FI118010B - Actinomaduran ksylanaasisekvenssit ja käyttömenetelmät - Google Patents

Description

1 118010 1 f

Actinomaduran ksylanaasisekvenssit ja käyttömenetelmät ΐ

Actinomaduraa xylanassekvenser och förfaranden för dess användning

Keksinnön ala on termostabiilit entsyymit ja niiden käyttö. Erityisesti keksinnön ala on korkeassa lämpötilassa aktiiviset ksylanaasit. Keksinnön mukaiset koostumukset ovat käyttökel- ΐ poisia kasvibiomassan ominaisuuksien muuntamiseen, erityisesti ligniinipitoisuuden vähentämiseen. Keksintö kohdistuu myös entsyymivalkaisumenetelmään, jossa käytetään keksinnön mukaisia entsyymikoostumuksia.

Sulfaattimassan valkaisun tarkoituksena on poistaa massasta keiton jälkeen massassa jäljellä oleva jäännösligniini. Tämä . i on perinteisesti tehty käyttämällä klooria sisältäviä kemikaaleja. Huoli ympäristöstä ja kuluttajien vaatimukset ovat herättäneet tarpeen kehittää vaihtoehtoisia valkaisuteknii-koita. '

Ensimmäinen biotekninen lähestymistapa tähän ongelmaan oli käydä käsiksi ligniiniin, suoraan ligniiniä hajottavilla entsyymeillä. Entsymaattisen ligniininhajotuksen kemia näyttää kuitenkin olevan hyvin monimutkaista ja vaikeata säädellä. : • · · • Φ * * · « -!> • ·····* • · · : * ϊ Ligniiniä voidaan hajottaa, käyttämällä ligninaaseja tuottavaa : mikro-organismia sellaisenaan. Käsittelyajat ovat kuitenkin * · * j\·. suhteellisen pitkiä. Käsittelyajat voivat olla esimerkiksi • * :.*. päiviä, ja mikro-organismit tarvitsevat lisäravinteita toimi- • · · .•j·] akseen. Myös muiden, ei-toivottujen mikrobien kontrollointi * * * voi olla vaikeaa. Ligniinihajotuksen käyttö eristetyillä ligni- .. naaseilla tai mikro-organismeilla on runsaan tutkimuksen koh- • · : " teenä. (Katso esimerkiksi Farrell, R.L., et ai., Lignocellu- '· *··.’ losics, 305-315 (1992); Jurasek, L., Lignocellulosics, 317-325 ,¾ ·;· (1992)). ^ • · · · * · · · * * 9 • * · • # Puumassa sisältää selluloosan ja ligniinin lisäksi hemisellu- * · · · · . : loosaa. Toinen lähestymistapa on käydä käsiksi hemiselluloo- * ‘ saan - puun kolmanteen pääaineosaan. Luontaisessa lehtipuussa hemiselluloosa on pääasiassa ksylaania, kun taas havupuussa 2 118010 heitti selluloosa on pääosin glukomannaaneja ja jonkin verran ksylaania. Massan keiton aikana osa ksylaanista liukenee keit-toliemeen. Keittoajan loppuvaiheessa alkalikonsentraation pienentyessä osa liuenneesta ja muuntuneesta ksylaanista saostuu uudelleen takaisin selluloosakuiduksi.

Vuonna 1986 havaittiin, että valkaisemattoman sulfaattimassan esikäsittely ksylanaasilla johtaa vähentyneeseen kemikaalien tarpeeseen valkaisuprosessissa (Viikari, L. , et ai. , Proceedings of the 3rd Int. Conf. on Biotechnology in the Pulp Paper Ind. , Tukholma (1986), s. 67-69). Sulf aattimassan ksylanaasi-esikäsittely hydrolysoi osittain sulfaattimassassa olevaa ksylaania. Tämä tekee massan rakenteesta huokoisempaa ja mahdollistaa tehokkaamman ligniini fragmenttien poiston myöhemmissä valkaisu- ja uuttovaiheissa. Useissa laboratorioissa selostettiin myöhemmin ksylanaasiesikäsittelyn olevan hyödyllinen yhdessä sellaisten peräkkäisten valkaisujaksojen kanssa, jotka koostuvat aineista Cla, CIO», HaOa, Oa ja 03. Katso katsaukset artikkeleissa Viikari, L. , et ai., FEMS Microbiol. Rev. 13: (1994, painossa); Viikari, L. , et ai., teoksessa: Saddler, J. N. , toim. , Bioconversion of Forest and Agricultural * · · V * Plant Residues, C-A-B International (1993), s. 131-182; Grant, • R. , Pulp and Paper Int. (Syyskuu 1993), s. 56-57; Senior & i l": Hamilton, J. Pulp & Paper. 111-114 (syyskuu 1992); Bajpai & ·*·': Bajpai, Process Biochem. 27: 319-325 (1992); Onysko, A., Bio- ; tech. Adv. 11: 179-198 (1993);' ja Viikari, L. , et ai., J.

Paper and Timber 73: 384-389 (1991).

Tällaisen ksylanaasikäsittelyn jälkeen massan paremman valkais-tavuuden suorana seurauksena on myöhempien valkaisukemikaalien kulutuksen väheneminen, mikä kloridia sisältäviä kemikaaleja • * · käytettäessä johtaa ympäristön kannalta ei-toivottujen orgaa- • e · *.* ~ nisten klooriyhdisteiden vähentyneeseen muodostumiseen. Ksyla-♦ · i'·" naasikäsittelyn jälkeen massan paremman valkaistavuuden suo-.··♦. rana seurauksena on myös mahdollisuus valmistaa tuote, jolla ·’· on sellainen lopullinen valkoisuusaste, mikä vai koi s uus as te * · muutoin olisi vaikea aikaansaada (kuten esimerkiksi kokonaan « : V kloorivapaassa (TCP) peroksidi valkaisussa. Ksylanaasientsyy- i ; 3 118010 min substraattispesifisyyden vuoksi selluloosakuidut eivät vahingoitu, ja tuotteen lujuusominaisuudet ovat reilusti hyväksyttävien rajojen sisäpuolella.

Asia ei kuitenkaan ole niin yksinkertainen kuin pelkästään ksylanaasikäsittelyvaiheen lisääminen. Useimmat massanvalkai-suun suunnitellut kaupalliset ksylanaasit eivät ole erityisen lämmönkestäviä, erityisesti käytettäessä neutraaleja tai emäksisiä pH-olosuhteita. Käytännössä ksylanaasit ovat tavallisesti tehottomia tai inaktiivisia lämpötiloissa, jotka ovat korkeampia kuin 60 ' C.

Ksylanaasien kloonaus on selostettu Actinomadura sp. FC7: stä (Ethier, J. -F. et ai. , teoksessa: Industrial Microorganisms:

Basic and Applied Molecular Genetics, R. Baltz, et ai., toim.

(Proc. 5th ASM Conf. Gen. Mol. Biol. Indust. Microorg. , 11-15.

lokakuuta, 1992, Bloomington, Indiana, posteri C25); bakteereista (esim. Ghangas, G. S. , et ai., J. Bacteriol. 171: 2963- 2969 (1989); Lin, L.-L. , Thomson, J. A. , Mol. Gen. Genet. 228: 55-61 (1991); Shareck, F., et ai.. Gene 107: 75-82 (1991); Scheirlinck, T. , et ai., Appi. Microbiol. Biotechnol. 33: :

»M

* 534-541 (1990); Whitehead, T. R. , Lee, D. A. , Curr. Microbiol.

* * * ; V 23: 15-19 ( 1991); ja sienistä (Boucher, F. et ai., Nucleic

Acids Res. 16: 9874 (1988); Ito, K. et ai., Biosci. Biotec.

Γ**: Biochem. 56: 906-912 (1992); Maat, J. et ai., teoksessa Vis- v * : ser, J. et ai., toim., Xylans and Xylanases (Elsevier Science,

«· I

Amsterdam), s. 349-360 (1992); van den Broeck, H. et ai., EP • « ' 463, 706 AI ( 1992), WO 93/25671 ja WO 93/25693). Eräät tutkijat ovat ehdottaneet, että entinen suku Actinomadura tulisi jakaa kahteen sukuun, Actinomadura ja Microtetraspora, joista jälkimmäinen sisältää esim. entisen A. flexuosan (Kroppenstedt, et ϊ·ί : ai., System. Appi. Microbiol, 13: 148-160 (1990).

• * · • * * * i • « J*.t> Thermomonospora /usea-lajin tiedetään tuottavan termostabii- .···. leja ja alkalistabiileja ksylanaaseja (EP 473, 545, Sandoz).

• « • · · • « Hemiselluloosaa hydrolysoivien entsyymien käyttö eri valkai- * ‘ suj ärj estelmissä kuvataan patenteissa WQ 89/08738, EP 383, 999, : V WO 91/02791, EP 395, 792, EP 386, 888, EP 473, 545, EP 489, 104 ja 4 118010 WO 91/05908. Hemisellulolyyttisten entsyymien käyttö parannettuun vedenpoistoon mekaanisesta massasta kuvataan patenteissa EP 262,040, EP 334, 739 ja EP 351, 655 sekä DE 4,000, 558. Biomassan hydrolyysissä nestemäisiksi polttoaineiksi tai kemikaaleiksi on korkean saannon saamiseksi olennaista muuntaa sekä selluloosa että hemiselluloosa (Viikari et ai., " Hemicellulases for Industrial Applications," teoksessa: Bioconversion of Forest and Agricultural Wastes, Saddler, J. , toim. , CAB International, USA ( 1993)). Myös rehuteollisuudessa esiintyy tarvetta käyttää sopivia entsyymiaktiivisuuksien yhdistelmiä runsaasti β-glukaania ja hemiselluloosaa sisältävän substraatin hajottamiseen.

Emäksisessä pH:ssa aktiivinen ksylanaasi vähentäisi massan happamaksi tekemisen tarvetta ennen ksylanaasikäsittelyä.

Lisäksi monien nykyaikaisten massan keitto- ja valkaisuprosessien lämpötilat ovat suhteellisen korkeita, paljon korkeammat kuin 50 *C, mikä on sopiva lämpötila monille kaupallisille valkaisuentsyymeille. Näin ollen tarvitaan sellaisia puumassan valkaisuprosesseihin sopivia termostabiileja ksylanaasivalmis -teitä, jotka ovat stabiileja emäksisissä pH-arvoissa.

*♦ · * » t * · « j ' Kuvassa 1 esitetään pH: n vaikutus A. flexuosan (DSM43186) : ksylanaasi akti i visuuteen (vil j elysupernatantti). : • · * • · • « i ·’·'· • « : Kuvissa 2, 2A ja 2B esitetään lämpötilan vaikutus A. flexuosan • · · i i a » (DSM43186) ksylanaasiaktiivisuuteen (viljelyssä saatu super- « * < natantti). Jokaisessa kuvassa neljä pylvästä kussakin ajankohdassa tarkoittavat vastaavasti vasemmalta oikealle pH-ar-voj a pH 7, pH 8, pH 9 j a pH 9, 5.

• * ί.; - Kuvassa 3 esitetään A. flexuosan (DSM43186) ksylanaasien DEAE 1 • * * ·; .i ·.· Sepharose CL-6B-kromatografian eluutiokäyrä.

Λ « »· • • * i

Kuvassa 4 esitetään kuvan 3 DEAE: n pooli I: n Phenyl Sepharose * « *Γ. CL-4B-kromatografian eluutiokäyrä. Osoitetaan fraktiot, jotka yhdistettiin näytteen DEPS 1/1 saamiseksi.

• * * • · » • · • ♦ ' 5 118010

Kuvassa 4A esitetään kuvan 3 DEAE: n pooli II:n Phenyl Sepha-rose CL-4B-kromatografian eluutiokäyrä. Esitetään fraktiot, ? jotka yhdistettiin näytteiden DEPS II/l ja DEPS II/2 saarni- ,, seksi.

Kuvassa 4B esitetään kuvan 3 DEAE: n pooli III: n Phenyl Sepha-rose CL-4B-kromatografian eluutiokäyrä. Esitetään fraktiot, jotka yhdistettiin näytteiden DEPS III/l ja DEPS III/2 saamiseksi.

Kuvassa 5 esitetään eri kromatografiapoolien Coomassie Brilliant Blue-proteiinivärjäyskuvio. Kaksi vasemmanpuoleisinta kaistaa: molekyylipainomarkkerit; kaista 1: kasvualusta; kaista 2: DEPS (pooli 1/1); kaistat 3 ja 4: DEPS (poolit II/l ja vastaavasti II/2); kaista 5: tyhjä; kaistat 6 ja 7: DEPS (poolit III/l ja vastaavasti III/2); kaista 8: tyhjä. DEPS: ku vassa 3 esitetyn DEAE-kromatografian jälkeen saadut fraktiot ja kuvassa 4 esitetyn Phenyl Sepharose-kromatografian jälkeen saadut fraktiot. : :

Kuvassa 5A esitetään kuvassa 5 värjättyjen eri kromatografia-V ‘ poolien Western blot-analyysi. Toteamiseen käytettiin T. fus~ M · ; V can TfxA-ksylanaasia vastaan muodostettua polyklonaalista i.·/ antiseerumia. Vasemmanpuoleisin kaista: molekyylipainomark- ·’**; kerit; kaista 1: kasvualusta (medium); kaista 2: DEPS (pooli ψ t • ·*; 1/1); kaistat 3 ja 4: DEPS (poolit II/l ja vastaavasti II/2); t·* i kaista 5: tyhjä; kaistat 6 ja 7: DEPS (poolit III/l ja vastaavasti III/2); kaista 8: tyhjä. DEPS: kuvassa 3 esitetyn DEAE- ^ kromatografian jälkeen saadut fraktiot ja kuvassa 4 esitetyn ; 1. '"'t

Phenyl Sepharose-kromatografian jälkeen saadut fraktiot. ^ • * « I i ♦· Kuvassa 6 esitetään DEAE-läpivirtausmenetelmän läpäisseen *.· permeaatin Phenyl Sepharose FF-kromatografiän eluutiokäyrää.

Osoitetaan putket, jotka yhdistettiin näytteiden PF1 ja PF2 .··· saamiseksi.

• * • · · • · • · · ·

Kuvassa 6A esitetään DEAE-läpivirtausmenetelmässä saadun kon- ·« * : V sentraatin Phenyl Sepharose FF-kromatografian eluutiokäyrää.

118010 6 ;; t

Osoitetaan putket, jotka yhdistettiin näytteiden KF1, KF2 ja KF3 saamiseksi.

Kuvassa 7 esitetään eri kromatografiapoolien Coomassie Blue-proteiinivärjäyskuvio. Lyhenteet ovat kuten kuvissa 6 ja 6A. Vasemmanpuolimmaiset ja oikeanpuolimmaiset kaistat: molekyyli-painomarkkerit; kaista 1: kasvualusta (medium); kaista 2: PF1; kaista 3: PF2; kaista 4: KF1; kaista 5: KF2; kaista 6: KF3.

Kuvassa 7A esitetään kuvassa 7 proteiinivärjättyjen eri kromatografiapoolien Western blot-analyysi. Toteamiseen käytettiin T. fuscan TfxA-ksylanaasia vastaan muodostettua polyklonaalista antiseerumia. Lyhenteet ovat kuten kuvissa 6 ja 6A. Vasemmanpuolimmaiset ja oikeanpuolimmaiset kaistat: molekyylipaino- markkerit; kaista 1: kasvualusta (medium); kaista 2: PF1; : kaista 3: PF2; kaista 4: KF1; kaista 5: KF2; kaista 6: KF3.

Kuvassa 8 esitetään BSA: n vaikutus 35 kDa: n ksylanaasin ter- mostabiilisuuteen, Umpinaiset neliöt: ei BSA: ta; avoimet neliöt: BSA: n kanssa.

a· · !t! r Kuvassa 9 esitetään BSA: n vaikutus 50 kDa: n ksylanaasin ter- Γ**- mostabiilisuuteen. Umpinaiset neliöt: ei BSA: ta; avoimet ne- • · • ·*· liöt: BSA: n kanssa.

· * i • * " J**' • t»t Kuva 10 koostuu kuvista 10A-10C.

• # * • la i » · • * • t ’ Kuvassa 10A esitetään pH: n vaikutus 35 kDa: n ksylanaasin ak tiivisuuteen 80 *C:ssa.

Kuvassa 10B esitetään pH: n vaikutus 50 kDa: n ksylanaasin ak- • * tiivisuuteen 60 ’ C: ssa, (umpinaiset neliöt), 70 *C:ssa (avoi- !,! met neliöt) ja 80 'C:ssa (umpinaiset ympyrät).

4 • * • · • · *... Kuvassa 10C esitetään pH: n vaikutus 35 kDa: n ksylanaasin (um-pinaiset neliöt) ja 50 kDa: n ksylanaasin (avoimet neliöt) "ί" aktiivisuuteen 60 'C:ssa 60 minuutin inkubaatioilla.

·· * • · * • » • · 118010 7

Kuvassa 11 esitetään lämpötilan vaikutus 35 kDa: n ksylanaasin (umpinaiset neliöt) ja 50 kDa: n ksylanaasin (avoimet neliöt) aktiivisuuteen pH-arvossa 7 60 minuutin inkubaatioilla.

Kuvassa 12 esitetään plasmidin pALK185 (4470 bp) kartta.

Kuvassa 13 esitetään Actinomadura sp. DSM43186:n 35 kDa: n ksylanaasin 1375 emäsparin DNA-sekvenssi ja aminohapposekvenssi.

Kuvassa 14 esitetään Actinomadura sp. DSM43186: n 50 kDa: n ksylanaasin 1864 emäsparin DNA-sekvenssi ja aminohapposekvenssi.

Kuvassa 15 esitetään homologiavertailu aminohappotasolla 1864 emäparin insertistä johdetun AM50-peptidin ja Actinomadura sp.

FC7: n ksylanaasi II: n (talletusnumero U08894) geenin välillä. Kuva esittää sen, että 434 päällekkäisellä aminohapolla oli 70, 7 %: n identtisyys.

Kuvassa 15A esitetään homologiavertailu aminohappotasolla 1864 ··· V ! emäsparin insertistä johdetun AM50-peptidin ja Streptomyces te · | *,: lividansin ksylanaasi A: n (xlnA) geenin (talletusnumero : .·*' M64551 ) välillä. Kuva esittää sen, että 489 päällekkäisellä aa· I’»*: aminohapolla oli 70, 3 %: n identtisyys.

· e · * • * <* • e ?

Plasmidit pALK923, pALK938, pALK939, pALK940, pALK941 ja pALK

• ·

1056 talletettiin talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Saksa ja niille annettiin vastaavasti talletusnumerot DSM 9322, DSM 9899, DSM 9900, DSM 9901, DSM

• e !.! 9902 ja DSM 9903. pALK 923 talletettiin 29. heinäkuuta, 1994, • · a V ja pALK 938-941 sekä pALK1056 talletettiin 3. huhtikuuta, i\ ’ 1995.

• ♦ • aa· a *”· Plasmidit pALK927 ja pALK928 (jotka antoivat positiivisen '·"* signaalin S. lividans xlnA-oligomeerikoettimen kanssa ja sisäl- • a t • sivät Actinomaduran 50 kDa: n ksylanaasin geenin) talletettiin : 8 118010 DSM: ssä 27. syyskuuta, 1994, ja niille annettiin talletusnu-merot DSM 9447 ja vastaavasti DSM 9448.

Seuraavassa kuvauksessa käytetään laajalti useita yhdistelmä-DNA-tekniikassa käytettyjä termejä. Seuraavat määritelmät annetaan selityksen ja patenttivaatimusten ymmärtämisen selventämiseksi ja johdonmukaistamiseksi, mukaan lukien ne puitteet, joissa termiä käytetään.

Ksylanaasi. Tässä käytettynä ksylanaasi on hemisellulaasi, joka pilkkoo ksylaanin ksyloosiketjussa olevia 0-1,4-sidoksia (ksylaani on toisiinsa 0-1,4-sidoksin liittyneiden D-ksyloosi-tähteiden polymeeri). Ksylanaasiaktiivisuus tarkoittaa samaa kuin ksylanolyyttinen aktiivisuus.

..¾

Aminohapposekvenssillä, joka on spesifisen aminohapposekvenssin "ekvivalentti", tarkoitetaan aminohapposekvenssiä, joka ei ole identtinen spesifisen aminohapposekvenssin kanssa, mutta joka pikemminkin sisältää ainakin joitakin aminohappomuutoksia (deleetioita, substituutioita, inversioita, insertioita, ym. ), jotka eivät olennaisesti vaikuta proteiinin biologiseen ak- *·· ' tiivisuuteen verrattuna spesifisen aminohapposekvenssin vas- taavaan aktiivisuuteen kun aminohapposekvenssiä käytetään . .*· haluttuun tarkoitukseen. "Ekvivalentti" aminohapposekvenssi on :*,· edullisesti vähintään 85-99 %: sesti homologinen aminohappo- • · • ,· tasolla spesifiseen aminohapposekvenssiin nähden, edullisimmin » t t vähintään 90 %:sesti ja erityisen edullisessa suoritustavassa • « * vähintään 95 %:sesti homologinen aminohappotasolla.

Keksinnön mukaisen ksylanaasin aminohapposekvenssin "biologisella" aktiivisuudella tarkoitetaan sellaisen aminohapposek- e e ·,· venssin entsymaattista, funktionaalista (kuten esimerkiksi :Ί erityssignaalia tai spesifisen domeenin sekvenssiä) tai immuno- ' logista aktiivisuutta.

• · · t • V. Isännällä, joka on "olennaisilta osiltaan kykenemätön" synteti-soimaan yhtä tai useampaa entsyymiä, tarkoitetaan isäntää, | 'jossa yhden tai useamman luetellun entsyymin aktiivisuus on f ' ! :9 118010 heikentynyt, vajavainen tai puuttuva villityyppiin verrattuna.

Entsyymivalmiste. "Entsyymivalmisteella" tarkoitetaan koostumusta, joka sisältää entsyymejä, jotka on uutettu (joko osittain tai kokonaan puhdistettu) mikrobista tai sellaisen mikrobin kasvatukseen käytetystä kasvualustasta. "Uutettu" tarkoittaa mitä tahansa menetelmää, jolla halutut entsyymit erotetaan solumassasta, ja siihen sisältyy solujen rikkominen ja myös pelkästään käytettyjen solujen poistamista kasvualustasta. Tämän vuoksi termi "entsyymivalmiste" käsittää koostumukset, jotka sisältävät kasvualustaa, jota on ensin käytetty halut(t)u(je)n mikrobi(e)n viljelyyn ja mitä tahansa entsyymejä, joita mikrobi(t) ovat erittäneet kyseiseen kasvualustaan viljelyn aikana.

Biovalkaisu. "Biovalkaisulla" tarkoitetaan ligniinin uuttamista selluloosamassasta sen jälkeen, kun hemiselluloosaa hajottavat entsyymit ovat vaikuttaneet ligniiniä hajottavien

• .J

entsyymien kanssa tai ilman niitä. Hemiselluloosat voivat ' rajoittaa ligniinin poistamista joko fysikaalisesti (saostumalla uudelleen kuidun pintaan keiton aikana) tai kemialli- ··· V : sesti (ligniini-hiilihydraattikomplekseilla). Hemisellulaasi- e · · : *t aktiivisuus hajottaa osittain hemiselluloosaa, mikä voimistaa % j ;* ligniinien uutettavuutta tavanomaisilla valkaisukemikaaleilla > ·» (kuten kloorilla, kloori di oksi di 11 a, peroksidilla, jne. ) (Vii- e « ; kari et ai., "Bleaching with’ Enzymes" teoksessa Biotechnology ,·,· in the Pulp and Paper Industry, Proc. 3rd Int. Conf. , Tukhol- • » ma, s.67-69 (1986); Viikari et al., "Applications of Enzymes in Bleaching" teoksessa Proc. 4th Int. Symp. Wood and Pulping

Chemistry, Pariisi, Voi. 1, s. 151-154 ( 1987); Kantelinen et ai., "Hemicellulases and their Potential Role in Bleaching" Ϊ.: teoksessa International Pulp Bleaching Conference, Tappi Pro- *.· ceedings, s. 1-9 (1988)). Tämän parantuneen valkaistavuuden · • · j·. etuna on alempi valkaisukemikaalien kulutus ja pienempi ympä- .··* ristökuormitus tai paremmat lopulliset vai koi s uus arvot.

ψ ·*· « · ♦ · · - • " Homologinen. Entsyymillä, joka on "homologinen" keksinnön • · · ; *. mukaisen isännän suhteen, tarkoitetaan sitä, että isäntälajina 118010 ίο § olevan saman lajin transformoimaton kanta luontaisesti tuottaa jonkin verran natiivia proteiinia; keksinnön mukaisen isännän suhteen "homologisella" geenillä tarkoitetaan geeniä, jota esiintyy isäntälajina olevan saman lajin transformoimattoman kannan genomissa. Entsyymillä, joka on "heterologinen" keksinnön mukaisen isännän suhteen, tarkoitetaan sitä, että isäntälajina olevan saman lajin transformoimaton kanta ei luontaisesti tuota natiivia proteiinia; keksinnön mukaisen isännän suhteen "heterologisella" geenillä tarkoitetaan geeniä, jota ei esiinny isäntälajina olevan saman lajin transformoimattoman kannan genomissa.

Kloonausväline. Plasmidi- tai faagi-DNA tai muu DNA- sekvenssi (kuten esimerkiksi lineaarinen DNA), joka tarjoaa sopivan nukleiinihappoympäristön halutun geenin siirtämiseksi isäntä-solun sisälle. Keksinnön mukaiset kloonausvälineet voidaan suunnitella replikoitumaan itsenäisesti prokaryootti- ja euka-ryootti-isännissä. Sieni-isännissä, kuten Trichodermassa, kloonausvälineet eivät tavallisesti replikoidu itsenäisesti, vaan sen sijaan ne tarjoavat ainoastaan välineen halutun gee-nin siirtämiseksi Trichoderma-isäntään josta se insertoituu • f *·1 Trichoderman genomiin. Kloonaus välineelle voidaan lisäksi • 1 · : karakterisoida yhdellä tai muutamalla endonukleaasin tunnistus- * kohdalla, jossa sellaiset DNA-sekvenssit voidaan pilkkoa mää- • ritettävälla tavalla ilman että väline menettää olennaisen bio- ; **: logisen funktionsa, ja johon DNA: ta voidaan liittää mainitun • · · .·.1 DNA: n replikaation ja kloonauksen aikaansaamiseksi. Kloonaus- väline voi lisäksi sisältää markkerin, joka sopii käytettä- : vaksi kloonausvälineellä transformoitujen solujen tunnistamiseksi. Markkerit ovat esimerkiksi antibioottiresistenssi. :

Vaihtoehtoisesti sellaiset markkerit voidaan siirtää kloonaus- = • 1 ' *’1, välineellä, joka on eri kuin se, joka siirtää halutun geenin.

• » *** t Sanaa "vektori" käytetään joskus " kloonaus välineen" asemesta.

M • 1 e e ·1" Ilmentymisväline. Väline tai vektori, joka on samanlainen kuin ♦ · · ** kloonausväline, mutta joka pystyy ilmentämään halutun geenin *··' haluttuun isäntään transformoinen jälkeen.

• e ·> J

• 9 » 9 118010 η ; . f

Sieni-isäntää käytettäessä haluttu geeni siirretään edullisesti sieni-isännälle osana kloonaus- tai ilmentymisvälinettä, joka integroituu sienen kromosomiin. Kloonausvälineestä tai ilmentymisvälineestä peräisin olevat sekvenssit voidaan myös integroida halutun geenin kanssa integraatioprosessin aikana. Esimerkiksi T. Teeseissä haluttu geeni voidaan ohjata cbhl-lokukseen.

Haluttu geeni voidaan edullisesti asettaa vektorissa (joka integroituu halutun geenin kanssa) tarjoamien tiettyjen sää- Ί telysekvenssien, kuten esimerkiksi promoottorisekvenssien, säätelyn alaisuuteen (so. kytketään niihin toiminnallisesti). Haluttaessa isännän kromosomi voi tarjota sellaiset säätely-sekvenssit insertiolokuksessaan.

j · .$

Ilmentymisvektorilla olevat ilmentymisen säätelysekvenssit vaihtelevat riippuen siitä, onko vektori suunniteltu ilmentämään tietyn geenin prokaryootti- tai eukaryootti-isännässä (esimerkiksi sukkulavektori voi toimia bakteeri-isännissä, ja se voi lisäksi sisältää transkriptioon liittyviä osasia, kuten vahvistaj aosasia, terminaatiosekvenssej ä ja/tai translaation initiaatio- ja terminaatiokohtia.

f « * ' ' * * * • · * I. Actinomadura flexuoean ksylanaasien tunnistaminen ja eris- • * ; * täminen • · * * · • * · · * "·* ‘ Actinomadura flexuosasta on tunnistettu, puhdistettu ja kloo nattu kaksi ksylanaasia. Molemmilla näistä ksylanaaseista on sellainen pH-optimi ja termostabiilisuus, joka on haluttu puumassan entsyymivalkaisussa. Näistä ksylanaaseista toisen : molekyylipa!no on noin 35 kDa (AM35) ja toisen molekyylipaino :’·’· on noin 50 kDa (AM50).

i · • · *... Optimi lämpötila-alue Actinomadura flexuosan ksylanaaseille on ’•/I puhdistamattomissa valmisteissa 70-80 ‘C pH-arvossa 6-7. Tämän *:·*: ksylanaasivalmisteen optimilämpötila-alue pH-arvossa 8 on 60-70 * C. Sulfaattimassan valkaisussa tämä on hyödyllistä, koska sellun keiton jälkeen massan pH on emäksinen.

12 ' 118010

Puhdistetuissa valmisteissa AM35 säilyttää 80 % aktiivisuudestaan ja AM50 säilyttää 90 % aktiivisuudestaan 24 tunnin jälkeen inkuboitaessa BSA: n läsnäollessa. Lämpötilassa 80 *C sekä AM35 että AM50 ovat aktiivisimmillaan pH-arvossa 6, mutta molemmilla on pH 5: n ja pH 7: n välillä laaja aktiivisuusta-sanne, jossa noin 80 % aktiivisuudesta on säilynyt.

AM35 ja AM50 voidaan eristää preparaatista/ joka on saatavissa Actinomadura flexuosa-isännästä/ jonka talletusnumero on DSM-43186 ja joka on saatavissa talletuslaitoksesta Deutsche Samm-lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Saksa. Molemmat ksylanaasimuodot voidaan puhdistaa ajamalla ne kromatografiapylvässarjojen läpi. Ensimmäinen puhdistusvaihe DEAE Sepharose CL-4B: llä pidättää noin puolet ksylanaasiaktiivisuudesta silloin, kun näyte lisätään pH-alueella 8, 6-9 12, 5 mM NaaHPCu: ssä; toinen puoli havaitaan läpivirtausnesteessä.

Sitoutuneen ksylanaasiaktiivisuuden eluointi suolagradientilla :T; antaa terävän, ensin eluoi tuvan aktii visuus piikin ja leveän, ·’·*: myöhemmin eluoituvan aktii visuus piikin. Terävä, aikaisemmin • . eluoituva piikki säilyttää homogeenisuutensa, kun sille teh- • * · dään Phenyl Sepharose CL-4B~kromatografia. Myöhemmästä, le- • · . veästä aktiivisuuspiikistä otetut näytteet erottuvat vähintään • · · kahdeksi piikiksi, kun niille' tehdään Phenyl Sepharose CL-4B- • * * t · » * kromatografia. Nämä myöhemmin eluoituvat ksylanaasit . risti-reagoivat vain heikosti Thermomonospora fuscan ksylanaasia vastaan valmistetun polyklonaalisen vasta-aineen kanssa.

• · ·.· ! SDS-PAGE: 11a määritettynä DEAE-pidättymästä saaduissa pooleis- ;T: sa ksylanaasin molekyyli paino oli noin 50 kDa, kun taas DEAE- ./ * läpivirtauksessa ksylanaasien molekyylipainot olivat 30, 35, • · · *... 40 ja 50 kDa. Actinomadura flexuosa sisältää näin ollen kolme • · *;** tai neljä ksylanaasiproteiinivyöhykettä.

• * · · · « · ·*· · • · · • ♦ • * 118010 13 II. Ksylanaasin biovalkaisu käyttäen Actlnomadura flexuoaan , ksylanaasej a

Keksintö koskee menetelmää kasvibiomassan kemialliseksi käsittelemiseksi tunnin ajan olosuhteissa, joissa on korkea, 50-80 ' C: n lämpötila ja pH 5-8, erityisesti 60-70 * C: n lämpötila ja pH 6-7, edullisimmin 60 ' C: n lämpötila ja pH 6,5. Edullisessa suoritustavassa kasvihlomassa biovalkaistaan ksylanaaseilla, jotka pystyvät hydrolysoimaan ksylaaniketjua puumassassa neut- : raalissa tai kohtalaisen emäksisessä pH: ssa ja korkeassa lämpötilassa (60 * C).

Puumassa on yhdistelmämateriaali, joka koostuu pääasiassa selluloosa-, hemiselluloosa- ja ligniinimatriisista. Tavallinen puumassan tuotantomenetelmä on kemiallinen massanvalmistus ? (pulping). Eräs tyypillinen kemiallisen massanvalmistuksen tapa on emäksinen sulfaattikeitto, niin kutsuttu sellunkeitto. Prosessiolosuhteissa (korkeat lämpötilat ja korkea emäksisyys) keittokemikaalit uuttavat ligniinin eroon massasta. Kaikki ligniini ei kuitenkaan poistu keiton aikana, vaan osa siitä :*·*; (noin 5 %) jää massaan. Tämä jäännösligniini on poistettava, :·.*. jotta massa saadaan paperintuotantoon sopivaksi.

• * \ • · * · '

Ligniinin poistamiseksi on kehitetty monia menetelmiä. Tyypil- I ' lisesti puumassa käsitellään kloorilla tai muilla myrkylli- • · * **·/ sillä kemikaaleilla ligniiniosan poistamiseksi ja valkaistun • * massan saamiseksi. Kemikaalikäsittelyn myrkyllisillä sivutuotteilla on kuitenkin negatiivinen vaikutus sen ympäristön ter-veyteen ja stabiilisuuteen, johon ne vapautetaan. Näin ollen on suuri tarve kehittää vaihtoehtoisia, enemmän ympäristöä i, • :*: suojelevia tekniikoita massan valkaisun suorittamiseksi. Kei- ·· tetyn massan käsittely entsyymeillä, jotka hajottavat massassa * hemiselluloosakomponentin, esim. ksylaanin, muuntaa massaa • * niin, että ligniinin poistettavuus helpottuu. Tämä johtaa • * *·;·* parantuneeseen valkaistavuuteen, mikä puolestaan on edullista, ·;··; koska siitä seuraa alhaisempi vai kai s ukemi kaali kulutus ja pienempi ympäristökuormitus ja/tai korkeampi lopullinen valkoi- • · suusaste. ; 118010 ; 14 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä kehitetään biovalkai-sumenetelmä, jonka avulla voidaan käyttää termostabiileja ja neutraaleja ksylanaaseja sellaisissa olosuhteissa, että tarve säätää pH:ta ja lämpötilaa keittovaiheen jälkeen vähenee tai eliminoituu. Keksinnön mukaiset prosessointiolosuhteet voivat lisäksi vaikuttaa vähentämällä sellulaasiaktiivisuutta entsyymi valmisteessa tai kasvualustassa.

Edullisessa suoritustavassa keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan puumassassa in vitro. Menetelmään kuuluu entsyymi-valmisteen, kasvualustan tai ksylanaasia sisältävän konsentroidun seoksen saattaminen kosketukseen puumassan kanssa. Rutiini-laskutoimitukset tekevät alan asiantuntijoille mahdolliseksi optimikäsittelyajan määrittämisen riippuen halutusta tuloksesta, käytetyn ksylanaasientsyymin konsentraatiosta ja spesifisestä aktiivisuudesta, käytetyn massan tyypistä ja konsentraatiosta, happaman keittoliemen pHrsta ja lämpötilasta sekä muista parametrimuuttujista.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää yksin tai lisänä muihin käsittelyihin, jotka vähentävät puumassan ligniinipitoi-suutta, parantavat sen vedenpoistokykyä ja/tai alentavat sen • · · . vedensitomiskykyä. Edullisessa suoritustavassa keksintöä käy- * · « • ·' tetään vahvistamaan puumassan valkoisuusominaisuuksia kemial- • · * *·ί·* listen massojen käsittelyllä, so. niiden massojen, jotka si- • · · : ".· sältävät kemiallisella käsittelyllä kemiallisesti muunnettua • · : ligniiniä.

• · · ··· • * ·

Edullisessa suoritustavassa keksinnön mukaisissa menetelmissä ίί j*.<4 käytetyt ksylanaasit ovat edullisesti Actinomadura flexuosan * ,···, ksylanaaseja, ja erityisesti Actinomadura flexuosan 3 5 kDa: n • · • ja/tai 50 kDa:n ksylanaaseja. Erityisesti kasvualustat, jotka • * · * · ’ ' sisältävät yhdistelmäisäntien kasvatuksen seurauksena * * * eritettyjä entsyymejä, ovat edullisia keksinnön mukaisissa ! .*. menetelmissä, joka yhdistelmäisäntä on saatu transformoimalla * * * · .·. : Trichoderma reesei-isäntäsolu keksinnön mukaisia Actinomadura • * · flexuosan 35 kDa ja/tai 50 kDa ksylanaasia koodaavilla geeneillä.

: 118010 :1 15 III. Keksinnön mukaisten isäntien geenimuokkaus # '·.···£

Menetelmää keksinnön mukaisten isäntien geneettiseksi muokkaamiseksi mahdollistetaan kloonaamalla halutut ksylanaasiaktiivi-suutta koodaavat geenisekvenssit ja ilmentämällä sellaiset geenisekvenssit. Tässä käytettynä termillä "geenisekvenssit" tarkoitetaan nukleiinihappomolekyylia (edullisesti DNA). Haluttua ksylanaasia koodaavat geenisekvenssit saadaan monista eri lähteistä. Näihin lähteisiin kuuluvat Actinomadura flexuo-san genominen DNA, cDNA, synteettinen DNA ja näiden yhdistelmät. Vektorisysteemejä voidaan käyttää valmistamaan sellaisia isäntiä, jotka tuottavat keksinnön mukaisia entsyymivalmisteita. Vektorikonstruktioon (a) voidaan edelleen tehdä erillinen vektorikonstruktio (b) joka koodaa vähintään yhtä isännän genomiin integroitavaa haluttua geeniä ja (c) kohtiin (a) tai (b) liitetyn selektiomarkkerin. Vaihtoehtoisesti markkerina voidaan käyttää erillistä vektoria. ;

Nukleiinihappomolekyylin, kuten esimerkiksi DNA: n, sanotaan "pystyvän ilmentämään" polypeptidin, mikäli se sisältää trans- ·’1: kription säätelyinformaation sisältävät ilmentymisen säätely- * , sekvenssit ja sellaiset sekvenssit ovat "toiminnallisesti • 1 1 kytketyt" polypeptidiä koodaavaan nukleotidisekvenssiin. / · · « « · ’I1. Toiminnallinen sidos on sidos, jossa sekvenssi yhdistetään * säätelysekvenssiin (tai sekvensseihin) sellaisella tavalla, joka saattaa sekvenssin ilmentämisen säätelysekvenssin vaikutuksen tai kontrollin alaiseksi. Kahden DNA-sekvenssin (kuten esimerkiksi proteiinia koodaavan sekvenssin ja promoottori- 9 aluesekvenssin, joka on liittynyt koodaavan sekvenssin 5'-päähän) sanotaan olevan toiminnallisesti kytketyt, jos promoot- ··, tori toiminnan induktio johtaa sekvenssin mRNA: n koodaaman • · · proteiinin transkriptioon, ja jos kahden DNA-sekvenssin väli-*;·, sen sidoksen luonne ei (l) johda lukukehys-mutaation esiin- ’·1’ tuloon, (2) estä ilmentymisen säätelysekvenssien kykyä ohjata : mRNA: n, antisense-RNA: n tai proteiinin ilmentymistä tai (3) estä templaatin kykyä tulla promoottorialuesekvenssin tran-

16 118010 ! I

.1 it skriboimaksi. Promoottorialue olisi näin ollen toiminnallisesti kytketty DNA-sekvenssiin, jos promoottori pystyisi vai- -* kuttamaan sen DNA-sekvenssin transkriptioon.

Geenin ilmentymiseen tarvittavien säätelyalueiden täsmällinen luonne voi vaihdella lajien tai solutyyppien välillä, mutta tavallisesti niihin sisältyy välttämättöminä 5' -ei-transkri-boidut ja 5' -ei-transloidut (ei-koodaavat) sekvenssit, jotka osallistuvat transkription ja vastaavasti translaation aloituk- N

seen.

Proteiinin ilmentäminen transformoiduissa isännissä vaatii sellaisten säätelyalueiden käytön, jotka toimivat kyseisissä isännissä. Voidaan käyttää laajaa valikoimaa transkription ja translaation säätelysekvenssejä. Eukaryooteilla, joilla transkriptio ei ole liittynyt translaatioon, sellaiset säätely-alueet voivat joko tarjota, tai sitten eivät tarjoa, initiaat-torimetioniini (AUG)-kodonin, riippuen siitä, sisältääkö kloonattu sekvenssi sellaisen metioniinin. Sellaisiin alueisiin kuuluu tavallisesti promoottorialue, joka on riittävä ohjaa- «·» ' maan RNA-synteesin aloitusta isäntäsolussa.

• » * • t * « ; ·*· Kuten yleisesti tiedetään, eukaryootti-mRNA: n translaatio M* j*,*. aloitetaan kodonilla, joka koodaa ensimmäisen metioniinin.

* · • ,·, Tästä syystä on edullista varmistaa, että eukaryoottipromootto-[". rin ja DNA-sekvenssin, joka koodaa proteiinia tai sen funktio- 4 · 1 naalista johdannaista, välinen sidos ei sisällä yhtään väli-kodonia, joka pystyy koodaamaan metioniinia. Sellaisten kodo-nien esiintyminen johtaa joko fuusioproteiinin muodostumiseen (jos AUG-kodoni on samassa lukukehyksessä kuin proteiinia • · ·.: koodaava DNA-sekvenssi) tai lukukehys-mutaatioon (jos AUG- - • · » ; ·,· kodoni ei ole samassa lukukehyksessä kuin proteiinia koodaava * · ··. sekvenssi).

• · · **· • · .

*”* Edullisessa suoritustavassa haluttu proteiini eritetään ympä- • ·, ”** röivään kasvualustaan erityksen signaalisekvenssin läsnäolon ·· · : vuoksi. Jos halutulla proteiinilla ei ole omaa signaalisekvens- siä tai jos sellainen signaalisekvenssi ei toimi hyvin isän- 118010 17 nässä, silloin proteiinin koodaava sekvenssi voidaan kytkeä toiminnallisesti isännän kanssa homologiseen tai heterologi-seen signaalisekvenssiin. Haluttu koodaava alue voidaan kytkeä mihin tahansa signaalisekvenssiin, joka mahdollistaa proteiinin erityksen isännästä. Sellaiset signaalisekvenssit voidaan suunnitella joko spesifisten proteaasikohtien kanssa tai ilman niitä, niin että signaalipeptidisekvenssi on myöhemmin helposti irroitettava. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää isäntää, joka erittää proteiinin kasvualustaan, esimerkiksi sellaista isäntää, jolla on membraanissaan mutaatio.

Ei-transkriboidut ja/tai ei-transloidut alueet 3'-suuntaan proteiinia koodaavasta sekvenssistä voidaan haluttaessa saada edellä kuvatuilla kloonausmenetelmillä. 3'-Ei-transkriboitu alue voidaan säilyttää sen transkription terminaation säätely-sekvenssiosasten takia; 3'-ei-transloitu alue voidaan säilyttää sen translaation terminaation säätelysekvenssiosasten takia, tai sellaisten osasten takia, jotka ohjaavat polyade-nylaatiota eukaryoottisoluissa.

Keksinnön mukaiset vektorit voivat edelleen sisältää muita toiminnallisesti kytkeytyneitä säätelyosia, kuten esimerkiksi * * vahvistajasekvenssejä.

• · • · • · · • · *

Edullisessa suoritustavassa konstruoidaan geneettisesti sta- • · · j ·' biilit transformantit, joilla halutun proteiinin DNA integroi- * · · '··· I daan isännän kromosomiin. Haluttua proteiinia koodaava sekvens- * · * ·.· : si voi olla peräisin Actinomadura flexuosasta. Sellainen integraatio voi tapahtua de novo solun sisällä tai, edullisimmassa . j : suoritustavassa sitä voidaan avustaa transformoimalla sellai- sella vektorilla, joka insertoi itsensä toiminnallisesti isän- · · nän kromosomiin, esimerkiksi DNA-osilla, jotka edistävät DNA-sekvenssien integraatiota kromosomeihin.

* * ♦ · • · « i:*: Solut, jotka ovat stabiilisesti integroineet kromosomeihinsa ·*·.· niihin siirretyn DNA:n, valikoidaan siirtämällä niihin myös • m yhden tai useamman markkerin, joka mahdollistaa sellaisten isäntäsolujen valikoimisen, jotka sisältävät ilmentymisvek- 1 ‘.‘Sit 118010 18 torin kromosomissaan, markkeri voi esimerkiksi antaa biosidi-resistenssin, esimerkiksi resistenssin antibiooteille tai raskasmetalleille, kuten esimerkiksi kuparille, tai vastaavalle. Valikoitava markkerigeeni voidaan liittää joko suoraan ilmennettäviin DNA-geenisekvensseihin tai se voidaan siirtää samaan soluun kotransfektiolla.

Tärkeitä tekijöitä tiettyä plasmidi- tai virusvektoria valittaessa ovat: helppous, jolla vektorin sisältävät resipientti- solut voidaan tunnistaa ja valikoida niistä resipienttisoluis-ta, jotka eivät sisällä vektoria; tietyssä isännässä haluttujen vektorin kopioiden lukumäärä; ja se, halutaanko vektorin pystyvän "sukkuloimaan" eri lajisten isäntäsolujen välillä. j

Kun yhden tai useamman konstruktion sisältävä vektori tai DNA-sekvenssi valmistetaan ilmentämistä varten, DNA-konstruk-tio(t) siirretään sopivaan isäntäsoluun millä tahansa monista sopivista keinoista, mukaan lukien transformaatio kuten edellä on kuvattu. Vektorin siirtämisen jälkeen resipienttisoluja kasvatetaan selektiivisellä kasvualustalla, joka valikoi trans- « * * : formoitudut solut kasvun perusteella. Kloonat(t)u(je)n geeni- :*·* sekvenssi (e)n ilmentäminen johtaa halutun proteiinin tuottoon * j\ tai tämän proteiinin fragmentin tuottoon. Tämä ilmentyminen ti» voi tapahtua transformoiduissa soluissa jatkuvasti tai sääde- • · ; .·. tysti.

• · * • * · * « · * i «

Niinpä ksylanaasia koodaavat sekvenssit voidaan kytkeä toiminnallisesti mihin tahansa haluttuun vektoriin ja transformoida valikoituun isäntään niin, että sellaisten proteiinien ilmentyminen turvataan siinä isännässä.

• · * * « · • · · .

» « · ϊ,ί Ksylanaasia koodaavat sekvenssit voidaan fuusioida muihin • · ··, sekvensseihin lukukehyksessä niin, että konstruoidaan fuusio- • · proteiinia koodaava DNA. Ksylanaasigeeniä koodaava yhdistelmä- « vektori voidaan esimerkiksi valmistaa kuten edellä, paitsi että ksylanaasia koodaava sekvenssi fuusioidaan T. reesein t* · • \ sellulaasin, hemisellulaasin tai mannanaasin sekvenssin kanssa, tai mainitun sellulaasin, hemisellulaasin tai mannanaasin 118010 i 19 vähintään yhden funktionaalisen domeenin kanssa, kuten on kuvattu patenteissa US 5,298,405 ja WO 93/24622 sekä GenBankin esityksessä (submission) L25310, jotka kukin sisällytetään tähän viitteellä. Erityisesti entsyymi on CBHI, CBHII, EGI, EGII, XYLI, XYLII tai mannanaasi (MANI), tai niiden domeeni, kuten esimerkiksi erityssignaali tai ydinsekvenssi (core sequence). Mannanaasilla on sama domeenirakenne kuin sellulaa-seilla: aktiivisen kohdan sisältävä ydindomeeni, seriini-treo- niinirunsaan alueen sisältävä saranadomeeni ja sitojadomeenin sisältävä häntä.

Voidaan konstruoida fuusiopeptidejä, jotka sisältävät N-ter-minaalisen mannanaasin tai sellobiohydrolaasin tai endogluka-naasin ydindomeenin tai niistä peräisin olevat ydin- ja sara-nadomeenit fuusioituneena Actinomaduran ksylanaasisekvenssiin.

Tuloksena on proteiini, joka sisältää N-terminaalisen mannanaasin tai sellobiohydrolaasin tai endoglukanaasin ytimen tai ytimen ja saranadomeenit ja C-terminaalisen Actinomaduran ksylanaasin. Fuusioproteiini sisältää fuusi©konstruktiona eri domeenien sekä mannanaasin tai sellobiohydrolaasin tai endo-

«•I

II glukanaasin että ksylanaasin aktiivisuudet. < ·· · • · t • · : j* Fuusioproteiinit voidaan konstruoida myös siten, että manna- • e» naasi- tai sellobiohydrolaasi- tai endoglukanaasihäntä tai • » • ,v niiden haluttu fragmentti sisällytetään, sijoitettuna Actino- "*· maduran ksylanaasisekvenssin ‘ eteen, erityisesti niin, että • · mahdollistetaan hännässä olevan ei-spesifisen proteaasikohdan käyttö proteaasikohtana ksylanaasisekvenssin talteenottami-seksi ilmennetystä fuusioproteiinista. Vaihtoehtoisesti fuusioproteiinit voidaan konstruoida siten, että saadaan proteaa-i.| si kohta liittäjään (linker), joka sijoitetaan Actinomaduran • φ · V ksylanaasin eteen, joko häntäsekvenssien kanssa tai ilman fr · ·*, niitä.

· · • » * t - IV. Keksinnön mukaiset entsyymi valmisteet f···' e* · ; V Keksinnössä kuvataan entsyymikoostumukset, jotka ovat hyödyl lisiä entsyymivalkaisumenetelmässä ja sellun- ja paperinval- 118010 20 : mistuksessa. Kuvataan myös menetelmä sellaisen entsyymivalmisteen tuottamiseksi, jolta puuttuu joko osittain tai kokonaan sellulolyyttinen aktiivisuus (so. kyky hajottaa selluloosa täysin glukoosiksi) ja joka on rikastettu sellun- ja paperinvalmistuksessa toivottavilla ksylanaaseilla. "Sellu-lolyyttisen aktiivisuuden puuttumisella" tarkoitetaan vähennettyä, alennettua, heikennettyä tai estettyä kykyä hajottaa selluloosa glukoosiksi. Valmisteet, joista puuttuu sellulolyyttinen aktiivisuus, ja niiden valmistaminen yhdistelmä-DNA-menetelmillä kuvataan US-patentissa 5,298,405, joka sisällytetään tähän viitteellä. Kuten tässä kuvataan, ksylanaa-seja voidaan saada keksinnön mukaisilla isännillä suoraan (isännät itse siirretään väliaineeseen jossa puunkäsittely tapahtuu). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää isäntien kasvatuksessa saatua kasvualustaa tai siitä puhdistettuja entsyymejä. Lisäksi jos haluttuja aktiivisuuksia on useammassa kuin yhdessä yhdistelmäisännässä, voidaan sellaiset valmisteet eristää sopivista isännistä ja yhdistää ennen käyttöä keksinnön mukaisessa menetelmässä.

' 'I

Keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet tyydyttävät sellu- ja paperiteollisuuden eri sovellutuksissa vaadittavat erityis- ;·.·. tarpeet. Esimerkiksi jos aiottu sovellutus on sellun mekaa- * · nisen massan lujuuden parantaminen, keksinnön mukaiset entsyy- • · · mi valmisteet voivat tarjota entsyymejä, jotka vahvistavat tai * · · ; l helpottavat selluloosakuitujen kykyä sitoutua toisiinsa. Sa- • * · ;·* · maila tavalla massan hiertämissovellutuksessa (pulp milling) *.* * keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet voivat tarjota entsyy mejä, jotka vahvistavat tai helpottavat edullista turpoamista.

·· • · * ♦· :***: Keksinnön mukaisten entsyymi valmisteiden saamiseksi viljellään • · · sopivissa olosuhteissa edellä kuvattuja yhdistelmäisäntiä, • · ... joilla on halutut ominaisuudet (so. isäntiä, jotka pystyvät • m *·;·* ilmentämään haluttuja Actinomadura flexuosan 35 kDa ja/tai 50 kDa ksylanaasientsyymejä suurina määrinä ja valinnaisesti useampaa sellulaasientsyymiä), halutut entsyymit eritetään isännistä kasvualustaan ja entsyymivalmiste otetaan talteen :*·,· niitä, jotka eivät pysty olennaisesti ilmentämään yhtä tai • · 21 118010 i mainitusta kasvualustasta alalla tunnetuilla menetelmillä.

Entsyymivalmiste voidaan tuottaa viljelemällä yhdistelmäisän-tää kantaa fermentorissa. Keksinnön mukaista entsyymivalmistetta voidaan tuottaa esimerkiksi nestemäisessä kasvualustassa, joka sisältää päähiilenlähteenä kaurasta vapautettuja (oat spelt) ksylaaneita, kuten on kuvannut Morosoli (Biochem J. , 239: 587-592 (1986)). .

Entsyymivalmiste on kasvualusta, jossa on tai ei ole transformoituja isäntäsoluja, tai se otetaan talteen kasvualustasta soveltaen alalla hyvin tunnettuja menetelmiä. Joka tapauksessa koska ksylanaasientsyymit erittyvät kasvualustaan ja niillä on aktiivisuutta sellaisissa ympäristöolosuhteissa, jotka vallitsevat hemisellulolyyttisessä liuoksessa, keksinnön etuna on se, että keksinnön mukaisia entsyymivalmisteita voidaan käyttää suoraan kasvualustasta ilman myöhempää puhdistusta. Haluttaessa sellaiset valmisteet voidaan lyofilisoida tai entsyymiaktiivisuus voidaan muulla tavoin konsentroida ja/tai stabiloida säilytystä varten. Keksinnön mukaiset entsyymi valmisteet ovat hyvin taloudellisia hankkia ja käyttää, koska (1) entsyymejä voidaan käyttää • · * t’.t puhdistamattomassa muodossa; spesifisen entsyymin eristäminen • * · .1“ kasvuliuoksesta on tarpeetonta ja (2) koska entsyymit • * * ; l erittyvät kasvualustaan, vain kasvualusta on otettava talteen * · · •*: : halutun entsyymi valmisteen saamiseksi; entsyymiä ei tarvitse • * · *.* * uuttaa isännistä.

• · • *.. Haluttaessa ilmennetty proteiini voidaan edelleen puhdistaa :***: tavanomaisten olosuhteiden mukaisesti, kuten esim. uutolla, * * * saostuksella, kromatograf iällä, af f initeettikromatograf iällä, • · ... elektroforeesilla tai vastaavalla.

• · * · * · *

Keksintö kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeis-sä. Nämä esimerkit esittävät vain muutaman konkreettisen so- • · vellutuksen keksinnöstä. Alan asiantuntijalle on itsestäänselvää aikaansaada useita samanlaisia sovellutuksia. Esimerk- • f 22 1 1 801 0 kejä ei niin ollen pidä tulkita keksinnön piiriä kaventavina vaan keksinnön käyttöä selventävinä.

ESIMERKIT Esimerkki 1

Actinomadura flexuosa DSM43186-kaiman ravistelupullo- ja fer-mentoriviljelyt

Actinomadura flexuosa DSM43186-kantaa levitettiin kaurahiuta-le-kivennäisaine-alustamaljalle (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSM Catalogue of strains, 3. painos., Braunschweig, Saksa (1983)); 1 litra sisältää 20 g agaria, 20 g kaurahiutaleita, 1 ml hivenaineliuosta, joka sisältää 100 mg FeSC>4 x 7 H2O, 100 mg MnCl2 x 4 H2O, 100 mg ZnS04 x 7 H2O / 100 ml; pH 9,0) ja inkuboitiin 50 °C:ssa itiöiden muodostumiseen saakka. Itiöitä muodostava pesäke siirros-tettiin 10 ml:aan XPYB-kasvualustaa (Greiner-Mai, E. et ai.,

System. Appi. Microbiol. 9:97-109 (1987); Holtz, C. et ai.,

Antonie van Leeuwenhoek 59:1-7 (1991)); 1 litra sisältää 5 g kaurasta erotettua ksylaania, 5 g peptonia kaseiinista, 5 g hiivauutetta, 5 g lihauutetta, 0,74 g CaCl2 x 2 H2O; pH 9,0) ja inkuboitiin 55 °C:ssa pyörivässä ravisteli jassa (rotary ··.·. shaker) (250 rpm) kahdesta kolmeen päivää. Sen jälkeen 5 ml:n • · I ymppi siirrettiin 250 ml:aan samaa kasvualustaa ja inkuboitiin • · · samoissa olosuhteissa kolme päivää. Saatu ksylanaasiaktiivi- • · 1 I ·' suus oli 17 nkat/ml (mitattu pH-arvossa 6,0, 60 °C:ssa, 5 • · · ·’·: : minuutin reaktio; Bailey, M.J. et ai., J. Biotechnol. 23: • * · : 257-270 (1992).

Γ·.. Menettely toistettiin kahta 1 l:n fermentaatiota varten (Bio- :***; stat M, B. Braun, Melsungen, Saksa) kuten edellä. Fermentaat- : • · · . ioihin käytettiin 10 % (v/v) ymppiä. pH pidettiin pH-arvossa ... " 7,8 ±0,2 lisäämällä ammoniakkia (12,5 % (v/v)) ja fosforihap- • · *·;·* poa (17 % (v/v)), fermentointilämpötila oli 50 °C. Fermentoria sekoitettiin nopeudella 400 rpm ja ilmavirran nopeus oli 1 1/min. Saadut ksylanaasiaktiivisuudet olivat 32 ja 58 nkat/ml * · (pH 6,0, 60 °C, 5 minuutin reaktio; Bailey, M.J. et ai., J.

Biotechnol. 23: 257-270 (1992).

' ( 23 1180101

Esimerkki 2

Viljelysupernatantista saadun Actlnomadura flexuosan ksylanaa-siaktiivisuuden optimi-pH: n ja -lämpötilan määrittäminen

Ksylanaasiaktiivisuudet mitattiin kaikissa esimerkeissä M. J.

Baileyn ym. , J. Biotechnol. 23: 257-270 (1992), mukaisesti

käyttämällä substraattina 1 %:ista (w/v) koivun ksylaania (Roth 7500). Määritysolosuhteet ovat, ellei toisin mainita, pH

5,3 ja lämpötila 50 * C 5 minuutin inkubaatioaj alla. (Bailey, M. ym. , J. Biotechnol. 23: 257-270 (1992)). Yksi ksylanaasi- yksikkö (1 nkat) määritellään sellaisena entsyymimääränä, joka tuottaa pelkistäviä hiilihydraatteja, joiden pelkistyskyky vastaa yhden nmol: n ksyloosia muodostumista yhdessä sekunnissa koivun ksylaanista määritysolosuhteissa. Kansainvälinen yksikkö (International Unit) on sellaisen entsyymimäärän, joka tuottaa yhden mikromoolin mitattuja lopputuotteita yhdessä minuutissa polymeerisestä substraatista, jolloin 1 IU = 16,67 nkat.

Actinomaduran ksylanaasiaktiivisuuden optimi-pH: n määrittämiseksi ravistelupulloviljelmästä peräisin olevat näytteet i

»M

V : (viljelysupernatantti) laimennettiin Mcllvainin puskureihin • V (0,25 M sitruunahappoa -0,5 M NaaHPO<»), joiden pH-alue oli : Γ* 3,0-11,0. Entsyymi-puskuriseosten lopulliset pH: t olivat 3,5, ''* 4,5, 5,4, 6,4, 7,2, 8,0, 8,5, 9,7 ja 11,2. Ksylanaasiaktiivi- • · : suus mitattiin jokaisessa pH: ssa 50 *C:ssa, 5 minuutin reak- t · * · ,\\ tioaikaa käyttäen. Ksylanaasiaktiivisuus osoitti 80-100 % « maksimiaktiivisuudestaan pH-alueella noin 5,4-8,0. Entsyymillä oli maksimiaktiivisuus noin pH-arvossa 6,4 (kuva 1).

t Lämpöstabiiliuden määrittämiseksi näytteet viljelusupernatan-tista laimennettiin Mcllvainin puskureihin. BSA: ta lisättiin * · konsentraatioon 100 μ9/ιη1 ja pepstatiini A: ta (10 ug/ml) sa- • · :*v moin kuin fenyylimetyylisul f onyyli fluori dia (PMSF, 174 μ9/ιη1) ,··· lisättiin proteaasi-inhibiittoreina. Entsyymi-puskuriseos ten lopulliset pH-arvot olivat 6,9, 7,8, 9,0 ja 9,4. Näytteitä **"· inkuboitiin ilman substraattia 60 *C:ssa, 70 *C:ssa ja 80 ·· · • V * C: ssa. Näytteet otettiin 0, 30, 60 ja 120 minuutin väliajoin 118010 ί 24 ja jäähdytettiin välittömästi jäillä ennen jäännösksylanaasi-aktiivisuuden määrittämistä 50 'C:ssa (5 minuutin reaktio vastaavassa pH:ssa). Entsyymi oli hyvin stabiili, kun sitä inkuboitiin 60 *C:ssa ja 70 *C:ssa; yli 60 % ksylanaasiaktiivi-suudesta oli säilynyt 120 minuutin inkubaation 70 *C:ssa pH-arvossa 9 jälkeen (kuvat 2, 2A ja 2B).

Esimerkki 3

Actlnomaduran ksylanaasien puhdistus

Actinomaduran kasvatusalustasta peräisin olevien ksylanaasien puhdistus suoritettiin +4 *C:ssa FPLC- laitteistoon (Pharmacia) kytketyillä kromatografiapylväillä. Ksylanaasiaktiivisuus-mittaukset suoritettiin 50 ’ C:ssa ja pH-arvossa 6,5. Proteiinia seurattiin 280 nm: ssä läpi koko puhdistuksen. Näytteet ajettiin 0,1 % SDS: ää sisältävillä polyakryyliamidi-slab-gee- leillä Bio-Rad Mini Protean II-elektroforeesisysteemillä ja värjättiin Coomassie Brilliant Blue-värillä.

Thermomonospora fusca-lajin ksylanaasi A: ta (TfxA), saatu .,, prof. David Wilsonilta, Cornellin yliopisto) vastaan valmis- « · 4 *·' ' tettua polyklonaalista vasta-ainetta käytettiin toteamaan • f** : Actinomaduran ksylanaasi(t) Western blot-analyyseissä. Totea- misessa käytettiin Promegan ProtoBlot5* AP System-järjestelmää.

M « • · : Edellä kuvatun kahden 1 1: h fermentaation kasvatusalustat a·· m ·*;*; yhdistettiin ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 8000 g 30 mi- nuutin ajan. Supernatantti (1500 ml) laimennettiin 1 + 2 12,5 mM NaaHPO-u llä pH 9, 0 ja säädettiin pH-arvoon 8, 6 1 M NaOH- <

: 11a. Tämä näyte pantiin kahdessa erässä DEAE Sepharose CL-6B

. , (Pharmacia)-ioninvaihtopylväälle (2,5 x 29 cm), joka oli ta- '*t\t sapainotettu 12,5 mM Na2HP04: llä pH 9,0, virtausnopeudella 100 • · *** # ml/h. Molempien ajojen läpivirtaukset yhdistettiin ja käsitel- Γ*. tiin erikseen, kuten myöhemmin kuvataan.

• e* • * M»

*! Sitoutuneiden proteiinien eluutio DEAE-pylväästä suoritettiin lineaarigradientilla (400 ml + 400 ml) 25 mM NaaHPO*: stä pH

• · ϊ · 9,0, 1 M NaCl: ää sisältävään 25 mM NaaHPO^: ään, pH 9,0, vir- 25 1 1 801 0 tausnopeudella 105 ml/tunti, ja 10 ml: n fraktiot otettiin talteen. Voitiin kerätä kaksi ksylanaasiaktiivisuutta sisältävää piikkiä (poolit I ja II)/ samoin kuin toisen piikin pitkä "hännänmuodostus" (pooli III).

Kolme poolia (jokainen yhdistetty molemmista DEAE-ajoista) säädettiin kukin sisältämään 2 M natriumkloridia ja siirrettiin erikseen Phenyl Sepharose CL-4B (Pharmacia)-pylväälle (2,5 x 15 cm), joka oli tasapainotettu 25 mM NasHPCU: llä pH

9,0, joka sisälsi 2 M NaCl. Eluutio suoritettiin virtausnopeudella 100 ml/tunti kaksivaiheisella gradientilla 100%:i-sesta puskuri A: sta (25 mM Na^HPO1, pH 9) 35 %:iseen puskuri B: hen (25 mM Na2HP04, joka sisälsi 60 % etyleeniglykolia) 60 minuutin aikana, mitä seurasi jyrkempi gradientti 35 %:isesta B: stä 100 %: iseen B: hen 60 minuutin aikana. Otettiin talteen 7 ml: n (pooli I) ja 5 ml: n (poolit II ja III) fraktiot. Saadun pooli I: n ksylanaasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja nimettiin DEPS I: ksi. Kummatkin DEAE-poolit II ja III johtivat kahteen ksylanaasiaktiivisuutta sisältävään piikkiin, joille annettiin nimet DEPS II/l, DEPS II/2 ja vastaa- ... vasti DEPS III/l ja DEPS III/2.

• · • · 4 * ·· v • v 1 • ·’ DEAE-ajojen läpivirtaukset (katso edellä) konsentroitiin kai- volla, jonka läpäisyraja oli 30 kDa, ja säädettiin sisältämään i« i • 2 M NaCl. Tämä näyte pantiin Phenyl Sepharose 6 FastFlow (ma-tala sub; Pharmacia)-pylväälle (2,5 x 34 cm), joka oli tasa-painotettu 25 mM Na2HPO<»: llä pH 9,0, joka sisälsi 2 M NaCl. Eluutio suoritettiin virtausnopeudella 300 ml/h samanlaisella gradientilla kuin DEAE-pooleille käyttäen Phenyl Sepharose CL-6B: tä, ja 10 ml: n fraktiot otettiin talteen. Saadut ksy- . . lanaasiaktiivisuutta sisältävät piikit nimettiin KFI: ksi, • · ***, KFII: ksi ja KFIII:ksi. Konsentraatiosta saadulle permeaatille « · ** # tehtiin samanlainen Phenyl Sepharose 6 FastFlow (matala sub)-·· ϊV ajo, ja ksylanaasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot nimettiin PFl:ksi ja PFII:ksi.

·· « • 1

, Kaikkia saatuja DEPS-, KF- ja PF-piikkejä dialysoitiin 25 mM

* i · NasHPO^: ää vastaan yön yli.

"3 ; 26 1 1 801 0 \

Noin puolet ksylanaasiaktiivisuudesta sitoutui DEAE Sepharo-seen ensimmäisessä puhdistusvaiheessa. DEAE-proteiinien eluu-tio tästä ioninvaihtajasta johti todella terävään piikkiin, jota seurasi leveä "piikki" (kuva 3). Tämä leveä "piikki" jaettiin kahteen eri pooliin. Kukin näistä pooleista puhdistettiin edelleen hydrofobisella interaktio-kromatografia(HIC)-pylväällä (kuvat 4, 4A ja 4B). Joitakin eroja voitiin nähdä siinä, että DEAE: n pooli I johti homogeeniseen piikkiin HIC: llä (kuva 4), mutta molemmat poolit II (kuva 4A) ja III (kuva 4B) johtivat vähintään kahteen piikkiin. Näytteet näistä pooleista ajettiin SDS-PAGE: 11a ja proteiinivärjättiin Coomassie Blue-vä-rillä (kuva 5) samoin kuin analysoitiin Western blot-analyy- ; 4 seillä T. f usean vasta-aineen kanssa (kuva 5A). Vasta-aine reagoi vain kasvatusalustasta peräisin olevien kahden - kolmen pienemmän molekyylipainon omaavan (35 kDa tai aiempi) vyöhykkeen kanssa ja heikosti näissä pooleissa olevien proteiinien kanssa. Näissä pooleissa olevien proteiinien näennäiset mole-kyylipainot olivat 50 kDa arvioituna SDS-PAGE: sta molekyyli- } painostandardien kanssa. Puhtaimpia olivat poolit DEPS II/2, DEPS III/l ja DEPS III/2.

««« • · - • · · .

; DEAE-ioninvaihtajan läpivirtaus konsentroitiin kalvolla, jonka läpäisyraja oli 30 kDa. Noin puolet ksylanaasiaktiivisuudesta ·’**; havaittiin konsentraatissa ja puolet permeaatissa. Molemmat • · | puhdistettiin edelleen hydrofobisella interaktio-kromatogra- »·· * .·.· fialla, mikä johti kahteen ksylanaasiaktiivisuuspiikkiin per-• · - meaatilla (kuva 6) ja kolmeen konsentraatilla (kuva 6A). Nämä piikit analysoitiin SDS-PAGE: 11a samoin kuin Western blot-ana- lyyseillä (kuva 7). Konsentraatista peräisin olevalla ensim- -j mäisellä piikillä, KF1: llä, oli SDS-PAGE: 11a vyöhyke, jonka 5 ·* !·: näennäinen molekyylipaino oli 40 kDa, muttei antanut reaktiota • · · V Western blot-analyysissä. Tällä piikillä oli kuitenkin korkein * * ksylanaasiaktiivisuus. KF2: 11a oli SDS-PAGE:11a 50 kDa: n vyö- .··· hyke, joka reagoi heikosti vasta-aineen kanssa, mutta Western ’·’* blot-analyysissä voitiin havaita selvä 30 kDa: n vyöhyke. Koi- ··*·» * mannella piikillä, KF3: 11a, oli Western blot-analyysissä M » :Y 35 kDa: n vyöhyke. Konsentraatti sisälsi ksylanaaseja, joiden 27 1 1 801 0 ; näennäiset molekyylipainot olivat 50, 40, 35 sekä 30 kDa.

Ensimmäinen permeaatista saatu piikki, PF1, reagoi T. f usean vasta-aineen kanssa osoittaen kaksi vyöhykettä, joiden molekyylipainot olivat 35 kDa ja vastaavasti 30 kDa. Toisaalta PF2: 11a oli Western blot-analyysissä vain yksi 35 kDa: n vyöhyke.

Yhteenvetona Actinomadura sp. DSM43186:n kasvualusta sisältää ksylanaaseja, joiden molekyylipainot ovat noin 50, 40, 35 ja 30 kDa. Näistä 35 kDa: n ja 50 kDa: n proteiinit tulevat esiin molekyylipa!non päävyöhykkeinä (SDS-PAGE:11a). On mahdollista, että SDS-PAGE: 11a havaittu 40 kDa: n ksylanaasivyöhyke on SDS-PAGE: 11a havaitun 50 kDa: n hajoamistuote ja että SDS-PAGE: 11a havaittu 30 kDa: n ksylanaasivyöhyke on SDS-PAGE: 11a havaitun 35 kDa: n ksylanaasivyöhykkeen hajoamistuote.

Esimerkki 4

Peptidien tuotanto ja sekvensointi DEAE Sepharose CL-6B-ajosta (kuva 3) peräisin olevalle pooli ·· t » ♦ - *.’ I-näytteelle (12 ml) tehtiin geeliekskluusiokromatografia • e * : HighLoad 25/60 Superdex G75-pylväällä (Pharmacia), joka oli f tasapainotettu 25 mM Na^HPCU: llä pH 9, virtausnopeudella 120 f*·*; ml/tunti. Ksylanaasiaktiivisuutta sisältävän piikin fraktiosta • · | saatu näyte (25ml) laimennettiin (1 + 1) vedellä ja asetettiin ··> * .·.· mono Q (Pharmacia) -ioninvaihtajalle, joka oli tasapainotettu 25 mM NaaHPCU: llä pH 9. Eluutio suoritettiin virtausnopeudella 30 ml/tunti lineaarigradientilla 12,5 mM NaaHPO^: stä, pH 9, 12, 5 mM Na^HPCU: ään, pH 9, joka sisälsi 0, 5 M NaCl, 50 minuutin aikana. Ksylanaasiaktiivisuutta sisältävä piikki (1 ml) * i ··'· konsentroitiin Centricon mikro-rikastuslaitteella (läpäisyraja # · · V 30 kDa) ja eluoitiin 1%:isella ammoniumbikarbonaatilla. Tämä • · ·*·β. konsentroitu näyte haihdutettiin ja alkyloitiin vinyylipyri-« .···- diinillä. Alkyloitu näyte pilkottiin trypsiinillä (modifioitu *** trypsiini, sequenal-luokka, Promega V5111). Pilkottu tuote *·#·>' * ‘ pantiin HPLC: hen kytketylle käänteisfaasipylväälle, ja piikit, *· · ; V jotka absorboivat aallonpituudella 214 nm, otettiin käsin 118010 28 talteen. Jokaiselle kerätylle fraktiolle tehtiin Edmanin de-gradaatio kaasupulssi-nestefaasisekvensoijassa (gas-pulsed- liquid-phase sequencer) (Kalkkinen ja Tilgman, J. Protein Chem. 7: 242- 243 (1988)) ja vapautuneet PTH-aminohapot ana lysoitiin on-line käyttämällä kapean läpimitan (narrow bore) käänteisfaasi-HPLC: tä.

Puhdistetusta 50 kDa: n ksylanaasista saadut peptidit luetellaan taulukossa 1.

Taulukko 1: Peptidit puhdistetusta 50 kDa: n ksylanaasista Peptidi Sekvenssi # 1696 Ala-Ala-Ser-Thr-Leu-Ala-Glu-Gly-Ala-Ala-Gln-His-Asn-Arg # 1697 Tyr-Phe-Gly-Val-Ala-Ile-Ala-Ala-Asn-Arg # 1698 Leu-Asn-Asp-Ser-Val-Tyr-Thr-Asn-Ile-Ala-Asn-Arg # 1699 Asn/Gly/X-Thr-Gly-Ile-Thr-Val-X-Gly-Val # 1703 His/Glu/Thr-Glu/Phe-Leu/Asn-Val/Ser-Tyr/Val-Asn/Thr-

Met/Ala-Val/Glu-Asn/X-Glu/X-Met/X

# 1704 Glu-Phe-Asn-Ser-Val-Thr-Ala-Glu-Asn-Glu-Met-(Lys) *** • « · • · · • :***: Peptidisekvenssien #1696, 1697, 1698 ja 1704 yhdistelmä sopii : yhteen 75 %: n yhtäläisyydellä Streptomyces lividansin ksyla- • · « naasi A: n aminohappojen 42-89 kanssa. Lisäksi peptidi #1699 • · : .·. osoittaa 78 %: n yhtäläisyyttä S. lividansin XlnA: n aminohappo- iti jen 301-309 kanssa: * ♦ « • ♦ ♦

Actinomodura u „ tn. #1696 #1697 #1698 #1704 ‘

JU Kua 1 AASTLAEGAAQHNR YFGVAIAANR LNDSVYTNIANR EFNSVTAENEMK 4 S

_ _ I · I I I : : I I I · I I I I · I I I · I M I I I · I I I I I I | | | | | I I I

: S. Imdans 42 AESTLGAAAAQSGR YFGTAIASGR LSDSTYTSIäGR EFNMVTAENEMK 89

ϊ xinA

* · * • · » • * · • · ·’. Actinomodura #1699

• ·* G

*... 50 kDa NTGiTVXGV

Illhll \ . 5. lividans srclgitvwgvrd

XlnA 300 310 • ♦ · • » * • · • · 118010 2 9

Esimerkki 5

Puhdistettujen 35 kDa: n ja 50 kDa: n ksylanaasien pH-ominai-suudet ja lämpötilastabiilius

Puhdistettujen 35 kDa: n ja 50 kDa: n entsyymien (±100 ug/ml BSA: ta) lämpötilastabiilius määritettiin inkuboimalla entsyymi-näytteitä 70 ‘C: ssa, pH 6, 0: ssa, 0,2, 6 ja 24 tuntia kestävinä ajanjaksoina, minkä jälkeen näytteiden ksylanaasi aktiivi s uus määritettiin (pH-arvossa 6,5, 60 ' C, 20 minuutin reaktio).

Niissä näytteissä, joihin oli lisätty BSA: ta, voitiin mitata yli 80 % alkuperäisestä aktiivisuudesta jopa 24 tunnin inku-boinnin jälkeen (kuvat 8 ja 9 35 kDa: n ja vastaavasti 50 kDa: n ksylanaasille). Kun BSA: ta ei lisätty, voitiin alkuperäisestä aktiivisuudesta silti mitata noin 60 % (35 kDa) tai 70 % (50 kDa) 24 tunnin inkuboinnin jälkeen (kuvat 8 ja 9).

pH-riippuvuus määritettiin inkuboimalla entsyyminäytteitä eri pH-arvoissa (pH 4-8) ja 80 *C: n (35 kDa) sekä 60, 70 ja 80 ' C: n (50 kDa) lämpötiloissa 20 minuutin ajan (35 kDa) tai 10 minuutin ajan (50 kDa). Lämpötilassa 80 ’C 35 kDa: n ksylanaa-sin pH-optimi oli noin pH-arvossa 6, ja sen aktiivisuudesta : miltei 90 % oli noin pH-arvosta 5 pH-arvoon 7 (kuva 10A).

Lämpötiloissa 60 * C ja 70 * C 50 kDa: n ksylanaasin pH-optimi • « • oli pH-alueella 5-7 ja 80 ’ C:ssa pH-optimi oli pH-alueella • « · 6-7. Näissä olosuhteissa entsyymi oli hyvin stabiili pH-välil- ; .·, lä 5-7 (kuva 10B). Sekä 35 kDa: n että 50 kDa: n ksylanaasin • · # ..V inkubointi 60 ’C.-ssa 60 minuutin ajan pH-arvoissa 4,2-8,7 • * * osoitti samanlaisen stabiilisuuden kuin edellä olevassa kokeessa havaittiin, paitsi että 50 kDa: n ksylanaasi näyttää olevan vähemmän stabiili pH-arvossa 4,2 näissä olosuhteissa (kuva 10C). Lämpötilariippuvuuskokeet pH-arvossa 7 35 kDa: n ja ; 50 kDa: n ksylanaasin 60 minuuttia kestävillä inkubaatioilla • · · l i substraatin kanssa lämpötiloissa 50, 60, 70 ja 80 *C osoitti molemmille entsyymeille maksimiaktiivisuuden 70 *C:ssa (kuva • ·« .···, 11). Näiden tulosten perusteella 50 kDa: n ksylanaasi näytti • · ***, olevan hieman stabiilimpi 80 ’C:ssa ja pH-arvossa 7 kuin 35 kDa: n ksylanaasi. Toisaalta 35 kDa: n ksylanaasi oli aktiivi-Γ·]: sempi ja stabiilimpi pH-alueella 4-5.

118010 ΐ , 30

Esimerkki 6 5

Valkaisukokeet käyttäen Actlnomaduran viljelysupernatanttia

Toisinaan seuraavia valkaisukoesarjoja tehtiin Actlnomadura flexuosan ksylanaasin hyödyllisyyden määrittämiseksi sekä sulfaattisellun ECF (kloorikaasuvapaa) että TCF (täysin kloo-rivapaa)-valkaisussa.

ECF-vaikaisu t

Actlnomadura flexuosan ksylanaasia sisältäviä kasvualustoja (katso esimerkki 1) lisättiin suomalaiseen happidelignifioi-tuun havupuusulfaattiselluun (kappaluku = 15) määränä 50 tai 100 nkat/g massan kuiva-ainetta pH-arvossa 7 ja lämpötilassa 70 *C 1 tunnin ajaksi. Tässä kasvualustassa on hyvin vähän endoglukanaaseja ja sellulaaseja. Vertailumassaa pidettiin samoissa olosuhteissa ilman entsyyminlisäystä.

Kaikki massat valkaistiin sitten samalla tavalla kahdessa vaiheessa: kloori di oksi di ja alkalinen uutto. Hajonneen lig- -} • · # V ’ niinin mittana määritettiin suodoksen absorbanssi 280 nm: ssä.

• · · t · · • * t·..' e t * t t * t « * * t · · • · ♦ • v «tv.

V t · f·* * · - * .

* '1 .

«V

V · * v V - V · · »·♦ *

• V

• · * ♦ V \

• V

• f • · ’· • · · V · • * • tv • · • · · · • · t* · • V t • · “ • * 3i 118010 : . j

Taulukko 2 0 nkat/g 50 nkat/g 100 nkat/g

Entsyymi vaihe ·.

Konsistenssi, % 3 3 3 Lämpötila, *C 70 70 70 pH alussa/lopussa 7,0/7,1 7,0/7,2 7,2/7,4

Retentioaika, min 60 60 60 A280 (laim. 1/10) 0,22 0, 49 0, 65

ClOa-vaihe

Konsistenssi, % 3 3 3 C102-annos 2, 3 2, 3 2, 3 Lämpötila, * C 60 60 60 pH lopussa 2, 4 2, 5 2,5

Retentioaika, min 60 60 60

Uuttovaihe

Konsistenssi, % 10 10 10

NaoH-annos, % 1,5 1,5 1/5 Lämpötila, * C : 70 70 70 pH lopussa 10,9 10,9 10,9

Retentioaika, min 60 60 60

Lopullinen massa

Valkoisuusaste, % ISO 56,7 59,9 60,6

Kappaluku 6, 6 5, 6 5, 4

Viskositeetti dm3/kg 920 910 900 9 9 9 » t t 9 9 * 9 :*·]: Kuten taulukosta 2 voidaan nähdä, ligniiniä poistui enemmän ; ·* (mitä todistaa muutos A2SO: ssa) ksylanaasilla tehdyn esikäsit- 9 9 9 telyn jälkeen. Lopullisilla massoilla oli 3-4 yksikköä kor- : • 9 : ,·. keampi valkoisuusaste massan lujuuden häviämättä (viskositee- 9 * · 99 9 9 t*t·. tm muutos 20 yksikköä on menetelmän normaalin vaihtelun ra- ; 9 t · joissa).

TCF-valkaisu i 9 9 K: · Suomalaista happidelignifioitua havupuusulfaattimassaa, jonka 9 9 9 ϊ.ί kappaluku oli 15, käsiteltiin Actinomadura flexuosan ksylanaa- • 9 ;·, silla käyttäen entsyymiannoksia 50 ja 100 nkat/g massan kui- 9 9 - va-ainetta. Käsittely tehtiin pH-arvossa 7 70 'C: ssa 1 tunnin 9 » *". ajan. Vertailumassaa pidettiin samoissa olosuhteissa ilman entsyymi nlisäys ta.

99 9 9 9 9 9 * 9 9 118010

'32 ./I

Tämän jälkeen kaikki massat valkaistiin samalla tavalla kahdessa vaiheessa: metallinpoistokäsittely kelatoimalla EDTA: n kanssa ja vetyperoksidikäsittely. Hajonneen ligniinin mittana määritettiin suodoksen absorbanssi 280 nm: ssä.

Taulukko 3 0 nkat/g 50 nkat/g 100 nkat/g

Entsyymivaihe

Konsistenssi, % 3 3 3 Lämpötila, * C 70 70 70 pH alussa/lopussa 7, 0/7, 4 7, 0/7, 3 7, 0/7, 3

Retentioaika, min 60 60 60

Abs 280 nm (laim. 1/10) 0, 27 0, 43 0, 57

Kelatointivaihe

Konsistenssi, % 3 3 3 EDTA, % 0, 2 0, 2 0, 2 : Lämpötila, ’C 70 70 70 / pH lopussa 5, 5 5, 6 5,8

Retentioaika, min 60 60 60

Abs 280 nm (laim. 1/10) 0, 24 0, 44 0, 64

Konsistenssi, % 10 10 10

HaOa-annos, % 3, 0 3, 0 3,0 H2O2-kulutus, % 0, 87 0, 85 0, 91 ... DTPA, % 0, 2 0,2 0, 2 - MgSO*, % 0, 5 0, 5 0, 5 «... NaOH, % ^ 3,0 3, 0 3,0 * Lämpötila, *C 80 80 80 { : ·*! pH lopussa 10,6 10,6 10,6 / .1” Retentioaika, min 180 180 180 t * · * __. * • · ............ I II·—»* ; ,·. Lopullinen massa · Valkoisuusaste, % ISO 71, 9 72, 9 73,0 •V Kappaluku 9, 0 8, 3 7,9 * Viskositeetti dm3/kg 870 890 890

Taulukko 3 osoittaa, että A2eo-mittauksen ja kappaluvun mukaan * ·*. ksylanaasiesikäsittelyn jälkeen poistui merkittävästi enemmän ··· ligniiniä samalla kun massan lujuus (viskositeetin mukaan) *· · säilyi hyvänä.

• i ··· • * • · ---5.

··· ’is ♦ · i ί ····*' • · ·· · » · • » * 33 118010

Esimerkki 7

Valkaisukokeet käyttäen puhdistettuja 35 kDa: n ja 50 kDa: n ksylanaasej a

Puhdistettua suurempaa 50 kDa: n (AM50) ksylanaasia ja pienempää 35 kDa: n (AM35) ksylanaasia (mukaan lukien myös 30 kDa: n ksylanaasi) käytettiin valkaisukokeisiin kolmivaiheisessa peroksidivalkaisussa. Puhdistetut entsyymivalmisteet olivat samat kuin ne jotka käytettiin puhdistettujen entsyymien pH: n ja lämpötilaominaisuuksien määrittämisessä.

Mukaan otettiin myös kontrollinäyte ilman entsyymikäsittelyä. Raaka-aineena käytetyn havupuumassan (V 541-18 (2129)) kuiva-painopitoisuus ja kappaluku olivat 28, 8 % ja vastaavasti 13,5.

Massan alkuvalkoisuusaste oli 37,1.

Entsyymikäsittely ja -annos

Entsyymin aktiivisuus mitattiin 60 *C:ssa, pH-arvossa 6,5 käyttäen koivupuun ksylaania (Roth no. 7500) substraattina.

Entsyymiannos oli 100 nkat/g kuivamassaa. Actinomaduran ksy- lanaasit liuotettiin 25 mM dinatriumfosfaattipuskuriin, joka ;; sisälsi 50 mM NaCl, ja kontrollinäytteeseen lisättiin sama jV; määrä tätä puskuria. Massan pH säädettiin rikkihapolla. 1 • « t t * *#*'

Kelatointi • · • · • I 4 * · · "Y Kelatointi suoritettiin lisäämällä EDTA:ta 0,2 %: iin kuiva- • · * *·* painosta ja se tehtiin 3,0 %: n konsistenssilla 50 ’C:ssa yhden > tunnin aikana.

: Ή .·>

Peroksidivalkaisu f • · * · -t · :T Kolme peroksidivalkaisuvaihetta (80 *C, 180 min) suoritettiin Y* samalla tavalla, paitsi että jokaisen vaiheen jälkeen kolman- *... nes massasta otettiin pois testausta varten. Olosuhteet olivat *···' seuraavat: • · ···· • * ·*·' • · .? • ·

J V

- ;,jk 118010 ί 34

Konsistenssi 10 % H2O2 , 3 %

Naon : 3 % I

DTPA 0,2 %

MgSO1 0, 5 % :·

Tulokset

Tulokset Ecopulp X-200-entsyymivalmisteella (Primalco Ltd,

Biotec., Rajamäki, Suomi), joka sisältää T, reesein ksylanaasi II: ta on sisällytetty seuraavaan tarkasteluun. Raaka-ainemassa ja kaikki muut käsittelyt ovat samoja, paitsi että entsyymi-käsittely (100 nkat/g kuivapainoa) suoritettiin vedessä, pH-arvossa 5, 0 50 ‘ C: ssa, mikä on lähellä T. reesein xyl II; n optimia. Entsyymin aktiivisuus mitattiin 60 1C:ssa, pH-arvossa 6, 5 käyttäen koivupuun ksylaania (Roth no. 7 500) substraattina. Kontrollinäytettä käsiteltiin samalla tavalla, mutta ilman entsyymiä.

Pelkistävät sokerit (% kuivapainosta) analysoitiin entsyymi -käsittelyn jälkeen, ja ne olivat seuraavanlaiset: ··· t · " o, "·1: Kontrolli 0,19 • e » :’r AM50 1, 18 :v AM35 1, 64 • Kontrolli 0,20 • · 1 "V Ecopulp X-200 1,32 * t

Valkaisujen tulokset esitetään taulukossa 4. » • 1 ,

* I

·«· * · « * · • · • · • 1 * 1 < ··· * • · *··· * ' « • · * 35 118010 ?

Taulukko 4 ISO-valkoi- Käytetty suusaste Kappa peroksidi (%) P1-vaihe

Kontrolli 59, 6 5, 9 2,7 AM50 62, 3 6, 3 2, 7 AM35 63, 7 5, 3 2,6

Kontrolli 62, 2 5, 9 2, 2 ;

Ecopulp X-200* 64,1 7, 2 2,3 P2-vaihe

Kontrolli 67, 2 6, 8 2,2 AM50 69, 7 4, 8 2,4 AM35 70, 7 4,9 2,2

Kontrolli 6 8,8 7,7 2,2

Ecopulp X-200** 70, 6 5, 5 2, P3-vaihe

Kontrolli 71, 3 5, 2 2,2 AM50 74, 0 4, 1 2, 2 AM3 5 74, 4 2, 2 2, 0

Kontrolli 73, 3 6, 8 2, 2

Ecopulp X-200* 74,9 4, 2 2,1 AM50: n ja AM35: n käyttö nosti selvästi valkoisuusastetta nos-tamatta käytetyn peroksidin määrää.

»* « • * » 1 Esimerkki 8 • e > 9 9'

Kromosomaalisen DNA: n eristys ja genomikirjaston konstruointi • * 1 • • 9 9 · ‘ • f * ϊ·ϊ · Actinomadura flexuosa sp. DSM43186-kantaa viljeltiin 50 ml: ssa • * V kasvualustaa, jonka koostumus oli 10 % (w/v) sakkaroosia, 0,5 i % (w/v) kaurasta eristettyä ksylaania, 0, 5 % (w/v) peptonia kaseiinista, 0, 5 % (w/v) hiivauutetta, 0, 5 % (w/v) lihauutet-ta, 0, 074 % (w/v) CaCle x 2H20, pH 7,4-7,5, väliseinin varus-« .* tetussa ravistelupullossa 2,5 päivän ajan 52 *C:ssa raviste- • 9* ,·;· lemalla nopeudella 200 rpm. 2,5 ml tätä viljelmää siirrettiin ^ ##· ·. 50 ml: aan tuoretta kasvualustaa, johon oli lisätty 0, 8 % gly- · • 9 • * siiniä, ja kasvatettiin 2 päivää 50 *C:ssa, 200 rpm. Solut ··· pelletoitiin sentrifugoimalla ja pestiin seoksella 10 % sak- 4 9 karoosia - 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) - 25 mM EDTA.

«· * ’ f ··.'.

• ;

118010 I

36 ; I

Kromosomaalinen DNA eristettiin Hopwoodin ym. , Genetic mani- ! pulation of Streptomyces·. A laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich, Yhdistynyt Kuningaskunta (1985), mukaisesti. Lyhyesti sanottuna myseeli hajoitettiin lysotsyymillä ja 2 x Kirbyn seoksella (2 g natriumtri-isopropyylinaftaleeni-sulfonaattia, 12 g natrium-4-aminosalisylaattia, 5 ml 2 M Tris-HCl (pH 8,0), 6 ml Tris-HCl: llä kyllästettyä fenolia, mikä täydennetään vedellä 100 ml: aan). DNA saostettiin isopro- 1 panolilla ja liuotettiin TE: hen (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). RNA pilkottiin RNaasilla.

Kromosomaalinen DNA pilkottiin osittain SauZK·. 11a (Boehringer) - ja fraktioitiin koon mukaan sakkaroosigradientissa (10-40 % (w/v) sakkaroosia seoksessa 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA), jota ajettiin nopeudella 55 000 rpm 6 tunnin ajan 22 ' C:ssa Beckman TL-100-ultrasentrifuugissa TLS-55-rootto-rissa. Gradientti jaettiin fraktioihin ja niitä, jotka sisäl-. sivät kooltaan pääosin 7-10 kb: n DNA: ta, käytettiin genomisen Actinomadura-kirjaston konstruoimiseen.

Esipilkottua ZAP Express™ BamHI/CIAP Vector Cloning Kit -pakkausta (Stratagene) käytettiin kirjaston konstruoimiseen ja kaikissa seuraavissa vaiheissa noudatettiin valmistajan • » ; ·*: ohjeita. Lyhyesti sanottuna noin 200 ng kokofraktioitua DNA: ta a«l Ϊ*.' liitettiin 1 μg: aan ZAP Express valmisteisiä käsivarsia ja ; /. pakattiin käyttämällä Gigapack II pakkausuutetta (Stratagene).

“V Kirjaston tiitteri määritettiin infektoimalla E. coli XLl-Blue * · • MRF' -solut pakkaus f aagin sarj alaimennoksilla ja maljaamalla i NZY-maljoille. Ligaatioseoksen kokonaistiitteri oli noin 3 x Λ 107 pfu/ml, yli 96 %: n inserttifrekvenssillä. Kirjastoa käytet- * tiin seulontaan ilman monistusta.

• · • · * * 7 et* ί,ί Esimerkki 9A ^ •\ 35 kDa: n ksylanaasia koodaavan geenin eristäminen RBB-ksylaani- e ’ maljojen hydrolysointiaktiivisuuden perusteella M» ♦ · ZAP Express’I'M-vektorissa olevaa Actinomadura flexuosa sp. ‘ i * - DSM43186: n DNA: n genomikirjastoa seulottiin ksylanolyyttisen | 2

118010 I

37 ί aktiivisuuden suhteen seuraavalla tavalla. Isäntää, Strata-genen E. coli XL-Blue MRF' -soluja, kasvatettiin LB-elatusai-neessa + 0, 2 % (w/v) maltoosia + 10 mM MgSO* ja säädettiin tiheyteen 0D6oo = 0, 5. Soluja infektoitiin yhdistelmäkirjastolla 15 minuuttia 37 ’C:ssa ja maljättiin NZY-topagarin kanssa NZY-maljoille. Maljoja inkuboitiin 4 tunnin ajan 42 *C:ssa, päällystettiin nitroselluloosasuodattimilla, jotka oli kyl- > lästetty 10 mM IPTG:llä lacZ-fuusioproteiinin ilmentämisen ^ indusoi mi seksi, ja inkuboitiin yli yön huoneenlämpötilassa.

Suodattimet pestiin 50 mM K-fosfaattipuskurilla (pH 6,8) ja siirrettiin RBB-ksylaani + Km-maljoille. Maljassa on kaksi kerrosta; alempi 15 ml:n kerros varsinaista LB:tä + Km: ää (40 μ9/πι1) ja 5 ml: n ylemempi kerros RBB-ksylaania (0,5 % (w/v) RBB-ksylaania, 1 % (w/v) kaurasta vapautettua ksylaania LB +

Km -seoksessa, joka on puskuroitu 50 mM K-fosfaatilla, pH

6,8). Maljat siirrettiin 50 * C: seen toiseksi yöksi ksylanolyyt- tisen aktiivisuuden määrittämiseksi. Suodattimet otettiin pois ja selvä kehä RBB-ksylaani + Km-maljoilla paljasti ne kloonit, · joilla oli ksylanaasiaktiivisuutta. Alkuperäisistä NZY-mal- joista poimittiin 22 positiivista plakkia SM-puskuri/kloro- ... f ormi-seokseen.

* · * * * *** • * ZAP Express-vektori on suunniteltu mahdollistamaan minkä ta- • · · *···* hansa lambdavektorin sisältämän kloonatun insertin yksinker- ; • · « : täinen, tehokas in vivo-irrotus ja saattaminen uudestaan reng- • * ·.: * asmuotoon kloonatun insertin sisältävän fagemidin muodosta-« r * · miseksi. Lyhyesti sanottuna positiivisia klooneja inkuboitiin XL1 Blue MRF'-solujen kanssa ExAssist-auttajafaagin kanssa.

• 'X

Lampodenaturoinnin (70 ' C, 15 min) ja sentrifugoinnin jälkeen irrotettu fagemidi pBK-CMV pakataan rihmamaisina faagipartik- ; .·. keleinä supernatantissa. Vapautettu fagemidi sekoitettiin 1 • * · "··] XLOLR-soluj en kanssa ja mal jättiin LB/kanamysiinille (50 μg-'. . /ml) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

• * · . . t * • · *

Vapautetun fagemidin DNA-molekyyleillä transformoidut E. coli XLOLR-solut testattiin uudelleen RBB-ksylaanilla + Km: llä. ; * * .. . Alkuperäisistä 22 positiivisesta kloonista 12 kloonia säilytti * • · • * 118010 i 38 : f ' ' ' '· ksylanaasiaktiivisuutensa. Fagemidi-DNA: t pilkottiin EcoRI-/Psthllä, niille tehtiin elektroforeesi, blotattiin nailon-kalvolle ja hybridisoitiin digoksigeniini-leimatun pALK185:stä peräisin olevan 1,15 kb: n T. fuscan ksylanaasifragmentin kanssa (kuva 12). P1 as mi di pALK18 5 sisältää T. fuscan xynA-geenin pTX101:stä (Ghangas, G. S. et ai., J. Bact. 171: 2953-2969 (1994)). Neljä fagemidiä hybridisoitui T. fuscan DNA-koettimen kanssa, mikä osoittaa, että ne kantoivat yhtä tai useampaa geeniä, jolla on jonkin verran homologiaa T. fuscan fragmentin kanssa. Näille fagemideille annettiin nimet pALK938, pALK939, PALK940 ja pALK941.

Esimerkki 9B

35 kDa: n ksylanaasia koodaavan geenin eristäminen T. fuscan | xynA-geeniin hybridisoitumisen perusteella 'k ZAP Express^M-vektorissa olevaa Actinomadura flexuosa sp.

DSM4318 5: n DNA: n genomikirj astoa seulottiin pALK185:stä peräisin olevalla digoksigeniini-leimatulla 1,15 kb: n T. fuscan ksylanaasifragmentilla (kuva 12) toimittajan ohjeiden mukaisesti. Poimittiin 17 positiivista kloonia. Fagemidit irrotet-tiin in vivo, kuten edellä esimerkissä 9A kuvataan. E. coli m · 1 -kloonit, jotka sisälsivät positiivisia fagemideja, testattiin • , ^ * 1 ksylanolyyttisen aktiivisuuden suhteen RBB-ksylaanilla, kuten !· * · • Φ » ";ϊ edellä esimerkissä 9A kuvataan. Yksitoista kloonia osoitti V’ · 1 ! 1 ksylanolyyttistä aktiivisuutta". Valittiin yksi klooneista ja i plasmidille annettiin nimi pALK1056.

« · .

• · 1 'i ^ * Φ ·

Esimerkki 10 35 kDa: n ksylanaasia koodaavan geenin eristäminen T. fuscan TfxA-vasta-aineen tunnistaman polypeptidin tuotannon perus- : .·. teella * 1 • · · • · · ··.1;1 t . Actinomaduran genomikirjaston seulontaan käytettiin polyklo- i ’1· naalista vasta-ainetta Thermomonospora fuscan 32 kDa: n ksyla-* 1 1 naasia, TfxA: ta, vastaan. Stratagenen XL-Blue MRF' -soluja • · kasvatettiin LB-elatusaineessa + 0, 2 % maltoosia + 10 mM MgSO1 • · · • « · · 118010 : 39 . Ί: ja laimennettiin tiheyteen 00*500=0, 5. Soluja infektoitiin yhdistelmäkirjastolla 15 minuuttia 37 *C:ssa ja maljattiin NZY-top-agarin kanssa NZY-mal j oille. Maljoja inkuboitiin 3,5 tunnin ajan 42 *C:ssa, päällystettiin nitroselluloosasuodatti-milla, jotka oli kyllästetty 10 mM IPTG: llä, ja inkuboitiin yli yön huoneenlämpötilassa. Toteaminen suoritettiin 1: 1500 laimennetulla T. fuscan TfxA-vasta-aineella käyttämällä Pro-megan ProtoBlot3*· AP-systeemiä. Kaksitoista positiivista kloonia, joista klooni 1.1 antoi selvästi voimakkaimman signaalin,

Otettiin talteen SM-puskuri/kloroformi-seokseen ja puhdistettiin toisella seulontakerralla.

Fagemidit irrotettiin in vivo, kuten edellä olevassa esimerkissä 9A on kuvattu. Sitten fagemidit pilkottiin PcoRIillä ja Pstl: llä, niille tehtiin elektroforeesi, blotattiin nailon-kalvoile ja hybridisoitiin digoksigeniini-leimatun pALK185:stä peräisin olevan 1, 15 kb: n T, fuscan ksylanaasifragmentin kanssa (kuva 12). Actinomadura flexuosa sp. DSM43186-kannan kro-mosomaalisesta DNA: sta T. fusca xynA-koetin hybridisoitui noin 4 kb: n PcoRI-Pst-fragmentti in. Kloonit testattiin myös ksyla-nolyyttisen aktiivisuuden suhteen RBB-ksylaanilla, kuten e- ... dellä olevassa esimerkissä 9A on kuvattu. Yksi klooni (klooni • · · • · · , 1-1) oli positiivinen molemmissa seulonnoissa. Tätä kloonia * • · * '} • ·’ kantavalle fagemidille annettiin nimi pALK923.

• · · • · ····' ··· i '.· Esimerkki 11 • · · 35 kDa: n proteiinia koodaavan ksylanaasi geeni n restriktioent- :V: syymianalyysi ja sekvensointi

Plasmidit pALK938, pALK939, pALK940, pALK941, pALK1056 ja pALK923 analysoitiin restriktioentsyymianalyysillä ja käytet- . . tiin ksylanaasigeenin sekvensointiin. DNA sekvensoitiin käyt- • · ***.' tämällä ABI (Applied Biosystems) -pakkauksia, jotka perustuvat » * **| , fluoreseiini-leimattuihin T3- ja T7-alukkeisiin tai sekvenssi- : spesifisiin alukkeisiin fluoreseiini-leimatuilla dideoksinuk- ·***: leotideilla, Taq dye-alukesyklisekvensointiprotokollalla toi- • * · mittajan ohjeiden mukaan. Koska Actinomaduran DNA: ssa on kor- e···· w • · ,, . kea GC-pitoisuus, sekvensointireaktiot suoritettiin 10 %: i-• · · • · • · 118010 40 sella (v/v) DMSO: 11a emäspariutuslampötilassa 58-60 *C. Sek-vensointireaktiot analysoitiin ABI 373A-sekvenoijalla ja saadut sekvenssit karakterisoitiin käyttämällä Genetics Computer Group Sequence Analysis Software Package-systeemiä, versiota 7. 2. Kuvassa 13 esitetään 35 kDa: n ksylanaasia koodaava DNA-sekvenssi. Sekvenssillä on 1035 bp: n ORF (avoin lukukehys), mikä viittaa 344 aminohapon polypeptidiin ja vastaa molekyy-lipainoltaan noin 37, 5 kDa: n proteiinia. Oletettu signaalin-prosessointikohta havaitaan alaniini 43: n jälkeen, ja ennus-tetulla kypsällä proteiinilla on noin 32,9 kDa: n laskennallinen molekyylipaino. Sekvenssiaineisto on näin ollen hyvässä sovussa 35 kDa: n ksylanaasin puhdistustulosten kanssa, jotka kuvattiin esimerkissä 3. 35 kDa: n geenisekvenssi ilmeni sa manlaisena kaikissa tutkituissa klooneissa, paitsi pALK923: n DNA: ssa. pALK923 sisälsi 93 emäsparin tuntemattoman sekvenssin insertin N-terminaalissa, minkä jälkeen Actinomaduran 35 kDa: n ksylanaasigeenin sekvenssi alkoi kohdassa, joka vastaa emäs-paria 411 kuvassa 13.

Sekvenssillä on korkea homologia eri organismeista peräisin olevia ksylanaaseja kohtaan. Aminohappotasolla geenillä on 76 ...t %: n homologia T, fuscan XynA: ta kohtaan.

• · · • e* * ! .

: \ Esimerkki 12 • · f

Actinomaduran 50 kDa: n ksylanaasigeenin eristäminen • · * • t · • · ·,: : ZAP Express^-vektorissa olevaa Actinomadura flexuosa sp.

t · ί,ί DSM43186: n DNA: n genomikirj astoa seulottiin käyttämällä DNA- , i koetinta. ?

Puhdistetusta 50 kDa: n proteiinista peräisin olevien peptidi- " • .·. sekvenssien perusteella suunniteltiin oligonukleotidialukkeet.

• i ";· Alukesekvenssit esitetään taulukossa 5. Koska peptidisekvens-*. . sien #1696, #1697, #1698 ja #1704 yhdistelmä vastaa 75 %: n • e • *·· samankaltaisuudella Streptomyces lividansin ksylanaasi A: ssa olevia aminohappoja 42-89, syntetisoitiin 39 emäsparin anti- tftt; sense-oligonukleotidi S. lividansin xlnA-sekvenssin emäksistä • » .. . 331-369. S. lividansin xlnA 331-369as-koetin ja alukkeet #- • a · " • · i (

118010 I

41 :i.

1704as, #l703as, #1696s leimattiin digoksigeniinillä ja terminaalisella transferaasilla, ja käytettiin koettimina hybridi-saatiossa 50 ’C:ssa teoksen Boehringer, DIG DNA Labeling and Detection Nonradioactive, Applications Manual, mukaan.

Aluke #1704as ja S. lividansin xlnAas-koetin tunnistivat saman 1,0 kb: n EcoRl -Pstl -fragmentin Actinomaduran DNA: s s a. Fragmentti on erilainen kuin 21. fuscan xynA- koettimen tunnistama 4 kb: n fragmentti. Näiden tulosten perusteella käytettiin 39-meeristä S. lividansin xlnAas-koetinta seulomaan Actinoma-dura-kirj asto 50 kDa: n ksylanaasia koodaavan geenin suhteen.

Kolme positiivista plakkia otettiin talteen yli yön detektion jälkeen. Näille klooneille annettiin nimet Act. xyl. 50/13,

Act.xyl. 50/14 ja Act. xyl. 50/15.

Kloonatun Actinomaduran insertin sisältävät fagemidit irrotettiin, kuten esimerkissä 9A on kuvattu. Ksylanaasiaktiivi-suuden määrittämiseksi E. coli-kloonit levitettiin RBB-ksy-laani + Km-maljoille, kuten esimerkissä 9A on kuvattu, käyttämällä positiivisena kontrollina kantaa, joka tuottaa Acti-nomaduran 35 kDa: n ksylanaasia (plasmidista pALK923). Kloonit · »

Act. xyl. 50/13 ja Act. xyl. 50/14 osoittivat ksylanaasiaktiivi-I suutta muodostaen selvän kehän pesäkkeen ympärille. , t · - ··· ••f'·' • « · • · • · • 9 1 • · -·#· - • · • 9 -

i J

9 9 9 9·.

9 9' 999

999 I

• · 1 • · • · • · • · • 9 · ··· 9 9 9 m 9 9. ‘ · .1 9 99 9 - « · 9 9 9 42 ' ; 118010 ί ' ; ιρ' . · 1 , 1 -λ

Taulukko 5. Oligonukleotidialukkeet, joita käytettiin Actinoma-duran 50 kDa: n ksylanaasia koodaavan geenin toteamisessa.

Aluke DNA-eekvenssi

Actinomadura sp. DSM43186

#l696s GC A/C/G/TGCA/ C/G/TCAA/ G/CAC/TAAC/TA/CG

#l703as ACC AT A/GTTA/GT AA/C/G/T AC A/C/G/T A i

#l704as TTCATC/TTCA/GTTC/TTCA/C/G/TGC

S. lividans xlnA 331-369as :

CGTGAGTTCAACATGGTGACGGCCGAGAACGAGATGAAG

S. lividans xlnA 257~284s ] AGAGCGGCCGCTACTTCGGCACCGCCAT S. lividans xlnA 530-56las »

CACGCCGTTGATGTGGTCGATCATCGCCTGGC

ί s = sense; as = antisense Esimerkki 13 50 kOa: n ksylanaasiproteiinin geenin sekvensointi

Fagemidi-DNA: t klooneista Act. xyl. 50/13 ja Act. xyl. 50/14 nimet- / ,·»·_. tiin pALK927: ksi ja vastaavasti pALK928: ksi. S. lividansin 9 · xlnA 331-369as -oligomeeriä käytettiin Actinomaduran insertin • * ; sekvensointiin. Lisäksi syntetisoitiin kaksi oligomeeriä, " ; • · * \ ["· jotka vastaavat nukleotideja 257-284 ja 530-561 S. lividansin • f » • · xiiiA-sekvenssissä, samoin kuin sekvenssispesifiset alukkeet • · i.: ; kloonatun insertin sekvenssin saamiseksi. Sekvensointireaktiot ·,· ’ suoritettiin 10 %: isella (v/v) DMSO: 11a emäspariutuslämpöti- · lassa 58 *C. Sekvensointi suoritettiin kuten esimerkissä 11 on > kuvattu. Kuvassa 14 esitetään Actinomadura sp. DSM43186: n 50 kDa: n ksylanaasigeenin 1864 emäsparin sekvenssi. Puhdistetusta : 50 kDa: n proteiinista saadut peptidisekvenssit osoitetaan **·· johdetun aminohapposekvenssin alleviivauksella. Johdetulla t « peptidisekvenssillä on 70-71 %: n samanlaisuus Actinomadura sp.

: *· FC7: n ksylanaasi II-proteiinia (kuva 15) ja S. lividansin • e * ksylanaasi A-proteiinia (kuva 15A) kohtaan. Sekvenssillä on ,...· 1479 emäsparin antisense avoin lukukehys, mikä viittaa 492 «· t • · * * * · 118010 - 43 : ·.> aminohapon polypeptidiin, joka vastaa molekyylipainoltaan noin 53, 5 kDa: n proteiinia.

Esimerkki 14 Fuusioproteiinit

Ksylanaasigeeniä koodaava yhdistelmävektori valmistetaan fuusioimalla ksylanaasia koodaava sekvenssi T, reesein sellulaa- ' ·? sin tai hemisellulaasin sekvenssin tai vähintään yhden mainitun sellulaasin tai hemisellulaasin funktionaalisen domeenin kanssa, kuten on kuvattu US-patentissa 5,298,405, patentissa WO 93/24621 ja Genbankin esityksessä (submission) L25310, jotka sisällytetään tähän viitteellä. Erityisesti entsyymi on CBHI, CBHII, EGI, EGII# XYLI, XYLII tai mannanaasi (MANI) tai niiden domeeni, kuten esimerkiksi erityssignaali tai ydinsek-venssi.

Voidaan konstruoida fuusioproteiineja, jotka sisältävät N-terminaalisen mannanaasin tai sellobiohydrolaasin tai endo- . < glukanaasin ydindomeenin tai samasta lähteestä peräisin olevat ’ ydin- ja saranadomeenit Actinomaduran ksylanaasisekvenssiin ,·*·, fuusioituneena. Tuloksena on proteiini, joka sisältää N-ter-minaalisen mannanaasin tai sellobiohydrolaasin tai endogluka- * naasin ytimen tai ydin- ja sarana-alueet sekä C-terminaalisen · *

Actinomaduran ksylanaasin. Fuusioproteiini sisältää * f * ! · mannanaasi- tai sellobiohydrolaasi- tai endoglukanaasi- että ; ksylanaasiaktiivisuutta eri domeenien fuusiokonstrukteina.

• t • · * • *

Fuusioproteiinit voidaan konstruoida myös siten, että sisällytetään mannanaasi- tai sellobiohydrolaasi- tai endoglukanaasi-häntä tai niiden haluttu fragmentti asetettuna ennen Actinoma- : duran ksylanaasi sekvenssi n eteen, erityisesti niin, että hän- • · ··· ,··· nässä olevan ei-spesifisen proteaasikohdan käyttö mahdollistuu • · . proteaasikohtana ksylanaasisekvenssin talteen ottamiseksi : · ilmennetystä fuusioproteiinista. Vaihtoehtoisesti voidaan ··· konstruoida fuusioproteiinej a, joilla on proteaasikohta lii- • · toskohdassa (linker), joka sijoitetaan ennen Actinomaduran j·,·, ksylanaasia joko häntäsekvenssien kanssa tai ilman niitä.

• * • · 118-010 i 44 -f

Esimerkki 15 Isännät

Haluttua ksylanaasia tai fuusioproteiinia koodaava yhdistelmä-konstruktio valmistetaan kuten edellä ja transformoidaan Tri-choderma spp. , Escherichia coll, Bacillus spp. tai Strepto-myces spp. -isäntään.

Kaikki tässä siteeratut viitteet sisällytetään tähän viitteellä. Vaikka tämä keksintö on kuvattu yksityiskohtaisesti ja sen yksityiskohtaisiin suoritustapoihin viitaten, alan asiantuntijalle on selvää, että siihen voidaan tehdä eri muutoksia ja modifikaatioita keksinnön hengestä ja piiristä poikkeamatta. i ··· · · · · · · · · ♦ ♦ 1 2 3 · • „ • e « · • « ··· ·· · • 1 • · 1 » » e·· - • w • • « ! • · • · 1 t · ·1· • · · • · 4 » · 2 • e • · • · 3 • · e • · t ··· - • · · » · 1 • · • e 45 118010

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEISTÄ INFORMAATIOTA: ; (i) HAKIJA:

(A) NIMI: AB Enzymes GmbH

(B) KATU: Feldbergstrasse 78 (C) KAUPUNKI: D-64293 Darmstadt

(D) MAA: GERMANY

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Actinomaduran ksylanaasisekvenssit ja käyttömenetelmät (lii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 25 (iv) OSOITE KIRJEENVAIHTOA VARTEN: (A) ASIAMIES: Oy Borenius & Co Ab

(B) POSTIOSOITE: Tallberginkatu 2 A

(C) KAUPUNKI: Helsinki i ' (D) MAA: Suomi.

(E) POSTINUMERO: FI-00180 (v) MUUT YHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: 358-9-6866840 (B) TELEFAX: 358-0-6866844^ (vi) PRIORITEETTIHAKEMUSTEN TIEDOT: (A) HAKEMUKSEN NUMBERO: US 08/468,812 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 06-06-1995 (vi) PRIORITEETTIHAKEMUSTEN TIEDOT: ! (A) HAKEMUKSEN NUMERO: US 08/332,412 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 31-10-1994 :**]: (vi) PRIORITEETTIHAKEMUSTEN TIEDOT: [ .·. (A) HAKEMUKSEN NUMBERO: US 08/282,001 1 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 29-07-1994 • · ·

• 1 · I

; (2) INFORMAATIO SEQ ID NO:l:STÄ: I

• · · ’ • · · (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: '·1 1 (A) PITUUS: 1375 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo .. (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti • 1·· (D) TOPOLOGIA: lineaarien ' * « · | ; 1

(ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA (genominen) I

* 1 · • · · *·· * · • · • 1 1 ····1 • 1 ,l .1 v * · · · 1 • · , 46 ' 1 118010 (ix) PIIRRE:

(A) NIMI/AVAIN: CDS

(B) SIJAINTI: 303.. 1334

X

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 1: CCCGGGTATT CATGTGAATG ATTAGCÄACA GTTATGTTAC GGAGATATTT CTGAGAGTGT 60 ; | TGACAGGTCG TGAAGTCGGT CCGATACTTT CGAGCTAGCT CCGATAGTTT TCGATACGCC 120 ' · ' GGCACATCGA GCACGTCGGA CGAGTCACGC GCCACGTCGG TTTTCCGCCG CACGCCGCGC 180 AGAGCGGCCG GAGAACCCCC GCGTGTCCGC GGCATCGGTG CCGGTCCGTC GTTCGCCGCC 240 GACCGCGCGC CGGGTCGCGA CACGCCAGCC CCCATCGGCC CTTCTTCACG AGGAAGCCGT 300 AC ATG AAC GAA CCC CTC ACC ATC ACG CAG GCC AGG CGC CGC AGA CGC 347

Met Asn Glu Pro Leu Thr Ile Thr Gin Ala Arg Arg Arg Arg Arg 15 10 15 CTC GGC CTC CGG CGC ATC GTC ACC AGT GCC TTC GCC CTG GCA CTC GCC 395

Leu Gly Leu Arg Arg Ile Vai Thr Ser Ala Phe Ala Leu Ala Leu Ala 20 25 30 ATC GCC GGT GCG CTG CTG CCC GGC ACG GCC CAC GCC GAC ACC ACC ATC 443

Ile Ala Gly Ala Leu Leu Pro Gly Thr Ala His Ala Asp Thr Thr Ile 35 40 45 ACC CAG AAC CAG ACC GGG TAC GAC AAC GGC TAC TTC TAC TCG TTC TGG 491

Thr Gin Asn Gin Thr Gly Tyr Asp Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Phe Trp 50 55 60 ACC GAC GCG CCC GGG ACC GTC TCC ATG ACC CTC CAC TCG GGC GGC AGC 539

Thr Asp Ala Pro Gly Thr Vai Ser Met Thr Leu His Ser Gly Gly Ser 65 70 75 TAC AGC ACC TCG TGG CGG AAC ACC GGG AAC TTC GTC GCC GGC AAG GGC 587 .* , Tyr Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Vai Ala Gly Lys Gly i ’ : 80 85 90 95 • · TGG TCC ACC GGG GGA CGG CGG ACC GTG ACC TAC AAC GCC TCC TTC AAC 635 .1*1 Trp Ser Thr Gly Gly Arg Arg Thr Vai Thr Tyr Asn Ala Ser Phe Asn : ’ · 100 105 110 : .? • * Ι.Λ CCG TCG GGT AAC GGC TAC CTC ACG CTC TAC GGC TGG ACC AGG AAC CCG 683 ‘IV Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro V ns 120 125 CTC GTC GAG TAC TAC ATC GTC GAG AGC TGG GGC ACC TAC CGG CCC ACC 731

Leu vai Glu Tyr Tyr Ile Vai Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr i 130 135 140 GGC ACC TAC AAG GGC ACC GTC ACC ACC GAC GGG GGA ACG TAC GAC ATC 779 • · Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Vai Thr Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile < ’ 145 150 155 *»< TAC GAG ACC TGG CGG TAC AAC GCG CCG TCC ATC GAG GGC ACC CGG ACC 827 • · Tyr Glu Thr Trp Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Thr Arg Thr 160 165 170 175 : • ·*’*: TTC CAG CAG TTC TGG AGC GTC CGG CAG CAG AAG CGG ACC AGC GGC ACC 875 *··* Phe Gin Gin Phe Trp Ser Vai Arg Gin Gin Lys Arg Thr Ser Gly Thr 1 V 180 185 190 ΐ .. · ATC ACC ATC GGC AAC CAC TTC GAC GCC TGG GCC CGC GCC GGC ATG AAC 923 * · -9 • 4 47 ‘ 118010 4

Ile Thr Ile Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg Ala Gly Met Asn

19 5 200 2 05 M

CTG GGC AGC CAC GAC TAC CAG ATC ATG GCG ACC GAG GGC TAC CAG AGC 971

Leu Glv Ser His Asp Tyr Gin lie Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser . . 210 215 220 AGC GGT AGC TCC ACC GTC TCC ATC AGC GAG GGT GGC AAC CCC GGC AAC 1019

Ser Gly Ser Ser Thr Val Ser lie Ser Glu Gly Gly Asn Pro Gly Asn 225 230 235 CCG GGT AAC CCC GGC AAC CCC GGC AAC CCC GGT AAC CCG GGT AAC CCC 1067

Pro Gly Asn Pro Gly Asn Pro Gly Asn Pro Gly Asn Pro Gly Asn Pro 240 245 250 255 GGC GGT GGC TGC GTC GCG ACC CTC TCC GCC GGC CAG CAG TGG AGC GAC 1115

Gly Gly Gly Cys Val Ala Thr Leu Ser Ala Gly Gin Gin Trp Ser Asp * 260 265 270 ·$ CGC TAC AAC CTC AAC GTC TCG GTC AGC GGC TCG AAC AAC TGG ACG GTC 1163

Arg Tyr Asn Leu Asn Val Ser Val Ser Gly Ser Asn Asn Trp Thr Val 275 280 285 CGG ATG GAC GTG CCC TAC CCG GCC CGC ATC ATC GCC ACC TGG AAC ATC 1211

Arg Met Asp Val Pro Tyr Pro Ala Arg lie lie Ala Thr Trp Asn lie 290 295 300 CAC GCC CAG TGG CCC GAG TCC CAG GTG CTC ATC GCC AGA CCC AAC GGC 1259

His Ala Gin Trp Pro Glu Ser Gin Val Leu lie Ala Arg Pro Asn Gly 305 310 315 AAC GGC AAC AAC TGG GGC GTG ACG ATC CAG CAC AAC GGC AAC TGG ACC 1307

Asn Gly Asn Asn Trp Gly Val Thr lie Gin His Asn Gly Asn Trp Thr 320 325 330 335 TGG CCG ACG GTC ACC TGT ACC GCG AAC TGAGTTCCCG CCCCCAAAGG 1354

Trp Pro Thr Val Thr Cys Thr Ala Asn 340 TGGCGCGGCG GCTCCCGGCC G 1375 • * (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 2: STA: • · • (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 344 aminohappoa • ·’ (B) TYYPPI: aminohappo : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · · : (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 2:

Met Asn Glu Pro Leu Thr Ile Thr Gin Ala Arg Arg Arg Arg Arg Leu 1 5 10 15 * · •*1 Gly Leu Arg Arg Ile Vai Thr Ser Ala Phe Ala Leu Ala Leu Ala Ile 20 25 30 : ; ' Ala Gly Ala Leu Leu Pro Gly Thr Ala His Ala Asp Thr Thr Ile Thr : *.. 35 40 45 I .* Gin Asn Gin Thr Gly Tyr Asp Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Phe Trp Thr ; **.*. 50 55 60 .

’ * Asp Ala Pro Gly Thr Vai Ser Met Thr Leu His Ser Gly Gly Ser Tyr 65 70 75 80 • · 118010 48

Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val Ala Gly Lys Gly Trp 85 90 95

Ser Thr Gly Gly Arg Arg Thr Val Thr Tyr Asn Ala Ser Phe Asn Pro 100 105 HO

Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu 115 120 125 >

Val Glu Tyr Tyr lie Val Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly 130 135 140

Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Asp lie Tyr 145 150 155 160

Glu Thr Trp Arg Tyr Asn Ala Pro Ser lie Glu Gly Thr Arg Thr Phe 165 170 175

Gin Gin Phe Trp Ser Vai Arg Gin Gin Lys Arg Thr Ser Gly Thr He 180 185 190

Thr He Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg Ala Gly Met Asn Leu 195 200 205

Gly Ser His Asp Tyr Gin He Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gin Ser Ser 210 215 220

Gly Ser Ser Thr Val Ser He Ser Glu Gly Gly Asn Pro Gly Asn Pro 225 230 235 240

Gly Asn Pro Gly Asn Pro Gly Asn Pro Gly Asn Pro Gly Asn Pro Gly 245 250 255

Gly Gly Cys Val Ala Thr Leu Ser Ala Gly Gin Gin Trp Ser Asp Arg 260 265 270

Tyr Asn Leu Asn Val Ser Val Ser Gly Ser Asn Asn Trp Thr val Arg 275 280 285

Met Asp Val Pro Tyr Pro Ala Arg He He Ala Thr Trp Asn He His ... 290 295 300 • * * • · φ .· · Ala Gin Trp Pro Glu Ser Gin Val Leu He Ala Arg Pro Asn Gly Asn • 305 310 315 320 e

Gly Asn Asn Trp Gly Val Thr He Gin His Asn Gly Asn Trp Thr Trp :\\ 325 330 335 , / • * I ·, Pro Thr Val Thr Cys Thr Ala Asn :.: ; 340 (2) INFORMAATIO SEQ ID NO: 3: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 1864 emäsparia (B) TYYPPI: nucleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti . . (D) TOPOLOGIA: ei relevantti • •e·'·· • · !···* (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA (genominen) * · * y'/ (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: : (A) ORGANISM: Actinomadura :*·*; (B) KANTA: DSM43186 : ··* (ix) PIIRRE:

(A) NIMI/AVAIN: CDS

* · * • f • ♦ 118010 ΐ! 49 (Β) SIJAINTI: 194..1669 -f (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 3: TTCGGCAGCC TATTGACAAA TTTCGTGAAT GTTTCCCACA CTTGCTCTGC AGACGGCCCC 60 GCCGATCATG GGTGCACCGG TCGGCGGGAC CGTGCTCCGA CGCCATTCGG GGGTGTGCGC 120 CTGCGGGCGC GGCGTCGATC CCGCGGGGAC TCCCGCGGTT CCCTTTCCGT GTCCCTCTAA 180 TGGAGGCTCA GGC ATG GGC GTG AAC GCC TTC CCC AGA CCC GGA GCT CGG 229

Met Gly Vai Asn Ala Phe Pro Arg Pro Gly Ala Arg 345 350 355 CGG TTC ACC GGC GGG CTG TAC CGG GCC CTG GCC GCG GCC ACG GTG AGC 277

Arg Phe Thr Gly Gly Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Ala Thr Vai Ser 360 365 370 GTG GTC GGC GTG GTC ACG GCC CTG ACG GTG ACC CAG CCC GCC AGC GCC 325 Γ

Vai Vai Gly Vai Vai Thr Ala Leu Thr Vai Thr Gin Pro Ala Ser Ala 375 380 385 GCG GCG AGC ACG CTC GCC GAG GGT GCC GCG CAG CAC AAC CGG TAC TTC 373

Ala Ala Ser Thr Leu Ala Glu Gly Ala Ala Gin His Asn Arg Tyr Phe 390 395 400 ' GGC GTG GCC ATC GCC GCG AAC AGG CTC ACC GAC TCG GTC TAC A CC AAC 421

Gly Vai Ala Ile Ala Ala Asn Arg Leu Thr Asp Ser Vai Tyr Thr Asn 405 410 415 420 ATC GCG AAC CGC GAG TTC AAC TCG GTG ACG GCC GAG AAC GAG ATG AAG 469

Ile Ala Asn Arg Glu Phe Asn Ser Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys 425 430 435 ATC GAC GCC ACC GAG CCG CAG CAG GGG CGG TTC GAC TTC ACC CAG GCC 517

Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gin Gin Gly Arg Phe Asp Phe Thr Gin Ala «*· 44 0 445 450 i • · « . 4 * * 1 GAC CGG ATC TAC AAC TGG GCG CGC CAG AAC GGC AAG CAG GTC CGC GGC 565 ; *,* Asp Arg Ile Tyr Asn Trp Ala Arg Gin Asn Gly Lys Gin Vai Arg Gly ;· l 455 460 465 t · · • * * .1" CAC ACC CTG GCC TGG CAC TCG CAG CAG CCG CAG TGG ATG CAG AAC CTC 613 • V His Thr Leu Ala Trp His Ser Gin Gin-Pro Gin Trp Met Gin Asn Leu . . 470 475 480 9 · » - • · * ...

"V AGC GGC CAG GCG CTG CGC CAG GCG ATG ATC AAC CAC ATC CAG GGG GTC 661 1 | ·„· ! Ser Gly Gin Ala Leu Arg Gin Ala Met Ile Asn His Ile Gin Gly Vai 485 490 495 500 ATG TCC TAC TAC CGG GGC AAG ATC CCG ATC TGG GAC GTG GTG AAC GAG 709 i

Met Ser Tyr Tyr Arg Gly Lys Ile Pro Ile Trp Asp Vai Vai Asn Glu i 505 510 515 ; .·, GCG TTC GAG GAC GGA AAC TCC GGC CGC CGG TGC GAC TCC AAC CTC CAG 757 , ‘ Ala Phe Glu Asp Gly Asn Ser Gly Arg Arg Cys Asp Ser Asn Leu Gin f 520 525 530 ΐ t * ’ CGC ACC GGT AAC GAT TGG ATC GAG GTC GCG TTC CGC ACC GCC CGC CAG 805 ' j

Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile Glu Vai Ala Phe Arg Thr Ala Arg Gin * 535 540 545 ·»· • · ’"’i GGG GAC CCC TCG GCC AAG CTC TGC TAC AAC GAC TAC AAC ATC GAG AAC 853 i .. .! Gly Asp Pro Ser Ala Lys Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn ** * 550 555 560 ‘ «* * ···’:' • ♦ * * • « ! · .-.4 118010 i 50 ϊ •f TGG AAC GCG GCC AAG ACC CAG GCG GTC TAC AAC ATG GTG CGG GAC TTC 901

Trp Asn Ala Ala Lys Thr Gin Ala Vai Tyr Asn Met Vai Arg Asp Phe i 565 570 575 580 ! AAG TCC CGC GGC GTG CCC ATC GAC TGC GTG GGC TTC CAG TCG CAC TTC 949

Lys Ser Arg Gly Vai Pro Ile Asp Cys Vai Gly Phe Gin Ser His Phe ! 585 590 595 f AAC AGC GGT AAC CCG TAC AAC CCG AAC TTC CGC ACC ACC CTG CAG CAG 997

Asn Ser Gly Asn Pro Tyr Asn Pro Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gin Gin 600 605 610 TTC GCG GCC CTC GGC GTG GAC GTC GAG GTC ACC GAG CTG GAC ATC GAG 1045

Phe Ala Ala Leu Gly Vai Asp Vai Glu Vai Thr Glu Leu Asp Ile Glu 615 620 625 AAC GCC CCG GCC CAG ACC TAC GCC AGC GTG ATC CGG GAC TGC CTG GCC 1093 -/

Asn Ala Pro Ala Gin Thr Tyr Ala Ser Vai Ile Arg Asp Cys Leu Ala 630 635 640 i GTG GAC CGC TGC ACC GGC ATC ACC GTC TGG GGT GTC CGC GAC AGC GAC 1141

Vai Asp Arg Cys Thr Gly Ile Thr Vai Trp Gly Vai Arg Asp Ser Asp 645 650 655 660 TCC TGG CGC TCG TAC CAG AAC CCG CTG CTG TTC GAC AAC AAC GGC AAC 1189

Ser Trp Arg Ser Tyr Gin Asn Pro Leu Leu Phe Asp Asn Asn Gly Asn 665 670 675 - AAG AAG CAG GCC TAC TAC GCG GTG CTC GAC GCC CTG AAC GAG GGC TCC 1237

Lys Lys Gin Ala Tyr Tyr Ala Vai Leu Asp Ala Leu Asn Glu Gly Ser 680 685 690 GAC GAC GGT GGC GGC CCG TCC AAC CCG CCG GTC TCG CCG CCG CCG GGT 1285 ·'

Asp Asp Gly Gly Gly Pro Ser Asn Pro Pro Vai Ser Pro Pro Pro Gly 695 700 705 GGC GGT TCC GGG CAG ATC CGG GGC GTG GCC TCC AAC CGG TGC ATC GAC 1333 ;

Gly Gly Ser Gly Gin Ile Arg Gly Vai Ala Ser Asn Arg Cys Ile Asp 710 715 720 j * * * [ :v. GTG CCG AAC GGC AAC ACC GCC GAC GGC ACC CAG GTC CAG CTG TAC GAC 1381 S Vai Pro Asn Gly Asn Thr Ala Asp Gly Thr Gin Vai Gin Leu Tyr Asp ; , .·, 725 730 735 740 ' • · » · · !V, TGC CAC AGC GGT TCC AAC CAG CAG TGG ACC TAC ACC TCG TCC GGT GAG 1429 : ·' Cys His Ser Gly Ser Asn Gin Gin Trp Thr Tyr Thr Ser Ser Gly Glu : ,\ 745 750 755 • * ·*«· .·.· TTC CGC ATC TTC GGC AAC AAG TGC CTG GAC GCG GGC GGC TCC AGC AAC 1477 *·* Phe Arg Ile Phe Gly Asn Lys Cys Leu Asp Ala Gly Gly Ser Ser Asn 760 765 770 : GGT GCG GTG GTC CAG ATC TAC AGC TGC TGG GGC GGC GCC AAC CAG AAG 1525 λ

Gly Ala Vai Vai Gin Ile Tyr Ser Cys Trp Gly Gly Ala Asn Gin Lys 775 780 785 \ j .* TGG GAG CTC CGG GCC GAC GGC ACC ATC GTG GGC GTG CAG TCC GGG CTG 1573 *· Trp Glu Leu Arg Ala Asp Gly Thr Ile Vai Gly Vai Gin Ser Gly Leu ·’!* 790 795 800 * · • * TGC CTC GAC GCG GTG GGT GGC GGC ACC GGC AAC GGC ACG CGG CTG CAG 1621 : • V Cys Leu Asp Ala Vai Gly Gly Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Gin ... 805 810 815 820 « CTC TAC TCC TGC TGG GGC GGC AAC AAC CAG AAG TGG TCC TAC AAC GCC 1669 ....: Leu Tyr Ser Cys Trp Gly Gly Asn Asn Gin Lys Trp Ser Tyr Asn Ala 825 830 835 ·· · • · Ψ * • 9 118010 51 TGATCCCCGG CTGATCGACC CTAGTTGAGG CCGTCTCCGG TACGGCACCG TCGGACCGGA 1729 GGCGGTCCCT TGTTCGTCCA GGACGGAAGG ACCGGTCTGA GCAGGCGCGG CGATCGGACA 1789 CCATGGTGGG AGGCACGAAA GCGGGAGGGG GTCGTATTCC GAGACTCCGG GAAGTGGAGG 1849 TGTTCCTCCA CCTGA 1864 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 4: STÄ: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 492 aminohappoa (B) TYPE: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 4:

Met Gly Vai Asn Ala Phe Pro Arg Pro Gly Ala Arg Arg Phe Thr Gly 1 5 10 15

Gly Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Ala Thr Vai Ser Vai Vai Gly Vai 20 25 30

Vai Thr Ala Leu Thr Vai Thr Gin Pro Ala Ser Ala Ala Ala Ser Thr 35 40 45

Leu Ala Glu Gly Ala Ala Gin His Asn Arg Tyr Phe Gly Vai Ala Ile 50 55 60

Ala Ala Asn Arg Leu Thr Asp Ser Vai Tyr Thr Asn Ile Ala Asn Arg 65 70 75 80

Glu Phe Asn Ser Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr ... 85 90 95 f · * • · .t . Glu Pro Gin Gin Gly Arg Phe Asp Phe Thr Gin Ala Asp Arg Ile Tyr : · . loo 105 no V · ! : * Asn Trp Ala Arg Gin Asn Gly Lys Gin Vai Arg Gly His Thr Leu Ala 115 120 125 • · * • - * ! * Trp His Ser Gin Gin Pro Gin Trp Met Gin Asn Leu Ser Gly Gin Ala ; 130 135 140 • e ·.* ’ Leu Arg Gin Ala Met Ile Asn His Ile Gin Gly Vai Met Ser Tyr Tyr 145 150 155 160

Arg Gly Lys Ile Pro Ile Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala Phe Glu Asp 165 170 175

Gly Asn Ser Gly Arg Arg Cys Asp Ser Asn Leu Gin Arg Thr Gly Asn . . 180 185 190 • * * ·

Asp Trp lie Glu Vai Ala Phe Arg Thr Ala Arg Gin Gly Asp Pro Ser 195 200 205 • · !*· Ala Lys Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Asn Ala Ala : 210 215 220 - • f *···" Lys Thr Gin Ala Vai Tyr Asn Met Vai Arg Asp Phe Lys Ser Arg Gly * 225 230 235 240 e···· • · ·. · Vai Pro Ile Asp Cys Vai Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Asn * V 245 250 255 i 118010 :ί 52

Pro Tyr Asn Pro Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gin Gin Phe Ala Ala Leu 260 265 270

Gly Vai Asp Vai Glu Val Thr Glu Leu Asp lie Glu Asn Ala Pro Ala 275 280 285

Gin Thr Tyr Ala Ser Val lie Arg Asp Cys Leu Ala Val Asp Arg Cys 290 295 300 i

Thr Gly lie Thr Val Trp Gly Val Arg Asp Ser Asp Ser Trp Arg Ser 305 310 315 320

Tyr Gin Asn Pro Leu Leu Phe Asp Asn Asn Gly Asn Lys Lys Gin Ala 325 330 335

Tyr Tyr Ala Val Leu Asp Ala Leu Asn Glu Gly Ser Asp Asp Gly Gly 340 345 350

Gly Pro Ser Asn Pro Pro Val Ser Pro Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gly 355 360 365

Gin lie Arg Gly Val Ala Ser Asn Arg Cys lie Asp Val Pro Asn Gly 370 375 380

Asn Thr Ala Asp Gly Thr Gin Val Gin Leu Tyr Asp Cys His Ser Gly 385 390 395 400

Ser Asn Gin Gin Trp Thr Tyr Thr Ser Ser Gly Glu Phe Arg lie Phe 405 410 415

Gly Asn Lys Cys Leu Asp Ala Gly Gly Ser Ser Asn Gly Ala Val Val ! 420 425 430 |

Gin lie Tyr Ser Cys Trp Gly Gly Ala Asn Gin Lys Trp Glu Leu Arg I

435 440 445

Ala Asp Gly Thr lie Val Gly Val Gin Ser Gly Leu Cys Leu Asp Ala 450 455 460 |

Val Gly Gly Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Gin Leu Tyr Ser Cys .··· 465 470 475 480 *.* rf :V Trp Gly Gly Asn Asn Gin Lys Trp Ser Tyr Asn Ala 5 . 485 490 \ί. (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 5: STÄ: * • · · • (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: *. (A) PITUUS: 480 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo ··* (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • :* (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: AM50 ,’* * (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 5: • * • t Met Gly Vai Asn Ala Phe Pro Arg Pro Gly Ala Arg Arg Phe Thr Gly 1 5 10 15 1*1

Gly Leu TY37 Arg Ala Leu Ala Ala Ala Thr Vai Ser Vai Vai Gly Vai «· · .

• · f • · • · 118010 53 20 25 30

Vai Thr Ala Leu Thr Vai Thr Gin Pro Ala Ser Ala Ala Ala Ser Thr 35 40 45

Leu Ala Glu Gly Ala Ala Gin His Asn Arg Tyr Phe Gly Vai Ala Ile 50 55 60

Ala Ala Asn Arg Leu Thr Asp Ser vai Tyr Thr Asn Ile Ala Asn Arg 65 70 75 80

Glu Phe Asn Ser Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr 85 90 95

Glu Pro Gin Gin Gly Arg Phe Asp Phe Thr Gin Ala Asp Arg Ile Tyr 100 105 110 ! <

Asn Trp Ala Arg Gin Asn Gly Lys Gin Vai Arg Gly His Thr Leu Ala 115 120 125

Trp His Ser Gin Gin Pro Gin Trp Met Gin Asn Leu Ser Gly Gin Ala 130 135 140

Leu Arg Gin Ala Met Ile Asn His Ile Gin Gly Vai Met Ser Tyr Tyr 145 150 155 160

Arg Gly Lys Ile Pro Ile Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala Phe Glu Asp 165 170 175

Gly Asn Ser Gly Arg Arg Cys Asp Ser Asn Leu Gin Arg Thr Gly Asn j 180 185 190

Asp Trp Ile Glu Vai Ala Phe Arg Thr Ala Arg Gin Gly Asp Pro Ser 195 200 205

Ala Lys Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Asn Ala Ala 210 215 220 ,·»· Lys Thr Gin Ala Vai Tyr Asn Met Vai Arg Asp Phe Lys Ser Arg Gly *.· ' 225 230 235 240 M «

♦ I

: Vai Pro Ile Asp Cys Vai Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Asn , 245 250 255 • · 1 * * »

Pro Tyr Asn Pro Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gin Gin Phe Ala Ala Leu : . 260 265 270

• I

ϊ.ϊ ; Gly Vai Asp Vai Glu Vai Thr Glu Leu Asp Ile Glu Asn Ala Pro Ala ,·.* 275 280 285 • « *

Gin Thr Tyr Ala Ser Vai Ile Arg Asp Cys Leu Ala Vai Asp Arg Cys 290 295 300

Thr Gly Ile Thr Vai Trp Gly vai Arg Asp Ser Asp Ser Trp Arg Ser 305 310 315 320 ! ."· Tyr Gin Asn Pro Leu Leu Phe Asp Asn Asn Gly Asn Lys Lys Gin Ala *··*· 325 330 335 ··· • t

Tyr Tyr Ala Vai Leu Asp Ala Leu Asn Glu Gly Ser Asp Asp Gly Gly ..* * 340 345 350 • t I · *... Gly Pro Ser Asn Pro Pro Vai Ser Pro Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gly J.,,' 355 360 365 • ·

Gin Ile Arg Gly Vai Ala Ser Asn Arg Cys Ile Asp Vai Pro Asn Gly 370 375 380 *· · • * » * * ...

t

118010 I

54

Asn Thr Ala Asp Gly Thr Gin Val Gin Leu Tyr Asp Cys His Ser Gly / 385 390 395 400

Ser Asn Gin Gin Trp Thr Tyr Thr Ser Ser Gly Glu Phe Arg lie Phe 405 410 415

Gly Asn Lys Cys Leu Asp Ala Gly Gly Ser Ser Asn Gly Ala Val Val i 420 425 430

Gin lie Tyr Ser Cys Trp Gly Gly Ala Asn Gin Lys Trp Glu Leu Arg 435 440 445

Ala Asp Gly Thr He Val Gly val Gin Ser Gly Leu Cys Leu Asp Ala 450 455 460 ΐ

Val Gly Gly Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Gin Leu Tyr Ser Cys 465 470 475 480 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 6: STÄ: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 434 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: U08894 ' · 1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 6: »*;*. Met Pro Ile Asn Vai Met Pro Arg Pro Gly Ala Arg Lys Xaa Xaa Xaa *1 5 10 15 ; 1« · * * • · Xaa Xaa Xaa Arg Ala Leu Leu Ala Gly Ala Vai Gly Leu Leu Thr Ala • 20 25 30 a· **· . Ala Ala Ala Leu Vai Ala Pro Ser Pro Ala Vai Ala Ala Glu Ser Thr : * 35 40 45 • * : Leu Gly Ala Ala Ala Ala Gin Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile : 50 55 60

Ala Ser Gly Arg Leu Asn Asp Ser Thr Tyr Thr Thr Ile Ala Asn Arg 65 70 75 80

Glu Phe Asn Met Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr 85 90 95 i ;,i ; Glu Pro Asn Arg Gly Gin Phe Asn Phe Ser Ser Ala Asp Arg Ile Tyr *·;. 100 105 110

* J

**. , Asn Trp Ala Vai Gin Asn Gly Lys Gin Vai Arg Gly His Thr Leu Ala ♦·. 115 120 125 : f · .···. Trp His Ser Gin Gin Pro Gly Trp Met Gin Ser Leu Ser Gly Ser Ser *... 130 135 140 ; • · ····: Leu Arg Gin Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Vai Met Ala His Tyr .. . 145 150 155 160 f · ‘ • , . -.4, « · it» 118010 'hl 55

Lys Gly Lys Ile Vai Gin Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala Phe Ala Asp I

165 170 175

Gly Asn Ser Gly Gly Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gin Arg Thr Gly Asn 180 185 190

Asp Trp Ile Glu Val Ala Phe Arg Thr Ala Arg Asn Ala Asp Pro Asn 195 200 205

Ala Lys Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn lie Glu Asn Trp Asn Trp Ala 210 215 220

Lys Thr Gin Gly Val Tyr Met Asn Val Arg Asp Phe Lys Gin Arg Gly 225 230 235 240

Val Pro He Asp Cys Val Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Ser 245 250 255

Pro Tyr Asn Ser Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gin Asn Phe Ala Ala Leu 260 265 270

Gly Vai Asp Val Ala He Thr Glu Leu Asp He Gin Gly Ala Ser Pro 275 280 285

Thr Thr Tyr Ala Asn Val Val Asn Asp Cys Leu Ala Val Ser Arg Cys 290 295 300

Leu Gly He Thr Val Trp Gly Val Arg Asp Thr Asp Ser Trp Arg Ser 305 310 315 320

Asp Gin Thr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Gly Asn Lys Lys Ala Ala 325 330 335

Tyr Ser Ala Val Leu Asn Ala Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Gly Gly 340 345 350

Gly Thr Ser Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Pro Pro Ala Ser Asp Ala Gly 355 360 365 .**’ Thr lie Lys Gly Val Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp val Pro Asn Ala ’·* " 370 375 380 ft ft * • ♦ 2 • * Ser Thr Ser Asp Gly Val Gin Leu Gin Leu Trp Asp Cys His Gly Gly . 385 390 395 400 ft · ' ft ft» »*·’ Thr Asn Gin Gin Trp Thr Tyr Thr Asp Ser Gin Glu Leu Arg Val Tyr : *' 405 . 410 415 • « ·** * Gly Asn Lys Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Gly Asn Gly Thr Lys Val 420 425 430 V 1

Gin He (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 7: STÄ: / (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: T ,· (A) PITUUS: 492 aminohappoa : ··* (B) TYYPPI: aminohappo :T (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti *· . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • ft • · *..! ; (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: peptidi »·» - j ♦ ft *:*· (viii) SIJAINTI GENOMISSA: -t (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: AM50 • · 118010 ί 56 : ! (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 7:

Met Gly Vai Asn Ala Phe Pro Arg Pro Gly Ala Arg Arg Phe Thr Gly * ' 1 5 10 15

Gly Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Ala Thr Vai Ser Vai Vai Gly Vai 20 25 30 ·

Vai Thr Ala Leu Thr Vai Thr Gin Pro Ala Ser Ala Ala Ala Ser Thr 35 40 45

Leu Ala Glu Gly Ala Ala Gin His Aan Arg Tyr Phe Gly Vai Ala Ile 50 55 60

Ala Ala Asn Arg Leu Thr Asp Ser Vai Tyr Thr Asn Ile Ala Asn Arg 65 70 75 80

Glu Phe Asn Ser Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr 85 90 95

Glu Pro Gin Gin Gly Arg Phe Asp Phe Thr Gin Ala Asp Arg Ile Tyr 100 105 110

Asn Trp Ala Arg Gin Asn Gly Lys Gin Vai Arg Gly His Thr Leu Ala 115 120 125

Trp His Ser Gin Gin Pro Gin Trp Met Gin Asn Leu Ser Gly Gin Ala 130 135 140

Leu Arg Gin Ala Met Ile Asn His Ile Gin Gly Vai Met Ser Tyr Tyr 145 150 155 160 .

Arg Gly Lys Ile Pro Ile Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala Phe Glu Asp 165 170 175 ·. ‘

Gly Asn Ser Gly Arg Arg Cys Asp Ser Asn Leu Gin Arg Thr Gly Asn 180 185 190

Asp Trp Ile Glu Vai Ala Phe Arg Thr Ala Arg Gin Gly Asp Pro Ser . 195 200 205 » « * • ·

Ala Lys Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Asn Ala Ala • ί ί 210 215 · 220 • 4 · * · · * ’ · Dys Thr Gin Ala Vai Tyr Asn Met Vai Arg Asp Phe Lys Ser Arg Gly . . 225 230 235 240 ^ ·*·* Vai Pro Ile Asp Cys Vai Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Asn : 245 250 255

Pro Tyr Asn Pro Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gin Gin Phe Ala Ala Leu 260 265 270 Ί

Gly Vai Asp Vai Glu Vai Thr Glu Leu Asp Ile Glu Asn Ala Pro Ala 275 280 285 • · * Gin Thr Tyr Ala Ser Vai Ile Arg Asp Cys Leu Ala Vai Asp Arg Cys .•f. 290 295 300 • · ] • · Thr Gly Ile Thr Vai Trp Gly Vai Arg Asp Ser Asp Ser Trp Arg Ser ·**.. 305 310 315 320 a

Tyr Gin Asn Pro Leu Leu Phe Asp Asn Asn Gly Asn Lys Lys Gin Ala *t\ 325 330 335 ; ’ • · · · · • · • * * * · 118010 57

Tyr Tyr Ala Val Leu Asp Ala Leu Asn Glu Gly Ser Asp Asp Gly Gly 340 345 350

Gly Pro Ser Asn Pro Pro Val Ser Pro Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gly 355 360 365

Gin Ile Arg Gly Vai Ala Ser Asn Arg Cys He Asp Val Pro Asn Gly 370 375 380

Asn Thr Ala Asp Gly Thr Gin Val Gin Leu Tyr Asp Cys His Ser Gly 385 390 395 400

Ser Asn Gin Gin Trp Thr Tyr Thr Ser Ser Gly Glu Phe Arg lie Phe 405 410 415

Gly Asn Lys Cys Leu Asp Ala Gly Gly Ser Ser Asn Gly Ala Val Val 420 425 430

Gin He Tyr Ser Cys Trp Gly Gly Ala Asn Gin Lys Trp Glu Leu Arg 435 440 445

Ala Asp Gly Thr He Val Gly Val Gin Ser Gly Leu Cys Leu Asp Ala 450 455 460

Val Gly Gly Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Gin Leu Tyr Ser Cys 465 470 475 480

Trp Gly Gly Asn Asn Gin Lys Trp Ser Tyr Asn Ala 485 490 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 8: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 491 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ..... (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: peptidi • · · • · * : ;* (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: M64551 • · « * * * • · • · :;V * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 8: • · · ' ' .4 *’ ’ Met Gly Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Ser Gly Vai Arg Arg Ser He Arg 1 5 10 15 |

Vai Leu Xaa Xaa Xaa Leu Ala Ala Leu Vai Vai Gly Vai Leu Gly Thr 20 25 30 . . Ala Thr Ala Leu He Ala Pro Pro Gly Ala His Ala Ala Glu Ser Thr ' 35 40 45 i ; - Leu Gly Ala Ala Ala Ala Gin Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile ; *. . 50 55 60 • · ; " Ala Ser Gly Arg Leu Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Ser Ile Ala Gly Arg 65 70 75 80 * · * ; Glu Phe Asn Met Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys He Asp Ala Thr ·:**; 85 90 95 * · · * · * • · • * 118010 58

Glu Pro Gin Arg Gly Gin Phe Asn Phe Ser Ser Ala Asp Arg Val Tyr 100 105 110

Asn Trp Ala Val Gin Asn Gly Lys Gin Val Arg Gly His Thr Leu Ala 115 120 125 i k

Trp His Ser Gin Gin Pro Gly Trp Met Gin Ser Leu Ser Gly Arg Pro 130 135 140

Leu Arg Gin Ala Met He Asp His He Asn Gly Val Met Ala His Tyr 145 150 155 ISO "i

Lys Gly Lys He Val Gin Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ala Asp 165 170 175

Gly Ser Ser Gly Ala Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gin Arg Ser Gly Asn 180 185 190

Asp Trp lie Glu Val Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ser 195 200 205

Ala Lys Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Val Glu Asn Trp Thr Trp Ala 210 215 220

Lys Thr Gin Ala Met Tyr Asn Met Val Arg Asp Phe Lys Gin Arg Gly 225 230 235 240

Val Pro He Asp Cys Val Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Ser 245 250 255

Pro Tyr Asn Ser Asn phe Arg Thr Thr Leu Gin Asn Phe Ala Ala Leu 260 265 270

Gly Vai Asp Val Ala He Thr Glu Leu Asp He Gin Gly Ala Pro Ala 275 280 285

Ser Thr Tyr Ala Asn Val Thr Asn Asp Cys Leu Ala Val Ser Arg Cys 290 295 300

Leu Gly He Thr Val Trp Gly Val Arg Asp Ser Asp Ser Trp Arg Ser 305 310 315 320 j1·1« Glu Gin Thr Pro Leu Leu Phe Asn Asn Asp Gly Ser Lys Lys Ala Ala ·’ ‘ 325 330 335 • 1 · • · » * ·' Tyr Thr Ala Val Leu Asp Ala Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Gly Gly : ;1: 340 ' 345 350 • « ·

Asp Ser Ser Glu Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp Gly Gly \ · 355 360 365 * 1 1 **·/ Gin He Lys Gly Val Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp Val Pro Asp Ala . 370 375 380

Ser Thr Ser Asp Gly Thr Gin Leu Gin Leu Trp Asp Cys His Ser Gly 385 390 395 400

Thr Asn Gin Gin Trp Ala Ala Thr Asp Ala Gly Glu Leu Arg Val Tyr 405 410 415 J : ί Gly Asp Lys Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Ser Asn Gly Ser Lys Val - ·". 420 425 430 • · . Gin He Tyr Ser Cys Trp Gly Gly Asp Asn Gin Lys Trp Arg Leu Asn ··. 435 440 445 • · 1· .**·. Ser Asp Gly Ser Val Val Gly Val Glri Ser Gly Leu Cys Leu Asp Ala ·· · • J! • · »· · • · · · 118010 59 450 455 460 ·’

Vai Gly Asn Gly Thr Ala Asn Gly Thr Leu Ile Gin Leu Tyr Thr Cys ΐ 465 470 475 480

Ser Asn Gly Ser Asn Gin Arg Trp Thr Arg Thr 485 490 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 9: STÄ: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti 1 (D) TOPOLOGIA: ei relevantti (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: peptidi (viii) SIJAINTI GENOMISSA: , (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: #1696 (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 9:

Ala Ala Ser Thr Leu Ala Glu Gly Ala Ala Gin His Asn Arg 1 5 10 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 10: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 10 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: ei relevantti (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: peptidi " • 1 « •

·'·1. (viii) SIJAINTI GENOMISSA

* : (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: #1697

V · V

• · :·.2. (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 10: * · : :1: Tyr Phe Gly Vai Ala Ile Ala Ala Asn Arg 1 5 10 · ~ • · (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 11: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 12 aminohappoa - (B) TYYPPI: aminohappo : ;· (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: ei relevantti « · • · e1· · . (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: peptidi • · • · *... (viii) SIJAINTI GENOMISSA » ·1...1 (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: #1698 • · * · · 1 t f • » 2 • · ' .-¾ 118010 (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 11:

Leu Asn Asp Ser Vai Tyr Thr Asn Ile Ala Asn Arg / 1 5 10 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 12: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 9 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: ei relevantti (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: #1699 l (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: Peptidi (B) PAIKKA: 1 (D) MUU INFORMAAIO: /huom= "Paikka 1 voi olla Asn,

Gly tai Xaa" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 12:

Xaa Thr Gly Ile Thr Vai Xaa Gly Vai 1 5 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 13: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 11 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: ei relevantti

j'*‘ (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: peptidi I

\:.r (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: #1703 • · !.;*i (ix) PIIRRE: i

lv (A) NIMI/AVAIN: Peptidi I

(B) PAIKKA: 1 (D) MUU INFORMAAIO: /huom= "Paikka 1 voi olla His,

Glu tai Thr" (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: Peptidi • ;*· (B) PAIKKA: 2 (D) MUU INFORMAATIO: /huom= "Paikka 2 voi olla Glu tai Phe" • · ψ * * ·* ! • ! • · · * « * • · • · * · • · * 1 • » e * • * •5η, 118010 61 (ix) PIIRRE: (A) NIMI /AVAIN: Peptidi (B) PAIKKA: 3 (D) MUU INFORMAATIO: /huom= "Paikka 3 voi olla Leu tai Asn" f (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: Peptidi (B) PAIKKA: 4 (D) MUU INFORMAATIO: /huom= "Paikka 4 voi ola Vai tai Ser" (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: Peptidi (B) PAIKKA: 5 (D) MUU INFORMAATIO: /huom= "Paikka 5 voi olla Tyr tai Vai" (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: Peptidi (B) PAIKKA: 6 (D) MUU INFORMAATIO: /huom= "Paikka 6 voi olla Asn tai Thr" (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: Peptidi .

(B) PAIKKA: 7 (D) MUU INFORMAATIO: /huom= "Paikka 7 voi Olla Met tai Ala" (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN: Peptidi (B) PAIKKA: 8 ·*:* (D) MUU INFORMAATIO: /huom= "Paikka 8 voi olla Vai , tai Glu" i (ix) PIIRRE: *·:· (A) NI MI /AVAIN: Peptidi :*·’ (B) PAIKKA: 9 " I I (D) MUU INFORMATIO: /huom= "Paikka 9 voi olla Asn tai ; Xaa" • * !·: (ix) PIIRRE: ! 'f (A) NIMI/AVAIN: Peptidi : ‘ (B) PAIKKA: 10 (D) MUU INFORMAATIO: /huom= "Paikka 10 voi olla Glu tai Xaa" : :* (ix) PIIRRE: (A) NI MI /AVAIN: Peptidi V (B) PAIKKA: 11 ..* * (D) MUU INFORMAATIO: /huom*= "Paikka 11 voi olla Met I ’·· tai Xaa" · · • .

··· • ♦ • a · · · ·* f • · * • * ' • * Ί (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 13: 118010 62

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 14: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti : (D) TOPOLOGIA: ei relevantti (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: #1704 (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 14;

Glu Phe Asn Ser Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys 1 5 10 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 15: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 14 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: ei relevantti (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi • * • · 4 (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: Ϊ V (A) ORGANISMI: S. lividans • « * (viii) SIJAINTI GENOMISSA:

\ (A) KROMOSOMI /SEGMENTTI: XlnA

• « : (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 15: * » t · * Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala Ala Ala Ala Gin Ser Gly Arg 15 10 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 16: STA: . , (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ·.: (A) PITUUS: 10 aminohappoa .*!· (B) TYYPPI: aminohappo *·) . (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti ··, (D) TOPOLOGIA: ei relevantti • · (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: peptidi ··· • * ····- ·;·>ι • · ·

I · I

♦ • · 118010 63 . I ' .. / (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: S. lividans (viii) SIJAINTI GENOMISSA:

(A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: XlnA

(xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 16:

Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly Arg 1 5 10 (2) INFORMAATIO SEK ID NO:17:STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: ei relevantti (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: S. lividans / (viii) SIJAINTI GENOMISSA:

(A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: XlnA

(xl) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 17:

Leu Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Ser Ile Ala Gly Arg 1 5 10 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 18: STA: :*:V (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ;·,· (A) PITUUS: 12 aminohappoa ! · (B) TYYPPI: aminohappo : ·* (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: ei relevantti • · • ,V (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: peptidi / • · * ·.?< * · f :Y (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE:

' (A) ORGANISMI: S. lividans ',Y

(viii) SIJAINTI GENOMISSA:

(A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: XlnA

. , (Xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 18: > • · • * t · ♦

Glu Phe Asn Met Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys 1 5 10 • · « « : · , • « · k * • · * • · • · · • * (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 19: STA: 1 118010 .

64 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 13 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: ei relevantti (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: S. lividans (viii) SIJAINTI GENOMISSA:

(A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: XlnA

(xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 19:

Ser Arg Cys Leu Gly Ile Thr Vai Trp Gly Vai Arg Asp 1 5 10 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 20: STÄ: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: 1 (A) PITUUS: 16 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Actinomadura sp. DSM43186 ,·:* (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: #1696s 1 • * ‘ ΐ (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 20: • · * *

f.· GCNGCNCAVA YAAYMG

: * 16 « · • * » ft - ;:y (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 21: STÄ: • (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 16 emäsparia 1 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * · * * · .

*"!. (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA (genominen) 1 * « * (iv) ANTI-SENSE: KYLLÄ • ft • · • · · .--)1 ft ft ft · · ft ft • · · · " ft ft* * ft ft -ft • · 118010 65 (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Actinomadura sp. DSM43186 (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: #1703as (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 21: ACCATRTTRT ANACNA 16 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 22: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) ; (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: / (A) ORGANISMI: Actinomadura sp. DSM43186 (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: #1704as (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 22: TTCATYTCRT TYTCNGC 17 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 2 3: STA: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: V (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 1 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • * f : V (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA (genominen) • · • ♦ - ;;*V (iv) ANTI-SENSE: KYLLÄ ·*· * ·

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE

(A) ORGANISMI: S. lividans : , (viii) SIJAINTI GENOMISSA: (A) KROMOSOMi/SEGMENTTI: xlnA 331-369as • · » · v * *t· ·*" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 23: * a * S\ CGTGAGTTCA ACATGGTGAC GGCCGAGAAC GAGATGAAG 3 9 «a * ♦ · * '' ·.-a a «·· • · at»·' • · · • · f « · (2) INFORMAATIO SEQ ID NO: 24: STÄ: 118010 66 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 2 8 emäs pari a.

(B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisaikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) ' (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: S. lividans

(viii) SIJAINTI GENOMISSA

(A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: xlnA 257-284S

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 24: AGAGCGGCCG CTACTTCGGC ACCGCCAT 28 (2) INFORMAATIO SEK ID NO: 2 5: STÄ: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 32 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLI TYYPPI: DNA (genominen) ί (iv) anti-sense: kyllä * 1 1 : (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: . (A) ORGANISMI: S. lividans • · · *** (viii) SIJAINTI GENOMISSA: *. ! (A) KROMOSOMI/SEGMENTTI: xlnA 530-561as * 1 1 ψ *' ’ (xi) SEKVENSSI KUVAUS: SEK ID NO: 25: ; CACGCCGTTG ATGTGGTCGA TCATCGCCTG GC 32 • · « • · · · ♦ 1 1 « · · .

• · • · * * · · * · * 1 · ' · · · » • 1 • 1 · • · • 1

Claims (28)

118010

1. Eristetty DNA, tunnettu siitä, että se koodaa Actinomadura flexuosan (DSM 43186) ksyianaasin aminohapposekvenssiä, joka sisältää kuvan 13 mukaisen aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on vähintään 85 %:sti homologinen mainitun kuvan 13 mukaisen aminohapposekvenssin kanssa ja jolla on ksylanolyyttinen aktiivisuus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA, tunnettu siitä, että se sisältää kuvan 13 mukaisen nukleiinihapposekvenssin.

3. Eristetty DNA, tunnettu siitä, että se koodaa Actinomadura flexuosan (DSM 43186) ksyianaasin aminohapposekvenssiä, joka sisältää kuvan 14 mukaisen aminohapposekvenssin tai aminohapposekvenssin, joka on vähintään 85 %:sti : homologinen mainitun kuvan 14 mukaisen aminohapposekvenssin kanssa ja jolla on ksylanolyyttinen aktiivisuus.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen eristetty DNA, tunnettu siitä, että se sisältää kuvan 14 mukaisen nukleiinihapposekvenssin. • 1 · • · 1 • · · ·’·1; 5. Eristetty DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se on peräisin plasmidista * · ; pALK.923 (DSM 9322), pALK938 (DSM 9899), pALK939 (DSM 9900), pALK940 • 1 · :1··; (DSM 9901), pALK941 (DSM 9902) tai pALK1056 (DSM 9903), joka koodaa • 1 • ;1: Actinomadura flexuosan (DSM 43186) 35 kDa ksylanaasia. e · « « • 1 · *

6. Eristetty DNA-fragmentti tunnettu siitä, että se on peräisin plasmidista pALK927 (DSM 9447) tai plasmidista pALK928 (DSM 9448), joka koodaa Actinomadura : flexuosan (DSM 43186) 50 kDa ksylanaasia. ; e ··2· .·1·. 7. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa , 1. Actinomadura flexuosan (DSM 43186) ksyianaasin aminohapposekvenssiä ja mainittu * · · • 1 1 « · · · · • 1 · * · · 2 • · 118010 aminohapposekvenssi sisältää kuvan 13 mukaisen aminohapposekvenssin tai kuvan 13 mukaisen aminohapposekvenssin kanssa vähintään 85 %:sti homologisen aminohapposekvenssin, jolla on ksylanolyyttinen aktiivisuus. I

8. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa Actinomadura flexuosan (DSM 43186) ksylanaasin aminohapposekvenssiä ja mainittu aminohapposekvenssi sisältää kuvan 14 mukaisen aminohapposekvenssin tai kuvan 14 mukaisen aminohapposekvenssin kanssa vähintään 85 %:sti homologinen aminohapposekvenssin, jolla on ksylanolyyttinen aktiivisuus.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa kuvan 13 mukaista aminohapposekvenssiä.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa kuvan 14 mukaista aminohapposekvenssiä.

11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi on kuvan 13 mukainen. ·1·1· 12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että mainittu DNA-sekvenssi on kuvan 14 mukainen. • · t • · · * 1 1

13. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää • · DNA-fragmentin plasmidista pALK923 (DSM 9322), pALK938 (DSM 9899), pALK939 ··· · :T: (DSM 9900), pALK940 (DSM 9901), pALK941 (DSM 9902) tai pALK1056 (DSM 9903), joka koodaa Actinomadura flexuosan (DSM43186) 35 kDa ksylanaasia. 118010 I

15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 7-14 mukainen yhdistelmävektori, joka I sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen eristetyn DNA-sekvenssin, I tunnettu siitä, että mainittu eristetty DNA-sekvenssi kytketään toiminnallisesti I homologiseen ksylanaasipromoottoriin tai Trichoderma reesein cbhl-promoottoriin. I

16. Yhdistelmä isäntä, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on Trichoderma spp, ja se I on transformoitu minkä tahansa patenttivaatimuksen 7-15 mukaisella I yhdistelmävektorilla. I

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen yhdistelmäisäntä, tunnettu siitä, että mainittu I isäntä on Trichoderma reesei.

18. Kasvualusta, tunnettu siitä, että se sisältää Trichoderma-yhdistelmäisännän viljelyssä eritettyjä 35 kDa tai 50 kDa ksylanaasientsyymejä, joka yhdistelmäisäntä on saatu transformoimalla minkä tahansa patenttivaatimuksen 7-15 mukaisella yhdistelmävektorilla.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen kasvualusta, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on T. reesei. • · · • · * • · ·

20. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 18-19 mukainen kasvualusta, tunnettu siitä, : että 35 kDa tai 50 kDa ksylanaasin aminohapposekvenssiä koodaava DNA kytketään : '1 toiminnallisesti homologiseen ksylanaasipromoottoriin tai T. reesein cM/-promoottoriin. * e * * * • · · * * * * ϊ.: *· 21. Entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että se on saatu kasvualustasta ultrasuodatuksella, kuivauksella, haihdutuksella, saostuksella, immobilisaatiolla tai millä ·« ♦ *·· tahansa "downstream"-käsittelymenetelmällä, mainitun kasvualustan sisältäessä • ♦ · rn6-Ao</em<z-yhdistelmäisännän viljelyn aikana eritettyjä 35 kDa tai 50 kDa ·;··· ksylanaasientsyymejä, joka yhdistelmäisäntä on saatu transformoimalla minkä tahansa ' :1; patenttivaatimuksen 7-15 mukaisella yhdistelmävektorilla. ·»« : ' v» j, • · · 118010

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että mainittu yhdistelmäisäntä on T. reesei.

23. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 21-22 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että 35 kDa tai 50 kDa ksylanaasin aminohapposekvenssiä koodaava DNA on toiminnallisesti kytketty homologiseen ksylanaasipromoottoriin tai I reesein cbhl-promoottoriin.

24. Biovalkaisumenetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa menetelmässä massaan lisätään kasvualustaa, mikä sisältää Trichoderma-yhdistelmäisännän viljelyn aikana eritettämiä 35 kDa tai 50 kDa ksylanaasientsyymejä, joka yhdistelmäisäntä on saatu j transformoimalla minkä tahansa patenttivaatimuksen 7-15 mukaisella yhdistelmävektorilla.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on ; 50-80 °C, edullisesti 70 °C.

26. Menetelmä kasvibiomassan kemialliseksi käsittelemiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä mainittu biomassa saatetaan kosketukseen kasvualustan kanssa yli 50 °C:n lämpötilassa ja yli 6,0:n pH-arvossa ja mainittu kasvualusta sisältää Trichoderma-yhdistelmäisännän viljelyn aikana eritettyjä 35 kDa tai 50 kDa ksylanaasientsyymejä, • · : joka yhdistelmäisäntä on saatu transformoimalla minkä tahansa patenttivaatimuksen 7-15 • · · :**]: mukaisella yhdistelmävektorilla. * 1 • · 1 • 1 · • e · · : 27. Biovalkaisumenetelmä, tunnettu siitä, että massaan lisätään minkä tahansa patenttivaatimuksen 18-23 mukaista kasvualustaa tai entsyymivalmistetta. ·· • · • · · # 1 1 « ί.,,ί 28. Menetelmä kasvibiomassan kemialliseksi käsittelemiseksi, tunnettu siitä, että mainittu biomassa saatetaan kosketukseen minkä tahansa patenttivaatimuksen 18-23 ·"**· mukaisen kasvualustan tai entsyymivalmisteen kanssa yli 50 °C:n lämpötilassa, • 1 1 . edullisesti 70 °C:n lämpötilassa. * · · *·1 ♦ • a · • »· • 1 118010 '