JP5733711B2 - ヘキセンウロン酸特異的遊離酵素およびこの酵素を産生する微生物 - Google Patents
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本発明は、木材チップのアルカリ蒸解過程で産出される、パルプ中などに含まれるヘキセンウロン酸の遊離に有効な酵素およびこの酵素を産生する微生物、並びにそれらの使用方法に関する。
製紙用化学パルプの漂白において、漂白後のパルプに多量のヘキセンウロン酸が残存すると、漂白後パルプの褪色性悪化の原因となる(非特許文献２)。
ヘキセンウロン酸とは、パルプ中に存在するヘミセルロースであるキシラン中の側鎖グルクロン酸が、蒸解工程にて脱メタノールする事により生じる物質である。パルプの白色度への影響は小さいものの、分子内に二重結合を有するため、過マンガン酸カリと反応し、Ｋ価あるいはｋａｐｐａ価としてカウントされる(非特許文献１)。
この褪色性悪化を改善するために、キシラン中の側鎖ヘキセンウロン酸を遊離させて除去する必要があるが、このための方法として、二酸化塩素あるいはオゾンの使用量を増やし、ヘキセンウロン酸を酸化して除去する方法がある。しかし、ヘキセンウロン酸は分子内の二重結合によりこれら酸化剤を消費するために、従来の塩素に比べ高価なこれら酸化剤の使用量を増やすことは、漂白コストを大幅に高くするとの問題を生じる。
非特許文献２には、高温酸処理でヘキセンウロン酸を遊離させ、洗い流す方法が開示されている。具体的には、９０℃、１８０分、ｐＨ３程度の酸処理によって、ヘキセンウロン酸を酸加水分解除去する方法が提案されている。この方法は、安価な酸によるｐＨ調整だけでヘキセンウロン酸を除去できることから有効な方法であるが、多量の蒸気を必要とするために、やはり漂白コストの増大は免れない。また、蒸気コストを下げるために、処理温度を７０℃程度とすると、ヘキセンウロン酸は殆ど除去されない。また、高温で酸処理をするために装置材質として腐食につよいハステロイなどの高価な材質が必要になるとの問題点がある。
さらに非特許文献２には、二酸化塩素処理条件を強化してヘキセンウロン酸を除去する方法が開示されている。すなわち、漂白温度９０℃、ｐＨ３、処理時間１２０分〜１８０分の処理でヘキセンウロン酸を除去する方法である。この方法は、高温酸処理と二酸化塩素処理を組み合わせた方法であり、酸処理と同様多量の蒸気を必要とすること、高温で二酸化塩素処理を行うため通常の二酸化塩素処理に比べ、白色度の向上が劣るなどの問題点がある。また、高温で処理するため装置材質として高価な材質が必要となるとの問題点がある。
非特許文献３では、広葉樹キシランから４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸を遊離するα−(１→２)−グルクロニダーゼを生産する微生物の探索を行っている。この研究の目的はα−グルクロニダーゼで４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸(飽和ウロン酸)を遊離させて、広葉樹キシランを糖化することであり、蒸解処理後酸素漂白した広葉樹パルプ中のキシランに結合したヘキセンウロン酸(不飽和ウロン酸)を除去する事の示唆はまったく無い。
特許文献１には、パルプを漂白用酵素で処理し、その酵素を回収・再利用する方法が記載されている。漂白酵素の１種としてヘミセルラーゼを使用すること、そのヘミセルラーゼの例としてグルクロニダーゼが記載されているが、不飽和ウロン酸の除去については全く開示されていない。
特許文献２において、本発明者等は、グルクロニターゼを用いてパルプ中の不飽和ウロン酸を遊離させて洗い流す方法を見いだした。この方法は、パルプの熱褪色性を改善する優れた方法であるが、熱褪色の原因とならない飽和ウロン酸とも作用してしまうため、酵素の使用量が増大するとともにパルプの収率を低下させてしまう可能性がある。また、これまで、飽和ウロン酸を実質的に遊離させずにヘキセンウロン酸を選択的に遊離させる酵素は知られていない。
ヘキセンウロン酸とは、パルプ中に存在するヘミセルロースであるキシラン中の側鎖グルクロン酸が、蒸解工程にて脱メタノールする事により生じる物質である。パルプの白色度への影響は小さいものの、分子内に二重結合を有するため、過マンガン酸カリと反応し、Ｋ価あるいはｋａｐｐａ価としてカウントされる(非特許文献１)。
この褪色性悪化を改善するために、キシラン中の側鎖ヘキセンウロン酸を遊離させて除去する必要があるが、このための方法として、二酸化塩素あるいはオゾンの使用量を増やし、ヘキセンウロン酸を酸化して除去する方法がある。しかし、ヘキセンウロン酸は分子内の二重結合によりこれら酸化剤を消費するために、従来の塩素に比べ高価なこれら酸化剤の使用量を増やすことは、漂白コストを大幅に高くするとの問題を生じる。
非特許文献２には、高温酸処理でヘキセンウロン酸を遊離させ、洗い流す方法が開示されている。具体的には、９０℃、１８０分、ｐＨ３程度の酸処理によって、ヘキセンウロン酸を酸加水分解除去する方法が提案されている。この方法は、安価な酸によるｐＨ調整だけでヘキセンウロン酸を除去できることから有効な方法であるが、多量の蒸気を必要とするために、やはり漂白コストの増大は免れない。また、蒸気コストを下げるために、処理温度を７０℃程度とすると、ヘキセンウロン酸は殆ど除去されない。また、高温で酸処理をするために装置材質として腐食につよいハステロイなどの高価な材質が必要になるとの問題点がある。
さらに非特許文献２には、二酸化塩素処理条件を強化してヘキセンウロン酸を除去する方法が開示されている。すなわち、漂白温度９０℃、ｐＨ３、処理時間１２０分〜１８０分の処理でヘキセンウロン酸を除去する方法である。この方法は、高温酸処理と二酸化塩素処理を組み合わせた方法であり、酸処理と同様多量の蒸気を必要とすること、高温で二酸化塩素処理を行うため通常の二酸化塩素処理に比べ、白色度の向上が劣るなどの問題点がある。また、高温で処理するため装置材質として高価な材質が必要となるとの問題点がある。
非特許文献３では、広葉樹キシランから４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸を遊離するα−(１→２)−グルクロニダーゼを生産する微生物の探索を行っている。この研究の目的はα−グルクロニダーゼで４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸(飽和ウロン酸)を遊離させて、広葉樹キシランを糖化することであり、蒸解処理後酸素漂白した広葉樹パルプ中のキシランに結合したヘキセンウロン酸(不飽和ウロン酸)を除去する事の示唆はまったく無い。
特許文献１には、パルプを漂白用酵素で処理し、その酵素を回収・再利用する方法が記載されている。漂白酵素の１種としてヘミセルラーゼを使用すること、そのヘミセルラーゼの例としてグルクロニダーゼが記載されているが、不飽和ウロン酸の除去については全く開示されていない。
特許文献２において、本発明者等は、グルクロニターゼを用いてパルプ中の不飽和ウロン酸を遊離させて洗い流す方法を見いだした。この方法は、パルプの熱褪色性を改善する優れた方法であるが、熱褪色の原因とならない飽和ウロン酸とも作用してしまうため、酵素の使用量が増大するとともにパルプの収率を低下させてしまう可能性がある。また、これまで、飽和ウロン酸を実質的に遊離させずにヘキセンウロン酸を選択的に遊離させる酵素は知られていない。
Tappi Journal May 2003 vol.2 No.5
Papehi ja Puu−Paper and Timber Vol.86 No.1 2004
森林総合研究所研究報告 第３５９号 １４１〜１５７
本発明者らは、ヘミセルロース中のウロン酸の遊離に有効な酵素であるα−グルクロニダーゼの産生能を有する公知の微生物（トリコデルマ リーゼ （Tricoderma rieesei）とアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger））を用いてヘキセンウロン酸の遊離を試みた。
具体的には、トリコデルマ リーゼ（Tricoderma rieesei）由来市販酵素製剤を用いたヘキセンウロノシルキシロトリオースの分解では、全く分解せず、また、アスペルギルス
ニガー（Aspergillus niger）由来培養上清を用いた分解では、グルクロン酸の遊離に比べて１／１００程度の低い分解率であった。
つまり、前記公知の微生物酵素系では、ヘキセンウロン酸の遊離能力が低いか、あるいは全く無く、現実的に採用するには能力的に不足している。
本発明者らは、ヘキセンウロン酸の遊離に優れた能力を有する酵素およびこの酵素を産生する微生物を探索するために、鋭意研究を重ねた結果、上記のような公知の酵素と比較してヘキセンウロン酸遊離活性が高いという目的の能力を有する酵素を発見し、この酵素を産生する微生物の単離に成功し、本発明に至ったものである。
ニガー（Aspergillus niger）由来培養上清を用いた分解では、グルクロン酸の遊離に比べて１／１００程度の低い分解率であった。
つまり、前記公知の微生物酵素系では、ヘキセンウロン酸の遊離能力が低いか、あるいは全く無く、現実的に採用するには能力的に不足している。
本発明者らは、ヘキセンウロン酸の遊離に優れた能力を有する酵素およびこの酵素を産生する微生物を探索するために、鋭意研究を重ねた結果、上記のような公知の酵素と比較してヘキセンウロン酸遊離活性が高いという目的の能力を有する酵素を発見し、この酵素を産生する微生物の単離に成功し、本発明に至ったものである。
本発明は、ヘキセンウロン酸の除去に有効な優れた特異的遊離酵素の提供を目的とする。
上記した目的を達成するために本発明は、下記の性質を示すヘキセンウロン酸特異的遊離酵素または該酵素を含む細胞画分を提供する。
（１）作用：ヘキセンウロン酸を側鎖および／または末端に有するキシロオリゴ糖からヘキセンウロン酸を遊離する。
（２）基質特異性：ヘキセンウロン酸を特異的に遊離し、ヘキセンウロン酸を遊離する活性に比べて、グルクロン酸を側鎖および／または末端に有するキシロオリゴ糖からグルクロン酸を遊離する活性は低い。
（１）作用：ヘキセンウロン酸を側鎖および／または末端に有するキシロオリゴ糖からヘキセンウロン酸を遊離する。
（２）基質特異性：ヘキセンウロン酸を特異的に遊離し、ヘキセンウロン酸を遊離する活性に比べて、グルクロン酸を側鎖および／または末端に有するキシロオリゴ糖からグルクロン酸を遊離する活性は低い。
本発明の酵素は、上記の作用、基質特異性の他、以下の性質を有することが好ましい。（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ：ヘキセンウロノシルキシロトリオース（図１参照、以下Δ-X3）の分解活性測定に基づく至適ｐＨは６．５〜７．０、安定ｐＨは５．０〜８．０である。
（４）至適温度：Δ-X3の分解活性測定に基づく至適温度は、３５〜４０℃である。
（５）熱安定性：Δ-X3の分解活性に関して、４５℃にて３０分の処理でほぼ１００％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約６０％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約２０％の活性を保持する。
（６）分子量：ゲル濾過カラムによるＨＰＬＣにて分子量マーカーとの溶出時間の比較から求めた酵素の分子量は、４５，０００〜６０，０００である。
（４）至適温度：Δ-X3の分解活性測定に基づく至適温度は、３５〜４０℃である。
（５）熱安定性：Δ-X3の分解活性に関して、４５℃にて３０分の処理でほぼ１００％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約６０％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約２０％の活性を保持する。
（６）分子量：ゲル濾過カラムによるＨＰＬＣにて分子量マーカーとの溶出時間の比較から求めた酵素の分子量は、４５，０００〜６０，０００である。
上記酵素は好ましくは、パエニバチルス（Paenibacillus）属細菌から得られ、より好ましくはパエニバチルス（Paenibacillus sp.）07-G-dH株（FERM BP-11131）から得られる。なお、パエニバチルス（Paenibacillus sp.）07-G-dH株は上記Δ-X3分解活性を有する限りにおいて、変異処理や遺伝子組み換えなどにより07-G-dH株から誘導される株であってもよい。
本発明はまた、上記酵素または該酵素を含む細胞画分を製紙用化学パルプに添加する工程を含む、製紙用化学パルプ中のヘキセンウロン酸の除去方法を提供する。
また、製紙用化学パルプ中のヘキセンウロン酸の除去には、前記酵素の産生能を有するパエニバチルス属に属するヘキセンウロノシルキシロトリオース分解微生物を用いることもできる。具体的には、パエニバチルス（Paenibacillus sp.）07-G-dH株（FERM BP-11131）（以下「07-G-dH」という）である。
また、製紙用化学パルプ中のヘキセンウロン酸の除去には、前記酵素の産生能を有するパエニバチルス属に属するヘキセンウロノシルキシロトリオース分解微生物を用いることもできる。具体的には、パエニバチルス（Paenibacillus sp.）07-G-dH株（FERM BP-11131）（以下「07-G-dH」という）である。
本発明の酵素もしくは該酵素を含む細胞画分および／または微生物を用いることにより、製紙用化学パルプ中のヘキセンウロン酸を効率よく遊離させて除去することができる。
本発明の07-G-dHは好気性グラム陽性桿菌であり、以下に示す菌学的性質を有している。
細胞形態 桿菌（０．７〜０．８×１．５〜２．５μｍ）
グラム染色 ＋
芽胞 ＋
運動性 ＋
コロニー形成 円形、レンズ状、全縁、滑らか、不透明
生育温度
３７℃ ＋
４５℃ ＋
５０℃ ＋
カタラーゼテスト ＋
オキシダーゼテスト ＋
グルコースからの酸／ガス産生 −／−
O/Fテスト −／−
３％ＮａＣｌでの生育 ＋
３％ＮａＣｌでの生育 −
カゼイン加水分解 −
発酵テスト
グリセロール −
エリスリトール −
Ｄ−アラビノース −
Ｌ−アラビノース ＋
リボース ＋
Ｄ−キシロース ＋
Ｌ−キシロース −
アドニトール −
β−メチル−Ｄ−キシロース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
フルクトース ＋
マンノース ＋
ソルボース ＋
ラムノース −
ズルシトール −
イノシトール ＋
マンニトール ＋
ソルビトール −
α−メチル−Ｄ−マンノ−ス −
α−メチル−Ｄ−グルコ−ス −
Ｎ−アセチルグルコサミン ＋
アミグダリン ＋
アルブチン ＋
エスクリン ＋
サリシン ＋
セロビオース ＋
マルトース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
スクロース ＋
トレハロース ＋
イヌリン ＋
メレジトース ＋
ラフィノース ＋
澱粉 ＋
グリコーゲン −
キシリトール −
ゲンチオビオース ＋
Ｄ−ツラノース ＋
Ｄ−タガトース −
Ｄ−フコース −
Ｌ−フコース −
Ｄ−アラビトール −
Ｌ−アラビトール −
グルコン酸塩 −
２−ケト−グルコン酸 −
５−ケト−グルコン酸 −
β-ガラクトシダーゼ ＋
アルギニンジヒドロラーゼ −
リシンデカルボキシラーゼ −
オルニチンデカルボキシラーゼ −
クエン酸の利用 −
硫化水素産生 −
ウレアーゼ −
トリプトファンデアミナーゼ −
インドール産生 −
アセトイン産生 −
ゼラチン加水分解 −
硝酸塩還元 −
グラム染色 ＋
芽胞 ＋
運動性 ＋
コロニー形成 円形、レンズ状、全縁、滑らか、不透明
生育温度
３７℃ ＋
４５℃ ＋
５０℃ ＋
カタラーゼテスト ＋
オキシダーゼテスト ＋
グルコースからの酸／ガス産生 −／−
O/Fテスト −／−
３％ＮａＣｌでの生育 ＋
３％ＮａＣｌでの生育 −
カゼイン加水分解 −
発酵テスト
グリセロール −
エリスリトール −
Ｄ−アラビノース −
Ｌ−アラビノース ＋
リボース ＋
Ｄ−キシロース ＋
Ｌ−キシロース −
アドニトール −
β−メチル−Ｄ−キシロース ＋
ガラクトース ＋
グルコース ＋
フルクトース ＋
マンノース ＋
ソルボース ＋
ラムノース −
ズルシトール −
イノシトール ＋
マンニトール ＋
ソルビトール −
α−メチル−Ｄ−マンノ−ス −
α−メチル−Ｄ−グルコ−ス −
Ｎ−アセチルグルコサミン ＋
アミグダリン ＋
アルブチン ＋
エスクリン ＋
サリシン ＋
セロビオース ＋
マルトース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
スクロース ＋
トレハロース ＋
イヌリン ＋
メレジトース ＋
ラフィノース ＋
澱粉 ＋
グリコーゲン −
キシリトール −
ゲンチオビオース ＋
Ｄ−ツラノース ＋
Ｄ−タガトース −
Ｄ−フコース −
Ｌ−フコース −
Ｄ−アラビトール −
Ｌ−アラビトール −
グルコン酸塩 −
２−ケト−グルコン酸 −
５−ケト−グルコン酸 −
β-ガラクトシダーゼ ＋
アルギニンジヒドロラーゼ −
リシンデカルボキシラーゼ −
オルニチンデカルボキシラーゼ −
クエン酸の利用 −
硫化水素産生 −
ウレアーゼ −
トリプトファンデアミナーゼ −
インドール産生 −
アセトイン産生 −
ゼラチン加水分解 −
硝酸塩還元 −
また、遺伝学的解析方法として１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を用いた微生物同定法を採用し、07-G-dHから回収したＤＮＡを増幅し、これをシーケンス解析したところ、パエニバチルス シネリス（Paenibacillus cineris）との相同性が９９.７％であった。パエニバチルス ラウツス（Paenibacillus lautus）との相同性は９５％であった。
なお、前記解析に用いた試薬および器具は以下のとおりである。
なお、前記解析に用いた試薬および器具は以下のとおりである。
１．ＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出には、BIO-RAD社製、InstaGene Matrixを用いた。
２．ＰＣＲ法
プライマーには、９F（配列番号１）、３３９F（配列番号２）、７８５F（配列番号３）、１０９９F（配列番号４）、５３６R（配列番号５）、８０２R（配列番号６）、１２４２R（配列番号７）、１５１０R（配列番号８）を用いた。
３．サイクルシーケンス
Applied Biosystems社製 BioDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いた。
4．シーケンシング
ＤＮＡシーケンサーには、Applied Biosystems社製 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer Systemを用いた。
ＤＮＡ抽出には、BIO-RAD社製、InstaGene Matrixを用いた。
２．ＰＣＲ法
プライマーには、９F（配列番号１）、３３９F（配列番号２）、７８５F（配列番号３）、１０９９F（配列番号４）、５３６R（配列番号５）、８０２R（配列番号６）、１２４２R（配列番号７）、１５１０R（配列番号８）を用いた。
３．サイクルシーケンス
Applied Biosystems社製 BioDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いた。
4．シーケンシング
ＤＮＡシーケンサーには、Applied Biosystems社製 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer Systemを用いた。
以上のように、07-G-dHは、好気性グラム陽性桿菌であり、芽胞およびカタラーゼテストが陽性である顕著な特徴およびその相同性から判断してパエニバチルス属に属する微生物と同定した。
この微生物はパエニバチルス（Paenibacillus sp.）07-G-dHと命名され、平成20年9月5日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受領番号FERM P-21669が付与された。その後、ブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-11131が付与されている。
パエニバチルス07-G-dH株の培養は、微生物の培養に一般的に用いられる、炭素源、窒素源、無機塩、栄養素等を含有させた培地を用いて行うことができる。培養時のｐHは４〜１０の範囲が好ましく、温度は２０〜３９℃が好ましい。培養は１日〜１週間程度好気的に行われる。
本発明のヘキセンウロン酸遊離酵素は、ヘキセンウロン酸を側鎖および／または末端に有するキシロオリゴ糖からヘキセンウロン酸を遊離させる活性を指標に、パエニバチルス07-G-dH株から通常の酵素精製法にしたがって精製することができる。例えば、培養終了後の培養液から遠心分離や膜分離等の通常の手法によって菌体を集め、超音波処理等の機械的方法等によって菌体を破砕する。その後、遠心分離等によって残渣を除き粗酵素液を得る。次にこの粗酵素液を塩析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、結晶化等により精製することができる。なお、本発明のヘキセンウロン遊離酵素は、必ずしも精製されたものを使用する必要はなく、粗酵素液の状態で使用することもできる。すなわち、パエニバチルス属細菌の細胞抽出液を分画し、その中から該酵素活性を指標にして選択された細胞画分を使用することもできる。
また、本発明のヘキセンウロン酸遊離酵素は、該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子組み換えによって生産することもできる。
パエニバチルス07-G-dH株の培養は、微生物の培養に一般的に用いられる、炭素源、窒素源、無機塩、栄養素等を含有させた培地を用いて行うことができる。培養時のｐHは４〜１０の範囲が好ましく、温度は２０〜３９℃が好ましい。培養は１日〜１週間程度好気的に行われる。
本発明のヘキセンウロン酸遊離酵素は、ヘキセンウロン酸を側鎖および／または末端に有するキシロオリゴ糖からヘキセンウロン酸を遊離させる活性を指標に、パエニバチルス07-G-dH株から通常の酵素精製法にしたがって精製することができる。例えば、培養終了後の培養液から遠心分離や膜分離等の通常の手法によって菌体を集め、超音波処理等の機械的方法等によって菌体を破砕する。その後、遠心分離等によって残渣を除き粗酵素液を得る。次にこの粗酵素液を塩析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、結晶化等により精製することができる。なお、本発明のヘキセンウロン遊離酵素は、必ずしも精製されたものを使用する必要はなく、粗酵素液の状態で使用することもできる。すなわち、パエニバチルス属細菌の細胞抽出液を分画し、その中から該酵素活性を指標にして選択された細胞画分を使用することもできる。
また、本発明のヘキセンウロン酸遊離酵素は、該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子組み換えによって生産することもできる。
本発明のパルプ中のヘキセンウロン酸の除去方法において、処理される製紙用化学パルプは、ポリサルファイドを含む、もしくは通常のクラフトパルプ化法(ＫＰ)、サルファイドパルプ化法(ＳＰ)、アルカリパルプ化法(ＡＰ)等のケミカルパルプ化法由来のパルプが好ましく、より好ましくはクラフトパルプ化法によって得られたパルプである。また、パルプ化に用いられる木本植物、草本植物については特に限定されるものではない。また、処理されるパルプは、前処理としてカッパー価２０以下になるように公知の酸素脱リグニン処理を行ったものが好ましく、より好ましくはカッパー価１２以下のものである。
本発明のパルプ中のヘキセンウロン酸の除去方法において、ヘキセンウロン酸遊離酵素の添加量はパルプ１ｇ当り０．１〜４００ユニットが好ましい。ここで、１ユニットは、３０℃で１分あたり１μｍｏｌのヘキセンウロン酸を遊離させる酵素量である。また、酵素処理のｐＨは２．０〜７．０、処理時間は１〜１２時間、処理温度は３０〜９０℃、パルプ濃度は３〜３０％が好ましい。
添加場所として酸素漂白後の未晒しパルプ、各種ＥＣＦ漂白段の中間部および漂白終了後に添加されるが、ヘキセンウロン酸遊離酵素の処理条件に合うところであれば、いずれの場所でもよい。
添加場所として酸素漂白後の未晒しパルプ、各種ＥＣＦ漂白段の中間部および漂白終了後に添加されるが、ヘキセンウロン酸遊離酵素の処理条件に合うところであれば、いずれの場所でもよい。
ヘキセンウロン酸遊離酵素は、精製されたものを使用することもできるし、精製されていない粗精製のものを使用することもできる。また、キシラナーゼ、キシロシダーゼ又はグルクロニダーゼ等を添加・混合したものを使用することもできる。さらに、生菌中に含有された状態のままで使用することもできる。
酵素処理を行ったパルプは、洗浄無しで、または洗浄を行って、次段のＥＣＦあるいはＴＣＦ漂白シークエンスへ送られる。分子状塩素を用いない漂白シークエンスとしては、Ｄ−Ｅｐ−Ｄ、Ｄ−Ｅｏｐ−Ｄ、Ｄ−Ｅｐ−Ｐ−Ｄ、Ｄ−Ｅｏｐ−Ｐ−Ｄ、Ｄ−Ｅｐ−Ｄ−Ｄ、Ｄ−Ｅｏｐ−Ｄ−Ｄ，Ｄ−Ｅｐ−Ｄ−Ｐ，Ｄ−Ｅｏｐ−Ｄ−Ｐのような二酸化塩素主体のＥＣＦシークエンスがある。また、Ｚ−Ｅｐ−Ｄ、Ｚ−Ｅｏｐ−Ｄ、Ｚ−Ｅｐ−Ｐ−Ｄ、Ｚ−Ｅｏｐ−Ｐ−Ｄ、Ｚ−Ｅｐ−Ｄ−Ｄ、Ｚ−Ｅｏｐ−Ｄ−Ｄ，Ｚ−Ｅｐ−Ｄ−Ｐ、ＺＤ−Ｅｏｐ−Ｄ−Ｐのようなオゾン主体のＥＣＦシークエンスや、ＺＤ−Ｅｐ−Ｄ、ＺＤ−Ｅｏｐ−Ｄ、ＺＤ−Ｅｐ−Ｐ−Ｄ、ＺＤ−Ｅｏｐ−Ｐ−Ｄ、ＺＤ−Ｅｐ−Ｄ−Ｄ、ＺＤ−Ｅｏｐ−Ｄ−Ｄ，ＺＤ−Ｅｐ−Ｄ−Ｐ、ＺＤ−Ｅｏｐ−Ｄ−Ｐのようなオゾンと二酸化塩素を併用したＥＣＦシークエンスがある。さらには、Ｚ−Ｅｐ−Ｐ、Ｚ−Ｅｏｐ−Ｐ、Ｚ−Ｅｐ−Ｐ−Ｐ、Ｚ−Ｅｏｐ−Ｐ−Ｐ、Ｚ−Ｅｐ−Ｑ−Ｐ、Ｚ−Ｅｏｐ−Ｑ−ＰのようなＴＣＦシークエンスがある。前記漂白シーケンスにおいて、Ｄは二酸化塩素、Ｅはアルカリ抽出、ｐおよびＰは過酸化水素、ｏは酸素、Ｚはオゾン、Ｑは酵素の漂白処理を表し、−は洗浄処理を表す。これらの漂白シークエンスの如何は、本発明をいささかも制限するものではない。ここで、ヘキセンウロン酸遊離酵素の添加場所として、上記漂白シーケンスの中間段および漂白終了後の完成パルプに添加してもよい。
すなわち、本発明の特徴は通常のＥＣＦ漂白、ＴＣＦ漂白シーケンスに酵素処理を導入することにより、従来、ヘキセンウロン酸の除去は難しいと言われた４０℃〜７０℃の低温処理においても、パルプ粘度を保持しながら、ヘキセンウロン酸を除去できることである。更に、ヘキセンウロン酸以外の物質へのダメージが少ないことから、排水ＣＯＤ値を上昇させることなく実施できることである。また、本発明の酵素を利用することにより、化学薬品の使用を極力抑えた漂白パルプの製造プロセスが可能となるため、環境面において非常に優れたパルプの製造方法となる。
微生物の単離
本発明の07-G-dHは、下記のように単離した。
本発明の07-G-dHは、下記のように単離した。
L字試験管にヘキセンウロノシルキシロトリオース（図１参照、以下Δ-X3） 0.5%、Yeast Nitrogen Base 0.1%、Yeast Extract 0.1%、Polypeptone 0.1%、KH2PO4 0.1%、MgSO4・7H2O 0.1%(pH8.5) からなる液体培地10mlを分注し、１２０℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、福島県いわき市内で採取した土壌を０．０５ｇ加え、３０℃恒温下で１２０rpmとして４日間振とう培養した。
前記で得られた集積培養液１００μｌを、上記液体培地に寒天１．５％を加えた平板培地上に植菌し、これを３０℃恒温下で２日間静置培養してコロニー単離を行った。
前記で得られた集積培養液１００μｌを、上記液体培地に寒天１．５％を加えた平板培地上に植菌し、これを３０℃恒温下で２日間静置培養してコロニー単離を行った。
前記で得られた単離株菌を上記液体培地に植菌し、３０℃恒温下で４日間振とう培養を行い、培養液を遠心分離後、培養上清を薄層クロマトグラフィーで分析しΔ-X3の資化能評価を行った。
その結果、Δ-X3の資化能の高い株菌（07-G-dHと命名）を得た。
その結果、Δ-X3の資化能の高い株菌（07-G-dHと命名）を得た。
前記07-G-dHは、Δ-X3資化能を示したが、本菌の培養上清をΔ-X3に作用させたところ、全く分解活性を示さなかった。
つまり、この株菌はΔ-X3の資化分解に酵素系を菌体内に産生していることが推察される。
つまり、この株菌はΔ-X3の資化分解に酵素系を菌体内に産生していることが推察される。
実施例１
本菌の培養液50 mLを遠心分離し、集めた菌体ペレットを酸化アルミニウムを用いて破砕した。これにリン酸緩衝液（pH6.5）を添加して撹拌後、遠心分離によって粗酵素液（i）を得た。さらに得られた沈殿物に1% Tritonを含む同緩衝液を添加後、遠心分離して、粗酵素液（ii）を得た。
本菌の培養液50 mLを遠心分離し、集めた菌体ペレットを酸化アルミニウムを用いて破砕した。これにリン酸緩衝液（pH6.5）を添加して撹拌後、遠心分離によって粗酵素液（i）を得た。さらに得られた沈殿物に1% Tritonを含む同緩衝液を添加後、遠心分離して、粗酵素液（ii）を得た。
Δ-X3溶液に粗酵素液（i）、（ii）をそれぞれ加え、30℃で24時間反応した。その後100℃で5分間加熱失活させ、薄層クロマトグラフィーによって分析した。ブランクは各粗酵素液をあらかじめ100℃で5分間失活させたものを用いた。
基質溶液に粗酵素液を添加、インキュベートしたサンプルをTLCによって分析した(図２)。ブランク、酵素液をそれぞれ添加した場合を比較してみると、粗酵素中のヘキセンウロン酸遊離酵素によりΔ-X3が分解されてヘキセンウロン酸が遊離したことがスポットの変化より推定された。
基質溶液に粗酵素液を添加、インキュベートしたサンプルをTLCによって分析した(図２)。ブランク、酵素液をそれぞれ添加した場合を比較してみると、粗酵素中のヘキセンウロン酸遊離酵素によりΔ-X3が分解されてヘキセンウロン酸が遊離したことがスポットの変化より推定された。
実施例２
Δ-X3およびグルクロノシルキシロトリオース (GA-X3) を用いて酵素の基質特異性を調べた。Δ-X3およびGA-X3 溶液に粗酵素液（i）、（ii）をそれぞれ加え、30℃で24時間反応した。その後100℃で5分間加熱失活させ、薄層クロマトグラフィーによって分析した。ブランクは各粗酵素液をあらかじめ100℃で5分間失活させたものを用いた。
図３より、07-G-dHより得られた酵素はΔ-X3を特異的に遊離することがわかった。
Δ-X3およびグルクロノシルキシロトリオース (GA-X3) を用いて酵素の基質特異性を調べた。Δ-X3およびGA-X3 溶液に粗酵素液（i）、（ii）をそれぞれ加え、30℃で24時間反応した。その後100℃で5分間加熱失活させ、薄層クロマトグラフィーによって分析した。ブランクは各粗酵素液をあらかじめ100℃で5分間失活させたものを用いた。
図３より、07-G-dHより得られた酵素はΔ-X3を特異的に遊離することがわかった。
また、上記粗酵素液を用いて酵素の酵素学的性質を調べたところ、以下の通りであった。
Δ-X3の分解活性測定に基づく至適ｐＨは６．５〜７．０、安定ｐＨは５．０〜８．０。
Δ-X3の分解活性測定に基づく至適温度は、３５〜４０℃。
Δ-X3の分解活性に関して、４５℃にて３０分の処理でほぼ１００％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約６０％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約２０％の活性を保持する。
さらに、ゲル濾過カラムによるＨＰＬＣにて分子量マーカーとの溶出時間の比較から求めた酵素の分子量は、４５，０００〜６０，０００であった。
Δ-X3の分解活性測定に基づく至適ｐＨは６．５〜７．０、安定ｐＨは５．０〜８．０。
Δ-X3の分解活性測定に基づく至適温度は、３５〜４０℃。
Δ-X3の分解活性に関して、４５℃にて３０分の処理でほぼ１００％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約６０％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約２０％の活性を保持する。
さらに、ゲル濾過カラムによるＨＰＬＣにて分子量マーカーとの溶出時間の比較から求めた酵素の分子量は、４５，０００〜６０，０００であった。
実施例３〜５
以下、広葉樹材（Ｌ材）パルプへの適用例について記す。パルプは、クラフト蒸解−酸素脱リグニン後のＬ材パルプＡを用いた。
以下、広葉樹材（Ｌ材）パルプへの適用例について記す。パルプは、クラフト蒸解−酸素脱リグニン後のＬ材パルプＡを用いた。
パルプ種Ａ；白色度５０．２％、Ｋ価６．７、ヘキセンウロン酸濃度：４６．２μｍｏｌ／ｇ
・白色度：ＩＳＯ−２４７０
・Ｋ価 ：ＴＡＰＰＩ Ｋ価法
・ヘキセンウロン酸濃度：絶乾量０．８ｇのパルプを、パルプ濃度１％に希釈し、蟻酸にてｐＨ３．０に調製後９０℃−２４０分加熱して、ヘキセンウロン酸を２−フランカルボン酸と５−ホルミル−２−フランカルボン酸に加水分解する。冷却後パルプと水に分離し、水中の２−フランカルボン酸と５−ホルミル−２−フランカルボン酸を液体クロマトグラフィーにより、ＵＶ２６５ｎｍの検出器を用いて定量し、その合算をＨｅｘＡ量とした。
・褪色テスト：酵素処理パルプを離解後、硫酸アルミニウムを添加しｐＨ５．５に調製した後、坪量６０ｇ／ｍ2のシートを作製した。作製したシートを８５℃、相対湿度６５％の条件下で２４時間静置し、静置前後の白色度から下式に従ってＰＣ価を算出した。
・ＰＣ価：褪色の度合い
PC価＝100(褪色後のK/S−褪色前のK/S)
K/S＝(１−白色度)2／（２×白色度）
・白色度：ＩＳＯ−２４７０
・Ｋ価 ：ＴＡＰＰＩ Ｋ価法
・ヘキセンウロン酸濃度：絶乾量０．８ｇのパルプを、パルプ濃度１％に希釈し、蟻酸にてｐＨ３．０に調製後９０℃−２４０分加熱して、ヘキセンウロン酸を２−フランカルボン酸と５−ホルミル−２−フランカルボン酸に加水分解する。冷却後パルプと水に分離し、水中の２−フランカルボン酸と５−ホルミル−２−フランカルボン酸を液体クロマトグラフィーにより、ＵＶ２６５ｎｍの検出器を用いて定量し、その合算をＨｅｘＡ量とした。
・褪色テスト：酵素処理パルプを離解後、硫酸アルミニウムを添加しｐＨ５．５に調製した後、坪量６０ｇ／ｍ2のシートを作製した。作製したシートを８５℃、相対湿度６５％の条件下で２４時間静置し、静置前後の白色度から下式に従ってＰＣ価を算出した。
・ＰＣ価：褪色の度合い
PC価＝100(褪色後のK/S−褪色前のK/S)
K/S＝(１−白色度)2／（２×白色度）
絶乾質量１ｇのクラフト蒸解−酸素脱リグニン後のＬ材パルプＡに粗酵素液（i）を，それぞれ、２ｍｌ（０．０８ユニット）、４ｍｌ（０．１６ユニット）、６ｍｌ（０．２４ユニット）添加し、パルプ濃度５％、ｐＨ５、温度４０℃の条件で２４０分処理した。反応終了後、パルプを濾別して酵素処理パルプを得た。結果を表２に示した。
比較例１
実施例３〜５において粗酵素液を添加しない以外は同様に処理した。結果を表２に示した。
実施例３〜５において粗酵素液を添加しない以外は同様に処理した。結果を表２に示した。
表１より、07-G-dHより得られた酵素は、Ｌ材パルプ中のヘキセンウロン酸を特異的に遊離することがわかった。
実施例６
クラフト蒸解後酸素漂白を行ったパルプＡを用い、初段に酵素処理を導入したＧ−Ｄ−Ｅｏp−Ｄの漂白シーケンスによる漂白を行った。
Ｇ(酵素処理)：ＰＣ１０％、ｐＨ５、４０℃、１８０分 酵素／絶乾パルプ質量１ｇあたり０．２ユニット（粗酵素液５ｍｌ）
初段Ｄ：ＰＣ１０％、６０℃、３０分、ＣｌＯ2／１．０％
Ｅｏp：ＰＣ１０％、６０℃、９０分、ＮａＯＨ／０．８％、Ｏ2／０．１５％
Ｈ2Ｏ2／０．３％
Ｄ：ＰＣ１０％、７０℃、１２０分、ＣｌＯ2／０．４％
洗浄条件：各段の反応終了後、パルプ濃度２．５％に希釈し、パルプ濃度２０％に脱水し、次段に移行した。
結果を表２に記した。
クラフト蒸解後酸素漂白を行ったパルプＡを用い、初段に酵素処理を導入したＧ−Ｄ−Ｅｏp−Ｄの漂白シーケンスによる漂白を行った。
Ｇ(酵素処理)：ＰＣ１０％、ｐＨ５、４０℃、１８０分 酵素／絶乾パルプ質量１ｇあたり０．２ユニット（粗酵素液５ｍｌ）
初段Ｄ：ＰＣ１０％、６０℃、３０分、ＣｌＯ2／１．０％
Ｅｏp：ＰＣ１０％、６０℃、９０分、ＮａＯＨ／０．８％、Ｏ2／０．１５％
Ｈ2Ｏ2／０．３％
Ｄ：ＰＣ１０％、７０℃、１２０分、ＣｌＯ2／０．４％
洗浄条件：各段の反応終了後、パルプ濃度２．５％に希釈し、パルプ濃度２０％に脱水し、次段に移行した。
結果を表２に記した。
実施例７
漂白段の中間に酵素処理を導入したＤ−Ｅop−Ｇ−Ｄの漂白シーケンスで行う以外、実施例６と同様に行った。結果を表２に記した。
漂白段の中間に酵素処理を導入したＤ−Ｅop−Ｇ−Ｄの漂白シーケンスで行う以外、実施例６と同様に行った。結果を表２に記した。
実施例８
漂白段の最終段に酵素処理を導入したＤ−Ｅop−Ｄ−Ｇの漂白シーケンスで行う以外、実施例６と同様に行った。結果を表２に記した。
漂白段の最終段に酵素処理を導入したＤ−Ｅop−Ｄ−Ｇの漂白シーケンスで行う以外、実施例６と同様に行った。結果を表２に記した。
比較例４
酵素処理を行わない以外、実施例６と同様に行った。結果を表２に記した。
酵素処理を行わない以外、実施例６と同様に行った。結果を表２に記した。
表２より、二酸化塩素と過酸化水素を使用した漂白シーケンスの中に酵素処理を導入することにより、パルプの褪色度を改善できた。
Claims (4)
- 次の性質を示す、パエニバチルス（Paenibacillus sp.）07-G-dH（FERM BP-11131）株に由来する、ヘキセンウロン酸遊離酵素または該酵素を含む細胞画分。
（１）作用：ヘキセンウロン酸を側鎖および／または末端に有するキシロオリゴ糖からヘキセンウロン酸を遊離させる。
（２）基質特異性：ヘキセンウロン酸を特異的に遊離し、グルクロン酸を側鎖および／または末端に有するキシロオリゴ糖からグルクロン酸を遊離する活性は低い。
（３）分子量：ゲル濾過カラムによるＨＰＬＣにて分子量マーカーとの溶出時間の比較から求めた酵素の分子量は４５，０００〜６０，０００である。 - ヘキセンウロン酸遊離酵素がさらに以下の性質を有する、請求項１に記載のヘキセンウロン酸遊離酵素または該酵素を含む細胞画分。
（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ：ヘキセンウロノシルキシロトリオースの分解活性測定に基づく至適ｐＨは６．５〜７．０、安定ｐＨは５．０〜８．０である。
（５）至適温度：ヘキセンウロノシルキシロトリオースの分解活性測定に基づく至適温度は３５〜４０℃である。
（６）熱安定性：ヘキセンウロノシルキシロトリオース分解活性に関して、４５℃にて３０分の処理でほぼ１００％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約６０％の活性を保持し、６０℃にて３０分の処理で約２０％の活性を保持する。 - パエニバチルス（Paenibacillus sp.）07-G-dH（FERM BP-11131）株。
- 請求項１又は２に記載の酵素もしくは該酵素を含む細胞画分、または請求項３に記載のパエニバチルス07-G-dH株を製紙用化学パルプに添加する工程を含む、製紙用化学パルプ中のヘキセンウロン酸の除去方法。
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