SE501096C2 - Delignfierande preparat som uppvisar alfa-L-arabinofuranosidasaktivitet, framställning och tillämpning därav - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 50-1 096 Ansträngningar gjordes att isolera en annan stam av ßacillus stearothgrmophilus som kunde användas för rening av andra delignifierande enzymatiska aktiviteter än xylanasaktivitet. Man tänkte sig att exempelvis ett a-L-arabinofuranosidas med förmåga att delignifiera massa av ved vid en hög temperatur och ett högt pH skulle vara ett ytterligare användbart verktyg vid utvecklande av en bleksekvens utan några klor-innehållande blekkemikalier.

Nyligen publicerades WO 91/18976 (inlämnad av Novo Nordisk.A/S).

Patentkrav 14 däri är inriktat på ett arabinofuranosidasenzym alstrat av Bacillus stearothermophilus. På sid 9, raderna ll-12, anges att litteraturen inte anger några referenser beträffande ett arabinofuranosidas från termofil Bacillus. Trots att WO 91/18976 har patentkrav inriktade på arabinofuranosidasenzym alstrat av Bacillus stearothermo hilus, beskriver den inte hur ett sådant enzym kan erhållas.

Tre stammar har deponerats, två isolerade och en nmterad.

Emellertid har ingen av dessa i nämnda ansökan visats alstra ett arabinofuranosidas.

Den enda stam som visats alstra ett arabinofuranosidas är en icke-deponerad mutantstam som designerats BPS-3-H-17-4. Det bör vidare nämnas att de preparat som använts i de i ansökningen visade experimenten (jämför uppe på sidan 17) utförts med fermenteringsprodukter erhållna från nämnda icke-deponerade stam. På sid 8, raderna 12-16 anges att nämnda stam härstammar från en av de deponerade stammarna efter mutagenes med etyl- metansulfonat. Detta mutagen är nwcket ospecifikt och inga betingelser anges för hur man kan komma till en arabinofuranosi- das-alstrande stam. Sålunda finns det fortfarande ingen beskriv- ning inom tekniken hur man kan erhålla ett arabinofuranosidas från en termofil Bacillus. 10 15 20 25 30 35 501 096 i Föreliggande uppfinning åstadkommer ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet innefattande a-L-arabinofuranosidasakti- vitet, vilket preparat har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 6$°C.

I föreliggande beskrivning och de åtföljande patentkraven skall- uttrycket "massa av ved" tolkas vidsträckt, och sålunda avses uttrycket omfatta alla slag av lignocellulosahaltiga material.

En aspekt av uppfinningen är inriktad på ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet, vilket kan erhållas genom aerob fermentering, i ett lämpligt medium av en Bacillus gtggrgthgg; mophilus stam vald från stammen NCIMB 40494 samt mutanter och varianter därav med väsentligen samma förmåga att alstra nämnda preparat som stammen NCIMB 40494, varvid.preparatets enzymatiska aktivitet innefattar a-L-arabinofuranosidasaktivitet.och prepa- ratet har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 65°C.

I en utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är preparatet en klarnad kulturbuljong. I en annan utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är preparatet en koncentrerad fraktion av nämnda kulturbuljong som uppvisar a-L-arabinofuranosidasakti- vitet i ett medium med massa av ved. I ytterligare en annan utförings form av uppfinningen härstammar a-L-arabinofuranos idas- aktiviteten från ett c-L-arabinofuranosidas med de egenskaperna att det är mest aktivt mellan pH 6,5-8,0, med en optimal temperatur av 70°C vid pH 8.

I en annan aspekt av uppfinningen är preparatet enligt den ovan beskrivna aspekten av uppfinningen i association med ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet alstrat av en annan mikrobiell stam och har förmåga att delignifiera massa av ved vid en temperatur av minst 65°C och ett pH av minst 9. I en specifik utföringsform av denna aspekt av uppfinningen omfattar 10 15 20 25 30 35 501 096 preparatet ett a-L-arabinofuranosidas som alstrats av ßggillgg gtegrotlgermgphilus stammen NCIMB 40494 och ett xylanas som alstrats av ßagillus stgarothermophilug stammen NCIMB 40222.

Ytterligare en annan aspekt av uppfinningen är inriktad på förfarande för framställning av ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet, vid vilket en Bacillus gtgargthermgphilgs stam vald från stammen NCIMB 40494 och mutanter och varianter därav med väsentligen samma förmåga att alstra nämnda preparat som stammen NCIMB 40494, underkastas aerob fermentering, i ett lämpligt medium, varvid preparatets enzymatiska aktivitet inne- fattar a-L-arabinofuranosidasaktivitet och preparatet har för- måga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 65°C.

Ytterligare en annan aspekt av uppfinningen är inriktad på den isolerade Bacillus stgargthermophilus stammen NCIMB 40494 och mutanter och varianter därav, vilka mutanter och varianter har väsentligen samma förmåga att alstra ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet som nämnda stam NCIMB 40494, varvid den enzymatiska aktiviteten innefattar a-L-arabinofuranosidasaktivi- tet och preparatet har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 65°C. Ännu en annan aspekt av uppfinningen är inriktad på ett för- farande som omfattar behandling av massa av ved, vid vilket massa av ved behandlas i minst ett steg med ett preparat enligt något av kraven 1-6. I en utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är den massa av ved som skall behandlas sulfat- massa. I en annan utföringsform är den sulfatmassa som skall behandlas en partiellt delignifierad sulfatmassa. I ytterligare en annan utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är den partiellt delignifierade sulfatmassan en syrgasdelignifierad sulfatmassa. 10 15 20 25 30 35 501 096 5 En ytterligare aspekt av uppfinningen är inriktad på massa av ved som har behandlats i minst ett steg med ett preparat enligt uppfinningen. ri ' oor a 'sm ßggillgs stgargthermophilus stammen, L1 deponerades under Budapest-överenskommelsen vid the National Collections of' Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB), Aberdeen, den 24 mars 1992 och gavs accessionsnummer NCIMB 40494. ßacillus stgargthermophilus stammen T-6, som erhållit acces- sionsnummer NCIMB 40222 av samma depositionsinstitut, deponera- des tidigare i samband med inlämnande av prioritetsansökningen (för WO 91/10724.

Isolering av termostabil g-L-arabinofuranosidas-alstrande c' lus tea hermo h' u stam L1 A. Pramställning av alkaliextraherad massa (AKP).

Suspensionen av Kl5, partiellt syrgasblekt barrvedssulfatmassa, (6-10% torrvikt fiber) i 0,02 N Na0H (pH 11,7) inkuberades vid 60-62'C i 18-20 timmar. Fluiderna separerades från fibrerna medan de ännu var heta med användning av en sinter-glastratt under sug. Den resulterande lösningen neutraliserades till pH 7,0 och koncentrerades genom ultrafiltrering (molekylviktsspärr 10.000). Retentatet (AKP-1) innehöll 5,2 mg/ml lignin, 1,85 mg/ml kolhydrat (enligt fenol-svavelsyra och 0,83 mg/ml pentoser (enligt orcinol).

B. Anrikningskultur.

AKP-l utökades med salter (0,l% MgS0,.7H2O, 10 mM Kzl-IPO" 0,l% urea och spårämnen) och inokulerades med slam- och vattenprover tagna från vattenreningsdammar tillhörande Korsnäs. Kolvarna inkuberades under skakning vid 65°C och pH 9,8 i 48 timar. En 10 15 20 25 30 35 501 096 6 droppe av grumlig kultur inokulerades sedan i en kolv som inne- höll 15 ml 0,2% galaktomannan (Locust bean gum, Sigma) -medium.

Efter inkubation under 24 timmar vid 65°C och pH 9,0, utströks kulturen på LB-agar. Efter inkubation isolerades och erhölls i ren kultur ungefär 20 olika kolonityper. Efter preliminär testning studerades en av stammarna i detalj: stam Ll som innehöll ett termofilt a-L-arabinofuranosidas.

C. Termofilt a-L-arabinofuranosidas från stam Ll Stam Ll utvaldes för vidare studium på grund av att den råa extracellulära vätskan från odling av kulturen.på galaktomannan- medium var aktiv vid delignifiering av Kl5 massa. För uppskatt- ning av hur mycket lignin som görs extraherbart av det enzyma- tiska preparatet användes en känslig spektrofotometrisk analys- metod. Absorbansvärdena vid 350 nm(Aæ0) mättes på provernas supernatantvätskor och de uppmätta värdena presenterades som % frisatt lignin. Odlingen och delignifieringsaktiviteten av stam Ll somn odlats på. olika kolkällor sammanfattas i Tabell 1- Stammen växte till viss utsträckning på jästextrakt och lkasaminosyror utan tillsättning av någon annan kolkälla och gav en netto delignifiering av 5,l%. Ytterligare tillväxt observera- des med alla de tillförda sockerarterna med undantag för galaktos, som också inhiberade alstringen av delignifierings- aktivitet. De bästa delignifieringsaktiviteterna erhölls på kulturer som odlats på xylos och arabinos, 7,18 resp 7,6%.

De extracellulära enzymatiska aktiviteterna av stam L1 som odlats på xylos- och arabinosmedier har sammanställts i Tabell 2. xylanasaktiviteten bestämdes genom inkubering av en färsk lösning av xylan med extracellulär supernatantvätska och analysering beträffande ökning av reducerande socker genom ferricyanidmetoden (Spiro, R.G. 1966, Methods in Enzymology §: 7-9). Analysbufferten var 50 mM Tris. Cl, pH 7,0 och 0,5% xylan (oat spelts, Sigma). Aktivitetsenheter för xylanas är pmol reducerande socker genererat per minut vid 65°C. 10 15 20 25 30 35 501 096 7 Arabinofuranosidasanalysen är en modifiering av standardanalysen för ß-galaktosidas (G. Tabolt and Syguson, Appl. & Enviro.

Microbiol, vol 56, No. 11, 1990). Provröret innehåller 0,5 ml 40 mM Tris-buffert, pH 7,0. 0,4 ml av enzymprovet och 0,1 ml 10 mM p-nitrofenyl-a-L-arabinofuranosid (Sigma Chemicals) in- kuberades vid 65°C i 15 minuter. Reaktionen avslutades genom att sätta provröret i is-vattenbad. Frisättningen av p-nitrofenol bestäms spektrofotometriskt vid 401 nm. 10 mikromol p-nitro-- fenol per ml har en absorbans av 18,4. En verksam enzymenhet definieras som mikromol p-nitrofenyl frisatt per minut.

På xylosmedium observerades endast två aktiviteter: 1,3 enheter per ml xylanas och 0,004 enheter per ml a-L-arabinofuranosidas.

Det förekom inte någon detekterbar a-L-arabinopyranosidas-, mannanas-, a-D-galaktosidas- eller a-L-mannosidasaktivitet.

Därför föreföll det som om delignifieringsaktiviteten av L1 berodde på xylanasaktivitet när cellerna odlades på xylosmediunn När emellertid cellerna odlades på arabinosmedium var huvud- aktiviteten u-L-arabinofuranosidas (0,5 enheter per ml). Därför föreföll det som om a-L-arabinofuranosidaset var ansvarigt för delignifiering i A-medium (arabinos-medium). a-L-arabinofuranosidas(AF)-aktiviteten koncentrerades från en 10 liter kultur av Ll odlad på A-medium (Tabell 3). Aktiviteten utfälldes med till 80% mättat ammoniumsulfat, vilket gav ett rått enzympreparerat med 11 enheter per ml AF och 0,96 enheter per ml xylanas. AF-aktiviteten band inte till karboxy1-metyl- cellulosa (CMC), men adsorberade fullständigt till DEAE- cellulosa eller DEAE-Sephacel.

Det koncentrerade AF uppvisade signifikant delignifieringsakti- vitet (Tabell 4). Det bör påpekas att vi ännu inte optimerat betingelserna för användning av AF för delignifiering av massa.

En potentiellt användbar egenskap hos AF är att det borde spjälka bindningen nära lignin, varigenom det mesta av hemi- cellulosan lämnas med cellulosafibrerna. Detta skulle ge ett högre utbyte av delignifierad massa. Därtill förefaller det som 10 15 20 25 30 35 501 096 e om delignifieringsaktiviteten av AF plus xylanas T-6 är mer än additiv.

Tabellerna 5-7 beskriver en del av de enzymatiska egenskaperna hos renat AF, med användning av PNP-a-L-Ara som substrat.

Enzymet är mest aktivt mellan pH 6,5-8,0, med ett optimum vid pH 7,0. Enzymet har ingen aktivitet vid pH 9,0 vid 70°C.

Temperaturoptimum var 70°C vid både pH 7,0 och pH 8,0. Enzymet var mest aktivt vid 20 mM Na2SO,, pH 7,5 i 10 mM fosfatbuffert vid 70°C. Vid pH 7,0 var enzymet mycket stabilt vid 60°C, men förlorade ca 50% av sin aktivitet vid 70°C under 75 minuter och var fullständigt inaktivt vid 80°C under 15 minuter.

Tabell 1 Tillväxt och delignifieringsaktivitet av stam Ll på olika medier.

Tillväxt Delignifiering (%)b Kolkällaa (A560) Totalt Netto Ingen 0,73 7,1 ,1 0,2 LB 1,30 8,8 1 0,2 Man 1,83 8,0 1 0,2 Gal 0,84 4,9 I 0,2 Glc 2,62 8,9 ,9 0,2 Xyl 2,04 9,1 ,1 0,2 Ara 1,81 10,5 1 ' Odlingsmedierna bestod av kolkälla (0,2%), 0,l% jäst- extrakt, 0,5% kasaminosyror och anrikningssalter (0,1% urea, 0,02% 2498047320, SmM KI-IZPOU pH 9,0, 20 m!! 'Prisü-ICI, pH 9,0, 0,18 NaC1 och standardblandning av spårelement).

Alla socker hade D-konfiguration, med undantag för L- arabinos; LB är locust bean-galaktomannan.

Delignifiering av K15 utfördes med den extracellulära supernatanten (justerad till pH 9,0), vid 65°C i 2 timmar. 10 15 20 25 30 35 _5D1 096 9 Tabell 2 Extracellulära enzymatiska aktiviteter av L1 X-mediunfi A-medium Substrat Akt. (U/ml) Akt. (U/ml) Xylan 1,3 0,05 PNP-a-L-AF 0,004 0,5 PNP-a-Gal < 0,001 - PNP-a-Man < 0, 001 - PNP-a-AP < 0,001 - LB-GM < 0,001 - ° _ Xylan- och LB-GM(1ocnst bean-galaktomannan) -nedbrytande aktiviteter bestämdes genom alstring av reducerande socker och PN?-X-aktiviteter mättes genom frisättning av PNP (p- nitrofenol).

Celler odlades under 24 timmar i antingen X-medium eller A-medium (xylos- eller arabinos-medium som beskrivits i Tabell 1) och centrifugerades för avlägsnande av celler.

Tabell 3 Preliminär rening av a-L-arabinofuranosidas från Ll odlat på A-medium Vol Protein' AF Xylanas Fraktion (ml) (mg/ml) (U/ml) (U/ml) Rå supernatant 8100 1,11 0,82 0,03 (NHQZSO, ppt 400 13,3 11,0 0,9_6 DEAE-Sephacel 20 41,1 46,6 0,09 Protein bestämt genom BioRad. 10 15 20 25 30 35 501 096 10 _ Tabell 4 Delignifiering av K15 med koncentrerat a-L-arabinofuranosidas % Ligninfrisättninga Enzym Totalt Netto Ar (20 u/mn” 9,6 3,0 Xylanas T-6° (5 U/ml) 11,3 5,7 AF + Xylanas T-6 16,1 11,5 a 10 mM fosfatbuffert, pH 8,0, 65°C, 2h.

Koncentrerat genom DEAE-Sephacel-kromatografi; innehåller <0,1 U/ml xylanas.

° Xylanas T-6 alstras av NCIMB 40222, som beskrivits i WO 91/10724, och har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av minst 9 och en temperatur av minst 65°C.

Tabell 5 Effekt av temperatur på aktivitet av AF vid pH 7 och 8 Temperatur pH 7 pH 8 'c Ar (u/mlf" Ar (u/mn* 40 2,1 1,0 50 5,0 2,4 60 8,3 5,2 65 10,1 7,6 70 10,3 9,6 75 9,9 7,5 80 4,2 1,0 90 0,8 0,3 100 0 0 ° I 20 mM Tris-buffert. 10 15 20 25 30 35 501 096 11 Tabell 6 Effekt av saltkoncentration på aktivitet av AF.

Na2S0, (mn) AF (U/m1)° 0 3,1 20 3, 50 3,4 100 3,0 150 1,0 ° I 10 mn fosfatbuffert, pH 7,5, vid 70°C.

Tabell 7 Stabilitet hos a-L-arabinofuranosidas(AF)-aktivitet. 5912 ZQLC 3912 Reaktions- AF* AF° AF* tid aktivitet aktivitet aktivitet (min) (U/ml) (U/ml) ' (U/ml) 2 7,7 6, 5,0 5 7,5 7, - 15 8,4 7,0 0 30 8,4 , 45 7,5 , 60 7,7 4, 75 8,0 2, a I 20 mn Tris, pH 7,0.

Claims (12)

10 15 20 25 30 501 096

1. Preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet, k ä n n e t e c k n a t därav, att det kan erhållas genom aerob fermentering, i ett lämpligt medium, av en Bagillgs steargthermgphilus stam vald från stammen NCIMB 40494 samt mutanter och varianter därav med väsentligen samma förmåga att alstra nämnda preparat som stammen NCIMB 40494, varvid prepara- tets enzymatiska aktivitet innefattar en väsentlig andel a-L- arabinofuranosidasaktivitet som har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 65°C.

2. Preparat enligt krav 1, vari preparatet är en klarnad kulturbuljong.

3. Preparat enligt krav 2, vari preparatet är en koncentrerad fraktion av nämnda kulturbuljong som uppvisar a-L-arabinofurano- sidasaktivitet i ett medium med massa av ved.

4. Preparat enligt kravet 3, vari nämnda a~L-arabinofuranosidas- aktivitet härstammar från ett a-L-arabinofuranosidas som har de egenskaperna att det är mest aktivt mellan pH 6,5-8,0, med en optimal temperatur av 70°C vid pH 8.

5. Preparat enligt något av kraven 1-4 i association med ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet alstrad av en annan 10 15 20 25 30 /3 501 096 mikrobiell stam och med förmåga att delignifiera massa av ved vid en temperatur av minst 65°C och ett pH av minst 9.

6. Preparat enligt kravet 5, vari nämnda preparat innefattar ett a-L-arabinofuranosidas som alstrats av Bagillgg gtggrgghggmgphi; lus stammen NCIM 40494 och ett xylanas alstrat av Bagillgs steargthermgphilgs stammen NCIM 40222.

7. Förfarande för framställning av ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet, k ä n n e t e c k n a t därav, att en Bagillns steargthermgphilus stam vald från stammen NCIMB 40494 samt mutanter och varianter därav med väsentligen samma förmåga att alstra nämnda preparat som stammen NCIMB 40494, underkastas aerob fermentering, i ett lämpligt medium, varvid preparatets enzymatiska aktivitet innefattar en väsentlig andel a-L- arabinofuranosidasaktivitet som har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 65°C.

8. Isolerad Bagillgs steargthgrmgphilgs stam NCIMB 40494 samt mutanter och varianter därav, vilka mutanter och varianter har väsentligen samma förmåga att alstra ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet som stammen NCIMB 40494, varvid nämnda enzymatiska aktivitet innefattar en väsentlig andel a-L- arabinofuranosidasaktivitet som har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 65°C.

9. Förfarande omfattande behandling av massa av ved, k ä n n e t e c k n a t därav, att massa av ved behandlas i minst ett steg med ett preparat enligt något av kraven 1-6.

10. Förfarande enligt krav 9, vari nämnda massa av ved är sulfatmassa. 501 096 H

11. Förfarande enligt krav 10, vari nämnda massa av ved är en partiellt delignifierad sulfatmassa.

12. Förfarande enligt krav 11, vari nämnda partiellt delignifie- rade sulfatmassa är en syrgasdelignifierad sulfatmassa.