SE501096C2

SE501096C2 - Delignifying preparations exhibiting alpha-L-arabinofuranosidase activity, preparation and application thereof

Info

Publication number: SE501096C2
Application number: SE9201006A
Authority: SE
Inventors: Eugene Rosenberg; Yuval Shoham
Original assignee: Korsnaes Ab
Priority date: 1992-03-31
Filing date: 1992-03-31
Publication date: 1994-11-14
Also published as: HUT70460A; SE9201006L; NO943612L; JPH07508162A; FI944501A0; SK118594A3; CA2132335A1; SE9201006D0; BR9306158A; KR950701381A; FI944501A; HU9402800D0; NO943612D0; EP0633932A1; AU3913093A; CZ239494A3

Abstract

2132335 9320192 PCTABScor01 A preparation exhibiting enzymatic activity comprising a substantial portion of .alpha.-L-arabinofuranosidase activity having the capability of delignifying wood pulp at a pH of 8 - 9 and a temperature of 65 ·C, is disclosed. Said preparation is obtainable by aerobic fermentation of a Bacillus stearothermophilus strain selected from the deposited strain NCIMB 40494 and mutants and variants thereof. The deposited strain and mutants and variants thereof are comprised by the invention. A method of producing said preparation, a process comprising treatment of wood pulp with said preparation, and wood pulp that has been treated with said preparation, and also said preparation in association with a preparation exhibiting enzymatic activity produced by another microbial strain and having the capability of delignifying wood pulp at a temperature of at least 65 ·C and a pH of at least 9, are disclosed. Use of an enzyme expressed by the deposited strain and .alpha.-L-arabinofuranosidase which comprises one or two specified partial sequences and homologues thereof, are also included.

Description

15 20 25 30 35 50-1 096 Ansträngningar gjordes att isolera en annan stam av ßacillus stearothgrmophilus som kunde användas för rening av andra delignifierande enzymatiska aktiviteter än xylanasaktivitet. Man tänkte sig att exempelvis ett a-L-arabinofuranosidas med förmåga att delignifiera massa av ved vid en hög temperatur och ett högt pH skulle vara ett ytterligare användbart verktyg vid utvecklande av en bleksekvens utan några klor-innehållande blekkemikalier. 50-1 096 Efforts were made to isolate another strain of ßacillus stearothgrmophilus that could be used to purify delignifying enzymatic activities other than xylanase activity. It was thought that, for example, an α-L-arabinofuranosidase capable of delignifying wood pulp at a high temperature and a high pH would be an additional useful tool in developing a bleaching sequence without any chlorine-containing bleaching chemicals.

Nyligen publicerades WO 91/18976 (inlämnad av Novo Nordisk.A/S).WO 91/18976 (submitted by Novo Nordisk.A / S) was recently published.

Patentkrav 14 däri är inriktat på ett arabinofuranosidasenzym alstrat av Bacillus stearothermophilus. På sid 9, raderna ll-12, anges att litteraturen inte anger några referenser beträffande ett arabinofuranosidas från termofil Bacillus. Trots att WO 91/18976 har patentkrav inriktade på arabinofuranosidasenzym alstrat av Bacillus stearothermo hilus, beskriver den inte hur ett sådant enzym kan erhållas.Claim 14 therein is directed to an arabinofuranosidase enzyme generated by Bacillus stearothermophilus. On page 9, lines 11-12, it is stated that the literature does not provide any references regarding an arabinofuranosidase from thermophilic Bacillus. Although WO 91/18976 has claims focused on arabinofuranosidase enzyme generated by Bacillus stearothermo hilus, it does not describe how such an enzyme can be obtained.

Tre stammar har deponerats, två isolerade och en nmterad.Three strains have been deposited, two isolated and one numbered.

Emellertid har ingen av dessa i nämnda ansökan visats alstra ett arabinofuranosidas.However, none of these have been shown in said application to produce an arabinofuranosidase.

Den enda stam som visats alstra ett arabinofuranosidas är en icke-deponerad mutantstam som designerats BPS-3-H-17-4. Det bör vidare nämnas att de preparat som använts i de i ansökningen visade experimenten (jämför uppe på sidan 17) utförts med fermenteringsprodukter erhållna från nämnda icke-deponerade stam. På sid 8, raderna 12-16 anges att nämnda stam härstammar från en av de deponerade stammarna efter mutagenes med etyl- metansulfonat. Detta mutagen är nwcket ospecifikt och inga betingelser anges för hur man kan komma till en arabinofuranosi- das-alstrande stam. Sålunda finns det fortfarande ingen beskriv- ning inom tekniken hur man kan erhålla ett arabinofuranosidas från en termofil Bacillus. 10 15 20 25 30 35 501 096 i Föreliggande uppfinning åstadkommer ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet innefattande a-L-arabinofuranosidasakti- vitet, vilket preparat har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 6$°C.The only strain shown to produce an arabinofuranosidase is a non-deposited mutant strain designated BPS-3-H-17-4. It should further be mentioned that the preparations used in the experiments shown in the application (compare at the top of page 17) were carried out with fermentation products obtained from said non-deposited strain. On page 8, lines 12-16, it is stated that said strain is derived from one of the deposited strains after mutagenesis with ethyl methanesulfonate. This mutagen is somewhat non-specific and no conditions are specified for obtaining an arabinofuranosidase-producing strain. Thus, there is still no description in the art of how to obtain an arabinofuranosidase from a thermophilic Bacillus. The present invention provides a composition which exhibits enzymatic activity comprising α-L-arabinofuranosidase activity, which composition is capable of delignifying pulp of wood at a pH of 8-9 and a temperature of 6 ° C.

I föreliggande beskrivning och de åtföljande patentkraven skall- uttrycket "massa av ved" tolkas vidsträckt, och sålunda avses uttrycket omfatta alla slag av lignocellulosahaltiga material.In the present specification and the appended claims, the term "pulp of wood" is to be interpreted broadly, and thus the term is intended to cover all kinds of lignocellulosic materials.

En aspekt av uppfinningen är inriktad på ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet, vilket kan erhållas genom aerob fermentering, i ett lämpligt medium av en Bacillus gtggrgthgg; mophilus stam vald från stammen NCIMB 40494 samt mutanter och varianter därav med väsentligen samma förmåga att alstra nämnda preparat som stammen NCIMB 40494, varvid.preparatets enzymatiska aktivitet innefattar a-L-arabinofuranosidasaktivitet.och prepa- ratet har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 65°C.One aspect of the invention is directed to a composition which exhibits enzymatic activity, which can be obtained by aerobic fermentation, in a suitable medium of a Bacillus gtggrgthgg; mophilus strain selected from the strain NCIMB 40494 and mutants and variants thereof having substantially the same ability to produce said preparation as the strain NCIMB 40494, wherein the enzymatic activity of the preparation comprises αL-arabinofuranosidase activity.and the preparation has the ability to delignify pulp of wood at a pH 8-9 and a temperature of 65 ° C.

I en utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är preparatet en klarnad kulturbuljong. I en annan utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är preparatet en koncentrerad fraktion av nämnda kulturbuljong som uppvisar a-L-arabinofuranosidasakti- vitet i ett medium med massa av ved. I ytterligare en annan utförings form av uppfinningen härstammar a-L-arabinofuranos idas- aktiviteten från ett c-L-arabinofuranosidas med de egenskaperna att det är mest aktivt mellan pH 6,5-8,0, med en optimal temperatur av 70°C vid pH 8.In one embodiment of this aspect of the invention, the composition is a clarified culture broth. In another embodiment of this aspect of the invention, the preparation is a concentrated fraction of said culture broth which exhibits α-L-arabinofuranosidase activity in a medium with a mass of wood. In yet another embodiment of the invention, the α-L-arabinofuranos idase activity is derived from a c-L-arabinofuranosidase with the properties that it is most active between pH 6.5-8.0, with an optimum temperature of 70 ° C at pH 8.

I en annan aspekt av uppfinningen är preparatet enligt den ovan beskrivna aspekten av uppfinningen i association med ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet alstrat av en annan mikrobiell stam och har förmåga att delignifiera massa av ved vid en temperatur av minst 65°C och ett pH av minst 9. I en specifik utföringsform av denna aspekt av uppfinningen omfattar 10 15 20 25 30 35 501 096 preparatet ett a-L-arabinofuranosidas som alstrats av ßggillgg gtegrotlgermgphilus stammen NCIMB 40494 och ett xylanas som alstrats av ßagillus stgarothermophilug stammen NCIMB 40222.In another aspect of the invention, the composition according to the above-described aspect of the invention is in association with a composition which exhibits enzymatic activity generated by another microbial strain and is capable of delignifying pulp of wood at a temperature of at least 65 ° C and a pH of at least 9. In a specific embodiment of this aspect of the invention, the composition comprises an αL-arabinofuranosidase generated by the βggillot gtegrotlgermgphilus strain NCIMB 40494 and a xylanase generated by the ßagillus stgarothermophilug strain NCIM.

Ytterligare en annan aspekt av uppfinningen är inriktad på förfarande för framställning av ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet, vid vilket en Bacillus gtgargthermgphilgs stam vald från stammen NCIMB 40494 och mutanter och varianter därav med väsentligen samma förmåga att alstra nämnda preparat som stammen NCIMB 40494, underkastas aerob fermentering, i ett lämpligt medium, varvid preparatets enzymatiska aktivitet inne- fattar a-L-arabinofuranosidasaktivitet och preparatet har för- måga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 65°C.Yet another aspect of the invention is directed to a process for the preparation of a composition exhibiting enzymatic activity, in which a Bacillus gtgargthermgphilgs strain selected from the strain NCIMB 40494 and mutants and variants thereof having substantially the same ability to produce said preparation as the strain NCIMB 40494 are subjected to aerobic fermentation, in a suitable medium, wherein the enzymatic activity of the preparation comprises αL-arabinofuranosidase activity and the preparation has the ability to delignify pulp of wood at a pH of 8-9 and a temperature of 65 ° C.

Ytterligare en annan aspekt av uppfinningen är inriktad på den isolerade Bacillus stgargthermophilus stammen NCIMB 40494 och mutanter och varianter därav, vilka mutanter och varianter har väsentligen samma förmåga att alstra ett preparat som uppvisar enzymatisk aktivitet som nämnda stam NCIMB 40494, varvid den enzymatiska aktiviteten innefattar a-L-arabinofuranosidasaktivi- tet och preparatet har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av 8-9 och en temperatur av 65°C. Ännu en annan aspekt av uppfinningen är inriktad på ett för- farande som omfattar behandling av massa av ved, vid vilket massa av ved behandlas i minst ett steg med ett preparat enligt något av kraven 1-6. I en utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är den massa av ved som skall behandlas sulfat- massa. I en annan utföringsform är den sulfatmassa som skall behandlas en partiellt delignifierad sulfatmassa. I ytterligare en annan utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är den partiellt delignifierade sulfatmassan en syrgasdelignifierad sulfatmassa. 10 15 20 25 30 35 501 096 5 En ytterligare aspekt av uppfinningen är inriktad på massa av ved som har behandlats i minst ett steg med ett preparat enligt uppfinningen. ri ' oor a 'sm ßggillgs stgargthermophilus stammen, L1 deponerades under Budapest-överenskommelsen vid the National Collections of' Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB), Aberdeen, den 24 mars 1992 och gavs accessionsnummer NCIMB 40494. ßacillus stgargthermophilus stammen T-6, som erhållit acces- sionsnummer NCIMB 40222 av samma depositionsinstitut, deponera- des tidigare i samband med inlämnande av prioritetsansökningen (för WO 91/10724.Yet another aspect of the invention is directed to the isolated Bacillus stgargthermophilus strain NCIMB 40494 and mutants and variants thereof, which mutants and variants have substantially the same ability to produce a preparation exhibiting enzymatic activity as said strain NCIMB 40494, the enzymatic activity comprising -arabinofuranosidase activity and the preparation are capable of delignifying pulp of wood at a pH of 8-9 and a temperature of 65 ° C. Yet another aspect of the invention is directed to a method comprising treating pulp of wood, in which pulp of wood is treated in at least one step with a preparation according to any one of claims 1-6. In one embodiment of this aspect of the invention, the pulp of wood to be treated is sulphate pulp. In another embodiment, the sulphate pulp to be treated is a partially delignified sulphate pulp. In yet another embodiment of this aspect of the invention, the partially delignified sulfate pulp is an oxygen delignified sulfate pulp. A further aspect of the invention is directed to pulp of wood which has been treated in at least one step with a preparation according to the invention. ri 'oor a' sm ßggillgs stgargthermophilus strain, L1 was deposited under the Budapest Treaty at the National Collections of 'Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB), Aberdeen, on 24 March 1992 and was given accession number NCIMB 40494. ßacillus stgargthermophilus strain T-6, who received accession number NCIMB 40222 from the same depositary institution, was previously deposited in connection with the submission of the priority application (for WO 91/10724.

Isolering av termostabil g-L-arabinofuranosidas-alstrande c' lus tea hermo h' u stam L1 A. Pramställning av alkaliextraherad massa (AKP).Isolation of thermostable g-L-arabinofuranosidase-producing c 'lus tea hermo h' u strain L1 A. Alkali extracted pulp (AKP) frame preparation.

Suspensionen av Kl5, partiellt syrgasblekt barrvedssulfatmassa, (6-10% torrvikt fiber) i 0,02 N Na0H (pH 11,7) inkuberades vid 60-62'C i 18-20 timmar. Fluiderna separerades från fibrerna medan de ännu var heta med användning av en sinter-glastratt under sug. Den resulterande lösningen neutraliserades till pH 7,0 och koncentrerades genom ultrafiltrering (molekylviktsspärr 10.000). Retentatet (AKP-1) innehöll 5,2 mg/ml lignin, 1,85 mg/ml kolhydrat (enligt fenol-svavelsyra och 0,83 mg/ml pentoser (enligt orcinol).The suspension of K15, partially oxygen bleached softwood sulfate pulp, (6-10% dry weight fiber) in 0.02 N NaOH (pH 11.7) was incubated at 60-62 ° C for 18-20 hours. The fluids were separated from the fibers while still hot using a sintered glass funnel under suction. The resulting solution was neutralized to pH 7.0 and concentrated by ultrafiltration (molecular weight cut-off 10,000). The retentate (AKP-1) contained 5.2 mg / ml lignin, 1.85 mg / ml carbohydrate (according to phenol-sulfuric acid and 0.83 mg / ml pentoses (according to orcinol).

B. Anrikningskultur.B. Enrichment culture.

AKP-l utökades med salter (0,l% MgS0,.7H2O, 10 mM Kzl-IPO" 0,l% urea och spårämnen) och inokulerades med slam- och vattenprover tagna från vattenreningsdammar tillhörande Korsnäs. Kolvarna inkuberades under skakning vid 65°C och pH 9,8 i 48 timar. En 10 15 20 25 30 35 501 096 6 droppe av grumlig kultur inokulerades sedan i en kolv som inne- höll 15 ml 0,2% galaktomannan (Locust bean gum, Sigma) -medium.AKP-1 was expanded with salts (0.1% MgSO 4 .7H 2 O, 10 mM Kzl-IPO "0, 1% urea and trace elements) and inoculated with sludge and water samples taken from water treatment ponds belonging to Korsnäs. The flasks were incubated with shaking at 65 °. C and pH 9.8 for 48 hours A drop of cloudy culture was then inoculated into a flask containing 15 ml of 0.2% 0.2% galactomannan (Locma bean gum) medium.

Efter inkubation under 24 timmar vid 65°C och pH 9,0, utströks kulturen på LB-agar. Efter inkubation isolerades och erhölls i ren kultur ungefär 20 olika kolonityper. Efter preliminär testning studerades en av stammarna i detalj: stam Ll som innehöll ett termofilt a-L-arabinofuranosidas.After incubation for 24 hours at 65 ° C and pH 9.0, the culture was plated on LB agar. After incubation, approximately 20 different colony types were isolated and obtained in pure culture. After preliminary testing, one of the strains was studied in detail: strain L1 which contained a thermophilic α-L-arabinofuranosidase.

C. Termofilt a-L-arabinofuranosidas från stam Ll Stam Ll utvaldes för vidare studium på grund av att den råa extracellulära vätskan från odling av kulturen.på galaktomannan- medium var aktiv vid delignifiering av Kl5 massa. För uppskatt- ning av hur mycket lignin som görs extraherbart av det enzyma- tiska preparatet användes en känslig spektrofotometrisk analys- metod. Absorbansvärdena vid 350 nm(Aæ0) mättes på provernas supernatantvätskor och de uppmätta värdena presenterades som % frisatt lignin. Odlingen och delignifieringsaktiviteten av stam Ll somn odlats på. olika kolkällor sammanfattas i Tabell 1- Stammen växte till viss utsträckning på jästextrakt och lkasaminosyror utan tillsättning av någon annan kolkälla och gav en netto delignifiering av 5,l%. Ytterligare tillväxt observera- des med alla de tillförda sockerarterna med undantag för galaktos, som också inhiberade alstringen av delignifierings- aktivitet. De bästa delignifieringsaktiviteterna erhölls på kulturer som odlats på xylos och arabinos, 7,18 resp 7,6%.C. Thermophilic α-L-arabinofuranosidase from strain L1 Strain L1 was selected for further study because the crude extracellular fluid from culture culture on galactomannan medium was active in delignifying Kl5 mass. To estimate how much lignin is made extractable by the enzymatic preparation, a sensitive spectrophotometric analysis method was used. The absorbance values at 350 nm (Aæ0) were measured on the supernatant liquids of the samples and the measured values were presented as% released lignin. The cultivation and delignification activity of strain L1 on which it was grown. various carbon sources are summarized in Table 1- The strain grew to some extent on yeast extracts and lcaamino acids without the addition of any other carbon source and gave a net delignification of 5.1%. Further growth was observed with all the added sugars with the exception of galactose, which also inhibited the generation of delignification activity. The best delignification activities were obtained on cultures grown on xylose and arabinose, 7.18 and 7.6%, respectively.

De extracellulära enzymatiska aktiviteterna av stam L1 som odlats på xylos- och arabinosmedier har sammanställts i Tabell 2. xylanasaktiviteten bestämdes genom inkubering av en färsk lösning av xylan med extracellulär supernatantvätska och analysering beträffande ökning av reducerande socker genom ferricyanidmetoden (Spiro, R.G. 1966, Methods in Enzymology §: 7-9). Analysbufferten var 50 mM Tris. Cl, pH 7,0 och 0,5% xylan (oat spelts, Sigma). Aktivitetsenheter för xylanas är pmol reducerande socker genererat per minut vid 65°C. 10 15 20 25 30 35 501 096 7 Arabinofuranosidasanalysen är en modifiering av standardanalysen för ß-galaktosidas (G. Tabolt and Syguson, Appl. & Enviro.The extracellular enzymatic activities of strain L1 grown on xylose and arabinose media have been summarized in Table 2. The xylanase activity was determined by incubating a fresh solution of xylan with extracellular supernatant fluid and analyzing for increasing reducing sugar by the ferricyanide method (Spiro, RG 1966, Spiro, RG 1966 Enzymology §: 7-9). The assay buffer was 50 mM Tris. Cl, pH 7.0 and 0.5% xylan (oat spelled, Sigma). Activity units for xylanase are pmol reducing sugar generated per minute at 65 ° C. The Arabinofuranosidase assay is a modification of the standard assay for β-galactosidase (G. Tabolt and Syguson, Appl. & Enviro).

Microbiol, vol 56, No. 11, 1990). Provröret innehåller 0,5 ml 40 mM Tris-buffert, pH 7,0. 0,4 ml av enzymprovet och 0,1 ml 10 mM p-nitrofenyl-a-L-arabinofuranosid (Sigma Chemicals) in- kuberades vid 65°C i 15 minuter. Reaktionen avslutades genom att sätta provröret i is-vattenbad. Frisättningen av p-nitrofenol bestäms spektrofotometriskt vid 401 nm. 10 mikromol p-nitro-- fenol per ml har en absorbans av 18,4. En verksam enzymenhet definieras som mikromol p-nitrofenyl frisatt per minut.Microbiol, vol 56, no. 11, 1990). The test tube contains 0.5 ml of 40 mM Tris buffer, pH 7.0. 0.4 ml of the enzyme sample and 0.1 ml of 10 mM p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside (Sigma Chemicals) were incubated at 65 ° C for 15 minutes. The reaction was terminated by placing the test tube in an ice-water bath. The release of p-nitrophenol is determined spectrophotometrically at 401 nm. 10 micromoles of p-nitrophenol per ml has an absorbance of 18.4. An active enzyme unit is defined as micromoles of p-nitrophenyl released per minute.

På xylosmedium observerades endast två aktiviteter: 1,3 enheter per ml xylanas och 0,004 enheter per ml a-L-arabinofuranosidas.On xylose medium, only two activities were observed: 1.3 units per ml of xylanase and 0.004 units per ml of α-L-arabinofuranosidase.

Det förekom inte någon detekterbar a-L-arabinopyranosidas-, mannanas-, a-D-galaktosidas- eller a-L-mannosidasaktivitet.There was no detectable α-L-arabinopyranosidase, mannanase, α-D-galactosidase or α-L-mannosidase activity.

Därför föreföll det som om delignifieringsaktiviteten av L1 berodde på xylanasaktivitet när cellerna odlades på xylosmediunn När emellertid cellerna odlades på arabinosmedium var huvud- aktiviteten u-L-arabinofuranosidas (0,5 enheter per ml). Därför föreföll det som om a-L-arabinofuranosidaset var ansvarigt för delignifiering i A-medium (arabinos-medium). a-L-arabinofuranosidas(AF)-aktiviteten koncentrerades från en 10 liter kultur av Ll odlad på A-medium (Tabell 3). Aktiviteten utfälldes med till 80% mättat ammoniumsulfat, vilket gav ett rått enzympreparerat med 11 enheter per ml AF och 0,96 enheter per ml xylanas. AF-aktiviteten band inte till karboxy1-metyl- cellulosa (CMC), men adsorberade fullständigt till DEAE- cellulosa eller DEAE-Sephacel.Therefore, the delignification activity of L1 appeared to be due to xylanase activity when the cells were grown on the xylose medium. However, when the cells were grown on arabinose medium, the main activity was u-L-arabinofuranosidase (0.5 units per ml). Therefore, the α-L arabinofuranosidase appeared to be responsible for delignification in A medium (arabinose medium). The α-L arabinofuranosidase (AF) activity was concentrated from a 10 liter culture of L1 grown on A medium (Table 3). The activity was precipitated with 80% saturated ammonium sulfate to give a crude enzyme preparation with 11 units per ml AF and 0.96 units per ml xylanase. The AF activity did not bind to carboxy1-methylcellulose (CMC), but completely adsorbed to DEAE-cellulose or DEAE-Sephacel.

Det koncentrerade AF uppvisade signifikant delignifieringsakti- vitet (Tabell 4). Det bör påpekas att vi ännu inte optimerat betingelserna för användning av AF för delignifiering av massa.The concentrated AF showed significant delignification activity (Table 4). It should be noted that we have not yet optimized the conditions for the use of AF for delignification of pulp.

En potentiellt användbar egenskap hos AF är att det borde spjälka bindningen nära lignin, varigenom det mesta av hemi- cellulosan lämnas med cellulosafibrerna. Detta skulle ge ett högre utbyte av delignifierad massa. Därtill förefaller det som 10 15 20 25 30 35 501 096 e om delignifieringsaktiviteten av AF plus xylanas T-6 är mer än additiv.A potentially useful property of AF is that it should cleave the bond near lignin, leaving most of the hemicellulose with the cellulose fibers. This would give a higher yield of delignified pulp. In addition, it appears as if the delignification activity of AF plus xylanase T-6 is more than additive.

Tabellerna 5-7 beskriver en del av de enzymatiska egenskaperna hos renat AF, med användning av PNP-a-L-Ara som substrat.Tables 5-7 describe some of the enzymatic properties of purified AF, using PNP-α-L-Ara as substrate.

Enzymet är mest aktivt mellan pH 6,5-8,0, med ett optimum vid pH 7,0. Enzymet har ingen aktivitet vid pH 9,0 vid 70°C.The enzyme is most active between pH 6.5-8.0, with an optimum at pH 7.0. The enzyme has no activity at pH 9.0 at 70 ° C.

Temperaturoptimum var 70°C vid både pH 7,0 och pH 8,0. Enzymet var mest aktivt vid 20 mM Na2SO,, pH 7,5 i 10 mM fosfatbuffert vid 70°C. Vid pH 7,0 var enzymet mycket stabilt vid 60°C, men förlorade ca 50% av sin aktivitet vid 70°C under 75 minuter och var fullständigt inaktivt vid 80°C under 15 minuter.The temperature optimum was 70 ° C at both pH 7.0 and pH 8.0. The enzyme was most active at 20 mM Na 2 SO 4, pH 7.5 in 10 mM phosphate buffer at 70 ° C. At pH 7.0, the enzyme was very stable at 60 ° C, but lost about 50% of its activity at 70 ° C for 75 minutes and was completely inactive at 80 ° C for 15 minutes.

Tabell 1 Tillväxt och delignifieringsaktivitet av stam Ll på olika medier.Table 1 Growth and delignification activity of strain L1 on different media.

Tillväxt Delignifiering (%)b Kolkällaa (A560) Totalt Netto Ingen 0,73 7,1 ,1 0,2 LB 1,30 8,8 1 0,2 Man 1,83 8,0 1 0,2 Gal 0,84 4,9 I 0,2 Glc 2,62 8,9 ,9 0,2 Xyl 2,04 9,1 ,1 0,2 Ara 1,81 10,5 1 ' Odlingsmedierna bestod av kolkälla (0,2%), 0,l% jäst- extrakt, 0,5% kasaminosyror och anrikningssalter (0,1% urea, 0,02% 2498047320, SmM KI-IZPOU pH 9,0, 20 m!! 'Prisü-ICI, pH 9,0, 0,18 NaC1 och standardblandning av spårelement).Growth Delignification (%) b Carbon source (A560) Total Net None 0.73 7.1, 1 0.2 LB 1.30 8.8 1 0.2 Man 1.83 8.0 1 0.2 Gal 0.84 4.9 I 0.2 Glc 2.62 8.9 .9 0.2 Xyl 2.04 9.1, 1 0.2 Ara 1.81 10.5 1 'The culture media consisted of carbon source (0.2%) 0.1% yeast extract, 0.5% casamino acids and enrichment salts (0.1% urea, 0.02% 2498047320, mM KI-IZPOU pH 9.0, 20 m !! 'Prisü-ICI, pH 9, 0, 0.18 NaCl and standard mixture of trace elements).

Alla socker hade D-konfiguration, med undantag för L- arabinos; LB är locust bean-galaktomannan.All sugars had D-configuration, with the exception of L-arabinos; LB is the locust bean galactomannan.

Delignifiering av K15 utfördes med den extracellulära supernatanten (justerad till pH 9,0), vid 65°C i 2 timmar. 10 15 20 25 30 35 _5D1 096 9 Tabell 2 Extracellulära enzymatiska aktiviteter av L1 X-mediunﬁ A-medium Substrat Akt. (U/ml) Akt. (U/ml) Xylan 1,3 0,05 PNP-a-L-AF 0,004 0,5 PNP-a-Gal < 0,001 - PNP-a-Man < 0, 001 - PNP-a-AP < 0,001 - LB-GM < 0,001 - ° _ Xylan- och LB-GM(1ocnst bean-galaktomannan) -nedbrytande aktiviteter bestämdes genom alstring av reducerande socker och PN?-X-aktiviteter mättes genom frisättning av PNP (p- nitrofenol).Delignification of K15 was performed with the extracellular supernatant (adjusted to pH 9.0), at 65 ° C for 2 hours. 10 15 20 25 30 35 _5D1 096 9 Table 2 Extracellular enzymatic activities of L1 X-medium ﬁ A-medium Substrate Akt. (U / ml) Act. (U / ml) Xylan 1.3 0.05 PNP-αL-AF 0.004 0.5 PNP-α-Gal <0.001 - PNP-α-Man <0.001 - PNP-α-AP <0.001 - LB-GM <0.001 - ° Xylan- and LB-GM (1ocnst bean-galactomannan) -degradable activities were determined by generating reducing sugar and PN? -X activities were measured by release of PNP (p-nitrophenol).

Celler odlades under 24 timmar i antingen X-medium eller A-medium (xylos- eller arabinos-medium som beskrivits i Tabell 1) och centrifugerades för avlägsnande av celler.Cells were cultured for 24 hours in either X-medium or A-medium (xylose or arabinose medium as described in Table 1) and centrifuged to remove cells.

Tabell 3 Preliminär rening av a-L-arabinofuranosidas från Ll odlat på A-medium Vol Protein' AF Xylanas Fraktion (ml) (mg/ml) (U/ml) (U/ml) Rå supernatant 8100 1,11 0,82 0,03 (NHQZSO, ppt 400 13,3 11,0 0,9_6 DEAE-Sephacel 20 41,1 46,6 0,09 Protein bestämt genom BioRad. 10 15 20 25 30 35 501 096 10 _ Tabell 4 Delignifiering av K15 med koncentrerat a-L-arabinofuranosidas % Ligninfrisättninga Enzym Totalt Netto Ar (20 u/mn” 9,6 3,0 Xylanas T-6° (5 U/ml) 11,3 5,7 AF + Xylanas T-6 16,1 11,5 a 10 mM fosfatbuffert, pH 8,0, 65°C, 2h.Table 3 Preliminary purification of αL-arabinofuranosidase from L1 grown on A-medium Vol Protein 'AF Xylanase Fraction (ml) (mg / ml) (U / ml) (U / ml) Crude supernatant 8100 1.11 0.82 03 (NHQZSO, ppt 400 13.3 11.0 0.9_6 DEAE-Sephacel 20 41.1 46.6 0.09 Protein determined by BioRad. 10 15 20 25 30 35 501 096 10 _ Table 4 Delignification of K15 with concentrated αL-arabinofuranosidase% Lignin Release Enzyme Total Net Ar (20 rpm) 9.6 3.0 Xylanase T-6 ° (5 U / ml) 11.3 5.7 AF + Xylanase T-6 16.1 11.5 and 10 mM phosphate buffer, pH 8.0, 65 ° C, 2h.

Koncentrerat genom DEAE-Sephacel-kromatografi; innehåller <0,1 U/ml xylanas.Concentrated by DEAE-Sephacel chromatography; contains <0.1 U / ml xylanase.

° Xylanas T-6 alstras av NCIMB 40222, som beskrivits i WO 91/10724, och har förmåga att delignifiera massa av ved vid ett pH av minst 9 och en temperatur av minst 65°C.Xylanase T-6 is generated by NCIMB 40222, as described in WO 91/10724, and is capable of delignifying pulp of wood at a pH of at least 9 and a temperature of at least 65 ° C.

Tabell 5 Effekt av temperatur på aktivitet av AF vid pH 7 och 8 Temperatur pH 7 pH 8 'c Ar (u/mlf" Ar (u/mn* 40 2,1 1,0 50 5,0 2,4 60 8,3 5,2 65 10,1 7,6 70 10,3 9,6 75 9,9 7,5 80 4,2 1,0 90 0,8 0,3 100 0 0 ° I 20 mM Tris-buffert. 10 15 20 25 30 35 501 096 11 Tabell 6 Effekt av saltkoncentration på aktivitet av AF.Table 5 Effect of temperature on activity of AF at pH 7 and 8 Temperature pH 7 pH 8 'c Ar (u / mlf "Ar (u / mn * 40 2.1 1.0 50 5.0 2.4 60 8, 3 5.2 65 10.1 7.6 70 10.3 9.6 75 9.9 7.5 80 4.2 1.0 90 0.8 0.3 100 0 0 ° I 20 mM Tris buffer. 10 15 20 25 30 35 501 096 11 Table 6 Effect of salt concentration on activity of AF.

Na2S0, (mn) AF (U/m1)° 0 3,1 20 3, 50 3,4 100 3,0 150 1,0 ° I 10 mn fosfatbuffert, pH 7,5, vid 70°C.Na 2 SO 4, (mn) AF (U / m 1) ° 0 3.1 20 3, 50 3.4 100 3.0 150 1.0 ° In 10 mn phosphate buffer, pH 7.5, at 70 ° C.

Tabell 7 Stabilitet hos a-L-arabinofuranosidas(AF)-aktivitet. 5912 ZQLC 3912 Reaktions- AF* AF° AF* tid aktivitet aktivitet aktivitet (min) (U/ml) (U/ml) ' (U/ml) 2 7,7 6, 5,0 5 7,5 7, - 15 8,4 7,0 0 30 8,4 , 45 7,5 , 60 7,7 4, 75 8,0 2, a I 20 mn Tris, pH 7,0.Table 7 Stability of α-L-arabinofuranosidase (AF) activity. 5912 ZQLC 3912 Reaction AF * AF ° AF * time activity activity activity (min) (U / ml) (U / ml) '(U / ml) 2 7.7 6, 5.0 5 7.5 7, - 8.4 7.0 0 8.4, 45 7.5, 60 7.7 4, 75 8.0 2, a I 20 mn Tris, pH 7.0.

Claims

10 15 20 25 30 501 096

Preparations having an enzymatic activity, characterized in that it can be obtained by aerobic fermentation, in a suitable medium, of a Bagillg's steargthermgphilus strain selected from the strain NCIMB 40494 and mutants and variants thereof having substantially the same ability to produce said preparations as strain NCIMB 40494, the enzymatic activity of the composition comprising a substantial proportion of αL-arabinofuranosidase activity capable of delignifying pulp of wood at a pH of 8-9 and a temperature of 65 ° C.

A composition according to claim 1, wherein the composition is a clarified culture broth.

The composition of claim 2, wherein the composition is a concentrated fraction of said culture broth exhibiting α-L-arabinofuranosidase activity in a wood pulp medium.

A composition according to claim 3, wherein said α-L-arabinofuranosidase activity is derived from an αL-arabinofuranosidase having the properties that it is most active between pH 6.5-8.0, with an optimum temperature of 70 ° C at pH 8.

A composition according to any one of claims 1-4 in association with a composition which exhibits enzymatic activity generated by another microbial strain and capable of delignifying pulp of wood at a temperature of at least 65 ° C and a pH of at least 9.

A composition according to claim 5, wherein said composition comprises an α-L-arabinofuranosidase generated by Bagillgg gtggrgghggmgphi; lice strain NCIM 40494 and a xylanase generated by Bagillg's steargthermgphilgs strain NCIM 40222.

A process for the preparation of a preparation which exhibits enzymatic activity, characterized in that a Bagillns steargthermgphilus strain selected from the strain NCIMB 40494 and mutants and variants thereof having substantially the same ability to produce said preparation as the strain NCIMB 40494 are subjected to aerobic fermentation, in a suitable medium, wherein the enzymatic activity of the preparation comprises a substantial proportion of αL-arabinofuranosidase activity capable of delignifying pulp of wood at a pH of 8-9 and a temperature of 65 ° C.

Isolated Bagillg's steargthgrmgphilgs strain NCIMB 40494 and mutants and variants thereof, which mutants and variants have substantially the same ability to produce a preparation which exhibits enzymatic activity as the strain NCIMB 40494, said enzymatic activity comprising a substantial proportion of α-arabinofuranide having delignify pulp of wood at a pH of 8-9 and a temperature of 65 ° C.

9. A method comprising treating pulp of wood, characterized in that pulp of wood is treated in at least one step with a preparation according to any one of claims 1-6.

A method according to claim 9, wherein said pulp of wood is sulphate pulp. 501 096 H

The method of claim 10, wherein said pulp of wood is a partially delignified sulfate pulp.

The method of claim 11, wherein said partially delignified sulfate pulp is an oxygen delignified sulfate pulp.