CZ239494A3

CZ239494A3 - De-lignification agent exhibiting alpha-l-arabinofuranosidase activity, process for preparing and use thereof

Info

Publication number: CZ239494A3
Application number: CZ942394A
Authority: CZ
Inventors: Eugene Rosenberg; Yuval Shoham
Original assignee: Korsnaes Ab; Technion Res & Dev Foundation; Univ Ramot
Priority date: 1992-03-31
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 1995-01-18
Also published as: AU3913093A; KR950701381A; NO943612L; FI944501A; BR9306158A; HUT70460A; CA2132335A1; NO943612D0; SE501096C2; FI944501A0; HU9402800D0; SE9201006D0; EP0633932A1; JPH07508162A; SE9201006L; SK118594A3

Description

Del ignifikační přípravek projevující se 1 \ α-L-arabi nofuranosí dázovou aktivitou, jeho výroba a použití'

Oblast techniky

Vynález se týká přípravku aktivitou obsahující α-L-arabi nofuranosí dázovou projevujícího se enzymatickou j ako akti vi tu hlavní se součást schopností °C. Dále delignifikace dřevní buničiny při pH 8-9 a teplotě 65 se týká způsobu výroby tohoto přípravku aerobní fermentací selekcí vybraného kmene Bacillus stearothermophi 1 us . Vynález se rovněž týká tohoto vybraného kmene. Kromě toho se týká způsobu, zaměřeného na zpracování dřevní podle vynálezu a rovněž buničiny přípravkem jako takové. Navíc se buničiny přípravkem zpracované uvedeným týká použití enzymu produkovaného uloženým kmenem Bacillus stearothermophi 1us NCIMB 40494 při zpracování buničiny. Rovněž se týká α-L-arabinofuranosidázy se sekvencí aminokyselin, která obsahuje jednu nebo dvě specifické dílčí sekvence aminokyselin nebo jejich homologů.

Dosavadní stav techniky

Vzhledem k vlivu na životní prostředí jsou předmětem zájmu průmyslu na zpracování buničiny a papírenského průmyslu bělící postupy vedoucí k delignifi kácí a bělení buničiny bez použiti sloučenin obsahujících chlor.

Za tím účelem byla nedávno podána řada patentových přihlášek popisujících enzymy pro del ignifi kácí dřevní buničiny. Jedna z těchto přihlášek je naše WO 91/10724 (švédská prioritní přihláška, na kterou byl vydán patent 19.prosince 1991), která mezi jiným nárokuje přípravek projevující enzymatickou aktivitu se schopností delignifikace buničiny při teplotě nejméně 65 °C a minimálním pH 9. Tento přípravek lze získat aerobní fermentací kmene Bacillus stearothermophi 1 us se schopností produkovat tento přípravek jako jeden z dvou kmenů uložených ve sbírce mikroorganismů pod čísly NCIMB 40221 nebo NCIMB 40222. Čištěním enzymatické aktivity byla získána xylanáza s MW /molekulovou hmotností/ 41 000 - 42 000 Da.

Byly vynakládány snahy za účelem izolace jiného kmene Bači 11us stearothermophi1us. který by mohl být použit pro čištění jiných delignifikačních aktivit, než je aktivita xylanázy. Záměrem bylo, aby například α-L-arabinofuranosidáza, která má schopnost delignifi kovat dřevní buničinu při vysoké teplotě a pH byla zároveň užitečným nástrojem při rozvinutí bělící operace bez jakýchkoli bělících chemikálií obsahujících chlor.

Nedávno byla publikována přihláška W0 91/18976 (podaná přihlašovatelem Novo Nordisk A/S). Její nárok č.14 je zaměřen na enzym arabinofuranosidázu produkovanou Bači 11us stearothermophi 1 us. Na straně 9, řádek 11 a 12 se praví, že v literatuře není obsažen žádný odkaz na arabinofuranosidázu získanou z termofilního /teplomilného/ Bací 11us. Ačkoliv W0 91/18976 nárokuje enzym arabinofuranosidázu produkovanou Bacillus stearothermophi1us, nepopisuje způsob jejího získáni.

Do sbírky mikroorganismu byly uloženy tři kmeny, dva izolované a jeden mutant. Nicméně žádný z nich nebyl v uvedené přihlášce popsán jako kmen produkující arabinofuranosidázu..

Jediný kmen popsaný jako kmen produkující arabinofuranosidázu je neuložený mutantní kmen označený jako BPS-3-H-17-4. Dále je třeba uvést, že pokusy s přípravky popsané v přihlášce (střed nahoře na str.17) byly prováděny s produkty fermentace získanými z tohoto neuloženého kmene. Na str.8 ř.12-16 se uvádí, že tento kmen je odvozen od jednoho z deponovaných kmenů po provedené mutagenezi pomocí ethylmethansulfonátu. Tento mutagen je velmi nespecifický a nejsou popsány žádné podmínky k získáni kmene produkujícího arabinofuranosidázu. Tudíž ve stavu techniky dosud nebyl popsán způsob, jak získat arabinofuranosidázu z termofilního - teplomilného - kmene Bacillus.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká přípravku projevujícího se enzymatickou aktivitou, ve které zaujímá podstatnou část aktivita α-L-arabinofuranosidázy se schopností delignifikace dřevěné buničiny při pH 8-9 a teplotě 60

V tomto popisu a připojených nárocích je třeba vykládat výraz dřevní buničina široce a to tak, že obsahuje všechny typy 1 ignocelulosových materiálů.

Jeden předmět vynálezu je zaměřen na přípravek projevující se enzymatickou aktivitou, který lze získat aerobní fermentací ve vhodném prostředí kmene Bacillus stearothermophi 1 us vybraného z kmene NCIMB 40494 a jeho mutantů a variant, které mají v podstatě tutéž schopnost produkovat uvedený přípravek, jako kmen NCIMB 40494, přičemž v enzymatické aktivitě uvedeného přípravku zaujímá podstatnou část aktivita α-L-arabinofuranosidázy se schopností delignifikace dřevěné buničiny při pH 8-9 a teplotě 65 θθ.

V jednom provedení tohoto předmětu vynálezu je přípravkem vyčištěná kultura živné půdy. V dalším provedení této části vynálezu je přípravkem koncentrovaná frakce zmíněné vyčištěné kultury živné půdy vykazující aktivitu α-L-arabinofuranosidázy v prostředí dřevěné buničiny. V ještě dalším provedení tohoto předmětu vynálezu je aktivita α-L-arabinofuranosidázy odvozena z α-L-arabinofuranosidázy, která je složena ze dvou podjednotek s přibližnou molekulární hmotností 52 500 Da respektive 57 500 Da.

V dalším předmětu vynálezu tvoří přípravek podle již výše uvedeného předmětu vynálezu spojení s přípravkem projevujícím enzymatickou aktivitu produkovanou jiným mikrobiálním kmenem a se schopnosti delignifikace dřevěné buničiny při teplotě nejméně 65 θθ a hodnotě pH nejméně 9. Při specifickém provedeni tohoto předmětu vynálezu obsahuje přípravek α-L-arabinofuranosidázu produkovanou kmenem NCIMB 40494 Bacillus stearothermophi 1us a xylanázu produkovanou kmenem NCIMB 40222 Bacillus stearothermophi 1us .

Dalším předmět vynálezu je zaměřen na α-L-arabinofuranosidázu se sekvencí aminokyselin, která obsahuje N-koncovou dílčí sekvenci aminokyselin SEQ Ident.č.l:

Met? Gin Pro Tyr Arg Pro? Glu Glu Leu nebo její homolog.

Dalším předmět vynálezu je zaměřen na α-L-arabinofuranosidázu se sekvencí aminokyselin obsahující N-koncovou dílčí sekvenci aminokyselin SEQ Ident.č.2;

Ser Met Lys Lys Ala Thr Met lle lle Glu Lys Asp Phe Lys lle Ala Glu lle Asp Lys Arg lle Tyr nebo j ej í homolog.

V souvislosti s α-L-arabinofuranosidázou se sekvencí aminokyselin, která obsahuje N-koncovou dílčí sekvenci aminokyselin SEQ Ident.č. 1:

Met? Gin Pro Tyr Arg Pro? Glu Glu Leu nebo jejím homologem a/nebo s α-L-arabinofuranosidázou se sekvencí aminokyselin obsahující N-koncovou dílčí sekvenci aminokyselin SEQ Ident.č.: 2

Ser Met Lys Lys Ala Thr Met lle lle Glu Lys Asp Phe Lys lle Ala Glu lle Asp Lys Arg lle Tyr nebo jejím homologem, je takovým homologem zamýšlen homolog se sekvencí aminokyselin, která ve vztahu k sekvenci SEQ Ident.č.l a/nebo SEQ Ident.č.2 má některé substituenty, extenze, nebo odstraněné části aminokyselin, které nezpůsobují eliminaci α-L-arabinofuranosidázové aktivity celého enzymu například v prostředí dřevěné buničiny a přednostně při teplotě 65 a pH 8-9. Dále může mít takový homolog například sekvenci, která má 80% nebo více společných aminokyselin se sekvencí SEQ Ident.č. 1 a/nebo SEQ Ident.č.2.

Příkladem homologu se sekvencí SEQ Ident.č.2 je sekvence SEQ Ident.č . 3 :

Ala Thr Lys Lys Ala Thr Met Ile Ile Glu Lys Asp

Phe Lys Ile Ala Glu Ile Asp Lys Arg Ile Tyr Gly

Ser Phe Ile Glu His Leu Gly Arg Ala Val Tyr Gly

Gly Ile Tyr Glu Pro Gly His Pro Gin Ala Asp Glu

Asn Gly což je M-koncová sekvence α-L-arabinofuranosidázy produkované kmenem Bacillus stearothermophi1us NCIMB 40222. Uvedená α-L-arabinofuranosidáza je složena ze dvou identických podjednotek, každá s přibližnou molekulární hmotnosti 64 000 Da (nativní enzym, 128 000 Da, hodnoceno podle SDS gelu).

Tudíž, homolog sekvence SEQ Ident.č.l a/nebo sekvence SEQ Ident.č.2 je jakákoli sekvence aminokyselin, která je dostatečně homologní na úrovni nukleotidů, aby byla rozpoznána kteroukoli sondou DNA nebo RNA odvozenou od uvedené/ých sekvence/í .

Jiný předmět vynálezu je zaměřen na způsob výroby přípravku, který projevuje enzymatickou aktivitu, přičemž kmen Bacillus stearothermophi1us vybraný z kmene NCIMB 40494 a jeho mutantů a variant, v podstatě se stejnou schopností produkovat přípravek jako kmen NCIMB 40494, je podroben aerobní fermentaci ve vhodném prostředí a enzymatická aktivita tohoto přípravku obsahuje z podstatné části aktivitu α-L-arabinofuranosidázy, se schopností delignifikace dřevěné buničiny při pH 8-9 a teplotě 65 °C.

Ještě další předmět vynálezu je zaměřen na izolovaný kmen NCIMB 44 Bacillus stearothermophi 1 us a jeho mutanty a varianty kde tyto mutanty a varianty mají v podstatě tutéž schopnost produkovat přípravek projevující enzymatickou aktivitu uvedeného kmene NCIMB 44, přičemž v této enzymatické aktivitě zaujímá podstatnou část aktivita α-L-arabinofuranosidázy se schopností delignifikace dřevěné buničiny při pH 8-9 a teplotě 65 °C.

Další předmět vynálezu je zaměřen na použití enzymu produkovaného kmenem Bacillus stearothermophi1us NCIMB 40494 ke zpracování dřevní buničiny. Jak je zřejmé z Tab.8 popisu přihlášky produkuje tento kmen několik typu enzymových aktivit degradujících extra-cel ul árni uhlohydráty, které jsou odvozeny od produkce různých genů obsažených v genomu této bakterie.

Ačkoliv tyto různé aktivity nebyly ještě jednotlivě prozkoumány, dá se věřit, že různé aktivity, odděleně nebo v různých kombinacích, budou užitečné pro zpracování dřevní buničiny.

Další předmět vynálezu je zaměřen na způsob obsahující zpracování dřevní buničiny, kde dřevní buničina je zpracována v nejméně jedné operaci přípravkem podle vynálezu. V jednom provedení tohoto předmětu vynálezu je zpracovávaná dřevní buničina sulfátová buničina. V jiném provedení je zpracovávaná sulfátová buničina částečně delignifi kovaná sulfátová buničina. Ještě v dalším provedení tohoto předmětu vynálezu je zracovávanou částečně delignifi kovanou sulfátovou buničinou sulfátová buničina delignifi kovaná kyslíkem.

Další předmět vynálezu je zaměřen na dřevní buničinu, která byla zpracována alespoň v jedné operaci přípravkem podle vynálezu.

Ještě další předmět vynálezu je zaměřen na sondu DNA nebo RNA, která rozeznává nukleotickou sekvenci, která kóduje sekvenci aminokyselin SEQ Ident.č.l:

Met? Gin Pro Tyr Arg Pro? Glu Glu Leu a/nebo sekvenci aminokyselin SEQ Ident.č.2:

Ser Met Lys Lys Ala Thr Met Ile Ile Glu Lys Asp Phe Lys Ile

Ala Glu Ile Asp Lys Arg Ile Tyr.

Posledně jmenovaný předmět vynálezu je užitečný pro zjišťování α-L-arabinofuranosidázy se schopností delignifikace dřevní buničiny při teplotě nejméně 65 θθ a pH nejméně 8-9.

Uložení mikroorganismů:

Kmen Bacillus stearothermophi1us LI byl uložen podle Budapeštské smlouvy v National Collections of Industrial and Marině Bacteria Ltd (NCIMB) /Národních sbírkách průmyslových a mořských bakterií spol. s ručením omezeným/ - (NCIMB) v Aberdeenu, dne 24.března 1992 a dostal evidenční číslo NCIMB 40494.

Kmen Bacillus stearothermophi 1 us T-6 dostal evidenční číslo NCIMB 40222 ve stejné sbírce mikroorganismů a byl uložen dříve v souvislosti s podáním prioritní přihlášky WO 91/10724.

Příklady provedení vynálezu

Izolace termostabi1 ηí α-L-arabinofuranosidázy produkující kmen Bacillus stearothermophi1us LI.

A. Příprava alkalicky extrahované buničiny (AKP)

Suspenze KI5, kyslíkem částečně bělené jemné dřevní sulfátové buničiny (6-10 % hmotnostních vláken v sušině) v 0,02 N NaOH (pH 11,7) byla inkubována při 60-62 θθ po dobu 18-20 hod. Ještě v horkém stavu byla tekutina oddělena od vláken odsátím při použití nálevky ze sintrovaného skla. Výsledný roztok byl neutralizován na pH 7 a zahuštěn ultrafi 1trací (odstranění 10,000 jedn. molekulární hmotnosti).

Zadržené množství (AKP-1) obsahovalo 5,2 mg/ml ligninu, 1,85 mg/ml uhlohydrátů (fenolsirovou kyselinou) a 0,83 mg/ml pentosy (orcinolem = 5-methyl-1.3-benzendiol ).

B. Obohacení kultury

K AKP-1 byly přidány soli (0,1 MgS0_Z|.7H2O, 10 mM ^HPO^ 0,l%m močoviny a stopové prvky) a byla inokulována vzorky kalu a vody odebrané z čistírenských nádrží v Korsnás. Baňky byly inkubovány třepáním při 65 θθ a pH 9,0 po dobu 48 hod. Zlomek kalné kultury byl pak inokulován do zkumavky obsahující jako medium 15 ml 0,2 % galaktomannanu (pryskyřice z locustových zrn. Sigma). Po inkubaci po dobu 24 hod. při 65 θθ a pH 9,0 byla kultura naočkována do LB agaru. Po inkubaci bylo izolováno a získáno v čisté kultuře přibližně 20 různých typu kolon. Po předběžném testování byl jeden z kmenů podrobně prostudován: kmen LI, který obsahoval termofilní a-L-arabinofuranosidázu.

Kmen LI byla grampozitivni, termofilní baktérie; rostla dobře při 60-65 θθ, avšak nerostla při teplotě pod 40 θθ. Byla tyčkovítého tvaru s koncovými sporami, aerobní a oxydázově pozitivní. Kmen LI rostl na následujících uhlíkatých zdrojích: D-glukosa, D-xylosa, L-arabinosa, D-mannosa a xylan. Nerostl na zdrojích uhlíku jako je melobiosa, a galaktosa. Na základě těchto vlastností byl kmen LI klasifikován jako kmen heterogenní skupiny, Bacillus stearothermophi 1 us .

Počáteční pokusy (s buničinou K15)

C. Termofilní α-L-arabinofuranosidáza z kmene LI

Kmen LI byl vybrán pro další studium, protože surová extracelulární tekutina kultury vypěstované na gal aktomannanovém mediu byla aktivní při delignifikaci buničiny K15. Pro ohodnocení, jak dalece se dal lignin extrahovat enzymatickým přípravkem byl použit citlivý spektrofotometricky test. Hodnoty absorbance při 350 nm (A350) byly měřeny na supernatantu (kapaliny na sedlinou) vzorků a změřené hodnoty jsou prezentovány jako procenta uvolněného ligninu. Růst a delignifiakčni aktivita kmene LI pěstovaného na různých zdrojích uhlíku jsou shrnuty v Tab.l. Kmen rostl do určité míry na kvasnicovém extraktu a kasaminových kyselinách bez přídavku jiného zdroje uhlíku čistá 5,1% delignifikace. Dodatečný růst byl přidání všech možných cukrů s výjimkou která také inhibovala tvorbu delignifikační Nejlepší delignifikační aktivity byly získány na kulturách pěstovaných na xylose a arabinose, 7,1% respektive 7,6%.

a výtěžkem byla pozorován při galaktosy akt i v i ty.

Extracelulární enzymatické aktivity kmene Ll pěstovaného v prostředí xylosy a arabinosy jsou shrnuty v Tab.2. Aktivita Xylanázy byla určena inkubací čerstvého roztoku xylanu s extracelulární supernatantni redukce cukrů ferrikyanidovou Methods of Enzymology 8: 7-9) tekutinou a testem metodou (Spiro, Zkušebním pufrem na zvýšeni R.G. 1966 bylo 50 mM

Tris.CL, pH 7.0 a 0,5% xylanu (nekul tivovaný oves, Sigma). Jednotky aktivity pro xylanázu jsou pmol redukovaného cukru vytvořeného při 65 θθ.

Arabinofuranosidázový test je modifikací standardního testu pro β-galaktosidázu Mi crobi ol. vol. 56 č mM Tris-pufru. při (G.Tabold and Syguson, Appl.& Enviro. 11, 1960). Zkušební trubice obsahuje 40 pH 7,0. Množství 0,4 ml vzorku enzymu a 0,1 ml 10 mM p-nitrofenyl-α-L-arabinofuranosidu (Sigma

Chemicals) bylo inkubována při 65θ0 po dobu 15 min. Reakce byla ukončena vložením zkušební trubice do ledové vodní lázně. Uvolnění p-nitrofenolu se určuje spektrofotometricky při 401 nm. Množství 10 mikromolů p-nitrofenolu na ml má absorbanci 18,4. Jednotka aktivního enzymu je definována jako množství mikromolů p-nitrofenylu uvolněných za min.

V prostředí xylosy byly sledovány pouze dvě aktivity.: 1,3 jednotek na ml xylanázy a 0,004 jednotek na ml α-L-arabi nofuranosi dázy. α-L-arabinofuranosidázy, a-L-mannosidázy. Ukázalo kmene Ll buněk v zjistitelné aktivity α-D-galaktosidázy nebo delignifikační aktivita

Nebyly mannanázy, se tedy, že vznikla v důsledku aktivity xylanázy po dobu růstu prostředí xylosy. Nicméně, jakmile byly buňky pěstovány v prostředí arabinosy, hlavní aktivitu vykazovala α-L-arabinofuranosidáza (0,5 jednotek na ml). Ukázalo se tudíž, že α-L-arabinofuranosidáza je odpovědná za del ignifikaci v A-prostředí.

Aktivita α-L-arabinofuranosidázy (AF) byla získána zahuštěním deseti litrové kultury kmene Ll pěstovaně v A-prostředí (Tab.3). Aktivita byla sražena 80% síranem amonným a výtěžkem byl surový enzymatický přípravek s 11 jednotkami na ml AF a 0,96 jednotkami na ml xylanázy. Aktivita AF nebyla vázána na karboxyl-methyl celulosu (CMC) avšak adsorbovala se kompletně na DEAE celulosu nebo v DEAE-Sephacel .

Koncentrovaná AF prokázala významnou delignifikační aktivitu (Tab.4). Je třeba zdůraznit, že jsme nezkoumali optimální podmínky při použití AF pro delignifikaci buničiny. Potenciálně užitečná vlastnost AF je ta, že by měla rozložit vazbu blízkou ligninu, čímž by většina hemi-celulosy byla ponechána u celulosních vláken. Tento krok by měl poskytnout vyšší výtěžek delignifi kované buničiny. Kromě toho je zřejmé, že del ignifikační aktivita AF spolu s aktivitou xylanázy T-6 je více než jenom přídavná.

Tabulky 5-7 ukazují nekteré enzymatické vlastnosti vyčištěné AF při použití ΡΝΡ-α-L-Ara jako substrátu. Enzym je nej akti vněj ší mezi pH 6,5 - 8,0 s optimem při pH 7,0. Enzym má nízkou aktivitu při pH 9,0 a 70 θθ. Optimální teplota byla 70 °C jak při pH 7,0 tak při pH 8,0. Enzym byl nejvíce aktivní při 20 mM v 10 mM ve fosfátovém pufru, pH 7,5 a teplotě 70 ®C, avšak ztratil asi 50% své aktivity při 70 ®C během 75 min a byl zcela neaktivní při 80 θθ během 15 min.

Rozšířené pokusy (s buničinou K20)

Extracelulární enzymatické aktivity degradace uhlohydrátů Bacillus stearothermophi1us - Ll.

Specifické extracelulární enzymatické aktivity degradující uhlohydráty byly testovány sledováním růstu v různých prostředích (Tab.8). Buňky byly pěstovány na různých zdrojích uhlíku jako jsou jmenovitě: p-nitrofenyl-β-D-mannopyranosid, p-nitrofenyl-α-D-galaktopyranosid a p-nitrofenyl a-L-arabinopyranosid.

Xylanáza a dvě další endohemicel ul ásy (mannáza a arabinása) byly testovány v 10 mM fosfátového pufru při pH 8,0 a 60 °C v 1 ml celkového zkušebního objemu. Vhodně rozředěný vzorek enzymu (0,1 ml) byl přidán do 0,25 ml substrátu, 0,1 ml 100 mM pufru a 0,55 ml vody. Reakce byla ukončena přenesením do lázně s ledovou vodou. Redukovaný cukr byl zjišťován metodou 3,5-dinitrosalicylové kyseliny jak je popsána Millerem ( Miller, GL, (1959) Anal. Chem 31:426-428). Substráty byly 4% xylan z nekul tivovaného ovsa) 0,4% pryskyřice z locustových zrn - galaktomannan, 4% arabinogal aktan z modřínového dřeva a 4% mannan ze Saccharomyces cerevisiae.

Enzymatické uvolňování ligninu z buničiny z měkkého dřeva bylo zjišťováno přidáním 200 mg vlhké buničiny K-20 (z Korsnas papírny v Gavle, Švédsko) k 3 ml roztoku enzymu, úpravou pH na 8,0 nebo 9,0 koncentrovaným roztokem NaOH a inkubací při 65 θϋ za stálého třepání. Po 2 hod. bylo odebráno 1,5 ml tekutiny a odstředěno při 10.000 x g po dobu 5 min. v minifůze za účelem odstranění zbývajících buničinových vláken. Čistá tekutina (0,5 ml) byla zředěna s 1,0 ml, 0,1 N NaOH k určeni absorbance při 350 nm. Kontrolou pro každý test byla inkubace buničiny za stejných podmínek bez enzymu. Protože 1 mg ligninu na ml vykazoval ^a35Q ⁼ 9,1 a buničina použitá v těchto pokusech měla obsah ligninu 1,3% (Klason, zjištěno podle Z.Zosima) je delta Α_35θ x 3 % obsah uvolněného ligninu = --------------- x 100

Ρ x 0,013 kde P je váha suché buničiny a delta Αβ^θ je absorbance po inkubaci minus absorbance před inkubací. Množství čistého uvolněného ligninu je celková suma minus množství zjištěné za podmínek bez přítomnosti enzymu.

Byly zjištěny dvě důležité aktivity a to xylanázy a α-L-arabinofuranosidázy. Xylanáza byla nalezena při nízké koncentraci kde zdrojem uhlíku v kultivačním mediu byla pryskyřice z locustových zrn (LBG), D-glukosa a L-arabinosa. Xylanázová aktivita byla zvýšena D-xylosou jako zdrojem uhlíku a dosáhla 1,23 U/ml. Mannosa inhibovala tvorbu xylanázové aktivity. Aktivita α-L-arabinofuranosidázy byla nízká, avšak byla významná v prostředí D-xylosy a vysoká v prostředí dosáhl a 1,5 U/ml.

a-D-galaktosi dázy,

L-arabinosy, kde aktivita mannázy

Nebyla zjištěna žádná [3-D-mannosi dázy, nebo α-L-arabi nopyranosi dázy

Čištění α-L-arabinofuranosidázy od Bacillus stearothermophi 1us

Po kultivaci Bacillus stearothermophi 1 us LI po dobu 24 hod při 60 θθ v prostředí obsahující L-arabinosu obsahovala volná extracelulární tekutina bez buněk 1,2 U/ml aktivity α-L-arabinofuranosidázy se specifickou aktivitou 1,7 U/mg (Tab.9). Předběžné experimenty ukázaly, že koncentrace enzymu mohla být realizována srážením saturací 90% síranem amonným. Nicméně byla získána pouze 68% aktivita a žádné podstatné zvýšení specifické aktivity. Proto nebylo srážení síranem amonným použito a surový enzym byl adsorbován přímo na DEAE Sephacel koloně (Tab.9, anionový měnič). Po propláchnutí kolony 10 mM fosforečňan-draselným pufrem při pH 8,0 byla eluce provedena roztokem NaCl s lineárním gradientem od 0,1 do 0,9 M. Aktivita α-L-arabinofuranosidázy se projevila v eluci jako ostrý pík mezi 0,53 a 0,57 M NaCl. Po následném zahuštění a odsolení aktivní frakce pomocí dialýzy proti polyethylenglykolu se specifická aktivita zvýšila 38x se 100% obnovením aktivity. Tento materiál byl přímo přenesen na kolonu s náplní Sephadex G-100. Aktivní materiál byl eluován s jediným ostrým pikem a jevící se molekulovou hmotností 108.000. Celkové vyčištění bylo 59-násobné při výtěžku 80%.

Vyčištěný enzym byl přezkoušen gelovou filtrací na FPLC Superose ve 100 mM fosforečňan-draselněm pufru při pH 7,0 a 100 mM NaCl. Přes 95% aktivity a proteinu bylo eluováno jako jediný ostrý vrchol s jevící se molekulovou hmotnosti 114.800. U SDS PAGE se projevil vyčištěný enzym jako dva pásy s molekulární hmotnosti 57.500 a 52.500. Po odsátí na PVDF membráně a sekvenování na plynovém sekvenceru Applied Biosystem model 475A ukázala analýza těchto pásu dvě N-koncové sekvence SEQ Ident.č.l a SEQ Ident.č.2.

Charakteristika α-L-arabinofuranosidázy Bači 11us stearothermophi1us LI

Při pH 7,0 byl vyčištěný enzym dobu nejméně 80 min, uchoval si inkubaci při 70 θθ po dobu 75 aktivitu po 15 min při 80 °C. opti mál ní aktivity optimál ní aktivitu aktivita zcela stabilní při 60 °C po 50% své maximální aktivity po a ztratil svoji všechnu θθ bylo pro aktivitu 8,0 činily příslušné a 8,0 byla maximál ní Na2S04 se mi n

Při 70 pH 7,0; při pH 6,5 a pH

55% a 50% optimální aktivity. Při pH 7,0 teplota pro aktivitu 70 °C. Enzym prokázal ve 20-50 mM Na2SC>4; při 100 mM a 150 mM snížila o 10% respektive o 50%.

Kinetické parametry enzymu byly změřeny při použití ρΝΡ-α-L-ara-f jako substrátu. Při pH 7,0 a 65 θθ, K_m a V_,_včinily příslušně 2,2 x 10 ^M a 101 μιτιοί /min /mg. Enzym prokázal pouze nízkou aktivitu na substrátu s vysokou molekulární hmotností jako je arabinoxylan a arabinogalaktan.

Del ignifikační aktivita α-L-arabinofuranosidázy Bacillus stearothermophi 1us LI

Během čištění enzymu (Tab.9) byly eluenty z kolony pravidelně zkoumány na delignifikačni aktivitu při použití částečně bělené buničiny jako substrátu. Del ignifikačni aktivita byla spojena a) s vrcholem aktivity α-L-arabinofuranosidázy,

b) s vrcholem aktivity endoxylanázy s nízkou molekulovou hmotností, c) s frakcemi, které obsahovaly spodní veličinu obou aktivit. Protože se nejvyšší specifická delignifikačni aktivita projevovala při přítomnosti obou enzymů, bylo rozhodnuto přezkoumat možnost synergické aktivity α-L-arabinofuranosidázy a předtím vyčištěné tepelně stabilizované xylanázy T6 popsané v přihlášce PCT WO 91/10724.

Tab.10 shrnuje typický pokus, při kterém byla delignifikační aktivita zkoumána s použitím čisté α-L-arabinofuranosidázy, čisté xylanázy a směsi obou dvou enzymů. Při pH 8,0 a 65 θθ po dobu 2 hod bylo ze směsi 38/ml α-L-arabinofuranosidázy a 5 U/ml xylanázy T6 uvolněno čistých 19,2% ligninu z buničiny, přičemž výsledek u každého enzymu působícího samostatně činil pouze 16,5%. K obdržení 16,5% uvolněného čistého ligninu při použití pouze xylanázy T6 za uvedených podmínek bylo třeba 50 U/ml enzymu. Při pH 9,0 a 65 θθ po dobu 2 hod uvolnila směs směs enzymů 18,4% ligninu ve srovnání s pouze 13,3% výsledkem kdy každá aktivita působila odděleně. Je jasné, že oba dva enzymy působily při uvolňování ligninu z buničiny synergicky.

Zjevným paradoxem je, že enzym α-L-arabinofuranosidáza projevil méně jak 1% své optimální aktivity při pH 9,0 při použití modelového substrátu P-nitrofenol α-L-arabinofuranosidázy. Nicméně při biologickém procesu bělení byl enzym téměř stejně účinný při pH 9,0 jako při pH 8,0. Je možné, že buničina určitým způsobem chránila a konzervovala aktivitu enzymu při vyšších hodnotách pH. Tyto výsledky jsou povzbuzující neboť průmyslový delignifikačni proces je snadněji realizovatelný při pH 9,0 a 65 θθ než za nižších hodnot teploty a pH.

Tab. 1

Růstová a delignifikační aktivita kmene LI v různých prostředích

Zdroj uh1 i ku ^a	Růst (^A560>	Del i gni fi kace Cel ková	(%) ^b Čistá
žádný	0,73	7,1	5,1
0,2 LB	1,30	8,8	6,8
0,2 mannosa	1,83	8,0	6,0
0,2 galaktosa	0,84	4,9	2,9
0,2 glukosa	2,62	8,9	6,9
0,2 xylosa	2,04	9,1	7,1
0,2 arabinosa	1,81	10,5	7,6

^Kultivační medium se skládalo ze zdroje uhlíku (0,2%), 0,1% kvasničného extraktu, 0,5% kasaminové kyseliny, a E.solí (0,1% močoviny, 0,02% MgSO₄ . 7H₂0, 5mM KH₂PO₄, pH 9,0, 20 mM Tris HC1, pH 9,0, 0,1% NaCl a standardní směs stopových prvků)

Všechny cukry měly D-konfiguraci s výjimkou L-arabinosy; LB je pryskyřice z locustových zrn.

b)Del ignifikace buničiny K15 byla provedena s extracelulárnim supernatantem (s úpravou pH na 9,0) při 65 θθ, po dobu 2 hod

Tab. 2

Extracelulární enzymatická aktivita kmene LI

Substrát	X medium ^a Akti v.(U/ml)	A-medium Akti v. (U/ml)
xyl an	1,3	0,05
PNP-a-L-AF	0,004	0,5
PNP-a-Gal	< 0,001
PNP-a-Man	< 0,001
PNP-a-AP	< 0,001
LB-GM	< 0,001

Degradační aktivity Xylanu a LB-GM (gal aktomannan z locustových zrn) byly určeny z produkce redukčních cukrů a PNP-X aktivity byly měřeny podle uvolněného PNP (p-ni trofenol).

kRuňky byly kultivovány po dobu 24 hodin buď na X-mediu nebo A-mediu (prostředí xylosy nebo arabinosy popsané v Tab.l) a směs odstředěna za účelem odstranění buněk.

Tab. 3

Předběžné čištění α-L-arabinofuranosidázy z LI vypěstovaného na A-mediu

Frakce	Obj . (mi 1 )	Prótei n	^a AF (U/ml)	Xy1anáza (U/ml)
Surový supernatant	8100	1,11	0,82	0,03
(NH₄)S0₄ ppt	400	13,3	11,0	0,96
DEAE-Sephacel	20	41,1	46,6	0,09

^a Protein určený podle BioRad

Tab 4

Del ignifikace K15 koncentrovanou α-L-arabinofuranosídázou

Enzym	% uvolněného ligninu
Celkem	Či stý
(20 U/ml) ^b	8,6	3,0
Xylanáza T-6 ^c (5 U/ml)	11,3	5,7
AF + xylanáza T-6	16,1	11,5

^a) 10 mM fosfátového pufru, pH 8,0, 65 ^bC 2 hod.

k) Zahuštěno pomocí DEAE-Sepharel chromatografie; obsahuje < 0,1 U/ml xylanázy.

^c) Xylanáza T-6 produkována kmenem NCIMB 40222 popsaným v přihl.PCT WO 91/10724 a schopná delignifi kovat dřevěnou buničinu při pH nejméně 9 a teplotě nejméně 65 °C.

Tab. 5

Vliv teploty na aktivitu AF při pH 7 a 8

Teplota °C	pH 7 AF (U/ml) ^a	pH 8 AF (U/ml) ^b
40	2,1	1,0
50	5,0	2,4
60	8,3	5,2
65	10, 1	7,6
70	10,3	9,6
75	9,9	7,5
80	4,2	1,0
90	0,8	0,3
100	0	0

^a Ve 20 mM Tris pufru

Tab. 6

Vliv koncentrace soli na aktivitu AF

	N3 2S 0^ (mM)	AF (U/ml) ^a
	0		3,1
	20		3,6
	50		3,4
	100		3,0
	150		1.0
^a) V 10 mM fosfátového pufru, pH 7,5, při	70 °C
			Tab. 7
	Stabi1 i ta	aktivity a-	-L-arabinofuranosidázy (AF)
		60 °C	70 °C	80 °C
Reakční	doba	AF ^a	AF ^a	AF ^a
(min)		aktivita	aktivita	aktivita
		(U/ml)	(U/ml)	(U/ml)
2		7,7	6,7	5,0
5		7,5	7,0	-
15		8,4	7,0	0
30		8,4	6,7
45		7,5	5,5
60		7,7	4,2
75		8,0	2,7

^a Ve 20 mM Tris pufru, při pH 7,0

Tab.

Extracelulární enzymatické aktivity LI ^a při degradaci uhlohydrátú

Bacillus stearothermophi 1us

Uhlohydrátové substráty použité pro:

Růst	Akti vi ta enzymu ^b	Typ enzymu	Aktivita (U/ml)
LGB ^C	LBG	mannanáza	<0,01
LGB	xyl an	xy 1 a n á z a	0,136
LGB	ρΝΡ-α-D-gal -p	a-D-galaktosidáza	0,008
D-glukosa	LBG	mannanáza	<0,01
D-glukosa	xyl an	xylanáza	0,319
D-xylosa	xy 1 an	xylanáza	1,25
D-xylosa	LBG	mannanáza	<0,01
X-xylosa	arabi nogalaktan	galaktanáza/arabinosidáza<0,01
D-xylosa	ρΝΡ-α-D-gal-p	a-D-galaktosidáza	<0,001
D-xylosa	ρΝΡ-β-D-man-p	β-D-mannosi daza	<0,001
D-xylosa	pNP-a-L-ara-p	a-L-arabino-pyranosidáza	<0,001
D-xylosa	pNP-a-L-ara-f	a-L-arabino-furanosidáza	0,01
D-mannosa	mannan	mannanáza	<0,01
D-mannosa	xy 1 an	xylanáza	<0,01
D-mannosa	LBG	mannanáza/galaktosidáza	<0,01
D-mannosa	ρΝΡ-β-D-man-p	β-D-mannosi dáza	<0,001
L-Arabi nosa	arabi nogalaktan	α-L-arabinosídáza	<0,01
L-Arabi nosa	xy 1 an	xylanáza	0.11
L-Arabi nosa	pNP-a-L-ara-f	a-L-arabino-furanosidáza	1,5

^a) Buňky byly kultivovány po dobu 24 hod při 60 θΰ a pH 8,0 v E-solích obsahujících 0,1 % kvasničného extraktu, 0,1% kasaminových kyselin a 0,2% zdroje uhlíku.

b) Po době inkubace 24 hod byla kultura odstředěna a extracelulární enzymy degradující karbohydráty testovány jak je uvedeno v popisu přihlášky.

^c) LGB je pryskyřice z lokustových zrn - galaktomannan; pNP je p-ni trofenol

Tab 9

Přehled postupu čištění α-L-arabinofuranosidázy a-L-arabinofuranosidáza

Čistící operace	Obj em (ml)	Prótei n (mg/ml)	(U/ml)	Sp.akti v. (U/mg)	Výtěžek
Surová ^a	1400	0,70	1,21	1,71
Anionový měnič	^b) 4,5	5,8	377	65	100
Gelová filtrace⁰^ 18	0,74	75,6	101	80
^a) 1,4 li tru	kul tury	kmene LI	byl o	při praveno	způsobem
popsaným v	při hlášce	. Kultura	byla odstředěna po	dobu 30

min při 10.000 x g. Supernatantní tekutina byla pak profi 1 trována na 0,8 gm filtru za účelem odstranění zbytků buněk. Tento surový supernatant byl výchozím materiálem pro čistící postup.

^b) Po projití kolonou s náplní DEAE sephacel následovala dialýza proti polyethylenglykolu.

^c) Sephadex G-100

Tab 10

Del ignifikačni aktivita α-L-arabinofuranosidázy a xylanázy T6 na částečně bělené buničině

Enzym ^a^	Del ignifikace (%) &
PH	Celkem	Či stá
žádný enzym		8,0	5,3
žádný enzym		9,0	5,2
α-L-arabi nofuranosi dáza		8,0	7,6	2,3
α-L-arabinofuranosidáza		9,0	7,3	2,1
xylanáza		8,0	19,5	14,2
xy1anáza		9,0	16,8	11,6
α-L-arabinofuranosidáza +	xylanáza	8,0	24,5	19,2
α-L-arabinofuranosidáza +	xylanáza	9,0	24,6	18,4

^a) Byla použita vyčištěná α-L-arabinofuranosidáza (38 jednotek/ml, specifická aktivita 126 U/mg) a xylanáza T6 (5 U/ml, 192 U/mg) Enzymy byly v 10 mM fosfátového pufru.

b) Použité podmínky byly tyto: 10 mM Na2S0₄ a 10 nM (NI^^SC^, 65 θθ při pH 8.0 nebo 9.0

Průmyslová využitelnost

Předmět vynálezu lze s výhodou využít v průmyslu celulosy k při delignifikaci a bělení všech typu dřevní buničiny obsahující lignin zejména u procesů, u kterých není žádoucí apli kace chloru..

SEZNAM SEKVENCÍ

(1)	Všeobecná informace:
(I)	Při hlašovatel:
(A)	Jméno:	Korsnas AB
(B)	Ulice:	neudána
(C)	Město:	Gavl e
(E)	Země:	Švédsko
(F)	PSČ:	S-801 81
(G)	Telefon:	026-151000
(H)	Telefax:	026-195253
(A)	Jméno:	The Technion Research and Development Foundation Ltd
(B)	Ulice:	Technion City
(C)	Město:	Ha i fa
(E)	Země:	Izrael
(F)	PSČ:	neudáno
(A)	Jméno:	Ramot - University Authority for Applied Res.& Ind.Dev.Ltd
(B)	Ulice:	32 H Levanon Street
(C)	Město:	Tel Aviv
(E)	Země:	Izrael
(F)	PSČ:	neudáno

(II) Název vynálezu: Del ignifikační přípravek projevující alfa-L-arabino-furanosidásovou aktivitu, jeho výroba a použití (III) Počet sekvencí: 3

(IV) Forma pro čtení z počítače: (A) Typ nosiče: Floppy disk
(B) Počí tač: (°C) Operační (D) Software:	IBM PC kompatibilní systém: PC-DOS/MS-DOS Patentln Release #1.0, Verse #1.25 (EPO)
(2) INFORMACE	PRO SEQ IDENT.Č.l
(I) Sekvenční	charakteri štika:
(A) Délka:	9 aminokyselin
(B) Typ:	ami nokysel i na
(D) Topologie:	neznámá

(II)	Typ molekuly:	protei n
(III)	Hypotetický:	ne
(V)	Typ fragmentu:	N-koncový
(VI)	Původní zdroj: (A) Organismus:	Bacillus stearothermophi 1us

(XI) Popis sekvence: SEQ Ident.č.l:

Xaa Gin Pro Tyr Arg Xaa Glu Glu Leu 1 5 (2) INFORMACE PRO SEQ IDENT.Č.2 (I) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: neznámá (II) Typ molekuly: protein (III) Hypotetický: ne

Typ fragmentu: N-koncový

Původní zdroj:

(A) Organismus: Bacillus (V) (VI) (XI) Popis sekvence: SEQ Ident Ser Met Lys Lys Ala Thr Met Ile

Glu Ile Asp Lys Arg Ile Tyr 20 stearothermophi 1 us

č.2:

Ile Glu Lys Asp Phe Lys 10

Ile Ala 15 (2) INFORMACE PRO SEQ IDENT.C.3 (I) Sekvenční charakteristika :

(A) Délka:

(B) Typ:

(D) Topologie:

ami nokysel i n ami nokysel i na neznámá (II) Typ molekuly: protein (III) Hypotetický: ne (V) Typ fragmentu: N-koncový (VI) Původní zdroj:

(A) Organismus: Bacillus stearothermophi 1us

(xí)

Popi s

sekvence

: SEQ Ident.

. č . 3 :

AI a

Thr

Lys

AI a

Thr

Met

Ile

Glu

Lys

Asp

Phe

Lys

1

5

10

G1 u

Ile

Asp

Lys

Arg

Ile

Tyr

Gly

Ser

Phe

Ile

G1 u

Hi s

Leu

20

25

30

AI a

Val

Tyr

Gly

Ile

Tyr

G1 u

Pro

Gly

Hi s

Pro

G1 n

AI a

35

40

45

Ile Ala

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY proj evujici e n ý tím, že ve vhodném mediu získaného selekcí z enzymati ckou j e při praví telný kmene

Pří pravěk vyznač fermentací stearothermophi 1us získaného selekcí z kmene NCIMB 40494 a jeho mutantú a variací, který má v podstatě tutéž schopnost produkce uvedeného přípravku jako kmen NCIMB 40494, přičemž enzymatická aktivita přípravku obsahuje podstatnou část aktivity α-L-arabinofuranosidázy se schopností delignifikace dřevní buničiny při pH 8-9 a teplotě 65 θθ.
2. Přípravek podle nároku lvyznačený tím, že sestává z vyčištěné kultury kultivační pudy.
3. Přípravek podle nároku 2 vyznačený tím, že sestává z koncentrovaná frakce kultury kultivační pudy projevující aktivitu α-L-arabinofuranosidázy v prostředí dřevní buničiny.
4. Přípravek podle nároku 3 vyznačený tím, že aktivita α-L-arabinofuranosidázy je odvozena od α-L-arabinofuranosidázy, která je složena ze dvou podjednotek s přibližnou molekulovou hmotností 52 000 Da a 57 500 Da.
5. Přípravek podle některého z nároků 1 až 4 vyznačený tím, že je spojen s přípravkem vykazujícím enzymatickou aktivitu produkovanou jiným mikrobiálním kmenem a se schopností delignifikace dřevní buničiny při teplotě nejméně 65 θθ a pH nejméně 9.

kmenem NCIMB 40222 Bacillus stearothermophi 1us
6. Přípravek podle nároku 5 vyznačený tím, že obsahuje α-L-arabinofuranosidázu produkovanou kmenem NCIMB

40494 Bacillus stearothermophi 1us a xylanázu produkovanou

7. Enzym α-L-arabinofuranosídáza vyzná č u j ící se sekvencí aminokyselin, která obsahuje sekvenci aminokyselin (SEQ Ident.č.l) Met? Gin Pro Tyr Arg Pro? Glu Glu Leu nebo j ej i homolog. N-koncovou dílčí 8) Enzym α-L-arabinofuranosídáza vyzná č u j i c i se sekvencí aminokyselin, která sekvenci aminokyselin (SEQ Ident obsahuj e • č.2) N-koncovou dílčí

Ser Met Lys Lys Ala Thr Met Ile Ile Glu Lys Asp Phe Lys Iie Ala Glu Ile Asp Lys Arg Ile Tyr nebo její homolog.
9. Způsob výroby přípravku projevujícího se enzymatickou aktivitou vyznačený tím, že kmen Bači 11us stearothermophi1us vybraný selekcí z kmene NCIMB 40494 včetně jeho mutantů nebo variant, který má v podstatě stejnou schopnost produkovat přípravek, jako kmen NCIMB 40494, se podrobí aerobní fermentací ve vhodném mediu přičemž v enzymatické aktivitě přípravku zaujímá podstatnou část aktivita α-L-arabinofuranosídázy se schopností del ignifikace dřevní buničiny při pH 8-9 a teplotě 65 ®C.
10. Izolovaný kmen Bacillus stearothermophi1us NCIMB 040494 včetně jeho mutantů a variant, který má v podstatě stejnou schopnost produkce přípravku aktivitu, jako kmen NCIMB enzymatické aktivitě zaujímá projevujícího enzymatickou 40494, přičemž v této podstatnou část aktivita α-L-arabinofuranosídázy se schopností delignifikace dřevní buničiny při pH 8-9 a teplotě 65 °C.

Použití enzymu stearothermoph i 1us buničiny.

produkovaného NCIMB 040494 při kmenem Bacillus zpracování dřevní
12. Způsob obsahující vyznačený tím, nejméně v jedné operaci 1 - 6.

zpracování dřevní buničiny že na dřevní buničinu se působí přípravkem podle jednoho z nároků
13. Způsob podle nároku 12 vyznačený tím, že dřevní buničina je sulfátová buničina.
14. Způsob podle nároku 13 vyznačený tím, že dřevní buničina je částečně delignifi kovaná sulfátová buničina.
15. Způsob podle nároku 13 vyznačený delignifi kovaná sulfátová tím, buničina je částečně kysl i kem delignifi kovaná sulfátová buniči na.
16. Dřevěná buničina zpracována nejméně vyznačená tím, ze byl a jedné operaci přípravkem podle některého z nároků 1 až 6.
17. Sonda DNA nebo RNA rozeznávající nukleotidní sekvenci, která kóduje sekvenci amino kyselin (SEQ Ident.č.l)

Met? Gin Pro Tyr Arg Pro? G1u Glu Leu a/nebo sekvenci aminokyselin (SEQ Ident.č.2)

Ser Met Lys Lys Ala Thr Met Ile Ile Glu Lys Asp Phe Lys Ile Ala Glu Ile Asp Lys Arg Ile Tyr.