JPH07508162A - α‐Ｌ‐アラビノフラノシダーゼ活性を示す脱リグニン化製剤，その製造および応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を示す脱リグニン化製剤、その製造および 応用本発明は、ｐＨ８〜９および６５℃の温度で木材バルブの脱リグニン化能を 有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性の本質部分を含んでなる、酵素活性 を示す製剤（ｐｒｅｐａｒａＬＩｏｎ　）に関する。また、本発明は、選択され たＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏＬｈｅｒｍｏｐｈｊｌｕｓ株の好気醗酵によ る前記製剤の製造法にも関する。本発明は、また、前記の選択された菌株も包含 する。更に、本発明は、木材バルブを本発明の製剤で処理することを含んでなる 方法、および前記製剤で処理した木材バルブにも関する。また本発明は、寄託し たＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ＋ｌｕｓ株ＮＣＩＭＢ　４ ０４９４によって発現される酵素の木材バルブの処理における使用にも関する。

また本発明は、１または２個の特定の部分アミノ酸配列またはその類似体を含ん でなるアミノ酸配列を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼにも関する。

背景 環境上の理由から、バルブおよび紙工業では、塩素含有化合物をまったく使用し ないバルブの脱リグニン化および漂白のための漂白工程に関心が集まってきてい る。

このため、最近ではバルブの脱リグニン化のための新規な酵素を開示した多くの 特許出願が出願されている。

このような特許出願の一つに、本発明者らのＷＯ９１／１０７２４号明細書（ス ウェーデン国優先権出願は１９９１年１２月１９日に特許として発行された）が あり、酵素活性を示しかつ少なくとも６５℃の温度および少なくともｐＨ９で木 材バルブの脱リグニン化能を有する製剤を特許請求している。この製剤は、２Ｆ ！類の寄託菌株ＮＣＩＭＢ　４０２２１またはＮＣＩＭＢ　４０２２２のうちの 一つのような前記製剤を製造する能力を何するＢａｃｉ　Ｉ　Ｉｕｓｓｔｅａｒ ｏＬｈｅｒｍ。

ｐｈ　ｉ　Ｉ　ｕｓを好気醗酵させることによって得ることができる。

酵素活性を精製した結果、分子量が４１，０００〜４２゜０００ダルトンのキシ ラナーゼが得られた。

キシラナーゼ活性以外の脱リグニン化酵素活性を精製するのに用いることができ るＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒＩＩｏ−ｐｈｉｌｕｓの別の菌株を 単離すべく努力が払われた。例えば、高温および高ｐＨで木材バルブを脱リグニ ン化することができるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、塩素を含む漂白化合 物を用いずに漂白工程を開発する際に追加の有用な手段となるものと考えられた 。

最近、Ｗ０９１／１８９７６号明細書（Ｎｏｖｏ　ＮｏｒｄｌｓｋＡ／Ｓによる 出願）が公表された。その請求の範囲第１４項は、Ｂａｃｉｉｌｕｓ　５ｔｅａ ｒｏＬ＋＋ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓによって産生されるアラビノフラノシダーゼ酵 素に関するものである。第９頁の１１および１２行目には、この文献が好熱性Ｂ ａｃｉｆｌｕｓ由来のアラビノフラノシダーゼに関連するものを全く含んでいな いことが記載されている。ＷＯ９１／１８９７６号明細書ては、Ｂａｃｌｌ　１ ｕｓ　５ｔｃａｒｏＬｌ＋ｅｒｍｏｐｈｌｌｕｓによって産生されるアラビノフ ラノシダーゼ酵素が特許請求されているが、この明細書にはこの酵素を得ること ができる方法については記載されていない。

３種類の菌株が寄託されており、２種類は単離されたものであり、１種類は変異 体である。しかしながら、これらのいずれについても前記出願明細書ではアラビ ノフラノシダーゼを産生ずることは示されていない。

アラビノフラノシダーゼを産生することが示されている唯一の菌株はｌ３１）Ｓ −３−１１−１７−４と命名されている寄託されていない変異体である。出願明 細書（第１７頁の最初の行を２照されたい）に示されている実験に用いられる製 剤は、この寄託されていない菌株から得られた醗酵生成物を用いて得られている ことも言わねばならない。第８頁の第１２〜１６行目には、この菌株か寄託菌株 の一つをエチルメタンスルホネートで突然変異誘発を行ったものに由来すること が開示されている。この突然変異誘発物質は特異性か極めて低く、アラビノフラ ノンダーゼ産生株を得る条件は得られない。従って、好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓか らアラビノフラノシダーゼを得る方法は、当該技術分野では未た開示されていな い。

発明の開示 本発明は、ｐＨ８〜９および６５℃の温度で木材バルブの脱リグニン化能を有す るα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性の本質部分を含んでなる、酵素活性を示 す製剤を提供するものである。

本明細書および請求の範囲において、「木材バルブ」という表現は広義に解釈す べきてあり、あらゆる種類のリグノセルロース性材料を包含するものとする。

本発明の一つの側面は、酵素活性を示す製剤であって、該製剤が菌株ＮＣＩＭＢ 　４０４９４並びに菌株ＮＣＩＭＢ　４０４９４と実質的に同様の前記製剤の産 生能ををするその突然変異体および変種から選択されるｌ１ａｃｌｌｌｕｓ　ｓ ＬｃａｒｏＬｂｃｒｍｏｐｈｌｌｕＳ株を適当な培地中において好気醗酵させる ことによって得られ、この製剤の酵素活性がｐＨ８〜９および６５℃の温度で木 材バルブの脱リグニン化能を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性の本質 部分を含んでなる製剤に関する。

本発明のこの側面の一つの態様では、製剤は清澄化された培養液である。本発明 のこの側面のもう一つの盾様では、この製剤は木材バルブ培地中てα−Ｌ−アラ ビノフラノシダーゼ活性を示す前記培養液を濃縮した両分である。本発明のこの 側面での更にもう一つの態様では、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性は近似 的分子量がそれぞれ５２，５００ダルトンおよび５７，５００ダルトンである２ つのサブユニットからなるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼに由来する。

本発明のもう一つの側面では、本発明の前記側面による製剤は、別の微生物株に よって産生される酵素活性を示しかつ少なくとも６５℃の温度および少なくとも ｐＨ９で木材バルブを脱リグニン化する能力を有する製剤と組み合わせたもので ある。本発明のこの側面での具体的態様では、この製剤はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓ ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＮＣＩＭＩ３４０４９４によって産生さ れるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｃａｒｏｔ ｈｃｒｗｏｐｈｉｌｕｓ株ＮＣＩＭＢ　４０２２２によって産生されるキシラナ ーゼを含んでいる。

本発明は、更なる側面において、Ｎ−末端部分アミノ酸配列：配列番号１： Ｍｅｔ９　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ？　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅ ｕを含むアミノ酸配列またはその類似体を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダー ゼに関するものである。

本発明は、Ｎ−末端部分アミノ酸配列：配列番号２：Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　 Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｉ　ｌｅ　Ｉ　Ｉｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓ ｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓｌｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ 　ｌｌｅ　Ｔｙｒを含むアミノ酸配列またはその類似体を有するα−Ｌ−アラビ ノフラノシダーゼに関するものでもある。

「Ｎ−末端部分アミノ酸配列：配列番号１：Ｍｅｔ？　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ 　Ａｒｇ　Ｐｒｏ？　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕを含むアミノ酸配列またはその類 似体を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ」および／または「Ｎ−末端部分 アミノ酸配列：配列番号２：Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ 　Ｍｅｔ　Ｉ　Ｉｅ　Ｉ　ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｉｋｅ　Ｌｙｓｌ ｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒを含 むアミノ酸配列またはその類似体を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ」に おいて、この類似体は配列番号１および／または配列番号２に関して、例えば木 材バルブ培地中で、好ましくは６５℃の温度およびｐＨ８〜９で酵素全体のα− Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を消失させない幾つかのアミノ酸の置換、伸張 または欠失を有するアミノ酸配列を有することを意味する。更に、このような類 似体は、例えば配列番号１および／または配列番号２の配列と共通のアミノ酸を ８０％以上有する配列を有することができる。

配列番号２の配列の類似体の一例は、 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＰｈｅ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ｌｌｅ　Ａ ｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　ＧｌｙＳｅｒ　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　Ｇｌ ｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＧｌｙＧｌｙ 　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｌａ 　Ａｓｐ　Ｇｌｕ＾ｓｎ　Ｇｌｙ の配列であって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒｉｏｐｈｌｌｕｓ　 ＮＣＩＭＢ４０２２２によって産生されるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼのＮ −末端配列である。このα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、それぞれ近似的分 子量が６４，０００ダルトンの２個の同一のサブユニットからなっている（ｎａ ｔｌＶｅ酵素はＳＤＳゲルによって判定したところ、１２８゜０００ダルトンで あった）。・ また、配列番号１の配列および／または配列番号２の配列の類似体は、これらの 配列に由来する任意のＤＮＡまたはＲＮＡプローブによって認識されるヌクレオ チドレベルでは十分に類似している任意のアミノ酸配列である。

本発明の更にもう一つの側面は、菌株ＮＣＩＭＢ　４０４９４並びに菌株ＮＧＩ Ｍ８４０４９４と実質的に同様の製剤の産生能を有するその突然変異体および変 種から選択されるＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒｉｏｐｈｌｌｕｓ株 を適当な培地中で好気醗酵させることによる酵素活性を示す製剤の製造法であっ て、前記製剤の酵素活性がｐＨ８〜９および６５℃の温度で木材バルブの脱リグ ニン化能を６するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性の本質部分を含んでなる ものである方法に関する。

更にもう一つの本発明の側面は、単離された１３ａｃｌ　Ｉ　ｌｕｓｓＬｅａｒ ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＮＣＩＭＢ　４０４９４　、並びに前記ＮＣＩＭ Ｂ　４０４９４株と実質的に同様の酵素活性を示す製剤の産生能を有し、この酵 素活性がｐＨ８〜９および６５℃の温度で木材バルブの脱リグニン化能を有する α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性の本質部分を含んでなるものである、その 突然変異体および変種に関する。

更にもう一つの本発明の側面は、Ｂ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｌＩｕｓ 株ＮＣＩＭＢ　４０４９４によって発現される酵素の木材バルブを処理するため の使用に関する。本明細書の第８表から明らかなように、この菌株は前記の細菌 のゲノムによって構成される様々な遺伝子の発現に由来する細胞外炭水化物分解 酵素活性を数種類産生ずる。

これらの様々な活性は総て個別に検討し尽くされてはいないが、これらの様々な 活性は個別にまたは様々な組み合わせで木材バルブの処理に有用であると考えら れる。

本発明のもう一つの側面は、木材バルブを本発明による製剤で少なくとも一つの 段階において処理することにより、木材バルブを処理する方法に関する。本発明 のこの側面の一態様では、処理を行う木材バルブは硫酸バルブである。もう一つ の態様では、処理を行う硫酸バルブは部分的に脱リグニン化された硫酸バルブで ある。本発明のこの側面の更にもう一つの態様では、処理を行う部分的に脱リグ ニン化された硫酸バルブは酸素−脱リグニン化された硫酸バルブである。

本発明のもう一つの側面は、本発明による製剤で少なくとも一つの段階において 処理された木材バルブに関する。

本発明の更にもう一つの側面は、配列番号１：Ｍｅｔ？　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙ ｒ　ＡｒｇＰｒｏ？　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕのアミノ酸配列および／または配 列番号２；Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｉ７ｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｉ　ｌ ｃ　Ｉ　ＩｃＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｃ　Ｌｙｓ１１ｅ＾Ｉａ　Ｇｌｕ　 Ｉ　ｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｉ　ｌｅ　Ｔｙｒのアミノ酸配列をコード するヌクレオチド配列を認識するＤＮＡまたはＲＮＡプローブに関する。

前記の本発明の側面は、少なくとも６５℃の温度および少なくともｐＨ８〜９で 木材バルブの脱リグニン化能を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを見出す のに有用である。

微生物の寄託 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈｌｌｕｓ株Ｌ１は、１９９２ 年３月２４日ブダペスト条約に基づき、Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔＩｏ ｎｓ　ｏ「ＩｎｄｕｓＬｒｌａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　 Ｌｔｄ　（ＮＣＩＭＢ）、アバディーンに寄託され、受託番号ＮＣＩＭＢ　４０ ４９４を得た。

同じ受託場所によって受託番号ＮＣＩＭＢ　４０２２２を受けているＢａｃｉｌ ｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏＬｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｔ−６は、ＷＯ９１／１０７ ２４号についての優先権出願の出願に関連して以前に寄託された。

熱に安定なα−Ｌ−アラビノフラノンダーゼを産生ずるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ ｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｌ１の単離Ａ、　アルカリ抽出したバルブ （ＡＲＰ）の調製酸素で半漂白した軟質の木材硫酸バルブに１５（乾燥重量繊維 ６〜１０％）を０．０２Ｎ　ＮａＯＨ（ｐＨ１１，７）に懸濁したものを、６０ 〜６２℃で１８〜２０時間インキュベーションした。熱いうちに、焼結ガラス漏 斗を用いて吸引下で流動物を繊維から分離した。

精製する溶液を中和してｐＨ７，０とし、限外濾過により濃縮した（分子０１０ ，０００カツトオフ）。代表的なしの（ＡＫＰ−１）は、リグニン５　、　２　 ｍｇ　／　ｍｌ　、炭水化物１　、　８５ｍｇ／ｍｌ　（フェノール−硫酸によ る）、およびペントース０．　８３ｍｇ／ｍｌ　（オルシノールによる）を含ん でいた。

Ｂ、　集積培養 ＡＲＰ−１に塩（０，１％Ｍｇ５０　・７Ｈ２０、１０ｍＭ　Ｋ　ＨＰＯ０，１ ％尿素および微量元素）２　４ゝ を補足し、Ｋｏｒｓｎａｅｓの水処理プールから採取した泥および水試料を接種 した。フラスコを、６５℃およびｐＨ９，０で４８時間振盪培養した。次に、濁 った培養液１滴を、０．２％ガラクトマンナン（Ｌｏｃｕｓｔ　ｂｅａｎ　ｇｕ ｍ。

５１ｇ５ａ）　１５　ｍｌを含むフラスコに接種した。６５℃およびｐＨ９，０ で２４時間培養した後、培養液をＬＢ寒天に塗布した。培養した後、約２０種類 のコロニーを純粋培養で単離し得た。予備実験の後、菌株の一つを詳細に検討し た。好熱性ａ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを含む菌株Ｌ１゜ 菌株Ｌ１はダラム陽性の好熱細菌であり、６０〜６５℃で良好に生育するが、４ ０℃未満では生育しなかった。

末端胞子を有する棒状の形態をしており、好気性で、オギシダーゼ陽性であった 。菌株Ｌ１は、Ｄ−グルコース、Ｄ−キンロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マン ノースおよびキシランの炭素源で生育した。メロビオースおよびガラクトースの 炭素源では生育しなかった。これらの特性に基づき、Ｌｌはへテログループの菌 株、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏＬｈｃｒｒａｏｐｈｉ　ｌｕｓとして分類し た。

初期実験（Ｋ１５パルプ使用） Ｃ１菌株Ｌ１由来の好熱性α−Ｌ−アラビノフラノンダーゼ ガラクトマンナン培地で生育した培養物の粗製の細胞外流動物はに１５バルブの 脱リグニン化で活性であったので、菌ｉＬ１を】舅択して更に検討を行った。酵 素調製物によって抽出されるリグニンの量を算出するため、感度の高い分光光度 分析法を用いた。試料の上澄液について３５０ｎｍ　（Ａ　）での吸光度をＡｌ １定し、測定値を放出されたリグニンの割合として表わした。様々な炭素源で生 育した菌株Ｌ］の生育度、および脱リグニン化活性を第１表に示す。この菌株は 酵母エキスおよびカザミノ酸て他の炭素源を加えなくともある程度まで生育し、 正味で５１９６の脱リグニン化度を生じた。ガラクトース以外の総ての糖類を加 えると更に生育が見られたが、ガラクトースは脱リグニン化活性の産生も阻害し た。最良の脱リグニン化活性は、キンロースおよびアラビノースそれぞれ７．１ ％および７．６％で生育した培養物でｉ）られた。

キシロースおよびアラビノース培地で生育した菌株Ｌ１の細胞外酵素活性を、第 ２表に示す。キシラナーゼ活性は、細胞外上澄液を含むキシランの新しい溶液を インキュベーションし、フェリシアニド法によって還元糖の増加をａｔｊ定する ことによって決定した（Ｓｐｌｒｏ、　Ｒ，Ｇ。

１９６６、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　８：　７−９） 。分析緩衝液は、５０　ｍ　Ｍ　トリス−ＣＩ、ｐ）ｆ７．Ｏおよび０．５％キ シラン（ｏａｔ　５ｐａｎｓ、　Ｓｉｇｍａ）であった。キシラナーゼの活性の 単位は、６５℃で毎分生成する還元糖のマイクロモル数である。

アラビノフラノシダーゼ分析は、β−ガラクトシダーゼの標準分析法の改変法で ある（Ｇ、　ＴａＬ＋ｏｌＬ　＆　Ｓｙｇｕｓｏｎ。

＾ｐｐ１．　＆　Ｅｎｖｉｒｏ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、、　ｖｏｌ、　５Ｂ、 　Ｎｏ、　ＩＩ、　１９９０）。

試験管には４０　ｍ　Ｍ　トリス−緩衝液、ｐＨ７，００，５ｍｌが入っている 。酵素試料０．４ｍｌおよび１０ｍＭｐ−二トロフェニルーα−Ｌ−アラビノフ ラノシド（Ｓｊｇ＋ｃａ　Ｃｈｅｒａｉｃａｌｓ）　Ｏ，１ｍｌを６５℃で１５ 分間インキュベーションした。試験管を氷水槽に入れて反応を停止した。ｐ−ニ トロフェノールの放出は、４０１ｎ■で分光光度法により′ｆＰｊ定した。１０ マイクロモル／　ｍｌのｐ−ニトロ−フェノールの吸光度は１８．４である。酵 素活性の単位は毎分放出されるｐ−ニトロフェニルのマイクロモル数として定義 される。

キシロース培地では２種類の活性だけが検出され、キシラカーゼ１，３単位／ｍ ｌおよびα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ０．００４単位／　ｍｌであった。α −Ｌ−アラビノピラノシダーゼ、マンナナーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼまた はα−Ｌ−マンノシダーゼ活性は検出されなかった。それ故、Ｌｌの脱リグニン 化活性は、細胞がキシロース培地で生育したときのキシラナーゼ活性によるもの と思われた。しかしながら、細胞をアラビノース培地で生育させたときには、主 要な活性はα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼであった（０．５単位／　ｍｌ　） 。それ故、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼはＡ−培地での脱リグニン化に関与 しているものと思われた。

α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＡＦ）活性を、Ａ−培地で生育したＬｌの１ ０リツトル培養物から濃縮した（第３表）。活性を８０％飽和硫酸アンモニウム で沈澱させ、ＡＦ　１１単位／、ｍｌおよびキシラナーゼ０．９６単位／　ｍｌ を有する粗酵素製剤を得た。ＡＦ活性はカルボキシル−メチルセルロース（ＣＭ Ｃ）に結合しないが、ＤＥＡＥセルロースまたはＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｃｅｌに 完全に吸着した。

濃縮したＡＦは、有意な脱リグニン化活性を示した（第４表）。本発明者らは、 バルブを脱リグニン化するためのＡＦの使用条件を最適化していないという点に 留意すべきである。ＡＦの潜在的に有用な特性は、これがリグニンに近い結合を 切断することによって、ヘミ−セルロースの大半をセルロース繊維と共に残すと いう点である。更に、キシラナーゼＴ−６を加えたＡＦの脱リグニン化活性は、 添加剤以上のものがあると考えられる。

第５〜７表には、ＰＮＰ−α−Ｌ−Ａｒａを基質として用いた精製ＡＦの酵素特 性の幾つかが挙げられている。

この酵素はｐＨ６，５〜８．０で最も活性が高く、ｐＨ７，０で最適となる。酵 素活性は、７０℃、ｐｉ（１０では低い。最適温度はｐＨ７，０およびｐＨ８， ０のいずれでも７０℃であった。酵素活性は、７０℃で１０ｍＭリン酸緩衝液中 では２０ｍＭ　Ｎａ　Ｓｏ　ｐＨ７゜５で最も高かった。ｐＨ７，０では、酵素 は６０℃で極めて安定であるが、７０℃では７５分以内にその活性の約５０％を 喪失し、８０℃では１５分で完全に失活した。

追加実験（Ｋ２０バルブ使用） Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　−Ｌ　１の細胞外 炭水化物分解酵素活性 様々な培地中で生育を行った後、特異的な細胞外炭水化物分解酵素活性を試験し た（第８表）。細胞は、様々な炭素源、すなわちｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ− マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびｐ −ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシドで生育させた。

キシラナーゼおよび２種類の他のエンドへミセルラーゼ（マンナナーゼおよびア ラビノース）を、１　ｍｌの総分析容積で１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８，０， ６０℃で分析した。適当に希釈した酵素試料（０，１ｍ１）を基質０．２５ｍ１ ，１００ｍＭ緩衝液、０．１ｍｌおよび水０．５５ｍ１に加えた。反応は、氷水 槽に移すことによって停止した。還元糖はＨ目１ｅｒ著の３．５−ジニトロサリ チル酸法によって決定した（Ｍｉｌｌｅｒ、　ＧＬ、（１９５９）＾ｎａｌＣｈ ｅｗ、　３１：　４２６−４２８）　、　Ｌ質は、４％Ｏａｔ　５ｐｌｃｔキシ ラン、０．４％Ｌｏｃｕｓｔ　Ｂｅａｎ　Ｇｕｍ−ガラクトマンナン、４％アラ ビノガラククン（Ｌａｒｃｈｖｏｏｄ）　、および４％マンナン（Ｓａｃｃｈａ ｒｏｉｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ）であった。

軟質バルブからのリグニンの酵素による放出は、Ｋ−２０バルブ（Ｋｏｒｓｎａ ｃｓ　ｐａｐｅｒ　ａ＋ＩＩＩ　Ｇａｃｖｌｃ、　Ｓｗｅｄｅｎ製）２００　ａ ｔｇ湿ｍｕを酵素溶液３　ｍｌに加え、濃ＮａＯＨ溶液でｐＨ８，０または９． ０に調整し、６５℃で振盪培養することによって測定した。２時間後に、液体１ ．５ｍｌを採取し、小型遠心分離機で１０，０００Ｘｇで５分間遠心分離して、 残っているバルブ繊維を除去した。透明な液体（０、５ｍｌ　）をＯ，ＩＮ　Ｎ ａＯＨ１，Ｏｍｌで希釈して、３５０ｎｗで吸光度を測定した。それぞれの分析 のコントロールは、酵素なしで同じ条件下でバルブをインキュベーションしたも のであった。リグニン１　ｅｇ　／　ｍｌはＡ９．１であり、これらの実験に用 いたバルブのリグニン含量は１　、　３９６　（Ｋｌａｓｏｎ、　Ｚ、　Ｚｏｓ ｉｍｌ：：より測定）であることから、 （式中、Ｐはバルブ乾燥ｆｆＩ量であり、ΔＡ　はインキユベーション後の吸光 度からインキュベーション前の吸光度を引いた値）となる。正味の放出リグニン の量は、総量から酵素なしのコントロールを引いた値である。

観察された２ＦＩ類の着意な活性は、キシラナーゼおよびα−Ｌ−アラビノフラ ノシダーゼであった。生育培地中の炭素源が１ｏｃｕｓｔ　ｂｅａｎ　ｇｕｍ　 （ＬＢＧ）　、Ｄ−グルコースおよびＬ−アラビノースであるときには、キシラ ナーゼが低濃度で認められた。キシラナーゼ活性は、炭素源としてＤ−キシロー スを用いると増幅して、１．２３Ｕ／ｍｌに達した。マンノースはキシラナーゼ 活性の産生を阻害した。α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性は低いがＤ−キシ ロース培地では有意であり、Ｌ−アラビノース培地では高＜、１．５Ｕ／ｍｌに 達した。マンナナーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼま たはα−Ｌ−アラビノピラノシダーゼの活性は認められなかった。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのａ−Ｌ−アラ ビノピラノシダーゼの精製 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｃｒＩａｏｐｈｉｌｕｓ　Ｌ　１をＬ−ア ラビノース含有培地で６０℃にて２４時間生育したところ、無細胞細胞外液はα −Ｌ−アラビノフラノシド活性が１．２Ｕ　／　ｍｌであり、比活性は１．７Ｕ 、’＋ａｇであった（第９表）。予備実験を行ったところ、酵素は９０％硫酸ア ンモニウム飽和で沈澱させることによって濃縮することができることが判った。

しかしながら、活性は６８％しか回収されず、比活性の増加はほとんどなかった 。従って、硫酸アンモニウムによる沈澱は用いず、粗酵素をＤＥＡＥ　５ｅｐｈ ａｃｅｌカラムに直接吸着させた（第９表、アニオン交換体）。カラムを１０ｍ Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８，０で洗浄した後、Ｏｌｌから０．９ＭＮａＣ １の直線グラディエンドで溶出を行った。α−Ｌ−アラビノフラノンダーゼ活性 は、０，５３および０゜５７Ｍ　ＮａＣ１でシャープなピークとして溶出された 。

活性画分をポリエチレングリコールに対する透析によって濃縮し脱塩したところ 、比活性は３８倍に増加し、活性の回収率は１００％であった。この物質を、５ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００カラムに直接適用した。

活性物質は、単一のシャープなピークとして溶出し、見掛けの分子量は１０８， ０００であった。全般的精製は５９倍であり、収率は８０％であった。精製した 酵素を、１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，０および１００ｍＭ　Ｎ ａＣ１中でＦＰＬＣ５ｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過により検討した。活性の９５ ９６以上およびタンパク質は単一のシャープピークとして溶出し、見掛は分子量 は１１４，８００であった。ＳＤＳ　ＰＡＧＥにより処理したところ、精製した 酵素は分子量が５７．５００および５２，５００の２種類のバンドを示した。こ れらの２種類のバンドを分析し、ＰＶＤＦ膜上でプロットしＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　４７５Ａ型気相シークエンサーで配列決定を行ったところ 、２種類のＮ−末端配列、配列番号１および配列番号２であることが判った。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　Ｌ　１　ａ　−Ｌ −アラビノフラノシダーゼの特性決定 ｐＨ７，０では、精製した酵素は６０℃では少なくとも８０分間完全に安定であ り、７０℃で７５分間インキュベーションした後でも、最大活性の５０％を保持 したが、８０℃では１５分後にその活性を総て喪失した。

７０℃では、活性の最適ｐＨは７，０であり、ｐＨ６，５およびｐＨ８，０では 、活性はそれぞれ最適活性の５５％および５０％であった。ｐＨ７，０およびｐ Ｈ８，０では、活性の最適温度は７０℃であった。酵素は、２０〜５０　ｍ　Ｍ 　Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４中で最大活性を示し、１００ｍＭおよび１５０ｍＭ　Ｎ ａ　ＳＯ２では、活性はそれぞれ１０％および５０％減少した。

酵素の速度論的パラメーターは、ｐＮＰ−α−Ｌ−ａｒａ−ｆを基質として用い て測定した。ｐＨ７，０および６５℃ではＫ　およびＶ　はそれぞれ２．２×ｍ 　ｗａｘ ｌｏ−’Ｍおよび１０１μｍｏｌ−分−１．ｌｌ１ｇ−１テあツタ。

酵素の活性は、アラビノフラノキシランおよびアラビノガラクタンのような高分 子量の基質では低い値に止どまった。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｃａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈｌｌｕｓ　Ｌ　１　ａ　−Ｌ −アラビノフラノンダーゼの脱リグニン化活性 酵素の精製の際（第９表）、カラム溶離剤を半漂白クラフトバルブを基質として 用いて脱リグニン化活性について日常的に検討した。脱リグニン化活性は、（ａ ）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性、（ｂ）低分子量エンドキシラナーゼ活 性のピーク、および（Ｃ）両店性を少量含む両分と関連していた。両酵素が含ま れているときに最高の脱リグニン化比活性が得られるので、α−Ｌ−アラビノフ ラノシダーゼおよびＷ○９１／１０７２４号に開示された従来の精製された熱安 定性を有するキシラナーゼＴ６との可能な相乗的活性を検討することにした。

第１０表に、脱リグニン化活性を純粋なα−Ｌ−アラビノフラノンダーゼ、純粋 なキシラナーゼおよび、これら２種類の酵素の混合物を用いて検討した。ｐＨ８ ，０および６５℃で２時間処理したところ、３８　Ｕ　／　ｍｌのα−Ｌ−アラ ビノフラノシダーゼおよび５　Ｕ　／　ｍｌのキシラナーゼＴ６との混合物はパ ルプからリグニンを１９．２９０の真の値で放出したが、それぞれの個別に作用 する酵素の和は１６．５％に過ぎなかった。これらの条件下でキシラナーゼだけ を用いてリグニンの正味の放出１６゜５％を達成するには、酵素５０　Ｕ　／　 ｍｌが必要であった。

ｐＨ９，０および６５℃で２時間処理したところ、酵素の混合物はりゲニン１８ ，４％を放出したのに対し、個別に作用する２種類の活性の和では１３．７％に すぎなかった。これら２種類の酵素は、バルブからリグニンを放出するのに相乗 的に作用したことは明らかである。

α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ酵素は、モデル基質ｐ−ニトロフェノールα− Ｌ−アラビノフラノシダーゼを用いると、ｐＨ９，０では最適活性の１％未満し か示さないということは見掛上の逆説である。しかじな力（ら、生物学的漂白工 程では、酵素はｐＨ９，０ではｐＨ８，０とほぼ同程度に有効である。ｐＨ値が 高ければｌくルブは幾分酵素活性を保護し、保存することが可能である。これら の結果から、工業的酵素脱リグニン化工程は、低温および低ｐＨ値よりもｐＨ９ ，０および６５℃で一層容易に行われるものと考えられる。

０．２　ＬＢ　１．３０　８．８　６．８０．２マンノース　１，８３　８．０ 　６．００．２ガラクトース　０．８４　４．９　２．９０．２グルコース　２ ．６２　８．９　Ｇ、９０．２キシロース　２．０４　９．１　７．１０．２ア ラビノース　１．８１　１０．５　７．６８生育培地は、炭素源（０，２％）　 、０．１％酵母エキス、０．５％カザミノ酸およびＥ、塩（０，１％尿素、０　 、　０２９６　Ｍ　ｇ　Ｓ　０　・７　Ｈ２０，５ｍ　Ｍ　Ｋ　Ｈ２Ｐ　０４、 ｐＨ９，０，２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９，０，０，１％ＮａＣ１および標 準的微量元素混合物）からなっていた。糖はＬ−アラビノースを除き、総てＤ− 配置であり、ＬＢは１ｏｃｕｓｔ　ｂｅａｎガラクトマンナンである。

ｂＫ１５の脱リグニン化は、細胞外上澄液（ｐＨ９，０に調整）を用いて６５℃ で２時間行った。

Ｌｌの細胞外酵素活性 基質　Ｘ−培地ａ　Ａ−培地５ 活性（Ｕ／ｍｌ）　活性（Ｕ／ｉｆ） キシラン　１．３　０．０５ ＰＮＰ−α−Ｌ−ＡＦ　Ｏ，００４０，５ＰＮＰ−ａ　−Ｇａｌ　＜０．００１ ＰＮＰ−ａ　−Ｍａｎ　（０，００１ ＰＮＰ−α−ＡＰ　＜０．００１ ＬＢ−ＧＭ　＜０．００１ ン）分解活性は還元糖の産生によって決定し、ＰＮＰ−Ｘ活性はＰＮＰ（＋）− 二トロフェノール）の放出によって測定した。

５菌体をＸ−培地またはＡ−培地（第１表に記載のキシロースまたはアラビノー ス培地）で２４時間生育させ、遠心分離により菌体を除去した。

第３表 Ａ−培地で生育したＬ１由来のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの予備精製 （ｉｆ）　（ａｇ／ｍｌ）　（１１／ｉｆ）　（Ｌｌ／＋＋１）ｔＬＬ澄液　８ １００　１．１１　０．８２　０．０３（ＮＨ４）　２Ｓ０４　ｐｐｔ　４００ 　１３．３　１１．０　０．９Ｇ８タンパク質はＢｉｏＲａｄによって測定した 。

第４表 濃縮したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼによるに１５キシラナーゼＴ−６（５ １１／１）　＋１．３　５．７ａｌＯｒＡＭリン酸緩衝液、ａｌｌ　８．０．６ ５℃、２時間。

ｂＤＥＡＥ−９ｅｐｈａｃｅｌ　クロマトグラフィにより濃縮。キシラナーゼ＜ ０．Ｉ　Ｕ／１のを含有。

０キシラナーゼＴ−ＧはＷＯ９１／１０７２４号に開示されているＮＣＩＭＢ　 ４０２２２によって産生され、ｐＨが少なくとも９および温度が少なくとも６５ ℃で木材バルブを脱リグニン化することができる。

第５表 ｐＨ７および８てＡＦの活性に対する温度の効果温度　ａｌｌ　７　ｐｉｔ　８ （”Ｃ）　ＡＰ　（Ｕ／１ｔ）ａＡｔ　（Ｕ／ｍ１）ａ４０　２．１．　１．０ ５０　５．０　２．４ ６０　８．３　５．２ ６５　１０．１　７．６ ７０　１０．３　９．６ ７５　９．９　７．５ ８０　４．２　１．０ ９０　０．８　０．３ 第６表 ＡＦの活性に対する塩濃度の効果 ａｌｏ　ｍＭ　’）　ン酸Ｗ１衝液、ｐＨ７，５，７０°。

第７表 α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＡＦ）活性の安定性反応時間　６０℃　７０ ℃　８０℃ 活性　活性　活性 （分）　（Ｕ／ｉｔ）　（Ｕ／ｍｌ）　（Ｕ／ｉｔ）第８表 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｃａｒｏｔｈｃｒｉｏｐｈｌｌｕｓ　Ｌ　１の細胞外炭 水化物う）解酵素活性８ 炭水化物基質 使用目的　活性 生育　酵素活性５　酵素の種類　（Ｕ／ａｌ）１８Ｇ”　Ｌｉ２Ｏマンナナーゼ 　（０，０１区　キシラン　キシラナーゼ　０．１３６ＬＩ３Ｇ　ｐＮＰ−α− Ｄ−ｇａｌ−ｐ　ａ−Ｄ−ガラクトシダーゼ　０．００８Ｆグルコース　区　マ ンナナーゼ　＜ｏ、ｏｔＦグルコース　キシラン　キシラナーゼ　０Ｊ１９トキ シロース　キンラン　キシラナーゼ　１．２５トキシロース　１　マンナナーゼ 　（０，０１Ｘ−キシロース　アラビノガラクタン　がラクタナーゼ／アラビ　 （０，０１ノフラノシダーゼ トキンａ−スｐＮＰ−α−Ｄ−ｇａｌ−ｐ　α−計ガラクトシダーゼ　＜Ｑ、０ ０１Ｆキンロース　ｐＮＰ−β−Ｄ−ｃａｎ−ｐ　β＋マンノンダーゼ　＜０． ００Ｌトキシロース　ｐＮＰ−ａ　−Ｌ−ａｒａ−ｐ　ａ−Ｌ−アラビノピラノ シ　＜Ｑ、００１ダーゼ トキシロース　ｐＮＰ−ａ　−Ｌ−ａｒａ（ａ−Ｌ−アラビノフラッジ　０．０ １ダーゼ Ｆマンノース　マンナン　マンナナーゼ　＜０．０１Ｆマンノース　キシラン　 キシラナーゼ　＜０．０１Ｆマンノース　ｕ℃　マンナナーゼ／ガラクトシ＜０ ．０１ダーゼ １）７ンノース　ｐＮＰ−β−１）−Ｍａｎ−ｐ　β−トマンノンダーゼ　＜０ ．００＋１、−アラビノース　アラビノガラクタン　α−Ｌ−アラビノシダーゼ 　＜０．０１Ｌ−アラビノース　キシラン　キシラナーゼ　０．１１Ｌ−アラビ ノ−７、ｐＮＰ−α−Ｌ−ａｒａ−ｒａ−Ｌ−アラビノフラッジ　１．５ダーゼ ３菌体は、０．１％酵母エキス、０．１％カザミノ酸および０，２％の炭素源を 含むＥＰ；ｉ中で６０℃でｐＯＨ９８，０で２４時間生育させた。

ｂ２４時間インキュベーションした後、培養液を遠心分離し細胞外炭水化物分解 酵素を本明細書に記載の方法で分析した。

’　ＬＢＧはＬｏｃｕｓｔ　Ｂｅａｎ　Ｇｕｍ　、ガラクトマンナンであり、ｐ ＮＰはｐ−ニトロフェノールである。

第９表 α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ精製手順のまとめアニオン交換体ｂ４．５　５ ．８　３７７　ｔ３５　１０（１ゲル濾過’　１８　０．７４　７５．１３　ｉ ｏｌ　８０３菌株Ｌ１の１．４リツトルの培養液を、明細書に記載の方法で調製 した。招養液を１０．ＯＯＯＸｇで３０分間遠心分離した。次に、上澄液を０． ８μｍフィルターを通過させて、残りの菌体を除去した。この組上澄液を精製手 順の出発物質とした。

ｂＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｃｅ　ｌカラムに続いて、ポリエチレングリコールに対 する透析。

ｃＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００゜ 第１０表 半漂白したパルプに対するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼ Ｔ６の脱リグニン化活性酵素ａ　ｐＨ総量　正味の値 酵素なし　８．０　５．３ 酵素なし　９．０　５．２ α−し−アラビノフラノンダーゼ　８．０　？、６　２．３α−Ｌ−アラビノフ ラノシダーゼ　９．［ｌ　７．３　２．１キシラナーゼ　８．０　１９．５　１ ４．２キシラナーゼ　９．０　１Ｂ、８　１１．６α−１、−アラビノフラノシ ダーゼ＋キシラナーゼ　８．０　２４．５　１９．２α−Ｌ−アラビノフラノシ ダーゼ＋キシラナーゼ　９，０　２３．６　１８．４８精製したα−Ｌ−アラビ ノフラノシダーゼ（３８単位／ｍ１、比活性１２６Ｕ／ｍりおよびキシラナーゼ Ｔ６（５Ｕ／ｍｌ、１９２Ｕ／ｍｇ）を用０た。酵素ｊｅｔ１０　ｍ　ｋｉミリ ン緩衝液に溶解したものとした。

５使用条件は、Ｎａ２ＳＯ４および（ＮＨ）　Ｓｏ４をそれぞれ１０ｍＭ、６５ ℃、ｐＨ８，０またｌ！９．０で２時間とした。

配列リスト （１）一般情報 （ｉ）出願人 （Ａ）名称：　Ｋｏｒｓｎａｓ　ＡＢ （Ｉ３）町名：なし くＣ）小名：　Ｇａｖｌｅ （Ｅ）国名、スウェーデン （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　Ｓ−１１１０１ｌ１ｌ（Ｇ）電話番号：　０２ Ｂ−１５１０００（１１）テレファックス二０２６−１９５２５３（Ａ）名称： 　Ｔｈｅ　Ｔｃｃｈｎｌｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ ｎｔＦｏｕｎｄａＬｌｏｎ　Ｌｔｄ （Ｂ）町名：　Ｔｅｃｈｎｉｏｎ　Ｃ１ｔｙ（Ｃ）小名：ｔ（ａｉｒａ （Ｅ）国名：イスラエル （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：なし くＡ）名称：　Ｒａ１ｏｔ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ　ｆｏ ｒ　ＡｐｐｌｉｅｄＲｅｓ、　＆　Ｉｎｄ、　Ｄｅｖ、　Ｌｉｄ（Ｂ）町名：　 ３２１１．　Ｌｅｖａｎｏｎ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）小名：　Ｔｅ１−Ａｖｊｖ （Ｅ）国名、イスラエル （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：なし くｉｆ）　発明の名称：　α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を示す脱リグニ ン化製剤、その製造および応用（ｉｌｌ）配列の数＝３ （１ｖ）　コンピューターによる読取りｉｆＪ能な形式（＾）　媒体の種類：フ ロッピーディスク（Ｂ）　コンピューター：　ＩＢＮ　ＰＣコンパチブル（Ｃ） 　オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）　ソフトウ エアニＰａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　雰１．０．　Ｖｅｒｓｉｏｎ婁１． ２５　（ＥＰＯ） （２）　配列番号１についての情報： （１）配列の特徴 （＾）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：不明 （１１）分子の種類：タンパク質 （Ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカル：なしくＶ）フラグメントの種類二Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物体：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｃａｒｏｔｈｃｒａ＋ｏｐｈＮｕｓ（ ｘｉ）　配列の記載：配列番号１： Ｘａａ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｘａａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕフ ロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｄ２１Ｃ９／１０　Ｚ 　７１９９−３Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０９ （Ｃ１２Ｎ　１／２０ ＣＩ　２　Ｒ１：０７） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＺ。

ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、 ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ ＦＩ （７１）出願人　ラモート、ユニバージティー、オーソリティー、フォー、アプ ライド、リサーチ、アンド、インダストリアル、デベロプメント、リミテッド イスラエル国テルアビブ、エイチ、レバノン、ストリート、３２ （７２）発明者　ローゼンバーグ、ニージンイスラエル国うマト、アビブ、パー ラ、ストリート、ヌ、アパートメント、３ （７２）発明者　ショーハム、ニーパルイスラエル国ハイファ、ニー、エイチ、 シルバー、１６／２２

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．酵素活性を示す製剤であって、該製剤が菌株ＮＣＩＭＢ４０４９４並びに菌 株ＮＣ１ＭＢ４０４９４と実質的に同様の前記製剤の産生能を有するその突然変 異体および変種から選択されるＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈ ｉｌｕｓ株を適当な培地中において好気醗酵させることによって得られ、前記製 剤の酵素活性がｐＨ８〜９および６５℃の温度で木材バルブの脱リグニン化能を 有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性の本質部分を含んでなることを特徴 とする、製剤。
2. ２．前記製剤が清澄化された培養液である、請求の範囲第１項に記載の製剤。
3. ３．前記製剤が、木材パルプ培地中でα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を示 す前記培養液の濃縮された画分である、請求の範囲第２項に記載の製剤。
4. ４．前記α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性が、近似的分子量がそれぞれ５２ ，５００ダルトンおよび５７，５００ダルトンである２種類のサブユニットから なるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼに由来する、請求の範囲第３項に記載の製 剤。
5. ５．別の微生物株によって産生される酵素活性を示し、かつ、少なくとも６５℃ の温度および少なくともｐＨ９で木材パルプを脱リグニン化する能力を有する製 剤と組み合わされた、請求の範囲第１〜４項のいずれか一項に記載の製剤。
6. ６．前記製剤が、Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈｌｌｕｓ株 ＮＣＩＭＢ４０４９４によって産生されるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼおよ びＢａｃｌｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈｌｌｕｓ株ＮＣＩＭＢ４０ ２２２によって産生されるキシラナーゼを含んでなる、請求の範囲第５項に記載 の製剤。
7. ７．Ｎ−末端部分アミノ酸配列（配列番号１）【配列があります】 を含むアミノ酸配列またはその類似体を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ 。
8. ８．Ｎ−末端部分アミノ酸配列（配列番号２）【配列があります】 を含むアミノ酸配列またはその類似体を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ 。
9. ９．酵素活性を示す製剤の製造法であって、菌株ＮＣＩＭＢ４０４９４並びに菌 株ＮＣＩＭＢ４０４９４と実質的に同様の前記製剤の産生能を有するその突然変 異体および変種から選択されるＢａｃｌｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐ ｈｌｌｕｓ株を適当な培地中で好気醗酵させ、前記製剤の酵素活性がｐＨ８〜９ および６５℃の温度で木材パルプの脱リグニン化能を有するα−Ｌ−アラビノフ ラノシダーゼ活性の本質部分を含んでなることを特徴とする、製剤の製造法。
10. １０．単離されたＢａｃｌｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈｌｌｕｓ株 ＮＩＣＭＢ４０４９４、並びに前記ＮＣＩＭＢ４０４９４株と実質的に同様の酵 素活性を示す製剤を産生する能力を有し、前記酵素活性がｐＨ８〜９および６５ ℃の温度で木材パルプの脱リグニン化能を有するα−Ｌ−アラビノフラノシダー ゼ活性の本質部分を含んでなるものであるその突然変異体および変種。
11. １１．Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｃｒｍｏｐｈｌｌｕｓ株ＮＣＩＭＢ ４０４９４によって発現される酵素の木材パルプの処理における使用。
12. １２．木材パルプの処理を含む方法であって、少なくとも一つの段階において木 材パルプを請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に記載の製剤で処理することを 特徴とする、方法。
13. １３．前記木材パルプが硫酸パルプである、請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. １４．前記木材パルプが部分的に脱リグニン化された硫酸パルプである、請求の 範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．前記部分的に脱リグニン化された硫酸パルプが酸素により脱リグニン化さ れた硫酸パルプである、請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．少なくとも一つの段階において、請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に 記載の製剤で処理されたことを特徴とする、木材パルプ。
17. １７．アミノ酸配列（配列番号１） 【配列があります】 および／またはアミノ酸配列（配列番号２）【配列があります】 をコードするヌクレオチド配列を認識するＤＮＡまたはＲＮＡプローブ。