℃
の温度において生育し得る好熱性細菌、該バチルス属細
菌を培養してその培養物より得られる、pH４．０より高
く且つ１０．０より低いpH範囲で作用し、至適温度が７
５℃付近の耐熱性キシラナーゼであるキシラナーゼ１、
及びpH２．６より高く且つ９．６より低いpH範囲で作用
し、至適温度が６５〜７０℃付近の耐熱性キシラナーゼ
であるキシラナーゼ２に関するものであり、また、該キ
シラナーゼの製造方法、該キシラナーゼを産生する微生
物、該キシラナーゼによるパルプ処理方法、及び該キシ
ラナーゼによるキシロースあるいはキシロオリゴ糖の製
造法に関するものである。

【０００９】本発明に用いる微生物は、キシラナーゼ１
及びキシラナーゼ２の生産能を有するバチルス属細菌で
あり、例えば、次のようにして分離された菌株を用いる
ことができる。

【００１０】すなわち、まず日本国内各地より採取され
た土壌試料から表１に示す組成からなる寒天培地を用
い、５５℃の恒温器内にて２〜３日間培養して透明帯
（ハロー）が出現した細菌コロニーを分離した。次に、
分離した各細菌コロニーから得た菌株を、夫々表２に示
す組成からなる液体培地を用い５５℃の恒温振盪機にて
２日間培養し、その培養物について下記の方法によりキ
シラナーゼ活性を測定し、活性値の大きい菌株を選択し
た。このような方法により分離し、純化した菌株の一つ
としては後述の通り同定されたバチルスｓｐ．ＳＤ９０
２が挙げられる。

【００１１】キシラナーゼ活性は、基質として１．２５
％バーチキシラン（カバ由来キシラン）を含む０．１Ｍ
リン酸緩衝液（pH７．０）０．８mlに酵素溶液０．２ml
を混合し、５０℃にて１０分間反応させ、生成した還元
糖を公知の方法である３，５−ジニトロサリチル酸法で
測定した。これ以後のキシラナーゼ活性測定方法も同様
の方法で行なった。この条件下で、１分間に１μmol の
キシロースを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。

【００１２】このようにして分離、選択、純化された菌
株は後述のような菌学的性質をもつことからバチルス属
細菌と同定され、工業技術院微生物工業技術研究所へ寄
託された（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５０８）。

【００１３】

【表１】

【００１４】

【表２】

【００１５】上記のようにして得られた菌株であるバチ
ルスｓｐ．ＳＤ９０２の菌学的性質は、５５℃で該菌株
を生育させ、ザ・ジーナス・バチルス（The Genus Baci
llus(1973))及びバージーズ・マニュアル・オブ・シス
テマティック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology (1984)) に記載された方法に
基づいて調べた。

【００１６】（１）形態 （ア）細胞の形及び大きさ：桿菌で大きさは約（０．４
〜０．８）μｍ×約（１．５〜３．０）μｍ （イ）細胞の多形性：なし （ウ）運動性：有り （エ）胞子形成能：有り。胞子の形状は楕円形で、位置
は中立から亜端立。胞子の大きさは約（０．５〜０．
８）μｍ×（０．８〜１．３）μｍ （オ）グラム染色性：陽性。

【００１７】（２）培地における生育状況 （ア）肉汁寒天平板培養：集落は黄白色半透明の円形、
表面は扁平状。 （イ）肉汁寒天斜面培養：拡布状に生育。 （ウ）肉汁液体培養：混濁。 （エ）肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。 （オ）リトマスミルク：凝固もペプトン化もしない。

【００１８】（３）生理学的性質 （ア）硝酸塩の還元：− （イ）ＶＰテスト：− （ウ）ＶＰブロスpH：５．９ （エ）インドールの生成：− （オ）硫化水素の生成：− （カ）澱粉の加水分解：＋ （キ）色素の生成：色素を生成しない。 （ク）カタラーゼの生成：＋ （ケ）オキシダーゼの生成：＋ （コ）生育範囲：pH中性（pH６〜８）付近で生育。温度
２５〜６０℃で生育し、６５℃では生育しない。 （サ）酸素に対する態度：絶対好気性。 （シ）脱窒反応：− （ス）無機窒素の利用：アンモニウム塩を利用できる
が、硝酸塩は利用できない。 （セ）ウレアーゼ：−（ソ）クエン酸の利用：− （タ）ＯＦテスト：グルコースを用いたとき嫌気的に酸
を生成する。 （チ）耐塩性：ＮａＣｌ濃度２．０％で生育する。

【００１９】（ツ）下記の糖からの酸の生成の有無 １）Ｌ−アラビノース ± ２）Ｄ−キシロース ＋ ３）Ｄ−グルコース ＋ ４）Ｄ−マンノース ＋ ５）Ｄ−フラクトース ＋ ６）Ｄ−ガラクトース − ７）マルトース ＋ ８）ショ糖 ± ９）乳糖 ＋ １０）トレハロース ± １１）Ｄ−ソルビトール ＋ １２）Ｄ−マンニトール ＋ １３）イノシトール ＋ １４）グリセリン ＋ １５）澱粉 −

【００２０】以上の菌学的性質から、本菌株ＳＤ９０２
の分類学的地位をバージーズ・マニュアル・オブ・シス
テマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology (1984))に従い検索し、好気
性、グラム陽性桿菌、胞子を形成する等の観点からバチ
ルス(Bacillus)属に属する細菌と同定した。

【００２１】さらに５５℃以上でも生育することから本
菌株はバチルス・ステアロサーモフィラス（B. stearot
hermophilus)、バチルス・シュレゲリイ(B. schlegeli
i) 、バチルス・アシドカルダリウス(B. acidocaldariu
s）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformi
s）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バ
チルス・ブレビス（B. brevis)らに近縁であることが考
えられたが、表３に示すように嫌気的生育、ＶＰテス
ト、ＶＰブロスのpH及び生育温度範囲等の性質から、本
菌株ＳＤ９０２はこれらバチルス属のどの公知の菌種の
標準株とも異なる菌学的性質を有していることが明らか
となった。従って、本菌株ＳＤ９０２は現在の分類学的
地位では、バチルス属の新菌種として分類するのが適当
であるとの結論に達した。

【００２２】

【表３】

【００２３】本菌株バチルスｓｐ．ＳＤ９０２は新規な
キシラナーゼであるキシラナーゼ１及びキシラナーゼ２
を産生する。例えば、主成分としてキシラン及び酵母エ
キス、ポリペプトンを含有する液体培地にバチルスｓ
ｐ．ＳＤ９０２菌株を接種し、５５℃で１〜３日間培養
する。培養液から遠心分離により菌体及び不溶物質をと
り除き培養上澄液を得、次いで、この培養上澄液から硫
安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー等の公知の方法によりキシラナーゼ１及
びキシラナーゼ２を分離もしくは精製することができ
る。例えば、硫安塩析による沈殿物を透析し、次いで陰
イオン交換クロマトグラフィー、陽イオンクロマトグラ
フィーにより精製し、更にゲル濾過クロマトグラフィー
により分離精製することによりキシラナーゼ１及びキシ
ラナーゼ２を分離して取得することができる。

【００２４】本発明のキシラナーゼ１の理化学的性質は
次の通りである。 （１）作用及び基質特異性 キシランまたはキシラン系多糖に作用し、そのβ−１，
４−キシロシド結合を加水分解してキシロース及びキシ
ロビオースを多量に生成し、キシロトリオース以上の重
合度を有するキシロオリゴ糖を少量しか生成しない。ま
た、結晶性セルロースを分解するアビセラーゼ活性やカ
ルボキシメチルセルロースを分解するシーエムシーアー
ゼ（ＣＭＣａｓｅ）活性等のセルラーゼ活性を実質的に
示さない。 （２）作用pH及び至適pH pH２．５から１０．０の範囲の種々のpHの酢酸緩衝液ま
たは硼酸緩衝液を用いて６０℃でのキシラナーゼ活性測
定を行なった場合、４．０より高く且つ１０．０より低
いpH範囲で作用し、至適pHが６．０付近である。また、
約pH４．７〜８．０の範囲で最大活性の７０％以上の活
性を示す。

【００２５】（３）作用温度及び至適温度 リン酸緩衝液（pH７．０）を用いて３０℃から９０℃ま
での種々の温度でキシラナーゼ活性を測定した場合、９
０℃までの温度範囲で作用し、至適温度が７５℃付近で
ある。 （４）pH安定性 pH３．２から９．９の範囲の種々のpHの酢酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液または硼酸緩衝液を用いて４０℃で４８時間
保持した後の残存キシラナーゼ活性を測定した場合、pH
５．０〜９．９の範囲で９５％以上の活性を保持してい
る。

【００２６】（５）熱安定性 リン酸緩衝液（pH７．０）を用いて６０℃で２４時間保
持した後の残存キシラナーゼ活性を測定した場合、９０
％以上の活性を保持している。 （６）分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量が約３４，０００である。 （７）等電点 pH９．４付近である。

【００２７】本発明のキシラナーゼ２の理化学的性質は
次の通りである。 （１）作用及び基質特異性 キシランまたはキシラン系多糖に作用し、そのβ−１，
４−キシロシド結合を加水分解してキシロースを生成し
且つキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラ
オース等のキシロオリゴ糖を多量に生成する。また、結
晶性セルロースを分解するアビセラーゼ活性やカルボキ
シメチルセルロースを分解するシーエムシーアーゼ（Ｃ
ＭＣａｓｅ）活性等のセルラーゼ活性を実質的に示さな
い。 （２）作用pH及び至適pH pH２．６から９．６の範囲の種々のpHの酢酸緩衝液また
は硼酸緩衝液を用いて６０℃でのキシラナーゼ活性測定
を行なった場合、２．６より高く且つ９．６より低いpH
範囲で作用し、至適pHが６．０付近である。また、約pH
５．０〜７．７の範囲で最大活性の７０％以上の活性を
示す。

【００２８】（３）作用温度及び至適温度 リン酸緩衝液（pH７．０）を用いて３０℃から９０℃ま
での種々の温度でキシラナーゼ活性を測定した場合、９
０℃までの温度範囲で作用し、至適温度が６５〜７０℃
付近である。 （４）pH安定性 pH３．２から９．９の範囲の種々のpHの酢酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液または硼酸緩衝液を用いて４０℃で４８時間
保持した後の残存キシラナーゼ活性を測定した場合、pH
４．０〜９．０の範囲で９５％以上の活性を保持してい
る。

【００２９】（５）熱安定性 リン酸緩衝液（pH７．０）を用いて６０℃で２４時間保
持した後の残存キシラナーゼ活性を測定した場合、７０
％以上の活性を保持している。 （６）分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量が約２１，０００である。 （７）等電点 pH９．８付近である。

【００３０】尚、キシラナーゼ１及びキシラナーゼ２の
作用pHを図１、作用温度を図２、pH安定性を図３、及び
熱安定性を図４に例示した。

【００３１】キシラナーゼ１あるいはキシラナーゼ２
は、バチルスｓｐ．ＳＤ９０２、その亜種、それらの突
然変異株及び遺伝子工学的手法による改良株から選んだ
菌株を培養し、培養物からキシラナーゼ１あるいはキシ
ラナーゼ２を回収することにより製造される。

【００３２】その際の培養方法としては、液体培養、固
体培養等の通常の細菌の培養方法を用いることができ
る。とりわけ、経済性の見地から、好気的に液体培養す
る方法が好ましく、その例としては、好気的条件下での
通気撹拌培養法や振盪培養法が挙げられる。

【００３３】本発明のキシラナーゼ製造法において用い
られる培地は、用いる菌株が増殖し得るものであれば任
意のものでよく、例えば、炭素源としては、同化できる
炭素化合物またはこれを含有するものであればよく、例
えば各種キシラン、小麦ふすま、パルプ廃液、穀物糖化
粕あるいは稲藁等のキシランあるいはキシラン系多糖を
含む各種原料あるいはグルコース、澱粉もしくは液化澱
粉等の澱粉水解物、糖蜜等の糖類を単独あるいは組み合
わせて用いることが出来る。

【００３４】また、例えば、窒素源としては、同化でき
る窒素化合物またはこれを含有するものであればよく、
例えば、有機窒素含有物として各種アミノ酸、コーンス
ティープリカー、麦芽エキス、ペプトン、大豆粉、脱脂
大豆粉等が、また無機窒素化合物としては、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩を単独あ
るいは組み合わせて用いることが出来る。

【００３５】その他、菌の生育及び酵素生産に必要な各
種の有機物や無機物またはこれを含有するもの、例えば
リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩
等の塩類、ビタミン類、酵母エキス等を適宜添加するこ
ともできる。

【００３６】培養温度は１０〜７０℃の範囲であればよ
いが、ｓｐ．ＳＤ９０２の場合には２５〜６０℃の範囲
が好ましく、更により好ましくは３５〜５５℃の範囲が
よい。培養pHは培養全期を通してpH４〜１０の範囲であ
ればよいが、ｓｐ．ＳＤ９０２の場合にはpH６〜８が好
ましい。培養時間は通常１０〜１２０時間の範囲であれ
ばよく、キシラナーゼ蓄積量が最高に達した時に培養を
終了すればよい。特に経済性の見地から、例えばｓｐ．
ＳＤ９０２の場合には２０〜８０時間の範囲とすること
が好ましい。

【００３７】培養終了後、培養液から公知の方法により
キシラナーゼ１またはキシラナーゼ２を得ることができ
る。すなわち、培養後、フィルタープレス濾過等の精密
濾過、膜濾過、遠心分離、硫酸アンモニウム等による沈
澱、膜濃縮等の濃縮、乾燥等の操作を適宜選択して用い
ることにより、培養液から不要物を分離除去し、キシラ
ナーゼ１またはキシラナーゼ２を酵素液あるいは酵素粉
末の状態で得ることができる。例えば、まず培養液中の
菌体等を遠心分離により除去し、培養上澄液を得る。こ
の上澄液を、そのままあるいは適宜希釈あるいは濃縮
し、あるいは安定化剤等を加えて、酵素液として利用す
ることも可能である。あるいは、この上澄液から、例え
ば６０％硫酸アンモニウム沈澱により酵素を沈澱させ、
沈澱物を濾過等の公知の方法により分離して酵素を得る
ことができる。また、得られた酵素を一夜透析後、各種
イオン交換クロマトグラフィーあるいはゲル濾過クロマ
トグラフィー等公知の方法を用いてキシラナーゼ１及び
キシラナーゼ２を取得することができる。

【００３８】本発明のキシラナーゼ１及びキシラナーゼ
２はパルプ中の主要構成成分であるセルロースを加水分
解するセルラーゼ活性を実質的に有していないため、パ
ルプ中のセルロースの損傷を誘起することなしに、パル
プの白色度向上、品質の向上、パルプ漂白工程で使われ
る塩素系漂白剤等化学漂白剤使用量の削減、その他前述
の応用を目的とするパルプ処理を行なうのに適してい
る。キシラナーゼ１あるいはキシラナーゼ２をかかるパ
ルプ処理に用いる場合、０．０１〜１０００Ｕ／ｇ乾燥
パルプ、好ましくは０．０５〜１０Ｕ／ｇ乾燥パルプの
範囲で使用することができる。

【００３９】本発明によるパルプ処理方法において、温
度、pH、圧力、時間等の、酵素をパルプに作用させる処
理条件は、所望の酵素作用が発現され、それによりパル
プの白色度向上などの所望の効果を生じる条件であれば
よい。すなわち、処理温度は１０〜８０℃の範囲であれ
ばよく、好ましくは４０〜７０℃の範囲がよい。処理pH
は３〜１０の範囲であればよく、好ましくは４〜９、よ
り好ましくは５〜８の範囲がよい。

【００４０】また、処理圧力は、パルプ漂白その他の通
常のパルプ処理工程において用いられる圧力であればよ
く、特に制限はないが、経済性の見地から常圧で行なう
ことが好ましい。処理時間としては、１０分〜５０時間
の範囲であればよく、好ましくは１〜２４時間の範囲が
よく、更により好ましくは１〜５時間の範囲がよい。

【００４１】例えば、実施例に示したようにバチルスｓ
ｐ．ＳＤ９０２由来のキシラナーゼ５００Ｕ／kg乾燥パ
ルプを用いて広葉樹未漂白クラフトパルプの酵素処理を
行なうと、比較的短時間の酵素処理で、多量の含有リグ
ニンが除去される効果が得られ、また、更に白色度を上
げたい場合に酵素処理の後に用いる化学漂白剤の使用量
が大幅に削減される。このような効果を有する本発明に
よるパルプ処理方法は、現在行なわれている塩素系化学
漂白剤を用いた漂白工程の少なくとも一部を代替する工
程として十分に利用可能なものと考えられる。

【００４２】本発明によるパルプの処理方法は、クラフ
トパルプ、サルファイトパルプ、セミケミカルパルプ、
砕木パルプ、リファイナ砕木パルプ、サーモメカニカル
パルプ等のような、広葉樹、針葉樹あるいは非木材由来
の広範囲のパルプに適用でき、パルプ中の残留リグニン
量を減少する効果が得られ、パルプの白色度の向上、品
質の向上、あるいは化学漂白剤使用量の削減などの効果
が得られる。また、これらのパルプを酸素等により漂白
処理する工程において、あるいはその前もしくは後にお
いて本発明による処理方法を適用できる。

【００４３】本発明によるキシラナーゼを用いたパルプ
の処理に続いて、パルプから溶解されたあるいは溶解し
易くなったリグニンを効果的に除去するために抽出操作
を行なうこともできる。例えば、水酸化ナトリウム抽出
を行なうことができ、その場合の典型的な抽出条件とし
ては、パルプ濃度を０．３〜２０％の範囲とし、水酸化
ナトリウムを０．５〜５％濃度（対乾燥パルプ重量）の
範囲で用い、４０〜８０℃の温度で、３０分〜３時間、
好ましくは１〜２時間処理することを例示できる。

【００４４】本発明の方法によるパルプ処理の後、更に
化学漂白剤等を使用することによりパルプの白色度を向
上させることができる。この場合、パルプを化学漂白剤
のみで漂白する場合に比べて化学漂白剤の使用量を大幅
に減じても、同等以上の白色度を得ることができる。例
えば、二酸化塩素を化学漂白剤として使用した場合、そ
の使用量を少なくとも２３％から４３％以上減じること
ができる。

【００４５】本発明によるパルプの処理方法により処理
されたパルプから製造された紙は、例えば、塩素化フェ
ノール性化合物の含量が低い等、従来の漂白パルプから
製造された紙よりも優れた品質を有することも見い出さ
れた。これは、パルプ中のヘミセルロース成分の一つで
あるキシランがセルラーゼ活性を有さないキシラナーゼ
処理により効果的に除去されたためと考えられるが、詳
細はよくわからない。

【００４６】本発明によれば、キシランまたはキシラン
系多糖にキシラナーゼ１あるいはキシラナーゼ２を作用
させてキシロースあるいはキシロビオース、キシロトリ
オース、キシロテトラオース等のキシロオリゴ糖を製造
する方法が提供される。

【００４７】本発明において、キシラナーゼ１あるいは
キシラナーゼ２を用い、キシロースあるいはキシロオリ
ゴ糖を製造するための製造条件は、酵素がキシラナーゼ
活性を保持している条件下であればよい。例えば、処理
温度は約１０〜８０℃の範囲であればよく、好ましくは
４０〜７０℃で行なわれる。処理pHは３〜１０の範囲で
あればよく、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８
の範囲である。また反応時間は、キシランまたはキシラ
ン系多糖に酵素が作用する時間であればよく、例えば１
０分〜２４時間の範囲であればよく、好ましくは１〜１
０時間、より好ましくは１〜３時間の範囲である。

【００４８】本発明によりキシロースあるいはキシロオ
リゴ糖を製造するために用いられるキシランまたはキシ
ラン系多糖としては、例えば稲藁、バガス、小麦フス
マ、コーンコブ等の農業廃棄物あるいは木材等またはそ
れらから予め分離したキシラン類が挙げられる。かかる
キシランまたはキシラン系多糖の濃度は０．１〜５０％
の範囲であればよく、好ましくは０．５〜３０％の範囲
で行なうことができる。

【００４９】本発明によるキシラナーゼ１およびキシラ
ナーゼ２は実質的にセルロースを加水分解するセルラー
ゼ活性を有していないため、キシロースあるいはキシロ
オリゴ糖の製造に用いる場合、例えば０．０１〜１００
０Ｕ／ｇ乾燥キシラン、好ましくは０．０５〜１０Ｕ／
ｇ乾燥キシランの範囲で使用することができる。

【００５０】

【実施例】次に本発明について実施例で更に詳しく説明
するが、これらは単なる例示であり、本発明を限定する
ものではない。 実施例１ １．０％バーチキシラン、０．１％酵母エキス、１．０
％ポリペプトン、０．５％リン酸水素二カリウム、０．
０５％硫酸マグネシウム、０．００２％硫酸鉄、０．０
５％塩化ナトリウムからなる液体培地（pH７．０）２リ
ットルを５リットル容のジャーファーメンターに入れ、
１２１℃で２０分滅菌した。これに同じ培地で培養した
バチルスｓｐ．ＳＤ９０２の菌体を接種し、５５℃で４
８時間好気的に通気撹拌培養を行なった（撹拌速度１０
００rpm 、通気量１リットル／分）。培養後、培養液を
６０００rpm で遠心分離して菌体を除去した。

【００５１】次に、上記の方法で得た上澄液のうち７０
０mlに硫酸アンモニウムを６０％飽和となるように添加
し、塩析を行なった。塩析により得た酵素沈澱物を５０
mMのリン酸緩衝液（pH７．０）に溶解して一夜透析し
た。透析後の酵素液を陰イオン交換クロマトグラフィー
（ＤＥＡＥ−セルロファイン、生化学工業（株）製）に
かけ、素通り画分を陽イオン交換クロマトグラフィー
（ＣＭ−セルロファイン、生化学工業（株）製）にか
け、０〜０．６Ｍの塩化ナトリウム１０００mlの直線濃
度勾配で溶出を行ない、７mlずつ分画した。キシラナー
ゼ活性が認められる画分を分取し、限外濾過による濃縮
を行なった後、濃縮液のうち１０mlを、５mMリン酸緩衝
液（pH７．０）を展開液としてゲル濾過クロマトグラフ
ィー（トヨパールＨＷ５５ｓ（東ソー（株）製）／カラ
ム径２．５cm、カラム長７０cm）による分離精製を行な
い、先に溶出する画分としてキシラナーゼ１（８１０
Ｕ）及び後に溶出する画分としてキシラナーゼ２（１１
５０Ｕ）を得た。

【００５２】実施例２ バーチキシラン（シグマ社製、Ｘ−０５０２）０．５重
量％溶液に、実施例１と同様の方法により得られたキシ
ラナーゼ１を、キシラン１グラム当り２００Ｕ添加し
た。この混合液のpHを６．０に調整し、次いで６０℃に
加温して反応させ、２４時間までの反応の経時変化を追
跡した。反応終了後、処理液を１００℃、５分間処理し
た後、遠心分離により酵素沈澱物を反応液中から除去し
た。反応生成物を薄層クロマトグラフィー及び高速液体
クロマトグラフィーを用いて分析した。

【００５３】薄層クロマトグラフィーによる生成物の分
析は次のようにして行なった。反応生成物を、薄層（キ
ーゼルグール ６０Ｆ２５４、メルク社製）上でブタノ
ール：ピリジン：水＝８：１：１で展開した。発色液
は、０．２％ジフェニルアミン及び０．２％アニリン含
有アセトン溶液と８５％リン酸を容量比で５：１に混合
して用いた。分析の結果、反応初期からキシロース、キ
シロビオースの生成が認められ、反応後期ではそれらの
生成量の顕著な増加が認められた。

【００５４】一方、高速液体クロマトグラフィーによる
反応生成物の分析は次のようにして行なった。反応成分
を糖類用ゲル濾過カラムであるＳｈｏｄｅｘ Ｉｏｎｐ
ａｋＳ−８０１（昭和電工（株）製）を用い、水での溶
出によりクロマトグラフィー処理を行なった。溶出した
成分を示差屈折率検出器で検出した。反応２４時間後の
生成物を分析したところ、原料バーチキシランに対しキ
シロースが２２％（ｗ／ｗ）、キシロビオースが４０％
（ｗ／ｗ）生成していた。

【００５５】実施例３ バーチキシラン（シグマ社製、Ｘ−０５０２）０．５重
量％溶液に、実施例１と同様の方法により得られたキシ
ラナーゼ２を、キシランの１グラム当り２００Ｕ添加し
た以外は実施例２と同様の方法で反応及び分析を行なっ
た。分析の結果、反応初期からキシロース、キシロビオ
ースの生成が認められ、反応後期ではそれらの生成量の
顕著な増加が認められた。また、反応２４時間後の生成
物を分析したところ、原料バーチキシランに対しキシロ
ースが８％（ｗ／ｗ）、キシロビオースが３４％（ｗ／
ｗ）、キシロトリオース以上の重合度を有するキシロオ
リゴ糖が７％（ｗ／ｗ）生成していた。

【００５６】実施例４ パルプ濃度１０重量％の広葉樹未漂白クラフトパルプス
ラリー５００ｇ（乾燥パルプ５０ｇ）に実施例１と同様
の方法により得られたバチルスｓｐ．ＳＤ９０２の培養
液から調製された酵素含有上澄液をキシラナーゼ活性と
して１００、５００、または１０００Ｕ／kg乾燥パルプ
となるように添加した。なお酵素処理を行なう際のpHは
６に調整した。このパルプスラリーを６０℃で１時間ま
たは３時間加温し、次いでパルプを濾過後、２〜３倍量
の水で洗浄した。つづいてこのパルプに水を加えてパル
プ濃度が１０重量％及び乾燥パルプ重量当り１．３重量
％相当の水酸化ナトリウムを含む液とし、６０℃で１時
間抽出処理し、その後パルプを水で洗浄した。

【００５７】酵素を添加しない場合以外は上記と同様の
処理により酵素無添加サンプルを調製し、酵素処理の効
果を比較した。リグニン含有量の指標であるカッパー価
の測定は日本工業規格ＪＩＳＰ８２１１の方法に従って
行なった。各処理により得られたパルプのカッパー価を
表４に示した。また、３時間酵素処理後の乾燥パルプ重
量は４９ｇであった。

【００５８】

【表４】

【００５９】実施例５ パルプ濃度１０重量％の針葉樹未漂白クラフトパルプス
ラリー５００ｇ（乾燥パルプ５０ｇ）を用いた以外は実
施例４と同様にして、酵素処理及び水酸化ナトリウムに
よる抽出処理を行なった。酵素無添加処理サンプルも同
様にして調製した。これらの処理により得られたパルプ
のカッパー価を表５に示した。また、２４時間酵素処理
後の乾燥パルプ重量は４９ｇであった。

【００６０】

【表５】

【００６１】比較例１ パルプ濃度１０重量％の広葉樹未漂白クラフトパルプス
ラリーに二酸化塩素を１２．５kg／ｔ乾燥パルプとなる
ように添加し、７０℃で１時間漂白処理した。処理後２
〜３倍量の水で洗浄した。つづいてこのパルプに水を加
えてパルプ濃度が１０重量％及び乾燥パルプ重量当り
１．３重量％相当の水酸化ナトリウムを含む液とし、６
０℃で１時間抽出処理し、その後パルプを水で洗浄し
た。このパルプのカッパー価は３．５となった。

【００６２】このようにして得た水酸化ナトリウム抽出
処理パルプ（カッパー価３．５）に水を加えてパルプ濃
度が１０重量％及び二酸化塩素が１８．９kg／ｔ乾燥パ
ルプを含む液とし、７０℃で３時間漂白処理した。処理
後２〜３倍量の水で洗浄した後乾燥してハンター白色度
９０％の漂白パルプを得た。尚、ハンター白色度は日本
工業規格ＪＩＳＰ８１２３の方法に従って測定した。こ
の二段漂白で使用した二酸化塩素の総使用量は３１．４
kg／ｔ乾燥パルプであった。

【００６３】実施例６ パルプ濃度１０重量％の広葉樹未漂白クラフトパルプス
ラリー５００ｇ（乾燥パルプ５０ｇ）に、実施例１と同
様の方法により得られたバチルスｓｐ．ＳＤ９０２の培
養液から調製された酵素含有上澄液をキシラナーゼ活性
として５００Ｕ／kg乾燥パルプとなるように添加した。
なお酵素処理を行なう際のpHは６に調整した。このパル
プスラリーを６０℃で３時間加温し、次いでパルプを濾
過後、２〜３倍量の水で洗浄した。つづいてこのパルプ
に水を加えてパルプ濃度が１０重量％及び二酸化塩素が
１０．２kg／ｔ乾燥パルプを含む液とし、７０℃で１時
間漂白処理した。処理後２〜３倍量の水で洗浄した。更
に、このパルプに水を加えてパルプ濃度が１０重量％及
び乾燥パルプ重量当たり１．３重量％相当の水酸化ナト
リウムを含む液とし、６０℃で１時間抽出処理した後、
パルプを水で洗浄した。このパルプのカッパー価は３．
５となった。

【００６４】このようにして得た酵素処理、二酸化塩素
処理及び水酸化ナトリウム抽出処理を行なったパルプ
（カッパー価３．５）に水を加えてパルプ濃度が１０重
量％及び二酸化塩素が７．７kg／ｔ乾燥パルプを含む液
とし、７０℃で３時間漂白処理した。処理後２〜３倍量
の水で洗浄した後乾燥してハンター白色度９０％の漂白
パルプを得た。この二段漂白で使用した二酸化塩素の総
使用量は１７．９kg／ｔパルプであり、酵素を使用しな
い場合（比較例１）に比べて二酸化塩素の使用量は４３
％少なかった。

【００６５】実施例７ パルプ濃度１０重量％の広葉樹未漂白クラフトパルプス
ラリー５００ｇ（乾燥パルプ５０ｇ）に実施例１と同様
の方法により得られたキシラナーゼ１をキシラナーゼ活
性として５００Ｕ／kgパルプとなるように添加した。こ
のパルプスラリーを６０℃で３時間加温し、ついでパル
プを濾過後、２〜３倍量の水で洗浄した。つづいてこの
パルプに水を加えてパルプ濃度が１０重量％及び二酸化
塩素が１０．１kg／ｔ乾燥パルプを含む液とし、７０℃
で１時間漂白処理した。処理後２〜３倍量の水で洗浄し
た。更に、このパルプに水を加えてパルプ濃度が１０重
量％及び乾燥パルプ重量当たり１．３重量％相当の水酸
化ナトリウムを含む液とし、６０℃で１時間抽出処理し
た後、パルプを水で洗浄した。このパルプのカッパー価
は３．５となった。

【００６６】このようにして得た酵素処理、二酸化塩素
処理及び水酸化ナトリウム抽出処理を行なったパルプ
（カッパー価３．５）に水を加えてパルプ濃度が１０重
量％及び二酸化塩素が７．７kg／ｔ乾燥パルプを含む液
とし、７０℃で３時間漂白処理した。処理後２〜３倍量
の水で洗浄した後乾燥してハンター白色度９０％の漂白
パルプを得た。この二段漂白で使用した二酸化塩素の総
使用量は１７．８kg／ｔパルプであり、酵素を使用しな
い場合（比較例１）に比べて二酸化塩素の使用量は４３
％少なかった。

【００６７】実施例８ パルプ濃度１０重量％の広葉樹未漂白クラフトパルプス
ラリー５００ｇ（乾燥パルプ５０ｇ）に実施例１と同様
の方法により得られたキシラナーゼ２をキシラナーゼ活
性として５００Ｕ／kgパルプとなるように添加した。こ
のパルプスラリーを６０℃で３時間加温し、ついでパル
プを濾過後、２〜３倍量の水で洗浄した。つづいてこの
パルプに水を加えてパルプ濃度が１０重量％及び二酸化
塩素が１１．３kg／ｔ乾燥パルプを含む液とし、７０℃
で１時間漂白処理した。処理後２〜３倍量の水で洗浄し
た。更に、このパルプに水を加えてパルプ濃度が１０重
量％及び乾燥パルプ重量当たり１．３重量％相当の水酸
化ナトリウムを含む液とし、６０℃で１時間抽出処理し
た後、パルプを水で洗浄した。このパルプのカッパー価
は３．５となった。

【００６８】このようにして得た酵素処理、二酸化塩素
処理及び水酸化ナトリウム抽出処理を行なったパルプ
（カッパー価３．５）に水を加えてパルプ濃度が１０重
量％及び二酸化塩素が１２．９kg／ｔ乾燥パルプを含む
液とし、７０℃で３時間漂白処理した。処理後２〜３倍
量の水で洗浄した後乾燥してハンター白色度９０％の漂
白パルプを得た。この二段漂白で使用した二酸化塩素の
総使用量は２４．２kg／ｔパルプであり、酵素を使用し
ない場合（比較例１）に比べて二酸化塩素の使用量は２
３％少なかった。

【００６９】実施例９ パルプ濃度１０重量％の広葉樹未漂白クラフトパルプス
ラリー５００ｇ（乾燥パルプ５０ｇ）に、実施例１と同
様の方法により得られたバチルスｓｐ．ＳＤ９０２の培
養液から調製された酵素含有上澄液をキシラナーゼ活性
として５００Ｕ／kg乾燥パルプとなるように添加した。
なお酵素処理を行なう際のpHは６に調整した。このパル
プスラリーを６０℃で３時間加温し、次いでパルプを濾
過後、２〜３倍量の水で洗浄した。つづいてこのパルプ
に水を加えてパルプ濃度が１０重量％及び二酸化塩素が
１０．２kg／ｔ乾燥パルプを含む液とし、７０℃で１時
間漂白処理した。処理後２〜３倍量の水で洗浄した。更
に、このパルプに水を加えてパルプ濃度が１０重量％及
び乾燥パルプ重量当たり１．３重量％相当の水酸化ナト
リウムを含む液とし、６０℃で１時間抽出処理した後、
パルプを水で洗浄した。このパルプのカッパー価は３．
５となった。一方、比較例１と同様の方法に従ってカッ
パー価３．５の酵素未使用パルプを得た。

【００７０】このようにして得たカッパー価３．５のパ
ルプに水を加えてパルプ濃度が１０重量％及び二酸化塩
素が８．０kg／ｔ乾燥パルプを含む液とし、７０℃で３
時間漂白処理した。処理後２〜３倍量の水で洗浄した後
乾燥してハンター白色度を測定した。その結果、酵素処
理パルプのハンター白色度は９０．２％であったのに対
し、酵素未処理パルプのハンター白色度は８８．５％で
あった。

【００７１】実施例１０ パルプ濃度１０重量％の広葉樹未漂白クラフトパルプス
ラリー５００ｇ（乾燥パルプ５０ｇ）に実施例１と同様
の方法により得られたキシラナーゼ１をキシラナーゼ活
性として５００Ｕ／kgパルプとなるように添加した。こ
のパルプスラリーを６０℃で３時間加温し、ついでパル
プを濾過後、２〜３倍量の水で洗浄した。つづいてこの
パルプに水を加えてパルプ濃度が１０重量％及び二酸化
塩素が１０．１kg／ｔ乾燥パルプを含む液とし、７０℃
で１時間漂白処理した。処理後２〜３倍量の水で洗浄し
た。更に、このパルプに水を加えてパルプ濃度が１０重
量％及び乾燥パルプ重量当たり１．３重量％相当の水酸
化ナトリウムを含む液とし、６０℃で１時間抽出処理し
た後、パルプを水で洗浄した。このパルプのカッパー価
は３．５となった。一方、比較例１と同様の方法に従っ
てカッパー価３．５の酵素未使用パルプを得た。

【００７２】このようにして得たカッパー価３．５のパ
ルプに水を加えてパルプ濃度が１０重量％及び二酸化塩
素が８．０kg／ｔ乾燥パルプを含む液とし、７０℃で３
時間漂白処理した。処理後２〜３倍量の水で洗浄した後
乾燥してハンター白色度を測定した。その結果、酵素処
理パルプのハンター白色度は９０．２％であったのに対
し、酵素未処理パルプのハンター白色度は８８．０％で
あった。

【００７３】実施例１１ パルプ濃度１０重量％の広葉樹未漂白クラフトパルプス
ラリー５００ｇ（乾燥パルプ５０ｇ）に実施例１と同様
の方法により得られたキシラナーゼ２をキシラナーゼ活
性として５００Ｕ／kgパルプとなるように添加した。こ
のパルプスラリーを６０℃で３時間加温し、ついでパル
プを濾過後、２〜３倍量の水で洗浄した。つづいてこの
パルプに水を加えてパルプ濃度が１０重量％及び二酸化
塩素が１１．３kg／ｔ乾燥パルプを含む液とし、７０℃
で１時間漂白処理した。処理後２〜３倍量の水で洗浄し
た。更に、このパルプに水を加えてパルプ濃度が１０重
量％及び乾燥パルプ重量当たり１．３重量％相当の水酸
化ナトリウムを含む液とし、６０℃で１時間抽出処理し
た後、パルプを水で洗浄した。このパルプのカッパー価
は３．５となった。一方、比較例１と同様の方法に従っ
てカッパー価３．５の酵素未使用パルプを得た。

【００７４】このようにして得たカッパー価３．５のパ
ルプに水を加えてパルプ濃度が１０重量％及び二酸化塩
素が１２．０kg／ｔ乾燥パルプを含む液とし、７０℃で
３時間漂白処理した。処理後２〜３倍量の水で洗浄した
後乾燥してハンター白色度を測定した。その結果、酵素
処理パルプのハンター白色度は８９．８％であったのに
対し、酵素未処理パルプのハンター白色度は８９．０％
であった。

【００７５】

【発明の効果】本発明によれば、新規なキシラナーゼで
あるキシラナーゼ１及びキシラナーゼ２及びその製造法
が提供される。これらの新規なキシラナーゼはパルプの
白色度の向上、品質の向上、パルプ漂白工程で使われる
化学漂白剤の削減、パルプフリーネスの向上等のための
パルプ処理等のバイオマス処理に有効に使用され、また
本発明によりかかるパルプ処理方法が提供される。例え
ば本発明のパルプ処理方法によりかかるパルプの処理を
行なうと、比較的短時間の酵素処理で、多量のリグニン
が除去される効果が得られ、パルプの白色度向上、品質
向上あるいは化学漂白剤使用量の削減等の効果が得られ
る。また、本発明によるこれらの新規キシラナーゼは、
甘味料、保湿剤、飼料等の用途面で食品工業、化粧品工
業、飼料工業等において有効に利用されるキシロースあ
るいはキシロオリゴ糖の製造に有効に使用され、本発明
によりかかるキシロースあるいはキシロオリゴ糖の製造
方法が提供される。また、本発明によれば、これらの新
規なキシラナーゼを産生するバチルス属細菌が提供され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】キシラナーゼ１及びキシラナーゼ２の作用pHを
例示するグラフである。

【図２】キシラナーゼ１及びキシラナーゼ２の作用温度
を例示するグラフである。

【図３】キシラナーゼ１及びキシラナーゼ２のpH安定性
を例示するグラフである。

【図４】キシラナーゼ１及びキシラナーゼ２の熱安定性
を例示するグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 正辻 詠子 東京都大田区多摩川２丁目24番25号 昭 和電工株式会社 生化学研究所内 (72)発明者 世古 雅彦 東京都大田区多摩川２丁目24番25号 昭 和電工株式会社 生化学研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 キシラナーゼであって、下記の理化学的
   性質を有するキシラナーゼ２： （１）キシランまたはキシラン系多糖に作用し、そのβ
   −１，４−キシロシド結合を加水分解してキシロースを
   生成し且つキシロビオース、キシロトリオース、キシロ
   テトラオース等のキシロオリゴ糖を多量に生成する。 （２）２．６より高く且つ９．６より低いpH範囲で作用
   し、至適pHが６．０付近である。 （３）９０℃までの温度範囲で作用し、至適温度が６５
   〜７０℃付近である。 （４）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測
   定した分子量が約２１，０００である。 （５）等電点がpH９．８付近である。
2. 【請求項２】 バチルス属細菌を培養し、培養物から請
   求項１記載のキシラナーゼを回収することを特徴とする
   キシラナーゼの製造法。
3. 【請求項３】 バチルス属細菌がバチルスｓｐ．ＳＤ９
   ０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５０８）である請求項２記載
   のキシラナーゼの製造法。
4. 【請求項４】 請求項１記載のキシラナーゼをパルプに
   作用させるパルプの処理方法。
5. 【請求項５】 キシランまたはキシラン系多糖に請求項
   １記載のキシラナーゼを作用させてキシロースあるいは
   キシロオリゴ糖を製造する方法。