FI118009B - Termostabiilin ksylanaasin käyttömenetelmä - Google Patents

Description

1 118009 :

Termostabiilin ksylanaasin käyttömenetelmä : Förfarande för användning av termostabilt xylanas

Keksintö kohdistuu termostabiileja entsyymejä koskevaan alaan ja mainittujen entsyymien käyttöön. Erityisesti keksinnön alaa ovat alhaisessa pH:ssa ja korkeassa lämpötilassa aktiivisten ksylanaasien käyttö kasvibiomassan käsittelemiseksi.

Hemiselluloosan pääasiallinen ainesosa ksylaani on polymeeri, joka koostuu β(1,4)-sidoksin liittyneiden D-ksyloositähtei- '(! den (usein asetyloitujen) muodostamasta rungosta, jossa on α-L-arabinofuranoosi- ja glukuronihapposivuketjuja (Timell, T.E., et ai., Wood Sei. Technol. 1·. 45-70 (1967)). Ksylaani on selluloosan jälkeen toiseksi runsain kasvibiomassan hiili-hydraattiosa. Viime aikoina ksylaani on saanut osakseen kasvavaa huomiota uusiutuvana luonnonvarana.

Ksylaanin täydelliseen hajottamiseen liukoisiksi monomeereiksi tarvitaan sen monimutkaisuuden vuoksi useampi kuin yksi entsyymi. Ksylaania voivat hydrolysoida monet hemisellulaasit, kuten esimerkiksi fö-l,4-ksylanaasit (EC 3.2.1.8), β-ksylosi- • » “j daasit ja useat haarautumista poistavat entsyymit (Biely, P.,

Trends Biotechnol. 3: 286-290 (1985); Dekker, R.F.H., teok- • · « !;··* sessa Hignehi, T., toim., Biosynthesis and biodegradation of * · « • ·* wood components (Academic Press Inc., Orlando), s. 505-533 • · : (1985); Woodward, J., Top Enzyme Ferment. Biotechnol. 8: 9-30 • · * : (1984)) . Näiden entsyymien aktiivisuuksilla on tärkeä merkitys maaperän kasvikarikkeen hajotuksessa, ja niitä on tutkittu ·**.. perusteellisesti sekä bakteereissa että sienissä (Wong, .···. K.K.Y., et ai., Microbiol. Rev. 52: 305-317 (1988); Poutanen, • · ·

•. K., et ai., teoksessa Enzymes in biomass conversion (ACS

• * i ;;.ii • * · t 1 • * .

• · · • · · • · · • · · « • · 7 • · · • · · )

'I

118009 1 2

Symposium sarja 460), Leatham & Himmel, toim., American r

Chemical Society, Washington DC (1991), s. 426-436; Gilbert & Hazlewood, J. Gen. Microbiol. 139: 187-194 (1993)). 1

Monet eri mikro-organismit erittävät entsyymejä, jotka pystyvät hajottamaan ksylaaneja, ja ksylanaaseja onkin löydetty sekä prokaryooteista että eukaryooteista (Dekker, R.F.H., Richards, G.N., Adv. Carbohydrate Chem. Biochem. 32: 277-352 (1976)). Ksylanolyyttiset mikro-organismit tuottavat usein monia erilaisia (multiple) ksylanaaseja hajottamaan näissä molekyyleissä olevia erilaisia sidoksia. Kaikki toistaiseksi karakterisoidut ksylanaasit sopivat kahteen luokkaan: korkea

Mr/matala pl-luokkaan ja matala Mr/korkea pl-luokkaan, jotka sopivat vastaavasti yhteen glykosyylihydrolaasiperheiden 10 ja 11 kanssa (Henrissat & Bairoch, Biochem. J. 293: 781-788 (1993) ) .

Ksylanaasien kloonaus on selostettu Actinomadura sp. FC7:stä Γ-' (Ethier, J.-F. et ai., teoksessa: Industrial Microorganisms:

Basic and Applied Molecular Genetics, R. Baltz, et ai., toim.

(Proc. 5th ASM Conf. Gen. Mol. Biol. Indust. Microorg., 11-15. lokakuuta, 1992, Bloomington, Indiana, posteri C25); bakteereista (esim, Ghangas, G.S., et ai., J. Bacteriol. 171: 2963-2969 (1989); Lin, L.-L., Thomson, J.A., Mol. Gen. Genet.

* * * 228: 55-61 (1991); Shareck, F., et ai., Gene 107: 75-82 (1991); Scheirlinck, T., et ai., Appi. Microbiol. Biotechnol.

• ·.·’ 33: 534-541 (1990); Whitehead, T.R., Lee, D.A., Curr. Micro- : biol. 23: 15-19 (1991); ja sienistä (Boucher, F. et ai., : Nucleic Acids Res. 16: 9874 (1988); Ito, K. et ai., Biosci.

• · · » ;*·*; Biotec. Biochem. 56: 906-912 (1992); Maat, J. et ai., teok sessa Visser, J. et ai., toim., Xylans and Xylanases (Elsevier . .·. Science, Amsterdam) , s. 349-360 (1992) ; van den Broeck, H. et • · · ai., EP 463,706 AI (1992), WO 93/25671 ja WO 93/25693).

• * * *

Kasvibiomassassa olevat ksylaania sisältävät hemiselluloosat * * * / ϊ,,,ϊ ovat sitoutuneet lujasti selluloosaan ja ligniiniin. Sellu- • . . ;·, loosa- ja paperiteollisuudessa, puun kemiallisessa massanval- • * * ] . mistuksessa (keitossa), suurin osa ligniinistä uutetaan hy- • · 118009 3 väksyttävän selluloosamassatuotteen saamiseksi. Tuloksena saatu massa on kuitenkin ruskeaa, pääasiallisesti sen vuoksi, että pieni osa ligniinistä jää keiton jälkeen yhä massaan.

Tämä jäännösligniini poistetaan perinteisesti monivaiheisessa valkaisumenetelmässä, jossa käytetään tavallisesti kloori-kemikaalien ja uuttovaiheiden yhdistelmää. Myös peroksidia, happea ja otsonia käytetään silloin, kun kloorikemikaalien käyttöä halutaan vähentää tai kokonaan välttää.

Hemisellulaaseja voidaan käyttää massojen entsyymiavusteisessa valkaisussa vähentämään kemiallista annosta myöhemmässä valkaisussa tai parantamaan massan valkoisuutta (Kantelinen et ai., International Pulp Bleaching Conference, Tappi Proceedings, 1-5 (1988); Viikari et ai., Paper and Timber 7: 384-389 (1991); ja Kantelinen et ai., "Enzymes in bleaching of kraft .

pulp," Väitöskirja tekniikan tohtorin arvoa varten, Valtion teknillinen tutkimuskeskus, VTT Julkaisut 114, Espoo, 1992).

Tässä tarkoituksessa hemiselluloosasta tulee luonnollisesti puuttua sellulaasit, jotka vahingoittaisivat selluloosakuitu- ja·

Hemiselluloosaa hydrolysoivien entsyymien käytöstä eri valkaisu j ärj estelmissä keskustellaan seuraavissa: W0 89/08738, EP 383,999, W0 91/02791, EP 395,792, EP 386,888, EP 473,545, EP " * 1 1 .

489,104 ja W0 91/05908.

> # · * ··2 : : Muita hemisellulolyyttisten entsyymien teollisuussovellutuksia ·1·1: löytyy kuumahierteiden eli termomekaanisten massojen tuotan- • · ϊ nossa, jossa hemisellulolyyttisten entsyymien käytön tarkoi- **< 1 tuksena on pienentää energiankulutus. Hemisellulolyyttisiä entsyymejä voidaan käyttää parantamaan uusiomassan suotautu- . mistä tai hemisellulolyyttisiä entsyymejä voidaan käyttää * 1 · "I liukosellujen tuotannossa (Viikari et ai., "Hemicellulases for • » ·

Industrial Applications", teoksessa Bioconversion of Forest *ϊ1’ί and Agricultural Wastes, Saddler, J., toim., CAB Internatio- nal, USA (1993)).

• 1 · • · • 1 • ·· 1 2 ····« 4 118009

Hemisellulolyyttisten entsyymien käytöstä parannettuun vedenpoistoon mekaanisesta massasta keskustellaan seuraavissa: EP

262,040, EP 334,739 ja EP 351,655 sekä DE 4,000,558. Kun aiotaan hydrolysoida biomassa nestemäisiksi polttoaineiksi tai kemikaaleiksi, on korkean saannon takaamiseksi olennaista muuntaa sekä selluloosa että hemiselluloosa (Viikari et ai., "Hemicellulases for Industrial Applications," teoksessa: Bioconversion of Forest and Agricultural Wastes, Saddler, J., toim., CAB International, USA (1993)). Myös rehuteollisuudessa esiintyy tarvetta käyttää sopivia entsyymiaktiivisuuksien yhdistelmiä runsaasti β-glukaania ja hemiselluloosaa sisältävän substraatin hajottamiseen.

Jotta selluloosa-hemiselluloosa-ligniini-matriisi altistuisi entsymaattiselle hydrolyysille in vitro, se on esikäsiteltävä kemiallisesti. Erääseen sellaiseen menettelytapaan kuuluu termomekaaninen hÖyrykäsittely, jota seuraa uutto kuumalla vedellä (Chahal, D.S., et ai., J. Indust. Microbiol. 1: 355-361 (1987)) . Saadaan heikosti hapan neste, joka sisältää vesiliukoisia hemiselluloosaketjuja ja joitakin ligniinin johdannaisia.

Kuitenkin jotta ksylaaniketjujen myöhempi entsymaattinen hyd-rolyysi oligomeereiksi tai monomeereiksi varmistuisi, tarvi- • · · taan entsyymijärjestelmiä, jotka ovat tehokkaita olosuhteissa, .,)·* joissa sekä korkea lämpötila (kuten 70 °C) että kohtalaisen hapan pH (noin 4,0) yhdistyvät. Näiden kahden parametrin ·’·*: yhdistelmä näyttää kuitenkin olevan haitallinen suurimmalle « · ; osalle tunnetuista ksylanaaseista. Esimerkiksi pH-arvossa 4 * · · * ksylanaasi II mesofiilisestä sädesienestä Streptomyces rosei- * scleroticus (matala Mr/korkea pl-entsyymi) säilyttää vähemmän . kuin 5 % siitä aktiivisuudesta, joka sillä oli pH-alueella • · · 6,0-6,5 (Grabski & Jeffries, Appi. Environ. Microbiol. 57: * * · *. 987-992 (1991)). Puhdistamaton ksylanaasi Aureobasidium *:*·: pullulansista (Myburgh, J. et ai., Proc. Biochem. 26: 343- 348 Γ'*: (1991)) on asidofiili, jonka pH-optimi on välillä 3,5 ja 4,0, mutta sen aktiivisuus vähenee jyrkästi 35 °C:tta korkeammissa * * • · m lämpötiloissa. Termostabiili ksylanaasi sienestä Thermoascus • · _ ' d* ..5 118009 aurantiacus säilyttää pH-arvossa 3,5 vain 12 % maksimaalisesta aktiivisuudestaan (Tan L.U.L. et ai., Can. J. Microbiol. 33: .

689-692 (1987)). Vielä yhden ksylanaasin, korkea Mr/matala pl-entsyymi ääriolosuhteissa viihtyvästä eli ekstremofiili-sestä bakteerista "Caldocellum saccharolyticum", osoitettiin olevan hyvin stabiili 60 °C:ssa, mutta se säilytti vähän aktiivisuutta pH-arvossa alle 5 (Liithi, E. et ai., Appi. Environ. Microbiol. 56: 2677-2683 (1990); Liithi, E. et ai.,

Appi. Environ. Microbiol. 56: 1017-1024 (1990). Puhdista- mattomat ksylanaasit eri Actinomaduran isolaateista olivat stabiileja monien tuntien ajan inkuboitaessa 70-75 °C:ssa, mutta ne säilyttivät vähemmän kuin 15 % aktiivisuudestaan pH-alueella 4,0-4,5 ja lämpötilassa 70 °C (Holtz, C. et ai., Antonie van Leeuwenhoek 59: 1-7 (1991)).

Näin ollen esiintyy tarve aikaansaada sellaisia entsyymival-misteita, jotka sisältävät teollisuuden ympäristöolosuhteissa aktiivisuutensa säilyttäviä ksylanaaseja. Erityisesti paperin-valmistusteollisuudessa on sellaisten ksylanaasivalmisteiden tarvetta, jotka toimivat korkeassa lämpötilassa, termomekaanisen höyrykäsittelyn ja kuumavesiuuton tuottamassa happamassa nesteessä.

Havaitessaan miten tärkeätä on kehittää sellainen ympäristön " ·»· kannalta turvallinen ja taloudellinen menetelmä kasvibiomassan kemialliseksi muuntamiseksi, jossa kasvibiomassa voidaan entsymaattisesti käsitellä korkean lämpötilan ja alhaisen pH:n ·*·*: muodostamissa ankarissa olosuhteissa, eli sellaisissa pro- • » j sesseissa joita esimerkiksi paperinvalmistusteollisuus käyt- * « * i tää, keksijät ovat etsineet uutta mikrobia, joka saattaisi * * * olla sellaisten entsyymien lähde.

·♦·.

• · · Nämä tutkimukset ovat johtaneet termofiilisen sädesienen • · · * Actinomadura sp. FC7 uuden kannan eristämiseen ja tunnista- ·:**: miseen. Actinomadura sp. FC7 ilmentää kahta ainutlaatuista I1; ksylanaasia, XYL I:tä ja XYL II:ta, jotka säilyttävät suuren • * * osan entsymaattisesta aktiivisuudestaan korkeissa lämpöti- * * * 9 ' , loissa ja alhaisessa pH:ssa.

* * * k · • · . t- 6 118009

Keksintö koskee menetelmää kasvibiomassan kemialliseksi käsittelemiseksi, jossa kemiallinen käsittely on entsyymiavusteinen valkaisu, jossa biomassa saatetaan kosketukseen Actinomadura sp. Fc7:n XYL I ja/tai XYL II ksylanaasin kanssa.

Kuva 1 esittää plasmidiin pJFl kloonattujen inserttien restrik- 1 tiokarttaa. Varjostetut laatikot osoittavat ksylanaasigeenien likimääräiset sijainnit niitä vastaavien inserttien delee-tioiden jälkeen. Ylärivi, täysipituisen insertin restriktio-kohdat. Varjostettu ylärivi: pJFl (20,0 kb; täysipituinen insertti); toinen varjostettu rivi: pJF102 (13,5 kb); kolmas varjostettu rivi: pJF103 (11,5 kb); ja neljäs varjostettu rivi: pJF1020 (7,5 kb). Bg, Bglll; B, BamHl; X, Xhol; +, ksylanaasipositiivinen; ksylanaasinegatiivinen.

Kuva 2 esittää plasmidiin pJF6 kloonattujen inserttien restrik- tiokarttaa. Varjostetut laatikot osoittavat ksylanaasigeenien likimääräiset sijainnit vastaavan insertin deleetion jälkeen.

Bg, BglII; N, NruI; No, No tl; S, Sali; +, ksylanaasipositii- i vinen; ksylanaasinegatiivinen. Varjostettu ylärivi: pJF6; '.·? .···. toinen varjostettu rivi: pJFSl; kolmas varjostettu rivi: *.*’ pJF62.

• · · ·«·« • * t 'y-' Kuva 3 esittää pH:n ja lämpötilan vaikutuksia ksylanaasi l:n * · ♦ • ·* aktiivisuuteen. Puhdistettua XYL I:tä (5 yksikköä) inkuboitiin • · : 10 minuutin ajan ilmoitetuissa lämpötiloissa ja pH-arvoissa, • · · V · ja pelkistävän sokerin vapautuminen mitattiin Nelson-Somogyi- menetelmällä. (·) 60 °C; (A) 70 °C; (*) 80 °C.

·· • · • ·♦ 1 2 3 • ♦ • · .

2 • · · 3 • · · • · • · * · · * .

• · • ♦ ♦ • · ♦ * * * * * · ·· • * 118009 7

Kuva 4 esittää pH:n ja lämpötilan vaikutuksen ksylanaasi II :n 1 aktiivisuuteen. Puhdistettua XYL II:ta (8 yksikköä) inkuboi-tiin 10 minuutin ajan ilmoitetussa lämpötiloissa ja pH-arvois- -sa, ja pelkistävän sokerin vapautuminen mitattiin Nelson-Somogyi-menetelmällä. (·) 60 °C; (A) 70 °C; () 80 °C.

Kuva 5 esittää kloonin pJF6 (koodaa XYL II:ta) 2,7 kb:n insertin restriktiokarttaa. Musta viiva osoittaa insertin sekvensoidun osan, joka alkaa osoitetusta NruI-kohdasta. Kirjaimet tarkoittavat seuraavia restriktiokohtia: Bg=BgrlII, S-SalI, N=WruI, Bo-Notl.

Kuva 6 esittää pJF6-insertin (xln2) nukleotidisekvenssiä kuvassa 5 esitetystä .NruI-kohdasta kuvassa 5 esitettyyn BglII-kohtaan asti. XYL II:n aminohapposekvenssi alkaa nukleotidista 521. Lihavoituna esitetään promoottorialueet -35 (TTGACG) ja -10 (CACAAT), ribosomin sitoutumiskohta (RBS: GGAGGA) ja aloituskodoni (CIT: GTG) esitetään lihavoituina.

Kuvassa 7 verrataan 40 streptomykeettigeenin ribosomaalista sitomiskohtaa (RBS) vastaavaan pJF6:n ksylanaasigeenin koodaaman xlnlhn sitomiskohtaan. RBS:iä vastaavat nukleotidit on alleviivattu, kun taas lihavoidut (nukleotidit) tarkoittavat translaation aloituskodonia.

» ♦ ··· *i* Kuva 8 esittää XYL II :n osittaista aminohapposekvenssiä, jossa signaalipeptidi sijaitsee. Hydrofobisten aminohappojen pitkä ·· ;*·*; sekvenssi osoitetaan lihavoituna. Hydrof iilisellä alueella • · j .·, tavallisesti esiintyvät tunnusomaiset arginiinit (R) on ;

14* I

.··,·. alleviivattu. Nuoli osoittaa peptidaasin signaalin mahdollisen • > * pilkkomiskohdan, jota reunustaa proliini (P) .

* * * « · ·

Kuva 9 esittää nukleotidisekvenssihomologian vertailun sel- * » * *] ' laisten streptomykeettipromoottorien, joilla on 16 nukleotidin *:··: etäisyys alueiden -35 ja -10 välillä, ja pJF6:n koodaaman ksylanaasin xlnll-geenin promoottorin välillä. Alueet -35 ja • · · -10 on lihavoitu.

* # • *· Ψ * • · 118009 8

Kuvat 10-10C esittävät pJF6:n koodaaman XYL II:n aminohappo-sekvenssin optimaaliset ryhmittymät muiden entsyymien joukossa. Entsyymilista on seuraavanlainen: 2 Pseudomonas fluore-scensin ksylanaasia (Psexyna, Psexynbc), pJF6:n ksylanaasi (xlnpjf6), Streptomyces lividansin ksylanaasi A (Stmxlna), Cellulomonas fimin eksoglukonaasi (Cficex), Clostridium thermocellumin ksylanaasi (Cloxylz), Bacillus sp.:n ksylanaasi (Bacxynaa), Clostridium stercoirariumin selloksylanaasi f (Pclocxl),Caldocellum saccharolyticumin ksylanaasi (Cdcxynab), Thermoanaerobacter sp.:n ksylanaasi (Teoendxyla), Caldocellum saccharolyticumin endoselluloosi (Cdccelb), Butyrivibrio fibrisolvensin ksylanaasi (Butxynb) ja Rumiococcus flavefacien-sin ksylanaasi (Rumlxyna). Aminohappokonsensus osoitetaan lihavoituna ja kaikissa tutkituissa entsyymeissä säilyneet aminohapot merkitään tähdellä (*). Oletetut säilyneet alueet , osoitetaan alleviivaushakasululla.

Kuva 11 esittää Streptomyces lividansin ksylanaasi A:n joh- ' detun aminohapposekvenssin ja vastaavan pJF6:n koodaaman XYL II :n sekvenssin välistä homologiaa. Sekvenssien väliset symbolit osoittavat, että vertailuarvo on sama (|), 0,5 (:), 0,1 (.). Osoitus 0,5 tarkoittaa, että kahdella eri aminohapolla on säilyneitä muutoksia (s.o. niiden välillä esiintyy > jonkin verran rakenteellista ja/tai toiminnallista samankal- * * * .#! taisuutta). Osoitus 0,1 tarkoittaa aminohappoja, joilla ei *; ole ollenkaan tai vain heikkoa rakenteellista ja/tai toiminnal- *i«» ;*. lista samankaltaisuutta.

* 4 « * * « * « « · « · * ,·. Kuva 12 esittää nukleotidien 1538-1672 välistä sekvenssiä • » » "!/ mukaan luettuna pJF6:lla oleva xlnll-sekvenssi. Nuolet osoit- «Il ' tavat toisto- ja käänteissekvenssit.

* · ♦ ♦ *-··* Kuvat 13 ja 13A esittävät MAP-ohjelman ennusteen pJF6:n at» V ' koodaaman XYL II :n johdetun aminohapposekvenssin ja Strepto- *·*·; myces lividansin ksylanaasi A:n aminohapposekvenssin proteo- I*'·. lyytt isistä pilkkomiskohdista. Kirjaimet tarkoittavat seu- M»

' raavia proteaaseja: S (Staphylococcus aureuksen proteaasi), T

f * » ♦· f » » · · • * 118009 9 (trypsiini) ja C (kymotrypsiini). Löytyneet eroavuudet on osoitettu lihavoituina.

Plasmidi pJFl talletettiin E. colissa talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 29. heinäkuuta 1994, ja sille annettiin talletusnumero ATCC 69670.

Plasmidi pJF6 talletettiin E. colissa kantakokoelmaan ATCC 29. heinäkuuta 1994, ja sille annettiin talletusnumero ATCC 69671.

Actinomadura sp. FC7 talletettiin kantakokoelmaan ATCC ja sille annettiin talletusnumero ATCC 55698.

I. Määritelmät

Seuraajassa kuvauksessa käytetään useita yhdistelmä-DNA-tekniikassa yleisesti käytettyjä termejä. Seuraavat määritelmät on annettu selityksen ja patenttivaatimusten selventämiseksi ja johdonmukaistamiseksi sekä selventämään käytettyjen termien suojapiirin tulkinnassa annettava laajuus.

Ksylanaasi. Tässä käytettynä ksylanaasi on hemisellulaasi, joka pilkkoo ksylaanin ksyloosiketjussa olevia β-1,4-sidoksia #· 4·.· (ksylaani on polymeeri, joka on muodostunut D-ksyloositäh- *j1 täistä, jotka ovat liittyneet toisiinsa β-l,4-sidoksin) .

. '1 Ksylanaasiaktiivisuus tarkoittaa samaa kuin ksylanolyyttinen ♦ · !V. aktiivisuus.

I ♦ .·» · » 1 • · · * · t if·· ( ··-, Isännällä, ^oka on "olennaisilta osiltaan kykenemätön" syn- S · 1 tetisoimaan yhtä tai useampaa sellulaasientsyymiä, tarkoite- . taan isäntää, jossa yhden tai useamman sellulaasientsyymin * · 'j1 aktiivisuus on heikentynyt, vajavainen tai puuttuva villi- » # » V 1 tyyppiin verrattuna.

f #♦?·· • » ***** Entsyymi valmiste. "Entsyymivalmisteella" tarkoitetaan koos- » 1 · tumusta, joka sisältää entsyymejä, jotka on uutettu (joko t osittain tai kokonaan puhdistettu) mikrobista tai sellaisen »M·· * 1 10 118009 mikrobin kasvatuksessa käytetystä ravintoalustasta. "Uutettu" tarkoittaa mitä tahansa menetelmää, jolla halutut entsyymit erotetaan solumassasta, ja siihen sisältyy solujen rikkominen ja myös yksinkertaisesti kasvualustan erottaminen käytetyistä soluista. Sen vuoksi termi "entsyymivalmiste" käsittää koostumukset, jotka sisältävät halut(t)u(je)n mikrobi(e)n viljelyyn aiemmin käytettyä ravintoalustaa ja mitä tahansa entsyymejä, joita mikrobi(t) on (ovat) sellaiseen ravinto-alustaan viljelyn aikana erittänyt(neet).

Biovalkaisu. "Biovalkaisulla" tarkoitetaan ligniinin uuttamista selluloosamassasta sen jälkeen, kun hemiselluloosaa '11 hajottavat entsyymit ovat toimineet joko ligniiniä hajottavien entsyymien kanssa tai ilman niitä. Hemiselluloosat voivat rajoittaa ligniininpoistoa joko fysikaalisesti (saostumalla uudelleen kuidun pintaan keiton aikana) tai kemiallisesti (ligniini-hiilihydraattikomplekseilla). Hemisellulaasiaktii- : visuus hajottaa osittain hemiselluloosan, mikä voimistaa ligniinien uutettavuutta tavanomaisilla valkaisukemikaaleilla (kuten kloorilla, klooridioksidilla, peroksidilla, jne.) (Viikari et ai., "Bleaching with Enzymes" teoksessa Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Proc. 3rd Int. Conf. , Tukholma, s.67-69 (1986); Viikari et ai., "Applications of ·;· Enzymes in Bleaching" teoksessa Proc. 4th Int. Symp. Wood and ..

• · · * ;*; Pulping Chemistry, Pariisi, Vol.l, s.151-154 (1987); Kan- • · telinen et ai., "Hemicellulases and their Potential Role in > * V, • * ; .·. Bleaching" teoksessa International Pulp Bleaching Conference, * · ·

Tappi Proceedings, s. 1-9 (1988)) . Tämän parantuneen vai- · · kaistavuuden etuna on pienempi valkaisukemikaalien kulutus ja . pienempi ympäristökuormitus tai paremmat lopulliset valkoi- * * *·:·* suusarvot.

• ♦ · • · · • · * * ♦;··; Entsyymillä, joka on "homologinen" keksinnön mukaisen isännän ·**'. suhteen, tarkoitetaan sitä, että isäntälajina olevan saman • · · lajin transformoimaton kanta luontaisesti tuottaa jonkin mää- * ♦ * ” rän natiivia proteiinia; keksinnön mukaisen isännän suhteen "homologisella" geenillä tarkoitetaan geeniä, jota esiintyy isäntälajina olevan saman lajin transformoimattoman kannan 11 118009 genomissa. Entsyymillä, joka on "heterologinen" keksinnön mukaisen isännän suhteen, tarkoitetaan sitä, että isäntälajina olevan saman lajin transformoimaton kanta ei luontaisesti tuota natiivia proteiinia; keksinnön mukaisen isännän suhteen "heterologisella" geenillä tarkoitetaan geeniä, jota ei esiinny isäntälajina olevan saman lajin transformoimattoman kannan genomissa.

Kloonausväline. Plasmidi- tai faagi-DNA tai muu DNA-sekvenssi (kuten esimerkiksi lineaarinen DNA), joka tarjoaa sopivan nukleiinihappoympäristön halutun geenin siirtämiseksi isäntä-solun sisälle. Keksinnön mukaiset kloonausvälineet voidaan , ' suunnitella replikoitumaan itsenäisesti prokaryootti- ja euka-ryootti-isännissä. Sieni-isännissä, kuten Trichodermassa, kloonausvälineet eivät tavallisesti replikoidu itsenäisesti, vaan sen sijaan ne tarjoavat ainoastaan välineen halutun geenin siirtämiseksi Trichoderma-isäntään, jossa se myöhemmin insertoituu Trichoderman genomiin. Kloonausvälineelle voi lisäksi olla tunnusomaista yksi tai jokunen endonukleaasin tunnistuskohta, jossa sellaiset DNA-sekvenssit voidaan pilkkoa määrätyllä tavalla ilman välineen olennaisen biologisen funktion häviämistä, ja johon DNA voidaan liittää (splice) toivo- * ·:·1 tun DNA-replikaation ja -kloonauksen aikaansaamiseksi. Kloo- nausväline voi lisäksi sisältää markkerin, joka sopii käytettä- * ·.· vaksi kloonausvälineellä transformoitujen solujen tunnista- • i · • ',ί misessa. Markkerit ovat esimerkiksi antibioottiresistenssi.

: Vaihtoehtoisesti kloonausvälineeseen voidaan asentaa sellaiset * 1 · · markkerit, jotka ovat peräisin eri lähteestä kuin haluttu geeni. Sanaa "vektori" käytetään joskus "kloonausvälineen" ase- , .·, mesta.

• 1 · • 1 1 * · « • 1 1 ···

Ilmentymisväline. Väline tai vektori, joka on samanlainen kuin kloonausväline, mutta joka pystyy ilmentämään halutun geenin • · 1 ί.,.ϊ haluttuun isäntään transformoinnin jälkeen.

• · · ""r· • 1 • · ·

Sieni-isäntää käytettäessä haluttu geeni viedään edullisesti sieni - isäntään osana kloonaus- tai ilmentymisvälinettä, joka integroituu sienen kromosomiin. Kloonausvälineestä tai il- 12 11 €0«? mentymisvälineestä peräisin olevat sekvenssit voidaan myös integroida halutun geenin kanssa integraatioprosessin aikana. Esimerkiksi T. reeseissä haluttu geeni voidaan ohjata cbhl-lokukseen.

Haluttu geeni voidaan edullisesti siirtää tiettyjen säätely-sekvenssien, kuten esimerkiksi promoottorisekvenssien, säätelyn alaisuuteen (so. kytkemällä se toiminnallisesti) vektorissa (joka integroituu halutun geenin kanssa isännän geno-miin). Haluttaessa isännän kromosomi voi itse tarjota sellaiset säätelysekvenssit koska ne jo ovat sen insertiolokuksessa.

Ilmentymisvektorissa olevat ilmentymisen säätelysekvenssit vaihtelevat riippuen siitä, onko vektori suunniteltu ilmentämään tietyn geenin prokaryootti- vai eukaryootti-isännässä (esimerkiksi sukkulavektori voi antaa käyttöön bakteeri-isännissä toimivan selektiogeenin), ja se voi lisäksi sisältää transkriptioon liittyviä osasia, kuten vahvistajaosasia, terminaatiosekvenssejä ja/tai translaation aloitus- ja termi-naatiokohtia.

I. Sädesienen Actinomadura sp. FC7 eristäminen ··· * · * * · ..li* Suunnitelman tarkoituksena oli eristää mikro-organismi, • sädesieni, olosuhteissa joissa olisi asidofiilistä ja termo- : \i stabiilia ksylanolyyttistä aktiivisuutta. Sädesienet ovat : aerobisia gram-positiivisia bakteereja, joita tavataan pää- • · · · ;'·*· asiassa maaperässä. Sädesienillä on rihmastomorfologia, joka * muistuttaa mielenkiintoisella tavalla mikroskooppisia sieniä.

. ,·. Lisäksi ne tunnetaan erinomaisina entsyymierittäjinä, minkä • * · vuoksi niillä on hyvin tärkeä merkitys biomassan hajotuksessa.

• * · * • ' ***· Järjestettiin seulontaohjelma sellaisten sädesienten löytä- • · · miseksi, jotka tuottavat ksylanaaseja, jotka pystyvät hydro- :*, lysoimaan ksylaaniketjuja hemiselluloosanesteessä (ligno- • · · « selluloosabiomassan höyrykäsittelyn sivutuote) kohtalaisen happamassa pH:ssa (4,0) ja korkeassa lämpötilassa (70 °C). Sellaisia organismeja etsittiin paikoista, joissa voitiin • · 118009 13 aikaansaada merkitsevä jaksoittainen kuumentuminen, kuten hei- 'j nässä, kompostissa ja karjanlannassa.

Ensimmäinen vaihe sisälsi sellaisten ksylanolyyttisten säde-sienten valikoimisen, joiden optimaalinen kasvu oli 50-60 °C:ssa ja jotka osoittivat voimakasta RBB-ksylaanin hajotus-kykyä kiinteällä alustalla. Kompostista, karjanlannasta ja oljista eristettiin sarja näillä ominaisuuksilla varustettuja termostabiileja ja asidofiilisiä sädesieniä, ja niistä tutkittiin edelleen kyky tuottaa ksylanolyyttisiä entsyymejä, jotka olivat suhteellisen aktiivisia pH-arvossa 4 ja lämpötilassa 70 °C. Tässä toisessa seulontavaiheessa verrattiin valikoiduista sädesienistä peräisin olevien puhdistamat torni en entsyymi- ' valmisteiden ksylaanin hydrolysointinopeuksia olosuhteissa :1 pH 5/60 °C samasta mikrobista peräisin olevien (entsyymivalmis-teiden) hydrolysointinopeuksiin olosuhteissa pH 4/70 °C. Tämä tehtiin kunkin mikrobin erittämien ksylanaasientsyymien hapon-ja lämmönkestävyyden tason määrittämiseksi.

Valikointimenettely tunnisti yhden sellaisen mikrobin karjanlannasta, jolla oli erityisen toivotut ominaisuudet siinä mielessä, että se tuotti ksylanolyyttisiä entsyymejä, jotka olivat suhteellisen aktiivisia pH-arvossa 4 ja lämpötilassa ..*·* 70 °C. Tämä mikrobi tunnistettiin Actinomadura-suvun jäseneksi " - kemotaksonomisilla menetelmillä ja nimettiin Actinomadura sp.

:*·*: FC7:ksi. Actinomadura sp. FC7:n puhdasviljelmät tuottivat • ainakin neljää ksylanolyyttistä aktiivisuutta tsymogrammilla ♦ » · « osoitettuna. Kannan FC7 tuottamat puhdistamattomat entsyymit säilyttivät 65 % aktiivisuudestaan mainituissa kahdessa , β·# ankarammissa olosuhteissa (pH 4/70 °C) .

• * * • · * • · · • · · *. II. Ksylanaasientsyymivalkaisu korkeassa lämpötilassa ja *·’" happamassa pH:ssa • · · i : * * * ;·* Keksintö koskee menetelmää kasvibiomassan kemialliseksi käsit- * * · [ . telemiseksi olosuhteissa, joissa on korkea lämpötila ja alhai- • · nen pH. Edullisessa suoritustavassa kasvibiomassa entsyymi-valkaistaan ksylanaaseilla, jotka pystyvät hydrolysoimaan ksy- :4 118009 laaniketjua hemiselluloosaliuoksessa (lignoselluloosabiomassan höyrykäsittelyn sivutuote) kohtalaisen happamassa pHrssa (4,0) ja korkeassa lämpötilassa (70 °C) . ' , .

Kasvibiomassa on yhdistelmämateriaali, joka koostuu pääasiassa selluloosa-, hemiselluloosa- ja ligniinimatriisista. Ligniini-osan poisto on paperinvalmistuksen aikana toivottavaa sen ruskean värin takia ja johtuen sen taipumuksesta vähentää paperituotteen lujuutta. Ligniininpoistoon on kehitetty monia menetelmiä. Tavallisesti puumassa käsitellään kloorilla tai muilla myrkyllisillä kemikaaleilla ligniiniosan poistamiseksi ja valkoisemman massan saamiseksi. Tämän kemiallisen käsittelyn myrkylliset sivutuotteet vaikuttavat kuitenkin haitallisesti terveyteen ja sen ympäristön stabiilisuuteen, johon ne j päästetään. Sen vuoksi esiintyy suurta tarvetta kehittää vaihtoehtoisia, enemmän ympäristöä suojelevia tekniikoita mas-sanvalkaisun suorittamiseen.

Yleinen paperituotannossa käytettävä kasvibiomassan käsittely sisältää termomekaanisen höyrykäsittelyn, jota seuraa uutto kuumalla vedellä. Tämä menettely hajottaa ksylaania sisältäviä . . hemisellulooseja ja joitakin ligniinijohdannaisia, jotka ovat muutoin tiukasti sitoutuneet selluloosaan. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä kehitetään biovalkaisutekniikka, jonka avulla alhaisessa pH:ssa aktiivisia termostabiileja ksylanaa-:***: se ja voidaan käyttää in vitro muuntamaan tai vähentämään puu- • ;*; massoissa olevaa ligniiniä. Nämä ankarat käsittelyolosuhteet • * * * f·*.·. voivat lisäksi vaikuttaa siten että ne alentavat entsyymival- * misteessa tai ravintoalustassa olevaa sellulaasiaktiivisuutta.

• · · • * * I" Edullisessa suoritustavassa keksinnön mukainen menetelmä * » * · » *. suoritetaan happamassa hemiselluloosanesteessä in vitro. Mene- *·*" telmään kuuluu entsyymivalmisteen, ravintoalustan tai ksylanaa- * * * , J : siä sisältävän konsentroidun seoksen saattaminen kosketukseen * * m ;·* puumassan kanssa. Rutiinilaskutoimitukset mahdollistavat alan * · * asiantuntijoille optimikäsittelyajan määrittämisen riippuen halutusta tuloksesta, käytetyn ksylanaasientsyymin konsentraa-tiosta ja spesifisestä aktiivisuudesta, käytetyn massan tyy- 15 118009 pistä ja konsentraatiosta, happaman keittoliemen pH:Sta ja lämpötilasta sekä muista parametrimuuttujista.

On edullista, että käsittely tapahtuu ympäristön lämpötilassa ja pH: ssa, lämpötilojen 45-90 °C ollessa edullisia ja 70 °C:n lämpötilan ollessa edullisin. Myös keittoliemen pH:n tulisi edullista olla alle 6,0 edullisimman pH-arvon ollessa 4,0.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää yksin tai lisänä muihin käsittelyähän, jotka vähentävät puumassan ligniini-pitoisuutta, parantavat sen suotautuvuutta ja/tai alentavat sen vedensitovuutta. Edullisessa suoritustavassa keksintöä käytetään vahvistamaan puumassan valkoisuusominaisuuksia kemiallisten massojen käsittelyllä, so. niiden massojen, jotka sisältävät kemiallisella käsittelyllä kemiallisesti muunnettua ligniiniä.

Edullisessa suoritustavassa keksinnön mukaisissa menetelmissä käytetyt ksylanaasit ovat edullisesti Actinomadura sp. FC7:n ksylanaaseja ja erityisesti XYL I:tä ja XYL II:ta. XYL I ja XYL II voidaan saada natiivilla Actinomadura sp. FC7-isännällä (ja erityisesti FC7-solujen kasvatuksesta saatavalla kasvu- * •I.* alustalla) tai niitä voidaan saada rekombinantti-isännällä, ..ΙΓ esimerkiksi pJFl:ssä ja pJF6:ssa olevien inserttien koodaa- ·.* maila ilmentymisellä.

·* · • · * • * • * : III. Keksinnön mukaisten isäntien geenimuokkaus ··· « • · · f * · * · ·

Menetelmää keksinnön, mukaisten isäntien geneettiseksi muok- . ,·, kaamiseksi mahdollistetaan kloonaamalla haluttua ksylanaasi- * · * !!! aktiivisuutta koodaavat geenisekvenssit ja ilmentämällä sei- • · · laiset geenisekvenssit. Tässä käytettynä termin "geenisekvens-sit" tarkoitetaan viittaavan nukleiinihappomolekyyliin (edul- • · · *,.,ί lisesti DNA:hän) . Haluttua ksylanaasia koodaavat geenisekvens- ··, sit saadaan monista eri lähteistä. Näihin lähteisiin kuuluvat • · ·

Actinomadura sp. FC7:n genominen DNA, cDNA, synteettinen DNA

ja näiden yhdistelmät. Vektorisysteemejä voidaan käyttää tuottamaan isäntiä keksinnön mukaisten entsyymivalmisteiden • · 118009 16 tuottamiseen. Sellainen vektorikonstruktio (a) voi edelleen tarjota käyttöön erillisen vektorikonstruktion (b) joka koodaa vähintään yhtä isännän genomiin integroitavaa haluttua geeniä ja (c) kohtiin (a) tai (b) liitetyn selektiomarkkerin. Vaihtoehtoisesti markkerina voidaan käyttää erillistä vektoria.

Nukleiinihappomolekyylin, kuten esimerkiksi DNA:n, sanotaan "pystyvän ilmentämään" polypeptidin, mikäli se sisältää transkription säätelyinformaatioon sisältyvät ilmentymisen sää-telysekvenssit ja sellaiset sekvenssit ovat "toiminnallisesti kytketyt" polypeptidiä koodaavaan nukleotidisekvenssiin.

Toiminnallinen sidos on sidos, jolla sekvenssi yhdistetään sää-telysekvenssiin (tai sekvensseihin) sellaisella tavalla, joka asettaa sekvenssin ilmentämisen säätelysekvenssin vaikutuksen tai kontrollin alaiseksi. Kahden DNA-sekvenssin (kuten esimerkiksi proteiinia koodaavan sekvenssin ja promoottorialuesek-venssin, joka on liittynyt koodaavan sekvenssin 5'-päähän) sanotaan olevan toiminnallisesti kytketyt, jos promoottori-toiminnan induktio johtaa proteiinia koodaavan mRNA-sekvenssin transkriptioon, ja jos kahden DNA-sekvenssin välisen sidoksen luonne ei (l) johda frame-shift-mutaation ilmenemiseen, (2) * "·* estä ilmentymisen säätelysekvenssien kykyä ohjata rnRNAm, antisense-RNA:n tai proteiinin ilmentymistä tai (3) estä templaatin kykyä tulla promoottorialuesekvenssin transkriboi- ·· · • *.ϊ maksi. Promoottorialue olisi näin ollen toiminnallisesti kyt- ketty DNA-sekvenssiin, jos promoottori pystyisi vaikuttamaan r*·*: sen DNA-sekvenssin transkriptioon.

• · I

, ,·, Geenin ilmentymiseen tarvittavien säätelyalueiden täsmällinen • · t ,»j·. luonne voi vaihdella lajien tai solutyyppien välillä, mutta • · · tavallisesti niihin sisältyy välttämättöminä 5'-ei-transkri- ·’** boidut ja 5'-ei-transloidut (ei-koodaavat) sekvenssit, jotka ·»« osallistuvat transkription ja vastaavasti translaation aloi-tukseen.

* ·* »···· ····.

Proteiinin ilmentäminen transformoiduissa isännissä vaatii sellaisten säätelyalueiden käytön, jotka ovat toiminnallisia 118009 17 sellaisissa isännissä. Voidaan käyttää laajaa valikoimaa transkription ja translaation säätelysekvenssejä. Eukaryooteilla, joilla transkriptio ei ole kytkeytynyt translaatioon, sellaiset säätelyalueet voivat joko tarjota, tai sitten eivät, initiaattorimetioniini (AUG)-kodonin, riippuen siitä, sisältääkö kloonattu sekvenssi sellaisen metioniinin. Sellaisiin alueisiin kuuluu tavallisesti promoottorialue, joka on riittävä ohjaamaan RNA-synteesin aloitusta isäntäsolussa.

Kuten yleisesti tiedetään, eukaryootti-mRNA:n translaatio aloitetaan kodonilla, joka koodaa ensimmäistä metioniinia. Tästä syystä on edullista varmistaa, että eukaryoottipromoottorin ja DNA-sekvenssin, joka koodaa proteiinia tai sen funktionaalista johdannaista, välinen sidos ei sisällä yhtään välikodonia, joka pystyy koodaamaan metioniinia. Sellaisten kodonien esiintyminen johtaa joko fuusioproteiinin muodostumiseen (jos AUG-kodoni on samassa lukukehyksessä kuin proteiinia koodaava DNA-sekvenssi) tai frame-shift-mutaatioon (jos AUG-kodoni ei ole samassa lukukehyksessä kuin proteiinia koodaava sekvenssi) . .

Edullisessa suoritustavassa haluttu proteiini eritetään ympä- G

» ··** röivään ravintoalustaan erityksen signaalisekvenssin läsnäolon ..!Γ vuoksi. Jos halutulla proteiinilla ei ole omaa signaalisekvens- ·.* siä tai jos sellainen signaalisekvenssi ei toimi hyvin isännäs- ; sä, silloin proteiinia koodaava sekvenssi voidaan kytkeä t :’: toiminnallisesti isännän kanssa homologiseen tai heterologi- r'·*: seen signaalisekvenssiin. Haluttu koodaava alue voidaan kytkeä mihin tahansa signaalisekvenssiin, joka mahdollistaa proteii- . , nin erittymisen isännästä. Sellaiset signaalisekvenssit voi- • · * * * · 4···, daan suunnitella joko spesifisten proteaasikohtien kanssa tai • · · *. ilman, niin että signaalipeptidisekvenssi on altis myöhemmälle • ·* " * irrottamiselle. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää isäntää, joka • t 4 vuotaa proteiinin ravintoalustaan, esimerkiksi sellaista t*. isäntää, jolla on membraanissaan mutaatio.

4 ·· * ·*··· • «

Ei-transkriboidut ja/tai ei-transloidut alueet 3'-suuntaan proteiinia koodaavasta sekvenssistä voidaan haluttaessa saada 118009

IS

edellä kuvatuilla kloonausmenetelmillä. 3'-Ei-transkriboitu -h alue voidaan säilyttää sen transkription terminaation säätely-sekvenssiosasten takia; 3'-ei-transloitu alue voidaan säilyt- tää sen translaation terminaation säätelysekvenssiosasten takia, tai sellaisten osasten takia, jotka ohjaavat polyadeny-laatiota eukaryoottisoluissa.

Keksinnön mukaiset vektorit voivat edelleen sisältää muita toiminnallisesti kytkeytyneitä säätelyosia, kuten esimerkiksi vahvistajasekvenssejä.

Edullisessa suoritustavassa konstruoidaan geneettisesti stabiilit transformantit, joilla halutun proteiinin DNA integroidaan isännän kromosomiin. Haluttua proteiinia koodaava sekvenssi voi olla peräisin mistä lähteestä tahansa. Sellainen integraatio voi tapahtua de novo solun sisällä tai, edullisemmassa suoritustavassa sitä voidaan avustaa transformoimalla sellaisella vektorilla, joka insertoi itsensä toiminnallisesti isännän kromosomiin, esimerkiksi DNA-osilla, jotka edistävät DNA-sekvenssien integraatiota kromosomeihin.

Solut, jotka ovat integroineet sisään viedyn DNA:n stabiilisti *·*·’ kromosomeihinsa, valikoidaan siirtämällä sisään myös yksi tai useampi markkeri, joka mahdollistaa sellaisten isäntäsolujen ' t *V valikoimisen, jotka sisältävät ilmentymisvektorin kromoso- ** t ] '/ missä, markkeri voi esimerkiksi antaa biosidiresistenssin, t esimerkiksi resistenssin antibiooteille tai raskasmetalleille, * * kuten esimerkiksi kuparille, tai vastaavalle. Selekt iomark-kerigeeni voidaan liittää joko suoraan ilmennettäviin DNA-, .·, geenisekvensseihin tai se voidaan siirtää samaan soluun ko- transformaatiolla.

• · * * * » * j Tärkeitä tekijöitä tiettyä plasmidi- tai virusvektoria välit- • * « taessa ovat: helppous, jolla vektorin sisältävät resipientti- * ;·, solut voidaan tunnistaa ja valikoida niistä resipienttisoluis- * * * * (tH> ta, jotka eivät sisällä vektoria; tietyssä isännässä haluttu- • · jen vektorikopioiden lukumäärä; ja se, halutaanko vektorin 19 1,1 8009 pystyvän "sukkuloimaan" eri lajia olevien isäntäsolujen välillä.

Kun yhden tai useamman konstruktion sisältävä vektori tai DNA-sekvenssi valmistetaan ilmennettäväksi, DNA-konstruktio(t) viedään sisään sopivaan isäntäsoluun millä tahansa monista sopivista keinoista, mukaan lukien transformointi kuten edellä on kuvattu. Vektorin sisäänviennin jälkeen resipienttisoluja kasvatetaan selektiivisellä ravintoalustalla, joka valikoi transformoitudut solut kasvun perusteella. Kloonat(t)u(je)n geenisekvenssi(e)n ilmentäminen johtaa halutun proteiinin tuotantoon tai tämän proteiinin fragmentin tuotantoon. Tämä ilmentyminen voi tapahtua transformoiduissa soluissa jatkuvalla tavalla tai kontrolloidusti.

Niinpä XYL I:tä ja XYL II:ta koodaavat sekvenssit voidaan kytkeä toiminnallisesti mihin tahansa haluttuun vektoriin ja transformoida valikoituun isäntään niin, että sellaisten ' proteiinien ilmentyminen taataan siinä isännässä.

IV. Keksinnössä käytettävät entsyymivalmisteet

... Keksinnössä kuvataan Actinomadura sp. Fc7:n XYL I ja /tai XYL

• · **; II ksylanaaseja sisältävät entsyymikoostumukset, jotka ovat • · hyödyllisiä kasvibiomassan kemiallisessa käsittelyssä, kuten • « « **:.* entsyymiavusteisessa valkaisussa. Voidaan käyttää myös . · * * · : *.· entsyymikoostumusta, jolta puuttuu joko osittain tai kokonaan • · j.j | sellulolyyttinen aktiivisuus (so. kyky hajottaa selluloosa täysin glukoosiksi) ja jossa on rikastettuna sellun- ja paperinvalmistuksessa toivotut ksylanaasit. "Sellulolyyttisen J*. aktiivisuuden puuttumisella" tarkoitetaan vähennettyä, .·*♦. alennettua, heikennettyä tai estettyä kykyä hajottaa * · ·* selluloosa glukoosiksi. Valmisteet, joista puuttuu sellulolyyt- * * tinen aktiivisuus, ja niiden valmistaminen yhdistelmä-DNA-mene- • · · ·,..· telmillä kuvataan US-patentissa 5,298,405, joka sisällytetään J tähän viitteellä. Kuten tässä kuvataan, ksylanaaseja voidaan ♦ · ♦ · : saada keksinnön mukaisilla isännillä suoraan (isännät itse asetetaan puun prosessointiväliaineeseen). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää isäntien kasvatuksesta saatua ravintoalustaa l· 118009 20 tai siitä puhdistettuja entsyymejä. Lisäksi jos haluttuja aktiivisuuksia on useammassa kuin yhdessä yhdistelmäisännässä, voidaan sellaiset valmisteet eristää sopivista isännistä ja * yhdistää ennen käyttöä keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet tyydyttävät sellu- ja paperiteollisuuden eri sovellutuksissa vaadittavat erityistarpeet. Esimerkiksi jos aiottu sovellutus on sellun mekaanisen massan lujuuden parantaminen, keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet voivat tarjota entsyymejä, jotka vahvistavat tai helpottavat selluloosakuitujen kykyä sitoutua toisiinsa.

Samalla tavalla massan hiertämissovellutuksessa (pulp milling) j! keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet voivat tarjota entsyymejä, jotka vahvistavat tai helpottavat sellaista turpoamista (swelling).

Keksinnön mukaisten entsyymivalmisteiden saamiseksi viljellään sopivissa olosuhteissa edellä kuvattuja natiiveja tai yh-distelmäisäntiä, joilla on halutut ominaisuudet (so. isäntiä, jotka pystyvät ilmentämään suuria määriä haluttuja ksyla-naasientsyymejä ja valinnaisesti sellaisia, jotka eivät pysty olennaisesti ilmentämään yhtä tai useampaa sellulaasient- ' syymiä) , isännät erittävät halutut entsyymit ravintoalustaan ja entsyymivalmiste otetaan talteen mainitusta ravintoalus- " * jj tästä alalla tunnetuilla menetelmillä.

» • t » • · * · ' SJ*: Entsyymivalmiste voidaan tuottaa viljelemällä yhdistelmä- isäntää tai natiivia kantaa fermentorissa. Keksinnön mukaista entsyymivalmistetta voidaan tuottaa esimerkiksi nestemäisessä j kasvualustassa, joka sisältää päähiilenlähteenä kaurasta eristettyjä ksylaaneja (oat spelt xylans) , kuten on kuvannut * · i *· Morosoli et ai., Biochem J. , 239: 587-592 (1986) .

f ·«·«· • t «·>(

Entsyymivalmiste on kasvualusta, jossa on tai ei ole natiiveja Γ. tai transformoituja isäntäsoluja, tai se otetaan talteen • 9 samasta (kasvaualustasta) soveltamalla alalla hyvin tunnettuja * · menetelmiä. Joka tapauksessa koska ksylanaasientsyymit eritetään ravintoalustaan ja niillä on aktiivisuutta ympäristö- 1 1 8009 21 · olosuhteissa, jotka vallitsevat hemiselluloosaliemessä, keksinnön etuna on se, että keksinnön mukaisia entsyymivalmisteita voidaan käyttää suoraan kasvualustaan ilman myöhempää puhdistusta. Haluttaessa sellaiset valmisteet voidaan lyofilisoida tai entsyymiaktiivisuus voidaan muulla tavoin konsentroida ja/tai stabiloida säilytystä varten. Keksinnön mukaiset ent-syymivalmisteet ovat hyvin taloudellisia hankkia ja käyttää, koska (1) entsyymejä voidaan käyttää puhdistamattomassa muodossa; spesifisen entsyymin eristäminen kasvualustasta on tarpeetonta ja (2) koska entsyymit erittyvät kasvualustaan, vain kasvualusta on otettava talteen halutun entsyymivalmis-teen saamiseksi; entsyymiä ei tarvitse uuttaa isännistä.

Haluttaessa ilmennetty proteiini voidaan edelleen puhdistaa tavanomaisten olosuhteiden mukaisesti, kuten esim. uutolla, saostuksella, kromatografiällä, affiniteettikromatografiällä, elektroforeesilla tai vastaavalla.

Keksintö kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä. Nämä esimerkit esittävät vain muutaman konkreettisen sovellutuksen keksinnöstä. Alan asiantuntijalle on itsestäänselvää miten voidaan aikaansaada useita samantyyppisiä sovel- ...# lutuksia. Esimerkkien ei niin ollen pidä ymmärtää kaventavan • · keksinnön suojapiiriä vaan ainoastaan selventävän keksinnön -- * · · ·*" käyttöä.

• · ] • « · · • * • · · : *-** ESIMERKKI 1 : Materiaali ja menetelmät • ♦ · :.· · Bakteerikannat ja vektori : Rutiinikäsittelyissä käytettiin Escherichia, coli-kantaa DH5a * a ...

i’\'i (F“ 08OdlacZAM15 Δ(IacZYAargF) U169 DeoR recAl endAl hsdRll sup- * . E44λ “ thi-1 gyrA96 relAl; Gibco, BRL) . Ksylanaasigeenien • · a · * • · kloonaukseen ja toteamiseen käytettiin periplasmiseen tilaan • · ’···* vuotavaa (periplasmic-leaky) kantaa E. coli 4924 N/14 (de

Zwaig et ai., J. Bacteriol. 94: 1112-1123 (1967). Streptomyces ·;··· lividans 1326-kannan antoi ystävällisesti D.A. Hopwood (John

Innes Institute, Norwich, Yhdistyneet Kuningaskunnat). S.

118009 22 lividans 10-164-kannan, ksylanaasi- ja sellulaasiaktiivi-suuksien suhteen negatiivisen S. lividans 1326 mutanttikannan (Mondou, F. et ai., Gene 49: 323-329 (1986)), antoi ystä vällisesti D. Kluepfel (Centre de Recherche en Microbiologie Appliquee, Laval (Quebec), Kanada). Kaikki muut käytetyt kannat olivat eri luonnon materiaaleista peräisin olevia villityyppi-isolaatteja. E. coIi-Streptomyces-sukkulavektori pFD666 on kuvattu aikaisemmin (Denis & Brzezinski, Gene 111: 115-118 (1992)) .

Bakteerikantojen kasvatus E. coli-kantoja kasvatettiin Luria Bertani (LB) kasvualustalla (Sambrook, J. et ai., Molecular cloning, a laboratory manual (2. painos), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)).

Sädesienikantoja kasvatettiin rutiininomaisesti Tryptic Soy

Broth-kasvualustalla (Difco). S. lividansin protoplastien valmistusta ja regeneraatiota varten käytettiin kasvualustoja, joita ovat kuvanneet Hopwood et ai. (Genetic manipulation of

Streptomyces, The John Innes Foundation, Norwich (1985)).

•••# Pitkäaikainen säilytys ja käsittely suoritettiin kuten aikai- • · semmin on kuvattu (Fink, D. et ai., Biotech. Lett. 13: 845-850 -- • · · ··*! (1991) ) .

• · • · · • · * * * * : ·’ Kemotaksonomiset menetelmät • · • « · « · · • · · · • · · :.· · Soluseinässä oleva diaminopimeliinihappomuoto ja kokonaisista soluista saaduissa hydrolysaateissa yleisimmin esiintyvät : Γ: sokerit analysoitiin ohutkerroskromatografiällä Staneckin ja

Robertsin (Appi. Microbiol. 28: 226-231 (1974)) mukaan.

* ' ΐ *. Kokonais-DNA:n G + C-pitoisuus arvioitiin Ulitzurin (Biochim.

Biophys. Acta 272: 1-11 (1972)) menetelmällä. Rasvahapot • « *···* analysoitiin Sasserin menetelmällä (Sasser, M., teoksessa : Methods in Phytobacteriology, Klement & Sands, toim. , Aka- ·:··· demiai Kiado, Budapest (1990), s. 199-204).

118009 23

Biokemialliset määritykset

Ksylanaasiaktiivisuus määritettiin käyttämällä Nelson-Somogyi-menetelmää (Spiro, R.G., Meth. Bnzymol. 8: 3-26 (1966)), joka mittaa pelkistävän sokerin vapautumista 0,5 %:ssa (w/v) sitraatti-fosfaatti-boraatti-puskurissa (Teorellin puskuri) olevasta liukoisesta kaurasta eristetystä ksylaanista. Stan-dardiolosuhteissa pH oli 5,0 ja inkuboitiaika oli 10 minuuttia 60 °C:ssa, Reaktio lopetettiin lisäämällä pelkistävän sokeri-määrityksen ensimmäistä reagenssia. Yksi entsyymiaktiivisuus-yksikkö määritettiin entsyymimääränä, joka vapauttaa 1 mikro-moolin D-ksyloosiekvivalenttia minuutissa standardimääritys-olosuhteissa.

β-Ksylosidaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen 2 mM p-nitro-fenyyli-S-D-ksylosidia substraattina. Inkuboitiaika oli 10 minuuttia 60 °C:ssa Teorellin puskurissa pH-arvossa 5,0. p-Nitrofenolin vapautumista seurattiin 410 nmrssä. (

Kokonaisproteiini määritettiin M.M. Bradfordin, Anal. Biochem.

72: 248-254 (1976), menetelmällä käyttämällä emäksistä Stos- checkin kuvaamaa reagenssia (Stoscheck, C.M., Anal. Biochem.

***. 184: 111-116 (1990). Puhdistettujen entsyymien molekyylipainot ... arvioitiin SDS-PAGE:lla (Laemmli, U.K. Nature 227: 680-685 " (1970)). Glykoproteiinien värjäys Schiffin reagenssilla oli - · * kuten on kuvattu teoksessa Glossman & Neville (1971) . Hydro- * · · • * * * lyysituotteiden ohutkerroskromatografia suoritettiin, kuten on • * · *”t* kuvattu artikkelissa Biely, P. et ai., Biochim. Biophys. Acta V*' 1162: 246-254 (1993).

• i :.·.· Y. Bertheaun et ai.'in kuvaamaa menetelmää Anal. Biochem. 139: :: : 383-389 (1984), käytettiin puhdistamattomien tai puhdistettu- j en ksylanaasien analysoimiseen elektrofokusoinnilla erittäin • * ohuessa polyakryyliamidigeelissä (pH-gradientti 5-8) . Lisät- • # *;* tiin 10 μΐ 20 kertaisesti konsentroitua supernatanttia. Stan- • « • '·♦ dardiproteiinit (Bio-Rad) applisoitiin näille geeleille viljel- *:**: mäsuodosten vierelle ksylanaasien pl:n arvioimiseksi. Ksylanaa- siaktiivisuuksien toteamiseen käytettiin agaroosi-RBB-ksylaani- 24 ;i 118009 päällystä. Päällysgeeli valmistettiin 0,8 %:sta agaroosin ja 0,2 %:n RBB-ksylaanin seoksesta. Elektrofokusointigeeli päällystettiin Agaroosi-RBB-ksylanaasigeelillä. Inkuboitiin 50 °C:ssa 1 tunnin ajan. Selvät vyöhykkeet päällysgeelissä osoittivat ksylanaasiaktiivisuuden.

Liuosviljelmässä ksylanaasipositiiviset sädesienet siirros-tettiin Tryptic Soy Broth-liemeen ja viljeltiin ravistellen 50 °C:ssa. Kun sopiva solutiheys saavutettiin, myseeli otettiin talteen sentrifugoimalla ja siirrostettiin ksylanaasintuo-tantoalustaan (Morosoli, R. et ai., Biochem. J. 239: 587-592 (1986)), joka sisälsi kaurasta eristettyä ksylaania päähii-lenlähteenä. Ksylanaasiaktiivisuus mitattiin päivittäin käyttämällä standardimääritystä (mittaamalla pelkistävien sokerien vapautuminen kaurasta eristettyä vehnäksylaanista, jota on inkuboitu alustan supernatanttinäytteiden kanssa 10 minuutin ajan-60 °C:ssa, pH arvossa 5,0).

Bakteeri-, bakteriofaagi- ja plasxnidivalmisteet 1

Yksisäikeisen DNA:n tuottamiseen käytettiin bakteriofaagia M13K07 (Vieira ja Messing, Methods Enzymol. 153·. 3-11 (1987)). ;

Vektoreita pFD666 (Denis ja Brzezinski, Gene 11: 115-118 ... (1992)), pUC118, pUC119 (Vieira ja Messing, Methods Enzymol.

Φ 153: 3-11 (1987)) ja pUC21 (Vieira ja Messing, Gene 100: mm.

189-194 (1991)) käytettiin kloonaus- ja sekvensointitarkoi- * * tuksiin.

* · · * · ♦ * * « · • · · • · · *♦* * Kasvualustat LB-kasvualustaa käytettiin kompetenttien solujen valmistamisen • t· !#! · ja niiden transformoinnin aikana (Sambrook et ai., Molecular *' cloning, A laboratory manual, toinen painos, Cold Spring • ·

Harbor Laboratory Press, New York (1989)). Ksylanolyyttisten * · Ί' kloonien toteamiseen käytettiin LB-RBB-ksylaania (LB + 0,2 % • « ί ’*· RBB-ksylaania + 1,5 % agaria) . RBB-ksylaani on yhdistelmä, *!'” joka saadaan, kun ksylaaniin liitetään väriainetta Remazol 118009 25

Brilliant Blue (RBB). Tämä syntetisoitiin seuraamalla Bielyn ym. julkaisemaa, Anal. Biochem. 144: 142-146 (1985)), ohjeistoa.

Ksylanaasin tuotantoon käytettiin kasvualustaa Ml3 (Morosoli et al., Biochem. J. 239: 587-592 (1986)). Kasvualustan koos tumus on seuraavanlainen: 10 g ksylaania, 1,4 g (NH4)2804, 2,5 g K2HPO4, 1,0 g KH2PO4, 2,0 g hiivauutetta, 1,0 g peptonia, 0,3 g MgS04 * 7H2O, litrassa vettä. Sterilisoinnin jälkeen pH säädetään arvoon 7,0, minkä jälkeen lisätään 1,0 ml hivenaine-liuosta (0,2 g C0CI2 * 7H2O, 0,5 g FeS04 * 7H2O, 0,16 g λ

MnS04 · H2O, 0,14 g ZnS04 · H2O, 100 ml:ssa tislattua vettä, pH on säädetty arvoon 3,0 HCl:llä). Oliiviöljyä (2 ml/litra) lisättiin entsyymin erittymisen parantamiseksi (Bertrand et ai., Biotechnol. Bioeng. 33: 791-794 (1989)).

Ksylanolyyttisen aktiivisuuden toteamiseen käytettiin RBB- ksylaani-minimialustaa. Menetelmää sovellettiin Kluepfelin ohjeiston (Methods Enzymol. 160: 180-186 (1988)) mukaisesti.

A-osa, joka sisältää 0,5 g K2HPO4, 0,2 g MgS04 7H2O, 1,0 g (NH4)2SO4, ja 15 g agaria tilavuudessa, joka on säädetty 700 ml:aan vettä, autoklavoidaan erikseen, samalla kun B-osa, joka "*· sisältää 2 g RBB-ksylaania 300 ml:ssa vettä, autoklavoidaan.

• · · ... Jäähdyttämisen ja osien A ja B yhdistämisen jälkeen lisätään 1 " .·, ml hivenaineliuosta.

I I * * • · · \ I R2YE-kasvualusta käytettiin S. lividans 10-164-kannan proto-

• · · t · I

*",* plastien transformointiin ja regenerointiin (Hopwood et ai., • · ’·* ’ Genetic manipulation of Streptomyces, a laboratory manual, the

John Innes Foundation, Norwich, 1985, 338 s.). E. colin monistamiseen käytettiin TB-kasvualustaa (Sambrook et ai. , • · · V i Molecular cloning, A laboratory manual, toinen painos, Cold ,...: Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)). S. lividans {···# 10-164- ja Actinomadura sp. FC7-preparaattien kasvatukseen '** käytettiin TSB-kasvualustaa. Yksisäikeisen DNA-.n tuotantoon E.

m · : *·· coli TGl-preparaatilla käytettiin 2xYT-kasvualustaa. Tämän kasvualustan koostumus on 16 g tryptonia, 10 g hiivauutetta ja 5 g NaCl lopullisen tilavuuden ollessa 1 litra pH-arvossa 4.

2? 118009

Restriktioendonukleaasi, ligaasi ja fosfataasi ;

Restriktioendonukleaasit ja ligaasit hankittiin yhtiöiltä Boehringer Mannheim ja Pharmacia. Vasikan suolen fosfataasi (CIP) on peräisin Pharmacialta. Näitä entsyymejä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Solujen ja protoplastien valmistus ja niiden transformaatio

Kompetentit E. coli DHSaF'-, TG1- ja 4924 N/14-solut valmistettiin ja transformoitiin Imperial Cancer Research Foun- ; dationin ohjeiston mukaisesti, ja se on kuvattu artikkelissa Desmarais, D., Memoire de mäitrise, Departement de biologie,

Faculte des sciences, Universite de Sherbrooke, 75 s. (1990).

Lyhyesti sanottuna käytettiin seuraavanlaista menettelytapaa.

A) Kompetenttien solujen valmistus > 1. Aloitetaan jäätyneillä E. coli DH5a-preparaatin soluilla, joita on säilytetty 20 % glyserolissa. Ne levitetään petri- maljalle SOB:n tai LB-.n kanssa (Maniatis et ai., Molecular ’"· cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, * 1 2

New York, 1982, 545 s. (1982)) ja inkuboidaan yön yli 37 - • · · · .1, °C:Ssa.

• # *· ·♦ 2 • · · • ·

It 2. Siirrostetaan 5 ml SOB-viljelmää käyttämällä yksittäistä • · « !ΐί.: pesäkettä.

I » » • · · 3. Inkuboidaan viljelmää 37 °C:ssa ravistellen noin 2 tunnin » ajan tai siihen saakka, kunnes A55Q-kohta on noin 0,3 tai • 1 · V · kunnes viljelmä samenee.

· 1 ·····' 2 • · 118009 27 5. Jätetään jäihin 5 minuutiksi.

6. Sentrifugoidaan 15 minuutin ajan solujen pelletoimiseksi.

7. Poistetaan kelluva aines ja suspendoidaan solut vielä kerran 40 ml:aan TFB I:tä (kuvattu jäljempänä).

8. Jätetään jäihin 5 minuutiksi.

9. Sentrifugoidaan kohdan numero 6 tavalla.

10. Poistetaan kelluva aines ja suspendoidaan solut vielä kerran 4 ml:aan TFB I:tä.

11. Jätetään jäihin 15 minuutiksi.

12. Jaetaan 200 μΐ erissä l,5:n mikrofuugiputkiin (via 1.5 microfuge tube) (mikrofuugiputkien, pipetinkärkien ja pipettien jäähdyttäminen 4 °C:seen on edullista).

13. Jäädytetään hiilihappojäässä.

··· * .

• · ·*· ... 14. Erät pidetään -60 °C:n ja -70 °C:n välillä.

«*·« • · - • · B. Transformaatio • · • « 4 · 4 4 4 • · 4 1. Solut sulatetaan huoneenlämpötilaan vain sen verran, että * I * * suspensio nesteytyy.

*.ϊ.· 2. Jätetään 10 minuutiksi jäihin.

»M 4 4 · • * · * ·;·· 3. Lisätään DNA: ta (l/5-tilavuuteen soluja; ei käytetä enempää ,···. kuin 100 ng DNA:ta 200 /xl:aan soluja) . Menettelytapa aloi- * * · tetaan tässä vaiheessa käyttämällä juuri valmistettuja soluja.

« 4 * 4» • **’ 4. Jätetään jäihin 30 minuutiksi.

i 118009

28 L

·}<! 5. Inkuboidaan soluja 42 °C:ssa 90 sekuntia. Tätä vaihetta ·.

voidaan optimoida preparaatin mukaisesti. ' 6. Laitetaan se jäihin 1-2 minuutiksi. j 7. Lisätään 4 tilavuusyksikköä SOB:tä tai LB:tä (800 μ1/200 μΐ soluja).

8. Inkuboidaan 37 °C:ssa 1 tunnin ajan (ravistelu on suosi- ' teltavaa, mutta ei välttämätöntä).

9. Sentrifugoidaan 1-2 minuuttia mikrosentrifuugissa ja resuspendoidaan jäännös 200 μΐ-.aan SOB:tä tai LB:tä.

10. Levitetään SOB tai LB petrimaljalle antibioottien kanssa.

HUOMAA: Kaikki sentrifugoinnit ja liuokset on tehtävä ja vastaavasti säilytettävä 4 °C:ssa. Soluja on edullista käsitellä varovasti resuspensiovaiheiden aikana.

TFB I sisältää 30 mM kaliumasetaattia, 100 mM RbCl2, 10 mM

CaCl2 2H20, 50 mM MnCl2 · 4H20 ja 15 % glyserolia. pH

***. säädetään arvoon 5,8 käyttämällä 0,2 M etikkahappoa. Käytetään

• M

... jääetikan haponlaimennusta 1/100: tämä vastaa noin 50 tippaa " [•t 200 ml:aan liuosta. Tislatun veden käyttö on edullista lasi- • * systeemissä. Steriloidaan suodattamalla.

Ill • » * · 4 * | * · ·*;/ TFB II sisältää 10 mM MOPS: ia, 75 mM CaCl2 · 2H20, 10 mM RbCl2 • * ·

’·’ ja 15 % glyserolia. pH säädetään arvoon 6,5 käyttämällä 1 M

K0H:ta (noin 35 tippaa). Steriloidaan suodattamalla.

4 • · · * · » »··.

· S. lividans 10-164-protoplastit valmistettiin ja transfor- ....: moitiin Hopwoodin ym., Genetic manipulation of Streptomyces, a 4 4 ...# laboratory manual, the John Innes Foundation, Norwich, 1985, f 4 *1* 338 s., ohjeiston mukaisesti.

44 4 4 4 44 • 4 44444 4 4 29 118009 DNA-fragmentin puhdistaminen agargeelilla

Sen jälkeen, kun DNA-vyöhyke oli kulkeutunut TAE-agargeelillä (Maniatis et ai., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, 545 s.) DNA-frag- mentit puhdistettiin menetelmällä, jota suosittelee "Gene Clean" Bio/Can Scientific, Inc.

Tsymogrammi

Menetelmä on sama kuin polyakryyliamidigeelille (SDS-PAGE), t paitsi että näytettä ei ole keitetty, ja lisäksi akryyliamidi-seokseen lisätään 2 % RBB-ksylaania. Proteiininäyte valmistetaan seuraavilla (3X) pumpulitukkopuikoilla (swab) käyttäen: 3,0 ml glyserolia, 0,6 g SDS:ää, 0,228 g Tris-Base-reagenssia ja 0,1 mg bromifenolisinistä.

Ksylanolyyttisen aktiivisuuden kehittyminen aikaansaadaan upottamalla geeli 100 ml:aan 50 mM (pH 7,5) Tris-HCl:ää - 20 % metanolia huoneenlämpötilassa 60 minuutiksi. Sen jälkeen gee- · liä pestään 500 ml:ssa 50 mM (pH 7,5) Tris-HCl:ää - 1 mM EDTA:ta 4 °C:ssa yli yön. Entsymaattinen aktiivisuus visuali- *)'; soidaan inkuboimalla geeliä 50 °C1.ssa Mcllvainen puskurissa * 1 « 1 ... (pH 6) , kunnes vyöhykkeet tulevat näkyviin.

**** t « * 1

Genomisen ja plasmidi-DNA:n uutto * · · a · | « t *”t1 Käytetty plasmidi-DNA:n uuttomenettely oli sen kaltainen kuin • 1 1 *·1 ’ ovat kuvanneet Maniatis et ai., Molecular cloning: a labo ratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, • · · - , _ 545 s.

• 1 1 • · · *·1.

; Actinomadura sp. FC7:n DNA:n uuttoon käytetty genomisen DNA:n • 1 ...t uuttomenettely, vastaa menetelmää, jota ovat kuvanneet Rao et ai., Methods Enzymol. 153: 166-198 (1987)), paitsi että ·· • '1· Actinomadura sp. FC7:n myseeli (20 ml) rikottiin käyttämällä Γ1ϊ French-puristinta paineella 2000 lb/po2. 1 118009 30

Esimerkki 2

Seulontaohjelma ksylanolyyttisten sädesienten, eristämiseksi

Uusien ksylanaasivarianttien, jotka ovat tehokkaita pH-arvossa 4 ja lämpötilassa 70 °C, löytämiseksi kehitettiin seulonta-ohjelma, jolla voidaan tunnistaa sellaisia organismeja, joilla on tällaisia aktiivisuuksia. Seulonta kohdistettiin sädesie-niin, koska ne ovat monien ekstrasellulaaristen entsyymien tehokkaita tuottajia, ja niille voidaan tehdä geeni- ja molekyylianalyysejä.

Komposti-, karjanlanta- ja olkinäytteitä samoin kuin näytteitä biofilmistä, jota muodostuu paperiteollisuuden käyttämien putkijohtojen sisäpinnoille, rikastettiin termofUlisten säde-sienten suhteen useilla käsittelyillä: kuiva lämpökäsittely (120 °C; 60 min) (Nonomura & Hayakawa, teoksessa Biology of actinomycetes '88, Okami, Y. et ai., toim., Japan Scientific

Societies Press, Tokio (1988), s. 288-293); valikointi fenolilla (30 minuutin käsittely 1,5 %:ssa (w/v) fenoliliuoksessa, pH-arvossa 6,0 30 °C:ssa), mitä seurasi sentrifugointi ja pesu vedellä (Nonomura & Hayakawa, teoksessa Biology of actinomycetes '88, Okami, Y. et ai., toim., Japan Scientific

Societies Press, Tokio (1988), s. 288-293); valikointi humus-

IM

... happo-vitamiiniagarilla (Hayakawa & Nonomura, J. Ferment.

Tech. 65: 501-509 (1987)) tai viljely puolikostealla (semidry) » « ./‘f ksylaanijauheella, kuten ovat kuvanneet Waldron et ai. (Appi.

I \ Microbio. Biotech. 24: 477-486 (1986)), paitsi että selluloosa t · · '•j/ korvattiin ksylaanilla.

x"; :

Haluttaessa voidaan käyttää novobiosiiniä (50 mg/1) elimi-noimaan liikkuvat bakteerit ensimmäisessä sädesienipesäkkeiden ‘ valinnassa. Jotkut termofiiliset sädesienikannat voivat kuolla silloin, kun novobiosiiniä käytetään tällä tavalla. Keksinnön • · ...# mukainen kanta, Actinomadura sp. FC7, näyttää kuitenkin olevan I · suhteellisen resistentti novobiosiinille.

» · • · • ·» f # 1 Näiden käsittelyjen jälkeen selviytyneet bakteerit maljattiin

Tryptic Soy Agar-kasvualustalle ja viljeltiin 50 °C:ssa tai '31 118009 60 °C:ssa. Yksittäiset pesäkkeet poimittiin ja siirrostettiin minimiagarille, joka sisälsi 0,2 % ksylaania kovalenttisesti Remazol Brilliant Blue-väriaineeseen sitoutuneena (RBB-ksy-laani; Biely, P. et ai., Anal. Biochem. 144: 142-146 (1985)), ja inkuboitiin 50 °C:ssa tai 60 °C:ssa. Pesäkkeistä tutkittiin joka päivä ravintoalustan kirkastuminen ja morfologia. Ksy-lanolyyttiset sädesienet säilytettiin myöhempiä tutkimuksia varten.

Kompostista, karjanlannasta ja oljesta eristettiin kaikkiaan 12 kantaa, jotka kasvoivat 50 °C:n ja 60 °C:n välisissä lämpötiloissa ja osoittivat huomattavaa RBB-ksylaanin ha-jotuskykyä kiinteällä alustalla (taulukko 1). Kaikki nämä kannat luokiteltiin sädesienten ryhmään niiden morfologian ja kokonais-DNA:ssa olevan korkean (> 65 mol-%) G + C-pitoisuuden perusteella.

Kaikista kannoista tutkittiin niiden kyky tuottaa ksylano- ' lyyttisiä entsyymejä, jotka olivat suhteellisen aktiivisia pH-arvossa 4, 70 °C:ssa. Tätä tarkoitusta varten kaikkia kantoja viljeltiin tryptic soy-liemessä 50 °C:ssa (paitsi kont-rollikantaa, S. lividans 1326, jota kasvatettiin 30 °C:ssa), *·'. minkä jälkeen ne siirrostettiin ksylanaasintuotantoalusta.

**· ... Ekstrasellulaarinen ksylanaasiaktiivisuus mitattiin ksylaanis- ta vapautuvien pelkistävien sokereiden perusteella kahdessa ; ψ ,.*! eri olosuhteessa: 60 °C:Ssa, pH-arvossa 5,0 (näissä olosuhteis- « t * ·** a * \ * sa mitattu ksylanaasiaktiivisuus otettiin 100 %:ksi) ja « · 70 °C:ssa, pH-arvossa 4,0 (ankarat olosuhteet) (taulukko 1).

ζ · · ·' ’ Kuusi kantaa (mukaan lukien S. lividans 1326) säilytti aktiivi suudestaan 5 % tai vähemmän ankarissa olosuhteissa; kolme kantaa säilytti (aktiivisuudestaan) 5 % - 20 % ja kolme kantaa *m Ψ ϊ säilytti enemmän kuin 40 %. Kanta FC7 (peräisin karjanlannasta „].· ja eristetty humushappo-vitamiiniagarilla) säilytti aktiivisuu- * i destaan 65 % 70 °C:ssa pH-arvossa 4. Tämä kanta valittiin i : **' myöhempiin tutkimuksiin, koska sen puhdistamaton ksylanaasi »» Ϊ **» oli myös tehokas hydrolysoimaan hemiselluloosaliemen sisältä- t *mää ksylaania. : 118009 : 32

Taulukko 1. Yhteenveto ksylanolyyttisten termofiilisten sädesienten eristämisestä

Isolaatti Alkuperä Rikastus- Ksylanolyyttinen menetelmä aktiivisuus pH 4/7 0°C1

Fl karjalanta kuiva lämpö2 14 % F2 karjalanta kuiva lämpö+fenoli2 2 % FAA3 karjalanta kiinteä rikastus4 12 % : FC7 karjalanta HV-agari5 65 % FP604 karjalanta fenoli 3 % FP605 karjalanta fenoli 2 % PAl olki kiinteä rikastus 5 % CAI komposti kiinteä rikastus 57 % CCA3 komposti kiinteä rikastus 50 % : CCA5 komposti kiinteä rikastus 20 % CCA601 komposti kiinteä rikastus 2 % C604 komposti -- 2 % S. lividans 1326 kontrollikanta 2 % i; Aktiivisuus olosuhteissa pH 5/60 °C otettiin 100 %:ksi. "j 2: Kuiva lämpökäsittely (120 °C, 60 min.) (Nonomura & Haya kawa, teoksessa Biology of actinomycetes '88, Okami, Y. et ai., toim., Japan Scientific Societies Press, Tokio (1988), s.

288-293) .

3: Käsittely 1,5 %:ssa fenolissa (30 °C, 30 min) (Nonomura &

Hayakawa, op. cit.).

4 : Modifioitu C.R. Waldron Jr. :n ym., Appi. Microbio. Biotech. ' 24: 477-486 (1986), mukaan.

···. 5: Humushappo-vitamiiniagarselektio (Hayakawa & Nonomura, J.

Ferment. Tech. 65: 501-509 (1987)).

• · * **" FC7-kannalla oli tyypillinen sädesienimorfologia ja sen pohjamyseeli (basic mycelium) oli valkokeltainen "tryptic • · · [ ·' soy"-agarilla kasvatettuna. Tryptic Soy Broth-kasvualustan • ♦ * liuosviljelyssä FC7:n kasvu (arvioituna myseelin märkäpainona : millilitrassa kasvualustaa) oli maksimaalista 37-50 °C:ssa, kohtalaista 30 °C:ssa ja 60 °C:ssa ja hyvin hidasta 22 °C:ssa.

Itiöintiä havaittiin vain kerran: FC7 oli yksi-itiöinen, itiöt muodostuivat hyvin lyhyillä sporof oreilla heikosti kehitty- neessä maanpäällisessä (aerial) myseelissä. Soluseinän pep- ... tidoglykaanissa havaittiin meso-diaminopimeliinihappoa.

« · *·;** Mykolihappoja (mycolic acids) ei havaittu. Kokonaisten solujen (whole cell) sokereilla ei ollut diagnostista arvoa, koska ne *j··; vaihtelivat laajalti sen lämpötilan mukaan, jossa organismia 33 1 1 8009 viljeltiin. Happojen suhteellinen runsaus rasvahappokoostu-muksessa määritettynä (malli "3a" R.M. Kroppenstedtin mukaan, teoksessa Chemical methods in bacterial systematics, Good-fellow & Minnikin, toim., Academic Press, Lontoo (1985), s.

173-199) antoi heksadekaanihappoa (26,45 % rasvahappojen kokonaispitoisuudesta), 14-metyylipentadekaanihappoa (11,28 %) ja 10-metyylioktadekaanihappoa (10,75 %) ja yhdessä muiden taksonomisten tietojen kanssa salli FC7:n luokittelemisen Thermomonosporaceae-heimon "Actinomadura-Thermomonospora curvata"-ryhmään (Kroppenstedt & Goodfellow, teoksessa The Prokaryotes, Balows et ai., toim., Springer-Verlag, New York (1992), s. 1085-1114). Kantaan viitataan siten nimellä Acti- i nomadura sp. FC7. Tätä kantaa ei yritetty luokitella laji-tasolla. Tämä bakteeri syntetisoi ksylanaaseja, jotka säilyttävät suurimman osan ksylanolyyttisestä aktiivisuudestaan 70 °C:n lämpötilassa ja pH-arvossa 4. Tsymogrammin avulla h pääteltiin tämän preparaatin tuottavan neljää ksylanaasia. >

Esimerkki 3

Actinomadura sp. FC7:n ksylanaasigeenien kloonaus kantaan E. coli DH5a tmm Kloonauskäsittelyihin käytettiin Escherichia coli DH5orF1

·"* -preparaatteja (Bethesda Research Laboratory). Kokonais-DNA

eristettiin geenipankin konstruoimiseksi Actinomadura sp.

• ·.* FC7: stä R.N. Raon ym. menetelmällä, Meth. Enzymol. 153: • · *

• *,· 166-198 (1987). Actinomadura sp. FC7-preparaatin genominen DNA

: pilkottiin täydellisesti restriktioendonukleaasilla BglII.

Actinomadura sp. FC7-preparaatin genomi tuotti täydellisen •

BglII-pilkonnan jälkeen keskimääräiseltä kooltaan 12 kb:n frag-. .·. menttej a.

• · ! • * * * · · *·· »Il

HgIII“fragmentit liitettiin pFD666-vektoriin, joka oli ensin • ) katkottu BamHI:lla ja defosforyloitu T. Maniatisin ym. (teok- * · · sessa Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring :·. Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982)) ehdot- • · · tomalla menettelytavalla. E. coli DHSaF' (200 μΐ kelpoisia * · soluja) transformoitiin 100 ngrlla sidosseosta. Solut levi- 34 1 1 8009 tettiin kiinteälle LB-RBB-ksylaani + kanamysiini (50 μg/ml) alustalle ja inkuboitiin sen jälkeen 37 °C:ssa 5-6 päivää.

Tuloksena saadun rekombinaation tehokkuus oli 86 % (noin 9 000 rekombinanttia 10 500 tutkitusta). Rekombinanttivalmis-teiden lukumäärä arvioitiin T. Maniatisin ym. (teoksessa Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982)) mini-valmistus-menetelmällä. Geenipankki edusti yli 99 % Actinomadura sp.

FC7:n genomista. Tämä prosenttiosuus johdettiin kaavasta, jonka ovat kuvanneet Clarke ja Carbon, Cell 9·. 91 (1976) .

Kuusi mahdollisesti positiivista ksylanolyyttistä kloonia saatiin 5-6 inkubointipäivän jälkeen hajotusvyöhykkeiden ilmaantuessa. Uudelleen LB-RBB-ksylaanialustalle levittämisen jälkeen identifioitiin ja valikoitiin viisi positiivista kloonia, eli kloonit pJFl, pJF3, pJF6, pJF8 ja pJFlO, kun taas muut kloonit (pJF2, pJF4, pJF5, pJF7 ja pJF9) eliminoitiin väärinä positiivisina. Restriktioendonukleaasianalyysi var-misti sen, että klooneilla pJFl ja pJF3 oli noin 20 kb:n kokoinen insertti, kun taas klooneilla pJF6 ja pJF8 saattaisi olla sama 2,7 kb:n insertti, mutta vastakkaisessa orientaatiossa. Kloonilla pJFlO oli monta Bglll-inserttiä, joista yksi *!1: 2,7 kb:n insertti oli identtinen erään pJF6:ssa ja pJF8:ssa .

• · ♦ ..· havaitun insertin kanssa.

• 1 · • 1 4 4 ft 4 4 E. coli on gram-negatiivinen bakteeri, eikä sen tiedetä olevan 4 4 . 1' tehokas entsyymien erittäjä. Kaikesta huolimatta positiiviset kloonit eristettiin bakteerien luonnollisen hajoamisen an- • 1 1 * t · * siosta. Toisin sanoen sen tuloksena, että E. coli-isännän sisältö vapautuu RBB-ksylaania sisältävään kasvualustaan; 4 4 4 *.i.' koska rekombinantti-isäntä ilmensi ksylanaasigeenin, se y * m m *.’ 1 tuottaa ympärilleen hajotusvyöhykkeen, joka ilmaantuu 5-6 päivän inkuboimisen jälkeen. i ; * · · I : • · · • 4 · • 1 4 · 1 « 35 1 1 8009

Esimerkki 4

Actinomadura sp. FC7:n ksylanaasigeenien kloonaus kantaan E.

coli 4924 N/14

Plasmidit esimerkissä 3 kuvatusta geenipankista eristettiin kokonaisplasmidivalmistuksella (total plasmid preparation), jonka ovat suunnitelleet Maniatis, T., et ai., (teoksessa Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982)), ja transformoitiin E. coli 4924 N/14-kantaan. DNA-seosta käytettiin ligaation jälkeen transformoimaan periplasmiseen tilaan vuotavan kannan E. coli 4924 kompetentit solut. Transfor-maatioseos maljattiin LB-agarille, joka sisälsi 50 μg/ml kanamysiiniä ja 0,2 mg/ml RBB-ksylaania. Saatiin yhteensä 8850 rekombinanttia. Kahdesta kolmeen päivää kestäneen inkubaation 37 °C:ssa jälkeen poimittiin talteen kirkkaiden alueiden ympäröimät pesäkkeet, kasvatettiin nestemäisessä LB-kasvu-alustassa ja maljattiin uudelleen alhaisella tiheydellä RBB-ksylaanialustalle. Kuusi näistä rekombinanteista osoitti RBB-ksylaanin kirkastumisen 2 inkubointipäivän jälkeen.

Hajotusvyöhykkeiden visualisointiin kuuluvien toimintojen nopeuttamiseksi käytimme E. coli 4924 N/14-preparaattia. E, ·* coli 4924 N/l4-kannalla on periplasminen puutos, jota ei ole " geneettisesti määritetty (de Zwaig ja Luria, J. Bacteriol. 94·.

:#J 112-1123 (1967) ) . Tämä mahdollistaa sen periplasman sisällön ·’·*: hyvin nopean kulun ulkopuoliseen kasvualustaan. Pääasialliset • · ϊ syyt sen käyttöön ovat parempi hajotuksen visualisointi ja ·» » taloudellinen ajankäyttö. Esimerkiksi klooni pJFll eristettiin tämän valmisteen avulla, koska menetelmän herkkyys on E. coli . 4924 N/14-valmisteen kanssa todennäköisesti parempi kuin E.

* * · coli DH5a-valmisteen kanssa. Hajotusvyöhykkeen ilmaantumiseen • * · ·. * tarvitaan vain 16 tuntia 120 tunnin sijasta.

• · Γ**; Kyky hydrolysoida RBB-ksylaania säilyi sen jälkeen, kun plasmidi oli puhdistettu kaikista näistä rekombinanteista ja • ·· * . transformoitu uudelleen uuteen isäntään. Koska ksylanolyyt- tisiä aktiivisuuksia todettiin rekombinantti-E. coli -kan- 36 118009 noissa ja koska E. colin ei tiedetä tuottavan ksylanolyyttisiä aktiivisuuksia, kloonattujen geenien tulisi koodata ksyla-naaseja eikä ksylanaasituotantoon osallistuvaa säätelypro-teiinia.

Kloonit, jotka näyttivät pystyvän hydrolysoimaan RBB-ksylaania tämän toisen maljauskerran jälkeen, säilytettiin myöhempiä tutkimuksia varten. Niiden plasmidi-DNA:t uutettiin ja kartoitettiin restriktioentsyymeillä käyttäen yleisiä menetelmiä (Sambrook, J. et ai., Molecular Cloning, a laboratory manual (2. painos), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)).

Plasmidit pJFl, pJF3, pJF6, pJF8 ja pJFlO analysoitiin restriktiokartoituksella. Plasmidit pJFl ja pJF3 kantoivat samaa kloonattua inserttiä (noin 20 kb), mutta vastakkaisissa orientaatioissa. Myös kolmella muulla plasmidilla oli yhteinen kloonattu segmentti (2,7 kb), joko kahdessa vastakkaisessa orientaatiossa (pJF6 ja pJF8) tai toiseen segmenttiin fuusioituneena (pJFlO). Tämä segmentti erosi pJFl:ssä ja pJF3:ssa olevasta insertistä. Transformantit jakautuivat näin ollen kahteen eri ryhmään. Myöhempiin tutkimuksiin valittiin yksi transformantti kummastakin ryhmästä (pJFl ja pJF6). Ksyla- ··· naasia koodaavat segmentit kartoitettiin deleetioalikloo- " tt|!* nauksella, transformaatiolla ja maljaamalla RBB-ksylaani- . agarille. Kuvissa 1 ja 2 esitetään lyhyimmät DNA-segment it, *·*· jotka vielä mahdollistivat ksylanaasin ilmentämisen. Restrik- * · : tiokarttojen väliset erot antoivat aiheen kloonata kaksi eri * · · ** • · · i ksylanaasigeeniä: pJFl:n kantama xlnl (kuva 1) ja pJF6:n 1(1 kantama xlnll (kuva 2) . Vastaaville ksylanaaseille annettiin . vastaavasti nimet XYL I ja XYL II. Klooni pJF6 valittiin • · · • · · sekvensoitavaksi sen mielenkiintoisen ominaisuuden, suhteel- « · * ’·] lisen lyhyen insertin (2,7 kb) vuoksi, jolloin sen inserttiä *:*·: ei tarvitse paljoa lyhentää alikloonauksella.

• · t : M·

Vektorin pFD666 BamHI-kohta, jota käytettiin ksylanaasigeenien • · • · * , insertioon, sijaitsee monikloonauskohdassa transkription terminaattorien reunustamana. Jonkin verran transkriptiota on 118009 37 kuitenkin osoitettu esiintyvän yhdestä puolesta lähtöisin, todennäköisimmin neomysiiniresistenssin geenin ohjaamana (Denis, F., "Construction d'un vecteur navette pour Escherichia coli et les actinomycetes et clonage d'un gene de :1 chitosanase d' actinomycete, 11 tohtorin väitöskirja, Universite de Sherbrooke (1994), 120 s.). Koska ksylanaasigeenit kloo nattiin molemmissa orientaatioissa BamHI-kohtaan ja ksyla-nolyyttinen (aktiivisuus) todettiin E. colin rekombinantti-kannoissa niiden orientaatioista riippumatta, näyttää todennäköiseltä, että E. colissa voidaan tunnistaa joitakin Acti-nomaduran promoottoreita.

Tsymogrammianalyysi paljasti sen, että klooni pJFl tuottaa kahta ksylanaasia. Nämä pJFl-ksylanaasit vastaisivat Acti-nomadura sp. FC7:n tuottamaa kahta korkeimman molekyylipainon omaavaa vyöhykettä. Actinomadura sp. FC7:n kasvusupernatant-tien tsymogrammianalyysi ksylaanikasvualustasta paljasti kaksi suurta (hitaampaa) ja kaksi pientä (nopeampaa) aktiivisuus- '> vyöhykettä (ei esitetä). Kaksi suurta (hitaampaa) vyöhykettä siirtyivät yhdessä kahden sellaisen vyöhykkeen kanssa, jotka saatiin 10-164(pJFl)-viljelysupernatantista saatavalla puh-distamattomalla valmisteella, ja vastasivat todennäköisimmin XYL I :n 48 kDa:n ja 37 kDa:n muotoja (katso jäljempänä).

.i.1 XYL II :n aktiivisuutta ei voitu visualisoida tällä nimeno- ” | ..!2 maisella tsymogrammijärjestelmällä, todennäköisesti koska tämä k ·#ί proteiini ei pysty renaturoitumaan inkubaationjälkeisissä vai- heissä. FC7 tuottaa siis XYL I-.n ja XYL II-.n lisäksi vähintään • · i ;2 yhtä tai kahta muuta ksylaaninhajotusaktiivisuutta. Monien • · · i erilaisten ksylanaasiaktiivisuuksien esiintymisestä on ra-portoitu useissa mikro-organismeissa (Wong, K.K.Y. et ai., . Microbiol. Rev. 52: 305-317 (1988)).

• · · \rt • · · • 1 1 # · · * 1 f * 1 1 *. pJFl-kloonin insertti pienennettiin, jolloin saatiin a’liklooni pJF1020. Jälkimmäisellä on noin 7,5 kb:n insertti, mikä IS riittää sisältämään itsessään 2 ksylanaasia koodaavaa geeniä.

;·) Geeni (t) sijaitsevat alkufragmentin 5 kb:n osassa.

• ·· · ·· » 2 • · 1 1 8009 : 38 ^ : ' '=1 Esimerkki 5 ':

Ksylanaasin tuotanto rekombinanttikannoilla

Plasmideja, jotka oli eristetty E. coli-klooneista, jotka pystyivät hydrolysoimaan RBB-ksylaania, käytettiin transformoimaan S. lividans 10-164-kannan protoplastit. Proto-plastien regeneraation ja kanamysiiniresistenssiin perustuvan pesäkevalinnan jälkeen transformanteista testattiin niiden ksylanaasipositiivinen fenotyyppi minimialustalla (Hopwood, D.A. et ai., Genetic manipulation of Streptomyces, The John Innes Foundation, Norwich (1985)), joka sisälsi RBB-ksylaania.

Plasmideja pJFl ja pJF6 käytettiin transformoimaan S. lividans, koska E. coli ei ole tehokas isäntä ekstrasellulaariseen entsyymituotantoon. Mutanttikantaa S. lividans 10-164 käytettiin, koska se ei pysty tuottamaan endogeenisiä ksylanaasi- ja sellulaasiaktiivisuuksia (Mondou, F. et ai., Gene 49: 323-329 (1986)). Molemmat plasmidit täydensivät ksylanaasinegatiivisen fenotyypin 10-164-kantaan siirrettyinä. Tämä isäntä mahdollisti kloonattujen geenien koodaamien ksylanaasien liikatuotannon alhaisella muiden proteiinien muodostavan taustan ollessa matala, mikä näin ollen helpottaa puhdistusprosessia.

* * *

Yksi kumpaakin pJFl- ja pJF6-plasmidia kantavaa transformantti- ..!·* tyyppiä testattiin ksylanaasintuotannon suhteen liuosviljel- * - ·#ί mässä. Kutakin transformanttia siirrostettiin Tryptic Soy Γ*]ί Broth (Difco) -kasvuliemeen, joka sisälsi 50 μ5/ιη1 kanamysii- i ·*· niä, ja viljeltiin 48-72 tuntia 30 °C:ssa ravistelijassa • » · · ,*}*. (rotary shaker) kierrosnopeudella 250 kierrosta minuutissa.

Myseeli otettiin talteen sentrifugoimalla viljelmiä "bench- t S' stop"-sentrifuugissa (3000 g, 15 min), suspendoitiin 50 ml:aan * · * 1*1 0,9 %:sta steriiliä suolaliuosta ja sentrifugoitiin uudelleen.

* * * *. Sen jälkeen 24 ml myseelipellettiä siirrostettiin 1,2 litraan ksylanaasintuotantoalustaan (Morosoli, R. et ai., Biochem. J* 239: 587-592 (1986)) ilman kanamysiiniä (vektori pFD666 ja sen ;·’ johdannaiset pidetään Streptomyces lividansissa tavallisesti » · · ] . stabiilisti yllä ilman antibioottivalintaa (Denis & Brze- zinski, Gene 111: 115-118 (1992)). Sen jälkeen, kun oli 39 1Λ 8009 viljelty 72 tuntia, viljelmä sentrifugoitiin (11 000 g, 30 min, 4 °C) ja supernatantti otettiin talteen puhdistamat-tomana entsyymivalmisteena.

ί I

Esimerkki 6

Ksylanaasien I ja II puhdistaminen

Kaikki puhdistusvaiheet suoritettiin 4 °C:ssa. Jäähdytettyä supernatanttia (0,6 litraa) S. lividans 10-164-viljelmästä (pJFl) (ksylanaasi I:n puhdistusta varten) tai S. lividans 10-164-viljelmästä (pJF6) (ksylanaasi II:n puhdistusta varten) sekoitettiin kolmeen tilavuusosaan jääkylmää 95 %:sta etanolia. Yön yli asettumisen jälkeen sakka otettiin talteen sentrifugoimalla (9 000 g, 30 min). Pelletti resuspendoitiin 50 ml:aan 20 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, ja syötettiin 0,9 cm x 30 cm DEAE-BioGel A-anioninvaihtopylvääseen (Bio-Rad), joka oli tasapainotettu samassa puskurissa. Pylväs pestiin sen jälkeen 50 ml :11a samaa puskuria ja proteiinit eluoitiin KCl:n lineaarigradientilla (0-0,6 M) (kokonaistilavuus: 120 ml). Fraktiot kerättiin ja ksylanaasiaktiivisuus todettiin täplittämällä (spotting) 20 μΐ näytteitä RBB-ksy-laaniagarilla ja inkuboimalla 37 °C:ssa. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin 4 ml:ksi dialysoimalla Concentra- ***j tor Resin (Bio-Rad)-hartsia vastaan ja syötettiin 1,6 cm x • * · ... 100 cm BioGel A-0,5m kokoekskluusiokromatografiapylväälle • * * · ,·. (Bio-Rad) , joka oli tasapainotettu 20 mM K-fosfaattipusku- • · •V, rilla, pH 6,0, (valmistettu sekoittamalla sopivat annokset • · " \ 100 mM yksiemäksistä kaliumfosfaattia ja 100 mM kaksiemäksistä ! ♦ · * · · *’*,* kaliumfosfaattia, ja laimentamalla sitten neljän tilavuusosan II· ·* ’ kanssa tislattua vettä). Fraktiot kerättiin talteen ja ksy lanaasiaktiivisuus todettiin kuten aikaisemmin. Glyserolin *.!.* (lopullinen konsentraatio 50 % v/v) lisäyksen jälkeen ent-

«M

V : syymejä säilytettiin -20 °C:ssa.

····· • · ···, Molemmat ksylanaasit puhdistettiin homogeenisiksi (pääteltynä *’* Coomassie-sinivärjätyistä SDS-PAGE-geeleistä) edellä maini- • « ϊ ’*· tulla menettelytavalla, johon sisältyy etanolisaostus, anionin- ***’· vaihtokromatograf ia ja kokoekskluusiokromatograf ia. Taulukko 2 118009 40 esittää yhteenvedon entsyyminpuhdistusaineistosta. Saatiin 27 ja 14 %:n saannot, ja spesifiset aktiivisuudet kaurasta eristetyllä ksylaanilla tehdyssä standardimäärityksessä olivat 178 ja 1268 yksikköä/mg vastaavasti puhdistetuille XYL I:lle ja XYL II:lie.

XYL I:n puhdistuksen aikana kokoekskluusiokromatografiavai-heella erotettiin kaksi ksylanaasiaktiivisuuspiikkiä. Suurempi piikki vastasi 48 kDa:n proteiinia (ja tämä proteiini tutkittiin perusteellisemmin), kun taas pienempi piikki vastasi 37 kDa-.n proteiinia. Kun monista eri pJFl-plasmidin deleetio-johdannaisista analysoitiin niiden proteiinituotannon malli, pienemmän vyöhykkeen häviäminen korreloi aina suuremman vyöhykkeen häviämisen kanssa. Päättelemme, että pienempi proteiini ei ole erillisen geenin koodaama vaan 48 kDa:n XYL I-proteiinin johdannainen. « XYL I:n ja XYL II:n biokemiallisista ominaisuuksista esitetään yhteenveto taulukossa 3. XYL I muistuttaa muita korkea mo-lekyylipaino/matala pl-ksylanaaseja (Wong, K.K.Y. et ai., Microbiol. Rev. 52: 305-317 (1988)), kuten esimerkiksi XInA:ta S. lividansista (Morosoli, R. et ai., Biochem. J. 239: 587-592 (1986); Shareck, F. et ai., Gene 107: 75-82 (1991)) tai ·«·

XynA:ta " Caldocellum saccharolyticumista" (Liithi, E. et ai.,

Appi. Environ. Microbiol. 56: 2677-2683 (1990); Liithi, E. et l/· ai., Appi. Environ. Microbiol. 56: 1017-1024 (1990): sen ;***: molekyylipaino on korkeampi kuin 40 000; sillä on alhaista • · ί ;'· mutta merkittävää aryyli-£-D-ksylosidaasiaktiivisuutta ja se ·*· · pystyy hydrolysoimaan tehokkaasti ksylo-oligosakkarideja, mitä * lyhyiden oligomeerien (ksylobioosin, ksylotrioosin) ilmaan-tuminen reaktiotuotteiden joukkoon hydrolyysin varhaisessa * · vaiheessa osoittaa (taulukko 3) . XYL II:11a ei sitä vastoin • # · • * · *. ole havaittavaa aryyli-iS-D-ksylosidaasiaktiivisuutta, ja se » hydrolysoi ksylo-oligosakkaride ja paljon hitaammin kuin XYL I.

*·· Tässä tapauksessa lyhyitä oligomeerejä ilmaantuu reaktio-;·* seokseen vasta hyvin pitkän inkubointiajan jälkeen.

» # · : 4i (f 118C09 XYL II :n luokittelu taulukossa 4 esitetyn aineiston perusteella ei ole yksinkertaista. Tällä proteiinilla on neutraali pl, mutta sen molekyylipaino on paljon alhaisempi kuin mitä suurimman osan "korkea Mr/matala pl"-ksylanaasien Mr on. Myös sen korkea spesifinen aktiivisuus kaurasta eristettyä ksy-laania kohtaan ja alentunut kyky hydrolysoida lyhyitä ksylo-oligomeerejä luokittelee XYL II :n lähemmäksi alhaisen mole-kyylipainon entsyymejä joilla on samanlaisia biokemiallisia ominaisuuksia, kuten esimerkiksi XlnB:tä ja XlnC:tä S. livi- t dansista (Biely, P. et ai., Biochim. Biophys. Acta 1162: 246-254 (1993)). XYL II antoi kuitenkin Western-blottausko-keissa (julkaisematon tieto) positiivisen reaktion kaniinin : vasta-aineella S. lividansista peräisin olevaa ksylanaasi A: ta kohtaan (korkea Mr/matala pl-ksylanaasi), joka ei ristireagoi samasta organismista peräisin olevien matala Mr/korkea pl-ksylanaasien XlnB ja XlnC kanssa (Vats-Mehta, S. et ai., Gene 86: 119-122 (1990)) . Me oletamme näin ollen XYL II :n olevan joko alhaisen Mr:n ksylanaasi, jolla on epätavallisen neutraali pl, tai todennäköisemmin typistetty proteiini, joka on peräisin korkean Mr:n ksylanaasin geenistä tai proteiinista.

pH: n vaikutusta kumpaankin ksylanaasiin tutkittiin kolmessa eri lämpötilassa (kuvat 3 ja 4) . Optimaalinen pH on sekä XYL l:lle että XYL II:lle välillä 5,2 ja 5,7. pH-arvossa 4 ja ' y

70 °C:ssa (seulontaohjelmassa käytetty lämpötila) XYL I

:: säilytti 67 % maksimaalisesta aktiivisuudestaan, kun taas ·· ·1·1: XYL II säilytti aktiivisuudestaan vain 26 % näissä olosuh- * · l ;1· teissä. Actinomadura sp. FC7:n puhdistamattomalla kasvusuper- * · 1 · ,1!1, natantilla havaittu aktiivisuustaso olosuhteissa 70 °C/pH 4 i i 1 * · johtui epäilemättä XYL I:n vallitsevuudesta tämän villityypin . kannan erittämien ksylanaasimuotojen joukossa.

* « · »··.

1 1 ‘ rt, % t · 118009 ' - . 42 pysyi pH-arvossa 4. Xyl II oli sitä vastoin jopa optimaalisessa pH-arvossaan 8,1-kertaa vähemmän aktiivinen 80 °C:ssa kuin 70 °C:ssa (kuva 4).

i

Xyl I :n termostabiilisuuden arvioimiseksi entsyymiä inkuboi-tiin Teorellin puskurissa eri lämpötiloissa 100 μ^/πιΐ naudan seerumin albumiinin (BSA) joko puuttuessa tai läsnäollessa. Näytteitä otettiin määräajoin ja jäännösaktiivisuus mitattiin standardikokeella. Esi-inkuboituna olosuhteissa pH 6/50 °C Xyl I säilytti täyden aktiivisuuden vähintään 96 tunnin ajan. Olosuhteissa pH 6/70 °C puoliintumisikä oli 6 tuntia BSA:n puuttuessa ja 18 tuntia BSA:n läsnäollessa. Olosuhteissa pH 4/70 °C puoliintumisikä oli 10 tuntia BSA:n puuttuessa ja 22 tuntia BSA:n läsnäollessa. Nämä arvot ovat sellaisten stabiilisuuksien rajoissa, jotka on saatu muista Actinomadura-lajeista peräisin oleville puhdistamattomille termoresisten-teille ksylanaaseille (Holtz, C. et ai., Antonie van Leeuwenhoek 59: 1-7 (1991)); ne ovat kuitenkin selvästi muuttuneet happamammissa pH-arvoissa.

Taulukko 2. Ksylanaasi I:n ja II :n puhdistaminen rekombi- « •h* nanttien Streptomyces lividans 10-164-kantojen kasvusuper-

Vi natanteista » * • ·

♦ · . — . . _ ' H

Kokonais- Spesif.

j ·* aktiivisuus Proteiini aktiiv. Saanto Puhdistus- i (yksikköä) (mg) (yks./mg) (%) kerroin • aa ^_ _

*«’ : Äi S~- lividans 10-164 :llä (p JFl) tuotettu ksylanaasi I

Kasvuliemi 3420 9Ö 38 100 Ϊ,6

Etanolisaostus 3250 58 56 95 1,5 %*\‘m DEAE-BioGel 1265 9,3 135 37 3,6 V : BioGel A-0,5m 910 5,1 178 27 4,7 a ^__

* B: S.lividans 10-164:llä (pJF6) tuotettu ksylanaasi II

• * ψ ·;·’ Kasvuliemi 11460 86,8 132 100 1,0 *«, Etanolisaostus 9412 37,5 251 82 1,9 • DEAE-BioGel 4115 6,7 615 38 4,6 *:*·· BioGel A-0,5m 1581 1,25 1268 14 9,6 118009 43

Taulukko 3: Xyl Isn ja Xyl II:n biokemialliset ominaisuudet

Xyl I Xyl II

Molekyylipaino “ ' ’ (SDS-PAGE:n jälkeen) 48 kDa 34 kDa

Isoelektrinen piste 5,8 7,1

Optimilämpötila pH-arvossa 51' 2 75 qq 70 °C

Optimi-pH 60 °C:SSa1'2 5,2 5,7 Päähydrolyysituotteet 30 min. ksylobioosi korkeammat reaktion jälkeen1 ksylotrioosi oligo- korkeammat ksylosidit oligoksylosidit Päähydrolyysituotteet 18 jälkiä ksylobioosi tunnin reaktion jälkeen1 ksyloosista ksylotrioosi ksylobioosi ksylotrioosi

Aryyli-S-D-ksylo-sidaasin spesifinen aktiivisuus 0,13 U/mg ei- todettavissa Värjäys Schiffin reagenssilla negatiivinen negatiivinen 1: Määritetty kaurasta eristetystä ksylaanisubstraatilla 2: Reaktioaika oli 10 minuuttia. ;

Lopuksi voidaan päätellä että keksintöä varten kehitetty seulontaohjelma, joka perustui kahden tarkasti määritetyn (stringent) parametrin (alhainen pH ja korkea lämpötila) yhtäaikaiseen käyttämiseen, johti sellaisen ksylanolyyttisen ·1· sädesienen eristämiseen, joka tuottaa ainakin yhtä ksylanaa- -t41i1 siä, joka säilyy miltei täydellisen aktiivisena ja on hyvin ϊ1ϊ stabiili näissä olosuhteissa.

PH

* · « ;·„ « » :- : .v. Esimerkki 7 • f » 1 · .··«. Insertin sekvenssi pJF6:ssa * » · , Restriktiokartta laadittiin mahdollistamaan fragmenttien * £ 1 ;2 alikloonaus, jolla mahdollistetaan sekvensointi (kuva 5) .

• · · ’ Alikloonattiin ja sekvensoitiin useita DNA-fragmentteja.

:·1·· ·1... ! »2’; Vektorin pFD666 sisältämä Actinomadura sp. FC7-valmisteen ·1♦ geenipankin positiivisten kloonien plasmidi-DNA pilkottiin « 1 M valikoiduilla restriktioendonukleaaseilla. Näin tuotetut 2 • · » 1 · * DNA-fragmentit puhdistettiin "Gene Clean"-valmisteella myö- 118009 44 hempää vektoreihin pUC118, pUC119 ja pUC21 liittämistä varten. Lisäalikloonien saamiseen valittiin Henikoffin, Methods enzymol. 155: 156-165 (1987), kuvaama yksisuuntainen ekso- nukleaasi III/nukleaasi Sl-deleetiomenetelmä.

Yksisäikeisen DNA1.n valmistamiseen valittiin Vieiran ja Messingin (Gene 100: 189-194 (1987)) menetelmä, jonka on modifioinut J-L. Parent, The JHJ-1 actinophage: sequencing and promotional study. Master's thesis. Department of Biology.

Faculty of Sciences. University of Sherbrooke. 81 s, (1992). Kaksisäikeinen DNA-valmiste tehtiin valmiiksi "T7 Quick Prime Kit"-valmisteen, Pharmacia LKB Biotechnology, mukaisesti. Yksisäikeisen ja kaksisäikeisen DNA:n sekvensointi aikaansaatiin Sangerin ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74: 5463- 5467 (1977), menetelmällä "Sequenase and 7-deaza-dGTP" -vä lineistöllä, United States Biochemical.

Alustava tietokoneanalyysi mahdollisti hyvin voimakkaan sekvensointihomologian osoittamisen Streptomyces lividansin ksylanaasi A:ta kohtaan. Tämä mahdollisti kloonilla pJF6 olevan ksylanaasin koodaavan avoimen lukukehyksen alkukohdan paikallistamisen. Näin ollen xlnJI-geeni paikallistetaan ja sekvensointi suunnataan vain osaan pJF6-inserttiä, mikä on : NruI-kohdasta oikealle BgrlII-kohtaan pJF6:n restriktiokartalla ·:* (kuva 5) .

* 1 * 1 * * * 1 · * * '1 pJF6:ssa olevan insertin nukleotidisekvenssi esitetään kuvassa • · • · ; .·. 6 ja se on Genback talletusnumero U08894. Avoin lukukehys « · · (ORF) alkaa nukleotidissa 521 kodonilla GTG ja loppuu toden- • · · * näköisesti vektorista seuraavana sovitettuna sijaitsevan translaatiokodonin lopun välityksellä, koska terminaatio- * · · *"·1 kodonia ei havaita kloonatun fragmentin sisällä. Geeni olisi • · * V ' siten typistetty ja koodattu aktiivisena ksylanaasina. Nuk- ·;··· leotidissa 509 havaittiin Shine-Dalgarnon sekvenssi (GGAGGA) , .***. joka on spesifinen ribosomeille kiinnittymistä varten. W.R.

Strohlin ym. , Nucleic Acids Research. 20: 961-974 (1992), • · • “ mukaan tämä RBS on täydellisen homologinen 40 streptomykeetti- 1 geenistä tuotetun konsensussekvenssin kanssa (kuva 7). Tämän 45 118009 geenin koodaavassa alueessa on G + C-rikas nukleotidisisältö, suuruusluokaltaan 68 %. Lisäksi kodonin asemassa 3 havaitun nukleotidityypin (G tai C) prosenttiosuus on yli 90 %, mikä f vastaa Bibbin ym. (1984) selostamia tuloksia.

Wongin ym. , Microbiol. Rev. 52 (3): 305-317 (1988), mukaan

ksylanaasit voidaan luokitella kahteen luokkaan, joko luokkaan A, joka ryhmittelee uudelleen ksylanaasit, joiden molekyyli-paino on yli 35 kDa ja joiden pl on hapan, kun taas luokka B kokoaa yhteen ne ksylanaasit, joilla on alle 35 kDa:n mole- J

kyylipaino ja emäksinen pl. Näin ollen tämä 1527 nukleotidin avoin lukukehys (ORF) koodaa noin 43 kDa:n ksylanaasia, ja kuuluisi sen vuoksi luokkaan A.

Tämän ksylanaasin preproteiinin signaalipeptidillä on omi- v naisuuksia, joita tavallisesti tavataan sellaisissa aminohapposekvensseissä (Perlman ja Halvorson, J. Mol. Biol. 167: - 391-409 (1983): so. positiivisesti varautunut N-terminaalinen ääripää, joka sisältää arginiineja (R) , joita seuraa pitkä hydrofobisten aminohappojen sekvenssi ja C-terminaalinen proliinin (P) sisältävä segmentti, joka sijaitsee lähellä peptidaasisignaalin lohkeamiskohtaa (AXA) (kuva 8).

’!*: Promoottorialue on tyypillinen; toisin sanoen 16 nukleotidin * * * ·;♦ väli erottaa -35-alueen (TTGACG) -10-alueesta (CACAAT) . Tämä *··» .*. promoottori on verrattavissa niihin, joita Strohl, Nucleic **

Acids Research. 20: 961-974 (1992) , on havainnollisesti * · • · ; .·. esittänyt (kuva 9) . Lisäksi tämä promoottori olisi melko • · * *11/ homologinen Escherichia colissa havaitun promoottorin kon- ♦ · · ’ sensussekvenssin (TTGAC...TATAAT) kanssa (Lewin, Genes, John

Wiley & Sons, Inc. USA, 1983, 715 s.).

« · · • · · ··· • V * Restriktiokarttatutkimukset viittasivat siihen, että kloo- ·.··· neissa pJF6, pJF8, pJFlO ja pJFll havaitut 2,5 kb:n fragmentit ,···. olivat identtiset. Tämän varmistamiseksi näiden fragmenttien * * · ääripäät sekvensoitiin ja niitä verrattiin toisiinsa. Tulokset * * : " osoittivat, että klooneissa pJF8 oleva 2,7 kb:n fragmentti oli * * identtinen pJF6:ssa havaitun kanssa. Lisäksi 2,7 kb:n frag- ... . 1 46 118009 mentin vieressä olevat fragmentit pJF10:ssä ja pJFll:ssä näyttävät olevan seurausta monesta ligaatiosta, koska saadut sekvenssit eivät edusta merkittävää homologiaa S. lividansin , ksylanaasi A:ta tai toisiaan kohtaan.

Translaation terminaatiokodonia ei havaittu pJF6-kloonien insertin xlnll-sekvenssissä. Johtopäätöksenä on, että kloonattu geeni on typistetty 3'-osastaan. Tähän viittaa lisäksi S. lividansin ksylanaasi A:n koodaavan sekvenssin vertaaminen pJF6:n koodaaman koodaavan sekvenssin kanssa. Noin 185 nuk-leotidia näyttää puuttuvan tai olevan typistettyinä pJF6:n koodaamasta sekvenssistä. t;

Kloonin pJF6 koodaavalla alueella on mahdollisuus koodata 44 kDa:n ksylanaasia. Tuotetun ksylanaasin molekyylipaino on kuitenkin 34 kDa:n luokkaa. Tämän selittämiseen on kolme mahdollisuutta. Ensimmäinen hypoteesi on se, että RNA-poly-meraasi pysäytetään transkription aikana. Toinen on se, että terminaattorisekvenssi on läsnä ja näin ollen pysäyttää translaatiomekanismin. Kolmas mahdollisuus on se, että proteiini pilkotaan luontaisesti proteolyyttisesti synteesin jälkeen.

*": Akino et ai.'in, Appi. Environ. Microbiol. 55: 3178-3183 · * * * ... (1989) , mukaan useiden käänteistoistosekvenssien on mahdol- t·»» .·. lista pysäyttää transkriptio. Nämä tekijät ovat kuvanneet • · geenin, joka koodaa kahta β-mannanaasia, joiden molekyyli- • · | painot ovat 54 kDa ja 37 kDa. Kooltaan 37 kDa:n mannanaasin • t · tuotanto johtuisi RNA-polymeraasin pysäytyksestä seurauksena » · « * toisto- ja käänteissekvenssien sekä harvinaisen kodonin yhdistetystä läsnäolosta. Tässä sellaisia toisto- ja kään- * · · teissekvenssejä esiintyy nukleotidien 1538 ja 1672 välillä.

• · · » » · • · * ....: Näillä sekvensseillä on myös mahdollisuus muodostaa useita ,···. sekundaarirakenteita, jotka voisivat olla energeettisestä • « ’** hyvin stabiileja, esimerkiksi nukleotidien 1538 ja 1672 ’ " välillä (kuva 12) . Nukleotidien 1538 ja 1610 välillä olevan hiusneulasilmukan laskennallinen sisäinen energia (ΔΟ on ' 47 : 118009 -55,2 Kcal (Tinoco et ai., Nature 246: 40-41 (1973) . Tämä saattaisi tuottaa noin 34 kDa:n proteiinin, mutta jälkimmäisen läheltä ei ole löydetty harvinaista kodonia.

Toinen hypoteesi edellyttää sellaisen sekvenssialueen läsnäoloa mRNArssa, joka mahdollistaa toisen stabiilin rakenteen muodostamisen. Samalla aikaisemmin esitetyllä alueella sellaisen sekundaarirakenteen muodostuminen on mahdollista. Tällä sekundaarirakenteella saattaisi mahdollisesti olla kyky · hidastaa ribosomien etenemistä mRNA:1la niin, että se vihdoin pysäyttää koko translaatiomekanismin, jolloin lopulta saadaan 34 kDa:n suuruusluokkaa oleva proteiini. Kolmannesta hypoteesista keskustellaan jäljempänä. ;

Esimerkki 8

Kloonin pJF6 ksylanaasin aminohapoista johdetun sekvenssin vertailu muiden proteiinien kanssa DNA-sekvenssit analysoitiin UWGCG-systeemin ohjelmilla: FASTA, TFASTA, BESFIT, PILEUP, PRETTY, STEMLOOP, REPEAT, MAP ja PROTEINSTRUCTURE "Genbank"- ja "EMBL"-tietokannoista saatujen sekvenssien perusteella (Devereux et ai., Nucleic Acids Res.

12: 387-395, 1984) .

• · · • · • · · . > ... TFASTA-oh j elmaa käytettiin sellaisen homologia-asteen tut- * 1 1 · kimiseen, joka tavataan xlnll-.stä johdetussa aminohapposek- j·.1. venssissä, kuten se kloonin pJF6 koodaamana on, verrattuna • · : .·. tietokannoissa olevista proteiineista johdettuihin sekvens- • 1 1 *"·1 seihin.

• 1 k » · · PILEUP-ohjelma teki sitten mahdolliseksi asettaa johdetut φ · · proteiinisekvenssit riviin (kuvat 10-10C) . Seuraavilla gee- • · · *·1 1 neillä havaittiin merkittävää homologiaa: ksylanaasigeenit ·:··· Butyrivibrio fibrisolvensista (Lin et ai., Genbank talletus- |—. numero: X61495 (1991), Ruminococcus flavefaciensista (Zhang et y k · · ..1 ai., Mol. Microbiol. 6; 1013-1023, 1992), Thermoanaerobacter * · : 1‘ saccharolyticumista (Lee et ai., Genbank talletusnumero: 1 M97882, Bacillus sp.:n C-125 alkalifiilisestä valmisteesta 118009 48 (Hamamoto et ai., Agric. Biol. Chem. 51: 953-955 (1987),

Clostridium thermocellumista (Grepinet et ai., j. Bacteriol.

170: 4582-4588 (1988), samoin kuin kaksi ksylanaasia Pseu domonas fluorescensilta (Hall et ai., Mol. Microbiol. 3: 1211-1219 (1989); Kellette et ai., Biochem. J. 272: 369-376 (1990)) . Lisäksi homologioita on havaittu proteiinisekvens-seissä, jotka on johdettu proteiineista, joita koodaavat Cellulomonas fimin eksoglukanaasigeenit (O'Neill et ai., Gene 44: 325-330 (1986), Clostridium stercoirariumin selloksyla- naasista (Fukumura et ai., 1992) ja viimeiseksi Caldocellum saccharolyticumin sellulaasilla ja ksylanaasilla (Saul et ai..

Appi. Environ. Microbiol. 56: 3117-3124 (1990); Luthi et ai., ;

Appi. Environ. Microbiol. 56: 1017-1024 (1990).

Streptomyces lividansin ksylanaasi A:ssa on havaittu yli 80 %:n homologiaa (Shareck et ai., Gene 107: 75-82 (1991) (kuva H) .

Edellä mainituista 13 geenistä johdettujen proteiinien sekvenssien asettaminen riviin paljastaa yhteensä 66 aminohappoa, joita ylläpidettiin yli 75 %:n yhtäläisyydellä, näistä 22 ovat identtisiä 100 %:sti, jolloin 7 aluetta säilyneitä aminohappoja on mahdollista (kuvat 10-10C).

··· • · ·· · ·;· Esimerkki 9 ♦ · · * . ; ' ! ,·. Proteaasikohtien tietokone-ennustus - ♦ * ·* ·

* ·*.,.· I

• # • · j m.m MAP-ohjelmaa käytettiin arvioimaan aminohapposekvenssissä • · ·

**!.* olevat mahdolliset proteaasien pilkkomiskohdat. Kuva 13 ja 13A

* · · • esittää analyysin, joka saatiin S. lividansin ja pJF6-ksy-lanaasin aminohapoista johdetuille sekvensseille.

• · · • · · *** » · · V * Kahden aminohapoista johdetun sekvenssin välillä on seuraa- « vanlainen merkittävä ero: pJF6-sekvenssin koodaaman aminohappo ,·**. 318 :n läheisyydessä ei havaittu pilkkomiskohtaa Staphylococcus aureuksen proteaasilla. Sitä vastoin sellainen kohta esiintyy * · • " S. lividansin ksylanaasi A-sekvenssin analyysissä.

• · · * 4 9 118009 Lähestyäkseen edellä mainittua kolmatta hypoteesia, joka koskee mahdollista proteolyyttistä mekanismia proteiinin .? translaationjälkeiseen lyhentämiseen, tätä viimeistä vaihetta on tarpeen valaista vertaamalla Streptomyces lividansin ksylanaasi A:n tuottamia ksylanolyyttisiä proteiineja pJF6:n vastaavaan. On huomioitava että ksylanaasi A-geeni koodaa 47 kDa:n proteiinia, ja polyakryyliamidigeelillä on lisäksi havaittavissa toinen, 31 kDa:n proteiini (Moreau, A., tohtorin väitöskirja, Department of Microbiology and Immunology,

Faculty of Medicine, University of Montreal, 1992, 140 s.).

Translaationjälkeinen kypsymisprosessi saattaisi selittää -tämän toisen 31 kDa:n molekyylimuodon. Tätä viimeistä ksy-lanaasityyppiä koskevia vertailuja tullaan tekemään.

Ensiksikin, tulokset osoittavat, että pJF6-ksylanaasin ja S. lividansin ksylanaasi A:n koodaamista aminohapposekvensseistä johdetut sekvenssit ovat melko homologisia. On normaalia odottaa käytännöllisesti katsoen identtistä tietokoneanalyysiä, ottaen huomioon mahdolliset proteaasin pilkkomiskohdat, jotka tunnetaan aminohapoista johdetuista kahdesta sekvenssistä. Silti yhdessä proteolyyttisessä kohdassa paljastetaan merkittävä ero. Verrattaessa S. lividansin ksylanaasi A-.n todennäköisten proteolyyttisten pilkkomiskohtien analyysiä, ***. pJF6-ksylanaasilla olisi yksi Staphylococcuksen proteaasin - ·· · ... pilkkomiskohta vähemmän. Tämä proteaasi tunnistaisi gluta- miinihapon (E) 318 aminohapolla ksylanaasi A:lie ja 345 * · ..** aminohapolla pJF6-ksylanaasille, pilkkoakseen lopulta amino- • * · * * hapon C-terminaalisen osan. Ero proteolyyttisessä pilkko- • * · **· * mismallissa selittäisi siten 31 kDa:n ksylanolyyttisen pro- • t · V * teiinin tuotannon S. lividansissa 3a 34 kDa:n vastaavan pJF6:ssa. Tiedetään, että proteiinin osat, jotka altistuvat ϊ.ϊ.ϊ proteolyyttiselle pilkkomiselle ovat proteaaseja, jotka • * * , , , : pyrkivät pilkkomaan proteiinia silmukassa, joka sijaitsee t>*t; esimerkiksi kahden alf a-heliksin välissä, tai yhden alfa- * · ... heliksin ja beta-laskoksen tai vielä kahden beta-laskoksen < : "* välissä.

·· ♦ · • ·· * • · 118009 " 50 PROTEINSTRUCTURE-ohjelman ansiosta oli mahdollista osoittaa mahdolliset pilkottavat alueet käyttämällä proteaaseja S. lividansin ksylanaasi A:11a ja pJF6:n ksylanaasilla. Nämä tulokset sopivat mielenkiintoisesti yhteen edellä keskustellun Staphylococcuksen proteaasin pilkkomiskohdan kanssa. Sen vuoksi proteaasin mukana olo saattaa selittää pJF6:n ksyla-naasin samoin kuin S. lividansin ksylanaasi A:n kypsymisprosessin.

Kuvat 10-10C osoittavat, että ksylanaasien ja sellulaasien välillä on merkittävää homologiaa. Gilkes et ai., Microbiol.

Rev. 55: 303-315 (1991), ehdottivat yhdeksän entsyymiperheen h; muodostamista analysoituaan yli 70 sellulaasin ja ksylanaasin aminohapposekvenssit. Näiden tutkijoiden mukaan sellulaasi-isoentsyymien ja useiden mikro-organismien ksylanaasien havainnointi todistaisi, että nämä proteiinit eivät olisi kehittyneet yhdestä geenistä, vaan ovat pikemminkin peräisin suuresta multigeenisestä perheestä. Lisäksi entsyymit, joilla on vallitseva ksylanolyyttinen aktiivisuus, luokitellaan — f kahteen eri heimoon (family). Tästä seuraa seuraava hypoteesi: varsinaiset sellulaasit ja varsinaiset ksylanaasit olisivat näin ollen kehittyneet eri geeneistä.

··· pJF6:n ksylanaasin termostabiilisuus ja happostabiilisuus on hämmästyttävää sen vuoksi, että Streptomyces lividansin i': ksylanaasi A on niin samanlainen kuin pJF6:n ksylanaasi. A.

·1·'. Moreaun (tohtorin väitöskirja, Department of Microbiology and * 1 j Immunology, Faculty of Medicine, University of Montreal, 1992, • · · » 140 s.) mukaan S. lividansin ksylanaasi A säilyttää vain 10 % aktiivisuudestaan sen jälkeen, kun sitä on inkuboitu 60 °C:n , lämpötilassa 8 tuntia substraatin puuttuessa, kun taas pJF6:n • · · 1 ' • 1 1 ksylanaasi säilyttää samoissa olosuhteissa miltei 95 % aktiivi- • · · •t ’ suudestaan. Näiden kahden ksylanaasin aminohapposekvensseissä ‘f1: havaitut pienet erot näyttävät antaneen pJF6:n ksylanaasille Γ": paljon stabiilimman koostumuksen korkeassa lämpötilassa.

• · · * · 1 ···' *

. I

· f · Λ • 1 51 118009

Esimerkki 10

Entsyymivaikaisu FC7:ää käyttäen » Männyn sulfaattimassaan lisätään noin yksi litra käytettyä kasvualustaa massatonnia kohti; kasvualusta otetaan Actinoma-dura sp. FC7-viljelmistä ja se sisältää XYL I ja XYL II-aktii-visuudet, kuten taulukossa 3 on kuvattu. Massaa inkuboidaan suhteellisen korkeassa lämpötilassa, kuten esimerkiksi 70 °C:ssa, ja happamassa pH:ssa, kuten esimerkiksi pH-arvossa 4, niin pitkän ajan, että se riittää ksylaanissa olevien XYL I:lle ja XYL II:lie alttiiden sidosten hajotukseen. Mikäli tarpeen, kasvualusta suodatetaan ennen käyttöä tai konsentroidaan käyttämällä alalla tunnettuja tekniikoita. Halutussa lämpötilassa ja pH:ssa inkuboimisen jälkeen tuote on männyn sulfaattimassavalmiste, jossa kappaluku (ligniinin määrä) männyn sulfaattimassassa on alhaisempi vaikuttamatta massan mekaanisiin ominaisuuksiin. Lisäksi valmiste vaatii vähemmän kloorin kulutusta kaikissa myöhemmissä kemiallisissa valkaisuissa . -

Esimerkki 11

Entsyymivalkaisu rekombinanttitekniikalla tuotettua XYL I:tä ja/tai XYL II:ta käyttäen e·· m % * ... Männyn sulfaattimassaan lisätään noin yksi litra käytettyä ,·, kasvualustaa massatonnia kohti; kasvualusta otetaan sellaisten • · ./I rekombinantti-isäntäsolujen viljelmistä, jotka ilmentävät • · * I rekombinantti-XYL I ja/tai rekombinantti-XYL II-aktiivisuuk- ill ·”/ siä, kuten taulukossa 3 on kuvattu. Massaa inkuboidaan, kuten t * * ·* * esimerkissä 10 on kuvattu, suhteellisen korkeassa lämpöti lassa, kuten esimerkiksi 70 °C:ssa, ja happamassa pH:ssa, kuten esimerkiksi pH-arvossa 4, niin pitkän ajan, että se φ · · *.s · riittää ksylaanissa olevien XYL I:lle ja XYL II:lle alttiiden sidosten hajotukseen. Mikäli tarpeen, kasvualusta suodatetaan • · «... ennen käyttöä tai konsentroidaan käyttämällä alalla tunnettuja t · “* tekniikoita. Halutussa lämpötilassa ja pH:ssa inkuboinnin « · : *·’ -jälkeen tuote on männyn sulf aattimassavalmiste, jossa kappa- ; *"*ϊ luku (ligniinin määrä) männyn sulfaattimassassa on alhaisempi 52 .

118009 vaikuttamatta massan mekaanisiin ominaisuuksiin. Lisäksi valmiste vaatii vähemmän kloorin kulutusta kaikissa myöhemmissä kemiallisissa valkaisuissa.

i # · • · ··#' • # · « ! % .

• · · · ... J

f · • 1 • » • 1 · • t · • ♦ « · • · f · · ' { » · 9191 • · 1 f 1 1 • I · # » 1 » 9 · · • m < t t • 1 a • * 1 ' t·1 t : • 1 · · • · f 1· 9 * * 1 53 1 1 8009

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEINEN INFORMAATIO: (i) HAKIJA:

(A) NIMI: AB Enzymes GmbH

(B) OSOITE: Feldbergstrasse 78 (C) KAUPUNKI: D-64293 Darmstadt

(D) MAA: GERMANY

(il) KEKSIJÄ:

Brzezinski, Ryszard Dery, Claude V Beaulieu, Carole (iii) KEKSINNÖN NIMITYS: Termostabiilin ksylanaasin käyttömenetelmä ’ j (iv) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 69 (v) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) ASIAMIES: Oy Borenius & Co Ab

(B) KATU: Tallberginkatu 2 A

(C) KAUPUNKI: Helsinki (D) MAA: Suomi (E) POSTINUMERO: FI-00180 (vi) MUUT YHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: 358-9-6866840 (B) TELEFAX: 358-9-68668444 (vii) HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: FI 953640 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 31.07.1995 «tt ...*·* (viii) PRIORITEETTIHAKEMUKSEN TIEDOT: . (A) HAKEMUSNUMERO: US 282,197 *"·* (B) HAKEMISPÄIVÄ: 29.07.1994 ί • * · • * * Φ · I I (2) SEK ID NO:1:N INFORMAATIO: • · · • · * • · » · (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ! ** * (A) PITUUS: 1020 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksi : (D) TOPOLOGIA: molemmat * * * • · . ’ (ix) PIIRRE: (A) NIMI/AVAIN SIJAINTI: 521..1020 • · · • · *" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:1: * * i ; 54 118009 TCGCGAGGTT GTAGACGTCC AGGGCCTTGC CGCTGTTGCG GTTGACCAGG ACGTACCACT 60 TGTTCACGTC CACTGTCGCG GCTAGGGCGG CCTGTGTGTT GATCACGGAC AAGAGCACCG 120 ACAGCAGGAG CGATGCAATC ACCGCCGCAC CGGTCCTCAG CATGGACTTC TTCCCTTCGT 180 GGGTGAATGT TACCGCTAAC ATTTCGAGCC GGGCAGAACC TCTTCTCCAT CGGCGATTGG . 240 GGGGAGGTGG TGGTGCGCCG GAGTAAATAC GAGGCCGCAC GGCTCGTCAA GGGGCAATCT 300 CGTCGAAACG TTTCGTATGC AGGTTGCCCT GCCAAACCGC GTGTTCACGC CGGTGATCGG 360 GCATCTGCCA TGAAATATTT TGAAACTATT GACGAACGTT CACGGCCTCA CACAATGAGT 420 CCTCGACGCC TTGGTGGTGG GCGTTCCGGT GAGGGAACGC GGCGTCTGCT GCACGGCTGT 480 ; GCCCGTGCCC CTTCTTCGCT TCACTCATGG AGGATCAGAC GTG CCC ATC AAG GTC 535

Met Pro Ile Asn Val 1 5 ATG CCC AGG CCC GGA GCC CGC AAG CGG GCT CTT CTC GCC GGC GCC GTC 583 i

Met Pro Arg Pro Gly Ala Arg Lye Arg Ala Leu Leu Ala Gly Ala Val 10 15 20 : .

GGA CTG CTC ACG GCG GCC GCC GCC CTG GTG GCG CCG TCC CCG GCC GTC 631

Gly Leu Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Val Ala Pro Ser Pro Ala Val 25 30 35 GCC GCG GAG AGC ACG CTG GGC GCC GCG GCC GCG CAG AGC GGC CGC TAC 679

Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala Ala Ala Ala Gin Ser Gly Arg Tyr 40 45 SO .

TTC GGC ACC GCC ATC GCC TCG GGC CGG CTC AAC GAC TCG ACG TAC ACC 727

Phe Gly Thr Ala lie Ala Ser Gly Arg Leu Asn Asp Ser Thr Tyr Thr : 55 60 65 ACG ATC GCG AAC CGC GAG TTC AAC ATG GTG ACC GCC GAG AAC GAG ATG 775

Thr lie Ala Asn Arg Glu Phe Asn Met Val Thr Ala Glu Asn Glu Met 70 75 80 85 ‘ ♦ » a .I.5 AAG ATC GAC GCC ACC GAG CCC AAC CGC GGC CAG TTC AAC TTC AGC TCC 823

Lys lie Asp Ala Thr Glu Pro Asn Arg Gly Gin Phe Asn Phe Ser Ser 90 95 100

* # I

GCC GAC CGC ATC TAC AAC TGG GCG GTC CAG AAC GGC AAG CAG GTA CGC 871 • » . . Ala Asp Arg lie Tyr Asn Trp Ala Val Gin Asn Gly Lys Gin Val Arg · 105 110 115 »T: GGC CAC ACC CTG GCC TGG CAC TCC CAG CAG CCC GGC TGG ATG CAG AGC 919

Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser Gin Gin Pro Gly Trp Met Gin Ser , 120 125 130 { · » CTC AGC GGC AGC AGC CTG CGC CAG GCG ATG ATC GAC CAC ATC AAC GGC 967 « · Ψ * § * *t Leu Sör Gly Ser Ser Leu Arg Gin Ala Met lie Asp His lie Asn Gly . 135 140 145 »·!«· ,.„f GTC ATG GCC CAC TAC AAG GGC AAG ATC GTC CAG TGG GAC GTC GTG AAC 1015 ί l ‘r Vai Ala His Tyr Lys Gly Lys lie Val Gin Trp Asp Val Val Asn 150 155 160 165 » <· ....: GAG Gc 1020 • · Glu Ala (2) SEK ID NO:2:N INFORMAATIO: 5S 1 1 8009 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 167 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:2:

Met Pro Ile Asn Vai Met Pro Arg Pro Gly Ala Arg Lys Arg Ala Leu 1 5 10 15

Leu Ala Gly Ala Vai Gly Leu Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Vai Ala 20 25 30

Pro Ser Pro Ala Vai Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala Ala Ala Ala 35 40 45

Gin Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly Arg Leu Aan 50 55 60

Asp Ser Thr Tyr Thr Thr Ile Ala Asn Arg Glu Phe Asn Met Vai Thr 65 70 75 80

Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Asn Arg Gly Gin 85 90 95

Phe Asn Phe Ser Ser Ala Asp Arg Ile Tyr Asn Trp Ala Vai Gin Asn 100 105 110

Gly Lys Gin Vai Arg Gly Hie Thr Leu Ala Trp His Ser Gin Gin Pro 115 120 125

Gly Trp Met Gin Ser Leu Ser Gly Ser Ser Leu Arg Gin Ala Met Ile 130 135 140

Asp His Ile Asn Gly Vai Met Ala His Tyr Lys Gly Lys Ile Vai Gin 145 150 155 160

Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala ... 165

e I

• · ; • · * (2) SEK ID NO:3:N INFORMAATIO: • · ./I (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: • *.· (A) PITUUS: 19 emäsparia : (B) TYYPPI: nukleiinihappo ‘••j : (C) SÄIKEISYYS: kaksi ! (D) TOPOLOGIA: molemmat ♦ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:3: * AAGAAGGAGA ACGAUCGUG 19 • · * * * * ·:·: (2) SEK ID NO: 4 : N INFORMAATIO: ' j * t * (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 16 emäsparia • *·· (B) TYYPPI: nukleiinihappo . . . j (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen e*···;, .i : i 118009 : bo : 1 (D) TOPOLOGIA: molemmat

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:4 : L

AAGGGGCGGG AACAUG 16 (2) SEK ID NO:5:N INFORMAATIO: (Ϊ) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 14 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:5: GUGGGGGAGA CAUG 14 j (2) SEK ID NO:6:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 14 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:6: CAGGAGGAAU CAUG 14 (2) SEK ID NO:7:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 16 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ! ... (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen *··· (D) TOPOLOGIA: molemmat » • # • 1 1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 7: • « • · : CAGGAGGCAC CACAUG 16 • · » • · 1 1 : : : (2) SEK ID NO:8:N INFORMAATIO: . (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 16 emäsparia V : (B) TYYPPI: nukleiinihappo < • (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen *:**: (D) TOPOLOGIA: molemmat • ♦ · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 8 : » » · • · *** CAGGAGGCAC CACAUG 16 (2) SEK ID NO :9:N INFORMAATIO: 57 1 1 8009 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ι (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:9: CGGAAGGAUG CACACAAUG 19 (2) SEK ID NO:10:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 16 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:10: UGAAAGGGCA UACAUG 16 i (2) SEK ID NO:11:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen - (D) TOPOLOGIA: molemmat ... (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 11: * » · UGAGAGGUGG UCCUCAGUG 19 * 1 1 1 « · 1." (2) SEK ID NO: 12 :N INFORMAATIO: • 1 1 • 1 * · : .1. (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: •;j#· (A) PITUUS: 20 emäsparia li: (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen

(D) TOPOLOGIA: molemmat D

• · 1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 12: • · · • ♦ 1 GACGAAGGAG CCACAAGAUG 20 ***** * 1 i • · · !...: (2) SEK ID NO: 13 :N INFORMAATIO: ; • · '·· (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 20 emäsparia Ββ 1 1 8009 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat . ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:l3: ACGGAGGCAG UACGUCGAUG 20 (2) SEK ID NO:14:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:14: UGAAAGGGCA CAGCCAUG 18 (2) SEK ID NO:15:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 17 emäsparia ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:15: UCGAAGGAGU CGUCAUG , : 17 (2) SEK ID NO:16:N INFORMAATIO: */;**· (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ... (A) PITUUS: 17 emäsparia ··” (B) TYYPPI: nukleiinihappo , (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen ..*! (D) TOPOLOGIA: molemmat • a · • · • * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:16: • · · Φ a a * !*:*: UUGAAGGGUG UGUAAUG 17 a . (2) SEK ID NO: 17 : N INFORMAATIO: 1' • · · :T: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 20 emäsparia *:·*: (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen l.,.· (D) TOPOLOGIA: molemmat * j *·. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 17: • · 118009 59 CGAGAGGUAG CGAGUUCAUG 20 (2) SEK ID NO :18:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 15 emäsparia ! (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:18: AAGGAGUCGC GGGUG ' 15 (2) SEK ID NO:19:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:19: CGGGAGAUGC GUUGACAUG 19

(2) SEK ID NO:20:N INFORMAATIO: I

(i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 19 emäsparia ( (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 20: .·1:1 UAGGAGGAGC UGGAUG 16 • · - » % 1 • 1 ·· · • V (2) SEK ID NO:21:N INFORMAATIO: • · » » · :y: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: 11:1: (A) PITUUS: 16 emäsparia

(B) TYYPPI: nukleiinihappo I

(C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen . i (D) TOPOLOGIA: molemmat • · 1 * 1 1 ' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 21: ; ·:··· AAGGAGUUGA UCGAUG 16 • · · : : · · (2) SEK ID NO: 22:N INFORMAATIO: * · • · 1 118009 60 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 17 emäsparia 1 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat ' ;- (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:22: CAGGAGGUCC GGACAUG 17 (2) SEK ID NO:23:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: : (A) PITUUS: 16 emäspäria : (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat 71 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:23: GAGGAGUGCG GCAGUG 16 (2) SEK ID NO:24:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 14 emäsparia ! (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:24: AGGGGGACGG OAUG 14 ··· • · i (2) SEK ID NO:25:N INFORMAATIO: • » · · (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 16 emäsparia : V (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen ·** ’ (D) TOPOLOGIA: molemmat i : : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:25: ; CGAGGGGUGG CGCAUG 16 • * * * * *

I I I

(2) SEK ID NO:26:N INFORMAATIO: ; • ' • » .... (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 16 emäsparia ! (B) TYYPPI: nukleiinihappo ! ; *·* (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat 118009 61 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:26: AUAGAGGUCC GCUGUG 16 ; i (2) SEK ID NO:27:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat . (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:27: AGGGAGGGGA ACACAUG . 17 (2) SEK ID NO:28:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:28: 1 CGGGAGAAGA AUCAGAUG 18 (2) SEK ID NO:29:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 14 emäsparia ... (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen ... (D) TOPOLOGIA: molemmat • · · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 29: • * ·· * • AUCGAGGUGC CAUG 14 • · » * · • · · • * · · (2) SEK ID NO : 3 0 : N INFORMAATIO: * (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: . (A) PITUUS: 17 emäsparia *"*. (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen • (D) TOPOLOGIA: molemmat

Mf·· • · ... (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 30: i : t · · CCGGUAGGAC GACCAUG 17 • · * ·· «··*· • * . l (2) SEK ID NO:31:N INFORMAATIO: 62 118009 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ’ (A) PITUUS: 16 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ' (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:31: AAGGAGACCU UCCAUG 16 (2) SEK ID NO:32:N INFORMAATIO:

(i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: V

(A) PITUUS: 18 emäsparia ’ : (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:32: CCCGAGGAAU UCGAUAUG 18 (2) SEK ID NO:33:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen 1

(D) TOPOLOGIA: molemmat ' . O

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:33: GAGGAGGAGG ACCCGUG 17 * • · · • * ft · (2) SEK ID NO: 34 :N INFORMAATIO : * · • · « * V (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: j .·. (A) PITUUS: 15 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo i :: (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat i . .*. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:34: ! ft · · :T: CAGGGGGGUC ACAUG 15 * ft ; • ft ... (2) SEK ID NO: 35:N INFORMAATIO: : : ♦ * · (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ! : *·· (A) PITUUS: 13 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 63 1 1 8009 (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:35: t CUCGACGACC AUG 13 (2) SEK ID NO:36:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 13 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen .

(D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:36: CGCGACGCUG AUG 13 (2) SEK ID NO:37:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ' (A) PITUUS: 12 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat : ,,, (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:37:

CUGGGGGCGU UAGGUG IS

(2) SEK ID NO:38:N INFORMAATIO: T: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: '"mt (A) PITUUS: 12 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 1 (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen ; ./f (D) TOPOLOGIA: molemmat ; # * · « · f I.*. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:38: • * ft « » * * GAGGGGGCCG UG 12

. .·. (2) SEK ID NO: 39 :N INFORMAATIO: U

• · « • * · (i) sekvenssin tunnusmerkit: *. (A) PITUUS: 16 emäsparia *;·♦ (B) TYYPPI: nukleiinihappo ... (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen *...· (D) TOPOLOGIA: molemmat »

• J

* *

> M

# ! » «···«-• · 118009 64 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO :3 9: AUGGAGGAGA GUCAUG 16 (2) SEK ID NO :40:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:40: CGGAAGGCCA CGGUCAUG " 18 > (2) SEK ID NO:41:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 15 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen | (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:41: ACGGACACUC GCAUG 15 ,/ (2) SEK ID NO:42:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 14 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (t, (D) TOPOLOGIA: molemmat * ··»· ·': (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 42: # 1 i CCGCAGAAAG CAUG 14 .

! M· 2 (2) SEK ID NO : 43 : N INFORMAATIO: * (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: , (A) PITUUS: 16 emäsparia *;1·2 (B) TYYPPI: nukleiinihappo : Γ: (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat # · · · 1 ... (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 43: I ’.

UGGAGGAUCA GACGUG 16 » 2 Ψ ·· h 2 .·3 3 • · (2) SEK ID NO:44:N INFORMAATIO: 118009 bb (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 47 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:44:

Vai Pro Ile Aan Vai Met Pro Arg Pro Gly Ala Arg Lys Arg Ala Leu 15 10 15

Leu Ala Gly Ala Vai Gly Leu Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Vai Ala i 20 25 30

Pro Ser Pro Ala Vai Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala Ala Ala 35 40 45 (2) SEK ID NO:45:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 40 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:45: CTCTTGACAA CCGCGTAACA GGAGTCATCA TATCGCCTAT 40 (2) SEK ID NO:46:N INFORMAATIO: * (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT:

j i (A) PITUUS: 40 emäsparia -..I

(B) TYYPPI: nukleiinihappo • ••S (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen ·'· (D) TOPOLOGIA: molemmat • » ]’v (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:46: • 9 : gagtggtgta agccgtgcac attgtcatca tgggctgcgg 40 9f* *· · • · * (2) SEK ID NO:47:N INFORMAATIO: » »“* (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: }*Γ: (A) PITUUS: 40 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ···: (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen ,,, (D) TOPOLOGIA: molemmat .*’* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:47: * *»· !.„· CACTGGAATG CCCCTACCAC GGTTGGTTGT TCGAAACGGG 40 ♦ * (2) SEK ID NO:48:N INFORMAATIO: 66 1 1 8009 ; (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 40 emäspari a (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:48: CTATTGACGA ACGTTCACGG CCTCACACAA TGAGTCCTCG 40 i ; (2) SEK ID NO:49:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ' (A) PITUUS: 413 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:49:

Asn Gly Trp Gly Trp Glu Asp Gin Arg Ser Cys Ile Ala Arg Ser Thr 1 5 10 15

Cys Ala Ala Gin Pro Ala Pro Phe Gly Ile Vai Gly Ser Gly Ser Ser 20 25 30 : ·.;

Thr Pro Vai Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ser Vai Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Vai Ala Thr 50 55 60

• M

Gly Asn Gly Leu Ala Ser Leu Ala Αβρ Phe Pro Ile Gly Vai Ala Vai es 70 75 80 • * · .

* **** Ala Ala Ser Gly Gly Asn Ala Asp Ile Phe Thr Ser Ser Ala Arg Gin . : : 85 90 95 • ·

Asn Ile Vai Arg Ala Glu Phe Asn Gin Ile Thr Ala Glu Asn Ile Met : .* 100 105 110 * ·.· * Lys Met Ser Tyr Met Tyr Ser Gly Ser Asn Phe Ser Phe Thr Asn Ser ... 115 120 125 * · · * · «

Asp Arg Leu Vai Ser Trp Ala Ala Gin Asn Gly Gin Thr Vai His Gly 130 135 140 • " : : : His Ala Leu Vai Trp His Pro Ser Tyr Gin Leu Pro Asn Trp Ala Ser ;;; 145 150 155 iso · * *. Asp Ser Asn Ala Asn Phe Arg Gin Asp Phe Ala Arg His Ile Asp Thr . 165 170 175 • · * · · • · ... Vai Ala Ala His Phe Ala Gly Gin Vai Lys Ser Trp Asp Vai Vai Asn 180 185 190

Glu Ala Leu Phe Asp Ser Ala Asp Asp Pro Asp Gly Arg Gly Ser Ala : ** 195 200 205 : ···· I · 67 1 1 8 0 0 9

Asn Gly Tyr Arg Gin Ser Val Phe Tyr Arg Gin Phe Gly Gly Pro Glu 210 215 220

Tyr lie Aep Glu Ala Phe Arg Arg Ala Pro Arg Ala Asp Pro Thr Ala 225 230 235 240 : ,

Glu Leu Tyr Tyr Atm Aep Phe Asn Thr Glu Glu Asn Gly Ala Lys Thr 245 250 255

Thr Ala Leu Val Asn Leu Val Gin Arg Leu Leu Asn Asn Gly Val Pro 260 265 270 lie Asp Gly Val Gly Phe Gin Met His Val Met Asn Asp Tyr Pro Ser 275 280 285 lie Ala Asn lie Arg Gin Ala Met Gin Lys lie Val Ala Leu Ser Pro 290 295 300

Thr Leu Lys lie Lys lie Thr Glu Leu Asp Val Arg Leu Asn Asn Pro 305 310 315 320

Tyr Asp Gly Asn Ser Ser Asn Asp Tyr Thr Asn Arg Asn Asp Cys Ala 325 330 335

Val Ser Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gin Lys Ala Arg Tyr Lys Glu lie 340 345 350

Val Gin Ala Tyr Leu Glu Val Val Pro Pro Gly Arg Arg Gly Gly lie 355 360 365

Thr Vai Trp Gly He Ala Asp Pro Asp Ser Trp Leu Tyr Thr His Gin 370 375 380

Asn Leu Pro Asp Trp Pro Leu Leu Phe Asn Asp Asn Leu Gin Pro Lys 385 390 395 400

Pro Ala Tyr Gin Gly Val Val Glu Ala Leu Ser Gly Arg 405 410 (2) SEK ID NO:50:N INFORMAATIO: • · · • · *". (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: • ••ί (A) PITUUS: 345 aminohappoa . (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat • ’.· ' (D) TOPOLOGIA: molemmat ··: Ϊ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:50: * · · • * · • * *

Gly Ala Trp Thr Thr Trp Gin Thr Ala Thr Ile Asp Vai Asp Leu Vai 1 S 10 15 • « * *·ϊ·* Gin Gly Asn Asn Ile Vai Gin Leu Ser Ala Thr Thr Ala Glu Gly Leu 20 25 30 • · · * Pro Asn Ile Asp Ser Leu Ser Vai Vai Gly Gly Thr Vai Arg Ala Gly 35 40 45 .*·*. Asn Cys Gly Ser Vai Ser Ser Ser Ser Ser Vai Gin Ser Ser Ser Ser ··* 50 55 60

Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ala Lys Lye Phe Ile Gly Asn Ile • 65 70 75 80 ; 118009 68

Thr Thr Ser Gly Ala Val Arg Ser Asp Phe Thr Arg Tyr Trp Asn Gin 85 90 95 lie Thr Pro Glu Asn Glu Ser Lys Trp Gly Ser Val Glu Gly Thr Arg 100 105 110

Asn Val Tyr Asn Trp Ala Pro Leu Asp Arg lie Tyr Ala Tyr Ala Arg 115 120 125 :

Gin Asn Asn lie Pro Val Lys Ala His Thr Phe Val Trp Gly Ala Gin 130 135 140

Ser Pro Ser Trp Leu Asn Asn Leu Ser Gly Pro Glu Val Ala Val Glu 145 150 155 160

He Glu Gin Trp He Arg Asp Tyr Cys Ala Arg Tyr Pro Asp Thr Ala 165 Π0 175

Met He Asp Val Val Asn Glu Ala Val Pro Gly His Gin Pro Ala Gly 180 185 - 190

Tyr Ala Gin Arg Ala Phe Gly Asn Asn Trp He Gin Arg Val Phe Gin 195 200 205 ,f

Leu Ala Arg Gin Tyr Cys Pro Asn Ser He Leu He Leu Asn Asp Tyr 210 215 220 ;

Asn Asn He Arg Trp Gin His Asn Glu Phe He Ala Leu Ala Lys Ala 225 230 235 240

Gin Gly Asn Tyr He Asp Ala Val Gly Leu Gin Ala His Glu Leu Lys 245 250 255

Gly Met Thr Ala Ala Gin Val Lys Thr Ala He Asp Asn He Trp Asn .,, 260 265 270

Gin Val Gly Lys Pro He Tyr lie Ser Glu Tyr Asp lie Gly Asp Thr 275 280 285

Asn Asp Gin Val Gin Leu Gin Aen Phe Gin Ala His Phe Pro Val Phe 290 295 300

Tyr Asn His Pro His Val His Gly He Thr Ser Gly lie Cys Gly Gly 305 310 315 320 '**. Gin Asp Leu Asp Arg Arg Leu Arg Phe Asp Pro Gly Gin Trp His Thr ·ί·1 325 330 335 • 1 1 ...I Ala Pro Gly Asn Asp Val Val Asp Xaa .·. 340 345 . · • · » · 1 • · · * · (2) SEK ID NO :51: N INFORMAATIO: « · 1 • » » ·«» · (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: j ' (A) PITUUS: 405 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo . (C) SÄIKEISYYS: molemmat . j ·.1.. (D) TOPOLOGIA: molemmat • 1 · • · · *\ 1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:51: * • · 1 · 1 • · • · · i : « · · ♦ · • · • · · • ! »···· · 69 1 1 8 0 0 9 i }

Vai Pro Ile Aan Vai Met Pro Arg Pro Gly Ala Arg Lys Arg Ala Leu 1 5 10 15 ' . %

Leu Ala Gly Ala Vai Gly Leu Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Vai Ala 20 25 30

Pro Ser Pro Ala Vai Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala Ala Ala Ala 3 S 40 45

Gin Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly Arg Leu Asn *\ 50 55 60

Asp Ser Thr Tyr Thr Thr Ile Ala Asn Arg Glu Phe Asn Met Vai Thr 65 70 75 80

Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Asn Arg Gly Gin 85 90 95

Phe Asn Phe Ser Ser Ala Asp Arg Ile Tyr Asn Trp Ala Vai Gin Asn 100 105 110

Gly Lys Gin Vai Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser Gin Gin Pro 115 120 125

Gly Trp Met Gin Ser Leu Ser Gly Ser Ser Leu Arg Gin Ala Met Ile · 1 130 135 140

Asp His Ile Asn Gly Vai Met Ala His Tyr Lys Gly Lys Ile Vai Gin 145 150 155 160

Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala Phe Ala Asp Gly Asn Ser Gly Gly Arg 165 170 175

Arg Asp Ser Asn Leu Gin Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile Glu Vai Ala 180 185 190

Phe Arg Thr Ala Arg Asn Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Cys Tyr Asn 195 200 205

Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Asn Trp Ala Lys Thr Gin Gly Vai Tyr 210 215 220

Asn Met Vai Arg Asp Phe Lys Gin Arg Gly Vai Pro Ile Asp Cys Vai 225 230 235 240 1 • · · , : Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn Ser Asn Phe ·" 245 250 255 • * * **** Arg Thr Thr Leu Gin Asn Phe Ala Ala Leu Gly Vai Asp Vai Ala Ile . · : 260 265 270 • # ·’·*; Thr Glu Leu Asp Ile Gin Gly Ala Ser Pro Thr Thr Tyr Ala Asn Vai * · 275 280 285 : * * • · · •·ί · Vai Asn Asp Cys Leu Ala Vai Ser Arg Cys Leu Gly Ile Thr Vai Trp 1 290 295 300 • Il

Gly Vai Arg Asp Thr Asp Ser Trp Arg Ser Asp Gin Thr Pro Leu Leu 305 310 315 320 ♦ · · ***** phe Asp Gly Asn Gly Asn Lys Lys Ala Ala Tyr Ser Ala Vai Leu Asn :*·*: 325 33(3 33s * ’ . Ala Leu Asn Gly Gly Gly Thr Ser Glu Pro Pro Pro Ala Ser Asp Ala *;**: 340 345 350 t ; Gly Thr Ile Lys Gly Vai Gly Ser Gly Arg Cys Leu Αβρ Vai Pro Asn *** 355 360 365 ♦ · * *·· Ala Ser Thr Ser Asp Gly Vai Gin Leu Gin Leu Trp Asp Cys His Gly ....I 370 375 380 j • · 7° 118009

Gly Thr Asn Gin Gin Trp Thr Tyr Thr Asp Ser Gin Glu Leu Arq Val 385 390 395 400

Tyr Gly Asn Lyc Cys 405 (2) SEK ID NO :52:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 406 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:52:

Met Gly Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Ser Gly Vai Arg Arg Ser Ile Arq 1 5 10 15 1

Vai Leu Leu Ala Ala Leu Vai Vai Gly Vai Leu Gly Thr Ala Thr Ala 20 25 30

Leu Ile Ala Pro Pro Gly Ala Hia Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala 35 40 45

Ala Ala Ala Gin Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly 50 55 60

Arg Leu Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Ser Ile Ala Gly Arg Glu Phe Asn 65 70 75 80

Met Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gin 85 90 95

Arg Gly Gin Phe Asn Phe Ser Ser Ala Asp Arg Vai Tyr Asn Trp Ala 100 105 110

Vai Gin Asn Gly Lys Gin Vai Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser ’ 115 120 125 < • ♦ «

Gin Gin Pro Gly Trp Met Gin Ser Leu Ser Gly Arg Pro Leu Arg Gin 130 135 140 *·· * ***» Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Vai Met Ala His Tyr Lys Gly Lys - j#! 145 150 155 1G0 ! * I Ile Vai Gin Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala Phe Ala Asp Gly Ser Ser *. 165 170 175 · · • · · **'.* Gly Ala Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gin Arg Ser Gly Αβπ Asp Trp Ile : · : 180 185 190 «

Glu Vai Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ser Ala Lys Leu 195 200 205 • · · *" Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Vai Glu Asn Trp Thr Trp Ala Lys Thr Gin : : : 210 215 220 *

Ala Met Tyr Asn Met Vai Arg Asp Phe Lye Gin Arg Gly Vai Pro Ile *:*" 225 230 235 240 ·*· t t Asp Cye Vai Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn *** 245 250 255 • · • *»» Ser Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gin Asn Phe Ala Ala Leu Gly Vai Asp » 260 265 270 ···»* • · 118009 71

Vai Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gin Gly Ala Pro Ala Ser Thr Tyr 275 280 285

Ala Aan Vai Thr Asn Asp Cys Leu Ala Vai Ser Arg Cys Leu Gly Ile 290 295 300

Thr Vai Trp Gly Vai Arg Asp Ser Asp Ser Trp Arg Ser Glu Gin Thr 305 310 315 320

Pro Leu Leu Phe Asn Asn Asp Gly Ser Lys Lys Ala Ala Tyr Thr Ala 325 330 335

Vai Leu Asp Ala Leu Asn Gly Gly Asp Ser Ser Glu Pro Pro Ala Asp 340 345 350

Gly Gly Gin Ile Lys Gly Vai Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp Vai Pro 355 360 365

Asp Ala Ser Thr Ser Asp Gly Thr Gin Leu Gin Leu Trp Asp Cys His 370 375 380

Ser Gly Thr Asn Gin Gin Trp Ala Ala Thr Asp Ala Gly Glu Leu Arg 385 390 395 400

Vai Tyr Gly Asp Lys Cys 405 (2) SEK ID NO:53:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 427 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat ' (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:53:

Met Pro Arg Thr Thr Pro Ala Pro Gly His Pro Ala Arg Gly Ala Arg 1 5 10 15

Thr Ala Leu Arg Thr Thr Arg Arg Arg Ala Ala Thr Leu Vai Vai Gly 20 25 30 • · · ··· Ala Thr Vai Vai Leu Pro Ala Gin Ala Ala Thr Thr Leu Lys Glu Ala ·*** 35 40 45 • » *·* Ala Asp Gly Ala Gly Arg Asp Phe Gly Phe Ala Leu Asp Pro Asn Arg SO 55 60 • · • · Ϊ .·, Leu Ser Glu Ala Gin Tyr Lys Ala Ile Ala Asp Ser Glu Phe Asn Leu :,.65 70 75 so i · * e · V · Vai Vai Ala Glu Asn Ala Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gin 85 90 95 ; t*m Asn Ser Phe Ser Phe Gly Ala Gly Asp Arg Vai Ala Ser Tyr Ala Ala I.:,* 100 io5 no • · · \* * Asp Thr Gly Lys Glu Leu Tyr Gly His Thr Leu Vai Trp His Ser Gin • 115 120 125 * * Leu Pro Asp Trp Ala Lys Asn Leu Asn Gly Ser Ala Phe Glu Ser Ala ,**·. 130 135 140 ·*··,'.

Met Vai Asn His Vai Thr Lys Vai Ala Asp His Phe Glu Gly Lys Vai • ·„ 145 150 155 160 • ····· • · 118009 72

Ala Ser Trp Asp Vai Vai Aan Glu Ala Phe Ala Asp Gly Asp Gly Pro 165 170 175

Pro Gin Asp Ser Ala Phe Gin Gin Lys Leu Gly Asn Gly Tyr Ile Glu 180 185 190

Thr Ala Phe Arg Ala Ala Arg Ala Ala Asp Pro Thr Ala Lys Leu Cya 195 200 205

Ile Asn Asp Tyr Asn Vai Glu Gly Ile Asn Ala Lys Ser Asn Ser Leu 210 215 220

Tyr Asp Leu Vai Lys Asp Phe Lys Ala Arg Gly Vai Pro Leu Asp Cys 225 230 235 240

Vai Gly Phe Gin Ser His Leu Ile Vai Gly Gin Vai Pro Gly Asp Phe 245 250 255

Arg Gin Asn Leu Gin Arg Phe Ala Asp Leu Gly Vai Asp Vai Arg Ile 260 265 270

Thr Glu Leu Asp Ile Arg Met Arg Thr Pro Ser Asp Ala Thr Lys Leu 275 280 285

Ala Thr Gin Ala Ala Asp Tyr Lys Lys Vai Vai Gin Ala Cys Met Gin 290 295 300

Vai Thr Arg Cys Gin Gly Vai Thr Vai Trp Gly Ile Thr Asp Lys Tyr 305 310 315 320

Ser Trp Vai Pro Asp Vai Phe Pro Gly Glu Gly Ala Ala Leu Vai Trp 325 330 335 4

Asp Ala Ser Tyr Ala Lys Lys Pro Ala Tyr Ala Ala Vai Met Glu Ala 340 345 350 >

Phe Gly Ala Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro 355 360 365 j

Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Gly Pro Ala Gly Cys Gin Vai 370 375 380

Leu Trp Gly Vai Asn Gin Trp Asn Thr Gly Phe Thr Ala Asn Vai Thr ... 385 390 395 400 • * *'* Vai Lys Asn Thr Ser Ser Ala Pro Vai Asp Gly Trp Thr Leu Thr Phe : •I* 405 410 415 ****:.

. ; ; Ser Phe Pro Ser Gly Gin Gin Vai Thr Gin Ala ** 420 425 * · · * * * * * : (2) SEK ID NO:54:N INFORMAATIO: ··· • · · V ‘ (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 399 aminohappoa ·. (B) TYYPPI: aminohappo ; ·"* (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat ...‘ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS:, SEK ID NO: 54: t : ··· Ser Asp Leu Gin Ala Leu Lys Arg His Leu Leu Gly Ile Ser Pro Leu ..’1 S 10 is i • · * . Thr Gly Glu Ala Leu Leu Arg Ala Asp Vai Asn Arg Ser Gly Lys Vai *:*·: 20 25 30 118009 73 v

Asp Ser Thr Asp Tyr Ser Vai Leu Lys Arg Tyr tie Leu Arg lie lie 35 40 45

Thr Glu Phe Pro Gly Gin Gly Asp Val Gin Thr Pro Asn Pro Ser Val 50 55 60

Thr Pro Thr Gin Thr Pro lie Pro Thr lie Ser Gly Asn Ala Leu Arg ' 65 70 75 80

Asp Tyr Ala Glu Ala Arg Gly lie Lys lie Gly Thr Cys Val Asn Tyr ! 85 90 95

Pro Phe Tyr Asn Asn Ser Asp Pro Thr Tyr Asn Ser lie Leu Gin Arg 100 105 110

Glu Phe Ser Met Val Val Cys Glu Asn Glu Met Lys Phe Asp Ala Leu 115 120 125

Gin Pro Arg Gin Asn Val Phe Asp Phe Ser Lys Gly Asp Gin Leu Leu 130 135 140 ;

Ala Phe Ala Glu Arg Asn Gly Met Gin Met Arg Gly His Thr Leu lie 145 150 155 160 . ir

Trp His Asn Gin Asn Pro Ser Trp Leu Thr Asn Gly Asn Trp Asn Arg 165 170 175

Asp Ser Leu Leu Ala Val Met Lys Asn His lie Thr Thr Val Met Thr 180 185 190

His Tyr Lys Gly Lys lie Val Glu Trp Asp Val Ala Asn Glu Cys Met 195 200 205

Asp Asp Ser Gly Asn Gly Leu Arg Ser Ser lie Trp Arg Asn Val lie 210 215 220

Gly Gin Asp Tyr Leu Asp Tyr Ala Phe Arg Tyr Ala Arg Glu Ala Asp 225 230 235 240

Pro Asp Ala Leu Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn lie Glu Asp Leu Gly 245 250 255

Pro Lys Ser Asn Ala Val Phe Asn Met lie Lys Ser Met Lys Glu Arg 260 265 270 ···, Gly Val Pro He Asp Gly Val Gly Phe Gin Cys His Phe He Asn Gly .I.* 275 280 285

Met Ser Pro Glu Tyr Leu Ala Ser He Asp Gin Asn He Lys Arg Tyr .·, 290 295 300 • * ·· ·# Ala Glu Ile Gly Vai Ile Vai Ser Phe Thr Glu He Asp He Arg He • '.· 305 310 315 320 ; • t · Pro Gin Ser Glu Asn Pro Ala Thr Ala Phe Gin Val Gin Ala Asn Asn *♦1. 325 330 335 • * · at*

Tyr Lys Glu Leu Met Lys He Cys Leu Ala Asn Pro Asn Cys Asn Thr 340 345 350 ϊ Ϊ ! Phe Val Met Trp Gly Phe Thr Asp Lys Tyr Thr Trp He Pro Gly Thr ;;; 355 360 355 • · · *.* * Phe Pro Gly Tyr Gly Asn Pro Leu He Tyr Asp Ser Asn Tyr Asn Pro • 370 375 380

• I

Lys Pro Ala Tyr Asn Ala He Lys Glu Ala Leu Met Gly Tyr Xaa ,·*·. 385 390 395 i ·

III

• a • · J ..

····· 118009 74 (2) SEK ID NO :55:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 397 aminohappoa ' (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:55:

Met Ile Thr Leu Phe Arg Lys Pro Phe Vai Ala Gly Leu Ala Ile Ser 1 5 .10 15 ;

Leu Leu Vai Gly Gly Gly Ile Gly Asn Vai Ala Ala Ala Gin Gly Gly 20 25 3 0 .

Pro Pro Lys Ser Gly Vai Phe Gly Glu Asn Glu Lys Arg Asn Asp Gin ·>·.

35 ,40 45

Pro Phe Ala Trp Gin Vai Ala Ser Leu Ser Glu Arg Tyr Gin Glu Gin 50 55 60

Phe Asp Ile Gly Ala Ala Vai Glu Pro Tyr Gin Leu Glu Gly Arg Gin 65 70 75 80

Ala Gin Ile Leu Lys His His Tyr Asn Ser Leu Vai Ala Glu Asn Ala 85 90 9 5

Met Lys Pro Glu Ser Leu Gin Pro Arg Glu Gly Glu Trp Asn Trp Glu 100 105 110

Gly Ala Asp Lys Ile Vai Glu Phe Ala Arg Lys His Asn Met Glu Leu 115 120 125 ;

Arg Phe His Thr Leu Vai Trp His Ser Gin Vai Pro Glu Trp Phe Phe 130 135 140

Ile Asp Glu Asp Gly Asn Arg Met Vai Asp Glu Thr Asp Pro Asp Lys 145 150 155 160 ... Arg Glu Ala Asn Lys Gin Leu Leu Leu Glu Arg Met Glu Asn His Ile . : 165 170 175 ··· *;* Lys Thr Vai Vai Glu Arg Tyr Lys Asp Asp Vai Thr Ser Trp Asp Vai 180 185 190 • · .,** Vai Asn Glu Vai Ile Asp Asp Gly Gly Gly Leu Arg Glu Ser Glu Trp : 195 200 205 * J : Tyr Gin Ile Thr Gly Thr Asp Tyr Ile Lys Vai Ala Phe Glu Thr Ala 210 215 '220 * « e * · ♦

Arg Lys Tyr Gly Gly Glu Glu Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn 225 230 235 240 : :*· Thr Glu Vai Pro Ser Lys Arg Asp Asp Leu Tyr Asn Leu Vai Lys Asp **· 245 250 255 • « ♦ • « · *. Leu Leu Glu Gin Gly Vai Pro Ile Asp Gly Vai Gly His Gin Ser His , 260 265 270 I·!·· • « ... He Gin He Gly Trp Pro Ser Ile Glu Asp Thr Arg Ala Ser Phe Glu * ί 275 280 285 • i • » : *· , ·«··» • * 118009 75 : . · . h

Lys Phe Thr Ser Leu Gly Leu Asp Asn Gin Val Thr Glu Leu Asp Met 290 295 300

Ser Leu Tyr Gly Trp Pro Pro Thr Gly Ala Tyr Thr Ser Tyr Asp Asp 305 310 315 320 ‘ lie Pro Ala Glu Leu Leu Gin Ala Gin Ala Asp Arg Tyr Asp Gin Leu 325 330 335

Phe Glu Leu Tyr Glu Glu Leu Ala Ala Asp lie Ser Ser Val Thr Phe 340 345 350

Trp Gly lie Ala Asp Asn His Thr Trp Leu Asp Gly Arg Ala Arg Glu 355 360 365

Tyr Asn Asn Gly Val Gly lie Asp Ala Pro Phe Val Phe Asp His Asn 370 375 380

Tyr Arg Val Lys Pro Ala Tyr Trp Arg Ile He Asp Xaa 385 390 395 (2) SEK ID NO :56:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 388 aminohappoa : .

(B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:56:

Met Asn Lys Phe Leu Asn Lys Lys Trp Ser Leu Ile Leu Thr Met Gly 1 5 10 15

Gly Ile Phe Leu Met Ala Thr Leu Ser Leu Ile Phe Ala Thr Gly Lys 20 25 30

Lys Ala Phe Asn Asp Gin Thr Ser Ala Glu Asp Ile Pro Ser Leu Ala ... 35 40 45 • *

Glu Ala Phe Arg Asp Tyr Phe Pro Ile Gly Ala Ala Ile Glu Pro Gly *!* 50 55 60 * ; Tyr Thr Thr Gly Gin Ile Ala Glu Leu Tyr Lys Lys His Vai Asn Met 65 70 75 80 * 9 # * 9 ^ * Leu Vai Ala Glu Asn Ala Met Lys Pro Ala Ser Leu Gin Pro Thr Glu : : : es 90 95 #*♦ · j : ί Gly Asn Phe Gin Trp Ala Asp Ala Asp Arg Ile Vai Gin Phe Ala Lys * 100 105 110

Glu Asn Gly Met Glu Leu Arg Phe His Thr Leu Vai Trp His Asn Gin « ·*· 115 120 125 e · · ·*·*; Thr Pro Thr Gly Phe Ser Leu Asp Lys Glu Gly Lys Pro Met Vai Glu V ’ 130 135 140 9 ; 9 i *·*'! Glu Thr Asp Pro Gin Lys Arg Glu Glu Asn Arg Lys Leu Leu Leu Gin ... 145 150 155 160 j : *t‘ Arg Leu Glu Asn Tyr Ile Arg Ala Vai Vai Leu Arg Tyr Lys Asp Asp - !*, 165 170 175 • 9« •

Ile Lys Ser Trp Asp Vai Vai Asn Glu Vai Ile Glu Pro Asn Asp Pro ’ * 180 185 190 76 1 1 8009

Gly Gly Met Arg Asn Ser Pro Trp Tyr Gin lie Thr Gly Thr Glu Tyr 195 200 205

Ile Glu Vai Ala Phe Arg Ala Thr Arg Glu Ala Gly Gly Ser Asp He 210 215 220

Lys Leu Tyr lie Asn Asp Tyr Asn Thr Asp Asp Pro Val Lys Arg Asp 225 230 235 240

He Leu Tyr Glu Leu Val Lys Asn Leu Leu Glu Lys Gly Val Pro He ! 245 250 255

Asp Gly Val Gly His Gin Thr His He Asp He Tyr Asn Pro Pro Val 260 265 270

Glu Arg He He Glu Ser He Lys Lys Phe Ala Gly Leu Gly Leu Asp 275 280 285

Asn Ile He Thr Glu Leu Asp Met Ser He Tyr Ser Trp Asn Asp Arp 290 295 300

Ser Asp Tyr Gly Asp Ser He Pro Asp Tyr He Leu Thr Leu Gin Ala 3°5 310 315 320

Lys Arg Tyr Gin Glu Leu Phe Asp Ala Leu Lys Glu Asn Lys Asp He 325 330 335

Val Ser Ala Val Val Phe Trp Gly He Ser Asp Lys Tyr Ser Trp Leu 340 345 350

Asn Gly Phe Pro Val Lys Arg Thr Asn Ala Pro Leu Leu Phe Asp Arg 355 360 365 “ :

Asn Phe Met Pro Lys Pro Ala Phe Trp Ala He Val Asp Pro Ser Arg 370 375 380

Leu Arg Glu Xaa 385 (2) SEK ID NO :57:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 343 aminohappoa .: (B) TYYPPI: aminohappo (c) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat * • 1 J: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:57: • ♦ ♦ ’ 1 Met Arg Cys Leu Ile Vai Cys Glu Asn Leu Glu Met Leu Asn Leu Ser i ; : 1 5 io 15 *· · · l1:’: Leu Ala Lys Thr Tyr Lys Asp Tyr Phe Lys He Gly Ala Ala Vai Thr • 20 25 30

Ala Lys Asp Leu Glu Gly Vai His Arg Asp He Leu Leu Lys His Phe • .1. 35 40 45 • · · .'V. Asn Ser Leu Thr Pro Glu Asn Ala Met Lys Phe Glu Asn Ile His Pro V ' 50 55 60 t Γ1ί Glu Glu Gin Arg Tyr Asn Phe Glu Glu Vai Ala Arg Ile Lys Glu Phe ... 65 70 75 80 * : ‘t1 Ala Ile Lys Asn Asp Met Lys Leu Arg Gly His Thr Phe Vai Trp His 85 90 95 • ·· « Asn Gin Thr Pro Gly Trp Vai Phe Leu Asp Lys Asn Gly Glu Glu Ala 100 105 no 118009 77

Ser Lys Glu Leu Val lie Glu Arg Leu Arg Glu His lie Lye Thr Leu 115 120 125

Cys Glu Arg Tyr Lys Asp Val Val Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu 130 135 140 ,

Ala Val Glu Asp Lys Thr Glu Lys Leu Leu Arg Glu Ser Asn Trp Arg 14S 150 155 160

Lys Ile He Gly Asp Asp Tyr He Lys He Ala Phe Glu He Ala Arg 165 170 175

Glu Tyr Ala Gly Asp Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Asn Glu iso 185 190

Met Pro Tyr Lys Leu Glu Lys Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu Leu Leu 195 200 205

Glu Arg Gly Thr Pro He Asp Gly He Gly He Gin Ala His Trp Asn 210 215 220

He Trp Asp Lys Asn Leu Val Ser Asn Leu Lys Lys Ala He Glu Val 225 230 ' 235 240

Tyr Ala Ser Leu Gly Leu Glu He His He Thr Glu Leu Asp He Ser 245 250 255

Val Phe Glu Phe Glu Asp Lys Arg Thr Asp Leu Phe Glu Pro Thr Pro 260 265 270

Glu Met Leu Glu Leu Gin Ala Lys Val Tyr Glu Asp Val Phe Ala Val 275 280 285

Phe Arg Glu Tyr Lys Asp Val He Thr Ser Val Thr Leu Trp Gly He 290 295 300

Ser Asp Arg His Thr Trp Lys Asp Asn Phe Pro Val Lys Gly Arg Lye 305 310 315 320

Asp Trp Pro Leu Leu Phe Asp Val Asn Gly Lys Pro Lys Glu Ala Leu 325 330 335

Tyr Arg He Leu Arg Phe Xaa ··· 340 • * tn

(2) SEK ID NO: 58 : N INFORMAATIO: I

* • l ,/V (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ; V (A) PITUUS: 474 aminohappoa • ,·. (B) TYYPPI: aminohappo ’·*· · (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat *

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 58: ;V

• « · t • s · !"* Lys Ala Thr Vai Lys Ala Thr Ser Asp Lys Asp Asn Tyr Ile Gin Vai : i : 1 5 10 15 *

Asn Asp Phe Ala Asn Vai Asn Lys Gly Glu Trp Thr Glu Ile Lys Gly '***» 20 25 30

• M

* Ser Phe Thr Leu Pro Vai Ala Asp Tyr Ser Gly Ile Ser Ile Tyr Vai 35 40 45 • · S ** Glu Ser Gin Asn Pro Thr Leu Glu Phe Tyr He Asp Asp Phe Ser Vai 50 55 60 • 9 78 118009

Ile Gly GIu Ile Ser Asn Asn Gin Ile Thr Ile Gin Asn Asp Ile Pro 70 75 80

Asp Leu Tyr Ser Vai Phe Lys Asp Tyr Phe Pro Ile Gly Vai Ala Vai 85 90 95

Asp Pro Ser Arg Leu Aen Asp Ala Asp Pro Hie Ala Gin Leu Thr Ala 100 105 110

Lys His Phe Asn Met Leu Vai Ala Glu Asn Ala Met Lys Pro Glu Ser 115 120 125

Leu Gin Pro Thr Glu Gly Asn Phe Thr Phe Asp Asn Ala Asp Lys Ile 130 135 140

Vai Asp Tyr Ala Ile Ala His Asn Met Lye Met Arg Gly His Thr Leu 145 150 155 160

Leu Trp His Asn Gin Vai Pro Asp Trp Phe Phe Gin Asp Pro Ser Asp 165 170 175

Pro Ser Lys Ser Ala Ser Arg Asp Leu Leu Leu Gin Arg Leu Lys Thr 180 185 190

His Ile Thr Thr Vai Leu Asp His Phe Lys Thr Lys Tyr Gly Ser Gin 195 200 205

Asn Pro Ile Ile Gly Trp Asp Vai Vai Asn Glu Vai Leu Asp Asp Asn 210 215 220

Gly Aen Leu Arg Asn Ser Lys Trp Leu Gin Ile Ile Gly Pro Asp Tyr 225 230 235 240

Ile Glu Lys Ala Phe Glu Tyr Ala His Glu Ala Asp Pro Ser Met Lys 245 250 255

Leu Phe Ile Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Asn Gly Vai Lys Thr Gin 260 265 270

Ala Met Tyr Asp Leu Vai Lys Lys Leu Lys Ser Glu Gly Vai Pro Ile 275 280 285

Asp Gly Ile Gly Met Gin Met His Ile Asn Ile Asn Ser Asn Ile Asp 290 295 300

Asn Ile Lys Ala Ser Ile Glu Lys Leu Ala Ser Leu Gly Vai Glu Ile 305 310 315 320 · ··· ·*·* Gin Vai Thr Glu Leu Asp Met Asn Met Asn Gly Asn Ile Ser Asn Glu ... 325 330 335 • * · *

Ala Leu Leu Lys Gin Ala Arg Leu Tyr Lys Gin Leu Phe Asp Leu Phe * I.* 340 345 350 : *.· Lys Ala Glu Lys Gin Tyr Ile Thr Ala Vai Vai Phe Trp Gly Vai Ser : .·, 355 360 365 ♦ · a • * · a ··· Asp Asp Vai Thr Trp Leu Ser Lys Pro Asn Ala Pro Leu Leu Phe Asp · 370 375 380

Ser Lys Leu Gin Ala Lys Pro Ala Phe Trp Ala Vai Vai Asp Pro Ser . 385 390 395 400 • · · a * ♦ I" Lys Ala Ile Pro Asp Ile Gin Ser Ala Lys Ala Leu Glu Gly Ser Pro i : : : 405 410 415 #<..j Thr Ile Gly Ala Asn Vai Asp Ser Ser Trp Lys Leu Vai Lys Pro Leu * ’ 420 425 430 • a «

Tyr Vai Asn Thr Tyr Vai Glu Gly Thr Vai Gly Ala Thr Ala Thr Vai • 435 440 445 • * • « ; ** Lyö Ser Met Trp Asp Thr Lye Asn Leu Tyr Leu Leu Vai Gin Vai Ser 450 455 460 i • · ( 79 118009

Asp Aan Thr Pro Ser Aen Asn Asp Gly Ile 465 470 (2) SEK ID NO:59:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 438 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:59:

Met Lys Arg Asn Leu Phe Arg Ile Vai Ser Arg Vai Vai Leu Ile Ala 1 5 10 15

Phe Ile Ala Ser Ile Ser Leu Vai Gly Ala Met Ser Tyr Phe Pro Vai 20 25 30

Glu Thr Gin Ala Ala Pro Asp Trp Ser Ile Pro Ser Leu Cys Glu Ser 35 40 45

Tyr Lys Asp Asp Phe Met Ile Gly Vai Ala Ile Pro Ala Arg Cys Leu 50 55 60

Ser Asn Asp Thr Asp Lys Arg Met Vai Leu Lys His Phe Asn Ser Ile \ 65 70 75 80

Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Pro Glu Ser Leu Leu Ala Gly Gin Thr 85 90 95

Ser Thr Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Ser Thr Ala Asp Ala Phe Vai Asp 100 105 110

Phe Ala Ser Thr Asn Lys Ile Gly Ile Arg Gly His Thr Leu Vai Trp 115 120 125

His Asn Gin Thr Pro Asp Trp Phe Phe Lys Asp Ser Asn Gly Gin Arg 130 135 140

Leu Ser Lys Asp Ala Leu Leu Ala Arg Leu Lys Gin Tyr Ile Tyr Asp ***: 145 150 155 160 • · 1 2 .·· Vai Vai Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Vai Tyr Ala Trp Asp Vai Vai Asn ···· 165 170 175 • · * !·1 Glu Ala Ile Asp Glu Asn Gin Pro Asp Ser Tyr Arg Arg Ser Thr Trp f.1. 180 185 190 * · • 1 ; .1. Tyr Glu Ile Cys Gly Pro Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Phe Ile Trp Ala : 195 200 205 . ; • 1 1 , e · ·,1 1 His Glu Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Thr 210 215 220 ···*·

Glu Ile Ser Lys Lys Arg Asp Phe Ile Tyr Asn Met Vai Lys Asn Leu ϊ.;.: 225 230 235 240 • · · ·#ϊ · Lys Ser Lys Gly Ile Pro Ile His Gly Ile Gly Met Gin Cys His Ile 245 250 255 2 ***** ' Asn Vai Asn Trp Pro Ser Vai Ser Glu Ile Glu Asn Ser Ile Lys Leu .···. 260 265 270 * ·

* 1 1 I

* Phe Ser Ser Ile Pro Gly Ile Glu Ile His Ile Thr Glu Leu Asp Met 275 280 285 80 118009

Ser Leu Tyr Asn Tyr Gly Ser Ser Glu Aan Tyr Ser Thr Pro Pro Gin 290 295 300 !

Asp Leu Leu Gin Lys Gin Ser Gin Lys Tyr Lys Glu lie Phe Thr Met 305 310 315 320

Leu Lys Lys Tyr Lys Asn Vai Vai Lys Ser Val Thr Phe Trp Gly Leu 325 330 335

Lys Asp Asp Tyr Ser Trp Leu Arg Ser Phe Tyr Gly Lys Asn Asp Trp 340 345 350

Pro Leu Leu Phe Phe Glu Asp Tyr Ser Ala Lys Pro Ala Tyr Trp Ala 355 360 365

Vai He Glu Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Ser Pro Thr Pro Thr Pro 370 375 380

Thr Pro Thr Val Thr Val Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro 385 390 395 400

Thr Val Thr Ala Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Val Ser Thr Pro 405 410 415

Ala Thr Gly Gly Gin He Lys Val Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Thr Asn 420 425 430

Ser Thr Thr Asn Thr He 435 (2) SEK ID NO:60:N INFORMAATIO: : (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 392 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:60: ··». Met Asn Leu Lys Thr Ala Tyr Glu Pro Tyr Phe Lys Ile Gly Ala Ala 1 5 10 15

He Ser Arg Trp Asn Leu His Thr Pro Ala His Thr Lys Leu Leu Ala 20 25 30 1 • · ·· ·' Glu Gin Phe Asn Ser Phe Thr Cys Glu Asn Asp Met Lys Pro Met Tyr • V 35 40 45 • * ; Tyr Leu Asp Arg Glu Ala Asn Lys Lys Asp Pro Glu Lys Tyr Asn Leu ··* 50 55 50 ♦ * · • · ·

Ser Pro Ala Leu Thr Phe Glu Asn Ala He Pro Tyr Leu Glu Phe Ala 65 70 75 80 • ky® Asp Asn Lys Ile Ala Met Arg Gly His Thr Leu Vai Trp His Asn \Y, 85 90 95 • · · * * · *. Gln Thr Pro Lys Trp Phe Phe Cys Glu Arg Tyr Asn Glu Asn Phe Pro 100 105 110 * * **·. Met Ala Asp Arg Glu Thr Ile Leu Ala Arg Leu Glu Ser Tyr He His 115 120 125 • G1Y Val Leu AsP Phe Vai Gin Thr Asn Tyr Pro Gly Ile Ile Tyr Ala * t 130 135 140 1 ! * 81 , 118009

Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ile Vai Asp Glu Gly Ala Phe Arg Lys Ser 145 150 155 160

Ile Trp Thr Glu Thr Vai Gly Glu Asp Phe Phe Ile Lys Ala Phe Glu 165 170 175

Phe Ala Arg Lys Tyr Ala Ala Pro Glu Vai Ser Leu Phe Tyr Asn Asp 1 180 185 190

Tyr Glu Thr Ala Gin Pro Trp Lys Arg Asp Phe Ile Leu Glu Lys Vai 195 200 205

Leu Gly Pro Leu Ile Asp Lys Lys Leu Ile Asp Gly Met Gly Met Gin 210 215 220

Ser His Leu Leu Met Asp His Pro Asp Ile Ser Glu Tyr Arg Thr Ala 225 230 235 240

Leu Glu Met Tyr Gly Ser Thr Gly Leu Gin Ile His Ile Thr Glu Leu 245 250 255

Asp Met His Asn Ala Asp Pro Ser Glu Glu Ser Met His Ala Leu Ala 260 265 270

Thr Arg Tyr Gin Glu Phe Phe Gin Thr Tyr Leu Asp Ala Lys Lys Ser 275 280 285

Gly Lys Ala Asn Ile Thr Ser Vai Thr Phe Trp Asn Leu Leu Asp Glu 290 295 300 t

Asn Ser Trp Leu Ser Gly Phe Arg Arg Glu Thr Ser Tyr Pro Leu Vai 305 310 315 320

Phe Lys Gly Lys Cys Glu Ala Lys Glu Ala Tyr Tyr Ala Vai Leu Lys ^ 325 330 335

Ala Ala Vai Ser Asp Asp Ser Ile Asp Lys Trp Vai Pro Asp Tyr Ser 340 345 350 '

Glu Glu Asp Tyr Lys Leu Gin Gly Met Pro Thr Pro Asp Ile Lys Arg ", 355 360 365 :;f

Phe Arg Glu Asn Ile Trp Gin Glu Asn Glu Tyr Asn Tyr Glu Ala Ser 370 375 380 ···, Tyr Gly Phe Ile Pro Asn Leu Phe 385 390 ··· • ! ί (2) SEK ID NO: 61:N INFORMAATIO: ' • * v *· ' !’·[: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: Ϊ . ^ (A) PITUUS: 405 aminohappoa : (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat * (D) TOPOLOGIA: molemmat 1 . (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:61: * · · · * >“*t Asn Gin Asn Asn Trp Asn Gin Asn Asn Asn Gin Gin Asn Ala Trp Asn V * 1 5 10 15

Gly Trp Asp Asn Asn Asn Asn Trp Asn Gin Trp Gly Gly Gin Asn Asn * * 20 25 30 • · * * · .·.* Asp Trp Asn Asn Gin Gin Gin Asn Asn Asp Trp Asn Gin Trp Asn Asn • 35 40 45 • * • · * Gin Gly Gin Gin Gin Asn Asn Asp Trp Asn Asn Gin Asn Asn Trp Asn ·;·<! 50 55 60 : 82 1 1 8009

Gin Gly Gin Gin Asn Aan Asn Asn Ser Ala Gly Ser Ser Asp Ser Leu 65 70 75 80

Lys Gly Ala Phe Ser Lys Tyr Phe Lys Ile Gly Thr Ser Vai Ser Pro 85 90 95

His Glu Leu Asn Ser Gly Ala Asp Phe Leu Lys Lys His Tyr Asn Ser 100 105 110

Ile Thr Pro Glu Asn Glu Leu Lys Pro Glu Ser Ile Leu Asp Gin Gly 115 120 125

Ala Cys Gin Gin Lys Gly Asn Asn Vai Asn Thr Gin Ile Ser Leu Ser 130 135 140

Arg Ala Ala Gin Thr Leu Lys Phe Cys Glu Gin Asn Gly Ile Ala Leu 145 150 155 160

Arg Gly His Thr Phe Vai Trp Tyr Ser Gin Thr Pro Asp Trp Phe Phe 165 170 175

Arg Glu Asn Phe Ser Gin Asn Gly Ala Tyr Vai Ser Lys Asp Ile Met 180 185 190

Asn Gin Arg Leu Glu Ser Met Ile Lys Asn Thr Phe Ala Ala Leu Lys 195 200 205 ;

Ser Gin Tyr Pro Asn Leu Asp Vai Tyr Ser Tyr Asp Vai Cys Asn Glu 210 215 220

Leu Phe Leu Asn Asn Gly Gly Gly Met Arg Gly Ala Asp Asn Ser Asn 225 230 235 240

Trp Vai Lys Ile Tyr Gly Asp Asp Ser Phe Vai Ile Asn Ala Phe Lys 245 250 255

Tyr Ala Arg Gin Tyr Ala Pro Ala Gly Cys Lye Leu Tyr Leu Asn Asp 260 265 270

Tyr Asn Glu Tyr Ile Pro Ala Lys Thr Asn Asp Ile Tyr Asn Met Ala 275 280 285 j i

Met Lys Leu Lys Gin Leu Gly Tyr Ile Asp Gly Ile Gly Met Gin Ser 290 295 300 **· His Leu Ala Thr Asn Tyr Pro Asp Ala Asn Thr Tyr Glu Thr Ala Leu ·;· 305 310 315 320 ··#· ·*; Lys Lys Phe Leu Ser Thr Gly Leu Glu Vai Gin Ile Thr Glu Leu Asp ·· 325 330 335 »« · • · · : ·' Ile Thr Cys Thr Asn Ser Ala Glu Gin Ala Asp Leu Tyr Glu Lys Ile : .*. 340 345 350 , » » · * · * ·

Phe Lys Leu Ala Met Gin Asn Ser Ala Gin Ile Pro Ala Vai Thr Ile *.* * 355 360 365

Trp Gly Thr Gin Asp Thr Vai Ser Trp Arg Ser Ser Gin Asn Pro Leu . 370 375 380 * * * • j·, Leu Phe Ser Ala Gly Tyr Gin Pro Lys Pro Ala Tyr Asp Arg Vai Met V ' 385 390 395 400 ··»·· Ala Leu Ala Lys Xaa 405 • · · j : *·· • ·

• · · I

• ·· * #···· • · 83 1 1 8009 (2) SEK ID NO:62:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 404 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:62:

Abu Ala Trp Gin Trp Vai Gly Asn Met Asn Arg Trp Vai Leu Pro Phe 1 5 10 15

Gly Ala Ser Arg Gly Gly Ile Arg Ala Gly Gin Gly Asp Ser Leu Ile 20 25 30

Ala Phe Ala Gly Ala Glu Ser Thr Asn Ala Ala Ala Asn Ile Arg Ser 35 40 45

Leu Ala Glu Ala Lys Asp Tyr Phe Lys Ile Gly Ala Ala Vai Glu Pro t 50 55 60

Tyr Arg Leu Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Ile Leu Lys Lys His Phe Asn 65 70 75 80 !

Met Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Pro Leu Asp Ala Leu Gin Pro Glu 85 90 95

Gly Thr Ser Asn Gin Phe Asn Phe Ser Asn Ala Asp Arg Ile Vai Glu

100 105 110 I

Phe Ala Gin Asn Gly Met Leu Arg Gly His Thr Leu Vai Trp His Asn 115 120 125

Gin Thr Pro Asp Trp Phe Phe Leu Asp Gly Met Vai Glu Thr Asp Pro 130 135 140

Lys Arg Glu Ser Asp Leu Leu Leu Gin Arg Leu Glu Asn His Ile Thr 145 150 155 160

Vai Met His Tyr Lys Thr Tyr Pro Gly Lys Ser Trp Asp Vai Vai Asn 165 170 175 *·· #j,* Glu Ala Phe Gly Asp Asp Gly Asp Asn Gly Gly Leu Arg Arg Ser Trp 180 185 190 ··· ***. Gin Ile Ile Gly Asn Asp Tyr Ile Glu Vai Ala Phe Arg Tyr Ala Arg : i 195 200 205 #· ·* · ϊ * ϊ Glu Tyr Ala Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Glu * ’ 210 215 220 * : : '**.* Trp Pro Trp Ala Lys Thr Asp Ala Leu Tyr Asn Vai Lys Asp Leu Lys I : ; 225 230 235 240

Glu Arg Gly Vai Pro Ile Asp Gly Vai Gly Phe Gin Ser His Phe Asn 245 250 255

. "J

*·*· Ile Gly Trp Pro Pro Tyr Ile Ser Asn Arg Thr Leu Lys Phe Ala Ser ;***: 260 265 270 . Leu Ser Gly Asp Ile Ile Thr Glu Leu Asp Ile Ser Leu Tyr Asn Trp ' 275 280 285 (f* t I Asp Tyr Tyr Asp Asp Ile Pro Glu Leu Leu Gin Ala Gin Ala Ala Arg •f 290 295 300 f# ί ** Tyr Lys Glu Phe Ala Cys Leu Ala Vai Ser Glu Lys Ala Vai Ile Thr • 305 310 315 320 j *····' * * 118009 84

Vai Thr Phe Trp Gly Ile Ser Asp Tyr Ser Trp Leu Ser Gly Phe Arg 325 330 335

Lys Glu Asp Trp Ala Pro Leu Leu Phe Asp Asn Tyr Gin Pro Lys Pro 340 345 350

Ala Tyr Trp Ala Vai Asp Ala Leu Gly Thr Ser Glu Pro Pro Pro Thr 355 360 365

Pro Ala Pro Gly Vai Gly Ser Gly Arg Leu Tyr Asp Vai Pro Asp Ser 370 375 380

Thr Asp Gly Thr Thr Vai Lys Thr Asn Gin Gin Trp Thr Thr Ser Glu 385 390 395 400

Tyr Gly Asn Lys (2) SEK ID NO:63:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 420 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:63:

Met Gly Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Ser Gly Vai Arg Arg Ser Ile Arg 1 5 10 15

Vai Leu Leu Ala Ala Leu Vai Vai Gly Vai Leu Gly Thr Ala Thr Ala 20 25 30

Leu Ile Ala Pro Pro Gly Ala His Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala 35 40 45

Ala Ala Ala Gin Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly 50 55 60

Arg Leu Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Ser Ile Ala Gly Arg Glu Phe Asn 65 70 75 80 ***. Met Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gin i .

.*.* 85 90 95 ··· •••Ϊ Arg Gly Gin Phe Asn Phe Ser Ser Ala Asp Arg Vai Tyr Asn Trp Ala .*, 100 105 110 • · * *

Vai Gin Asn Gly Lys Gin Vai Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser : .* 115 120 125 e * » » ·

Gin Gin Pro Gly Trp Met Gin Ser Leu Ser Gly Arg Pro Leu Arg Gin 130 135 140 i · ·

Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Vai Met Ala His Tyr Lys Gly Lys 145 150 155 160 $ • ·.·.* Ile Vai Gin Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala Phe Ala Asp Gly Ser Ser ... 165 170 175 Φ * f « · · • Gly Ala Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gin Arg Ser Gly Asn Asp Trp Ile · 180 185 190 • · ,*··, Glu Vai Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Aep Pro Ser Ala Lys Leu ‘ *...* 195 200 205 **·.. Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Vai Glu Asn Trp Thr Trp Ala Lys Thr Gin ' , 210 215 220 ·· *· · • · 118009 85

Ala Met Tyr Asn Met Vai Arg Asp Phe Lys Gin Arg Gly Vai Pro Ile 225 230 235 240 ί

Asp Cys Vai Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn 245 250 255

Ser Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gin Asn Phe Ala Ala Leu Gly Vai Asp 250 265 270

Vai Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gin Gly Ala Pro Ala Ser Thr Tyr 275 280 285

Ala Asn Vai Thr Asn Asp Cys Leu Ala Vai Ser Arg Cys Leu Gly Ile 290 295 300

Thr Vai Trp Gly Vai Arg Asp Ser Asp Ser Trp Arg Ser Glu Gin Thr 305 310 315 320

Pro Leu Leu Phe Asn Asn Asp Gly Ser Lys Lye Ala Ala Tyr Thr Ala 325 330 335

Vai Leu Asp Ala Leu Asn Gly Gly Asp Ser Ser Glu Pro Pro Ala Asp 340 345 350

Gly Gly Gin lie Lys Gly Vai Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp Vai Pro 355 360 365

Asp Ala Ser Thr Ser Asp Gly Thr Gin Leu Gin Leu Trp Ä6p Cys His 370 375 380 ,

Ser Gly Thr Asn Gin Gin Trp Ala Ala Thr Asp Ala Gly Glu Leu Arg 385 390 395 400

Vai Tyr Gly Asp Lys Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Ser Asn Gly Ser 405 410 415

Lys Vai Gin Ile , 420 (2) SEK ID NO:64:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 419 aminohappoa *··, (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat ··· (D) TOPOLOGIA: molemmat 4*** (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 64: a * · * ’,· Vai Pro Ile Asn Vai Met Pro Arg Pro Gly Ala Arg Lys Arg Ala Leu . . 1 5 10 15 f ♦ · *!.* Leu Ala Gly Ala Vai Gly Leu Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Vai Ala * ί Σ 20 25 30 ,

Pro Ser Pro Ala Vai Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala Ala Ala Ala . 35 40 45 I

*. : :

Gin Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr' Ala Ile Ala Ser Gly Arg Leu Asn : : : so 55 eo ♦

Asp Ser Thr Tyr Thr Thr Ile Ala Asn Arg Glu Phe Asn Met Vai Thr • · 65 70 75 80 ; * · a *„,· Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Asn Arg Gly Gin • 85 90 95 I * ♦ * * *’ Phe Asn Phe Ser Ser Ala Asp Arg Ile Tyr Asn Trp Ala Vai Gin Asn t 100 105 110 : 118009 86

Gly Lys Gin Val Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser Gin Gin Pro 115 120 125

Gly Trp Met Gin Ser Leu Ser Gly Ser Ser Leu Arg Gin Ala Met He 130 135 140

Asp Hie He Asn Gly Val Met Ala Hie Tyr Lys Gly Lys He Val Gin 145 150 155 160 ' :

Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ala Asp Gly Asn Ser Gly Gly Arg 165 170 175

Arg Asp Ser Asn Leu Gin Arg Thr Gly Asn Asp Trp He Glu Val Ala 180 185 190

Phe Arg Thr Ala Arg Asn Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Cys Tyr Asn 195 200 205

Asp Tyr Asn He Glu Asn Trp Asn Trp Ala Lys Thr Gin Gly Val Tyr 210 215 220

Asn Met Val Arg Asp Phe Lys Gin Arg Gly Val Pro He Asp Cys Val 225 230 235 240

Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn Ser Asn Phe 245 250 255

Arg Thr Thr Leu Gin Asn Phe Ala Ala Leu Gly Vai Asp Val Ala He 260 265 270

Thr Glu Leu Asp He Gin Gly Ala Ser Pro Thr Thr Tyr Ala Asn Vai I

275 280 285

Val Asn Asp Cys Leu Ala Val Ser Arg cys Leu Gly He Thr Val Trp 290 295 300

Gly Val Arg Asp Thr Asp Ser Trp Arg Ser Asp Gin Thr Pro Leu Leu 305 310 315 320 :

Phe Asp Gly Asn Gly Asn Lys Lys Ala Ala Tyr Ser Ala Val Leu Asn 325 330 335

Ala Leu Asn Gly Gly Gly Thr Ser Glu Pro Pro Pro Ala Ser Asp Ala 340 345 350 ! ··« • * Gly Thr He Lys Gly Val Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp Val Pro Asn *’ 355 360 365 *·· .---:-5 • '.·%

Ala Ser Thr Ser Asp Gly Val Gin Leu Gin Leu Trp Asp Cys His Gly ί Ϊ 370 375 380 * * ;*·*: Gly Thr Asn Gin Gin Trp Thr Tyr Thr Asp Ser Gin Glu Leu Arg Val * * 385 390 395 400 * · • · · *** ‘ Tyr Gly Asn Lys Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Gly Asn Gly Thr Lys »'·*; 405 410 415 *

Val Gin He f ; * « « * ·» · V : (2) SEK ID NO:65:N INFORMAATIO: ; « ; * (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 134 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: molemmat ’ (D) TOPOLOGIA: molemmat ' ! ^u»· I r 118009 87 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:65: GGCGGCGGCA CCTCCGAGCC GCCGCCCGCC TCCGACGCCG GGACGATCAA GGGCGTCGGC 60 j ' . " TCGGCCGCTG CCTGGACGTG CCCAACGCCA GCACCAGCGA CGGCGTCCAG CTCCAGCTGT 120 GGGACTGCCA CGGC 134 ! (2) SEK ID NO:66:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 420 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:66:

Met Gly Ser Cys Ala Leu Pro Thr Ser Gly Vai Thr Thr Ser lie Thr 1 5 10 15

Vai Leu Leu Ala Ala Leu Vai Vai Gly Vai Leu Gly Thr Ala Thr Ala 20 25 30

Leu Ile Ala Pro Pro Gly Ala His Ala Ala Ser Ser Thr Leu Gly Ala 35 40 45

Ala Ala Ala Gin Ser Gly Thr Cys Cys Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly 50 55 60 :

Thr Leu Ser Asp Ser Thr Cys Thr Ser Ile Ala Gly Thr Ser Cys Asn 65 70 75 80

Met Vai Thr Ala Ser Asn Ser Met Thr Ile Asp Ala Thr Ser Pro Gin

85 90 SS

Thr Gly Gin Cys Asn Cys Ser Ser Ala Asp Thr Vai Cys Asn Cys Ala 100 105 110

Vai Gin Asn Gly Thr Gin Vai Thr Gly His Thr Leu Ala Cys His Ser ···. 115 120 125 ' * *

Gin Gin Pro Gly Cys Met Gin Ser Leu Ser Gly Thr Pro Leu Thr Gin 130 135 140 • ·,· Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Vai Met Ala His Cys Thr Gly Thr .. . 145 150 155 160 • * · • · ! I Ile Vai Gin Cys Asp Vai Vai Asn Ser Ala Cys Ala Asp Gly Ser Ser : : : ies 170 175 • · * · • * · : I I Gly Ala Thr Thr Asp Ser Asn Leu Gin Thr Ser Gly Asn Asp Cys Ile * 180 185 190 . Ser Vai Ala Cys Thr Thr Ala Thr Ala Ala Asp Pro Ser Ala Thr Leu || : : : 195 200 205 • · ·

Cys Cys Asn Asp Cys Asn Vai Ser Asn Cys Thr Cys Ala Thr Thr Gin *. 210 215 220 • *·*" Ala Met Cys Asn Met Vai Thr Asp Cys Thr Gin Thr Gly Vai Pro Ile ... 225 230 235 240 • · *· Asp Cys Vai Gly Cys Gin Ser His Cys Asn Ser Gly Ser Pro Thr Asn 245 250 255 • e e •

Ser Asn Cys Thr Thr Thr Leu Gin Asn Cys Ala Ala Leu Gly Vai Asp * * 260 265, 270 118009 .

es ; ;J

Vai Ala Ile Thr Ser Leu Asp Ile Gin Gly Ala Pro Ala Ser Thr Cys 275 280 285 -

Ala Asn Vai Thr Asn Asp Cys Leu Ala Vai Ser Thr Cys Leu Gly Ile 290 295 300

Thr Vai Cys Gly Vai Thr Asp Ser Asp Ser Cys Thr Ser Ser Gin Thr 305 310 315 320

Pro Leu Leu Cys Asn Asn Asp Gly Ser Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala 325 330 335 , Vai Leu Asp Ala Leu Asn Gly Gly Asp Ser Ser Ser Pro Pro Ala Asp ' 340 345 350

Gly Gly Gin Ile Thr Gly Vai Gly Ser Gly Thr Cys Leu Asp Vai Pro 355 360 365

Asp Ala Ser Thr Ser Asp Gly Thr Gin Leu Gin Leu Cys Asp Cys His 370 375 380

Ser Gly Thr Asn Gin Gin Cys Ala Ala Thr Asp Ala Gly Ser Leu Thr 385 390, 395 400 :

Vai Cys Gly Asp Thr Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Ser Asn Gly Ser 405 410 415

Thr Vai Gin Ile 420 | .

(2) SEK ID NO:67:N INFORMAATIO: ; (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 420 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo ! h (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:67:

Met Gly Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Ser Gly Vai Arg Arg Ser Ile Arg 1 5 10 15 ···' Vai Leu Leu Ala Ala Leu Vai Vai Gly Vai Leu Gly Thr Ala Thr Ala 20 25 30 *·1 Leu Ile Ala Pro Pro Gly Ala His Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala . 35 40 45 • · * 1 ·

Ala Ala Ala Gin Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly : 1 : 50 55 60 • 1 ! I I Arg Leu Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Ser Ile Ala Gly Arg Glu Phe Asn 65 70 75 80 • 1 · * 1 ·

Met Vai Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gin 85 90 95 ; Arg Gly Gin Phe Asn Phe Ser Ser Ala Asp Arg Vai Tyr Asn Trp Ala ··· 100 105 110 • 1 · • 1 1 * Vai Gin Asn Gly Lys Gin Vai Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser 115 120 125 • · ... Gin Gin Pro Gly Trp Met Gin Ser Leu Ser Gly Arg Pro Leu Arg Gin *· I 130 135 140 .... i · ;·, Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Vai Met Ala His Tyr Lys Gly Lys : ’1 145 150 155 160 . | · 118009 89

Ile Vai Gin Trp Asp Vai Vai Aan Glu Ala Phe Ala Asp Gly Ser Ser 165 ΠΟ 17S

Gly Ala Arg Arg Asp Ser Αβπ Leu Gin Arg Ser Gly Asn Asp Trp Ile 180 185 190

Glu Vai Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ser Ala Lye Leu .

195 200 205

Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Vai Glu Aan Trp Thr Trp Ala Lys Thr Gin 210 215 220

Ala Met Tyr Asn Met Vai Arg Aap Phe Lys Gin Arg Gly Vai Pro Ile 225 230 235 240

Asp Cys Vai Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn 245 250 255

Ser Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gin Asn Phe Ala Ala Leu Gly Vai Asp 260 265 270

Vai Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gin Gly Ala Pro Ala Ser Thr Tyr 275 280 285

Ala Asn Vai Thr Asn Asp Cys Leu Ala Vai Ser Arg Cys Leu Gly Ile 290 295 300

Thr Vai Trp Gly Vai Arg Asp Ser Asp Ser Trp Arg Ser Glu Gin Thr 305 310 315· 320

Pro Leu Leu Phe Asn Asn Asp Gly Ser Lys Lys Ala Ala Tyr Thr Ala 325 330 335

Vai Leu Asp Ala Leu Asn Gly Gly Asp Ser Ser Glu Pro Pro Ala Asp 340 345 350

Gly Gly Gin Ile Lys Gly Vai Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp Vai Pro 355 360 365

Asp Ala Ser Thr Ser Asp Gly Thr Gin Leu Gin Leu Trp Asp Cys His 370 375 380 j

Ser Gly Thr Asn Gin Gin Trp Ala Ala Thr Asp Ala Gly Glu Leu Arg 385 390 395 400 ... Vai Tyr Gly Asp Lys Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Ser Asn Gly Ser . : 405 410 415 ··· •J* Lys Vai Gin Ile ·’** 420 * * (2) SEK ID NO: 68: N INFORMAATIO: ’ • · · • · j ... (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: • •1 · (A) PITUUS: 419 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo · (D) TOPOLOGIA: molemmat ' . .·. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 68: • · · • · · · .

: : : Vai Pro Ile Asn Vai Met Pro Arg Pro Gly Ala Arg Lys Arg Ala Leu *.l 5 10 15 • *· * Leu Ala Gly Ala Vai Gly Leu Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Vai Ala ··· 20 25 30 ; • Pro Ser Pro Ala Vai Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala Ala Ala Ala ·· • · » ·» *···· * · 118009 90 35 40 45

Gin Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly Arg Leu Asn 50 55 60

Asp Ser Thr Tyr Thr Thr Ile Ala Asn Arg Glu Phe Asn Met Vai Thr 65 70 75 60

Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Asn Arg Gly Gin 85 90 95

Phe Aan Phe Ser Ser Ala Asp Arg Ile Tyr Asn Trp Ala Vai Gin Asn

100 105 HO

Gly Lys Gin Vai Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser Gin Gin Pro 115 120 125

Gly Trp Met Gin Ser Leu Ser Gly Ser Ser Leu Arg Gin Ala Met Ile 130 135 140

Asp His Ile Asn Gly Vai Met Ala His Tyr Lys Gly Lys Ile Vai Gin "? 145 15 0 155 16 0

Trp Asp Vai Vai Asn Glu Ala Phe Ala Asp Gly Asn Ser Gly Gly Arg 165 170 175 . ·.

Arg Asp Ser Asn Leu Gin Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile Glu Vai Ala 180 185 190

Phe Arg Thr Ala Arg Asn Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Cys Tyr Asn 195 200 205

Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Asn Trp Ala Lys Thr Gin Gly Vai Tyr v 210 215 220

Asn Met' Vai Arg Asp Phe Lys Gin Arg Gly Vai Pro Ile Asp Cys Vai 225 230 235 240

Gly Phe Gin Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn Ser Asn Phe 245 250 255

Arg Thr Thr Leu Gin Asn Phe Ala Ala Leu Gly Vai Asp Vai Ala Ile 260 265 270

Thr Glu Leu Asp Ile Gin Gly Ala Ser Pro Thr Thr Tyr Ala Asn Vai . : 275 280 285 * * * ·;· Vai Asn Asp Cys Leu Ala Vai Ser Arg Cys Leu Gly Ile Thr Vai Trp ··*· 290 295 300 * • · **’ Gly Vai Arg Asp Thr Asp Ser Trp Arg Ser Asp Gin Thr Pro Leu Leu *.·.*. 305 310 315 320 • * ' j ;*· Phe Asp Gly Asn Gly Asn Lys Lys Ala Ala Tyr Ser Ala Vai Leu Asn ·♦* · 325 330 335 # · · • · * *·* Ala Leu Asn Gly Gly Gly Thr Ser Glu Pro Pro Pro Ala Ser Asp Ala 340 345 350 .

. .*. Gly Thr Ile Lys Gly Vai Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp Vai Pro Asn 1 ·*· 355 360 365 • · · • * * *.* * Ala Ser Thr Ser Asp Gly Vai Gin Leu Gin Leu Trp Asp Cys His Gly • 370 375 380 * · * · ·

Gly Thr Asn Gin Gin Trp Thr Tyr Thr Asp Ser Gin Glu Leu Arg Vai X***; 365 390 395 400 ·*·

Tyr Gly Asn Lys Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Gly Asn Gly Thr Lys ♦ *·· 405 410 415 *···· Vai Gin Ile ,·? • · 1 118009 ' 91 : ' ί (2) SEK ID NO:69:N INFORMAATIO: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 419 aminohappoa , (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: molemmat (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO:69:

Vai Pro Ile Aan Vai Met Pro Thr Pro Gly Ala Thr Thr Thr Ala Leu 1 5 10 15 i

Leu Ala Gly Ala Vai Gly Leu Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Vai Ala 20 25 30

Pro Ser Pro Ala Vai Ala Ala Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ala Ala Ala 35 40 45

Gin Ser Gly Thr Cys Cys Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly Thr Leu Asn 50 55 60

Asp Ser Thr Cys Thr Thr Ile Ala Asn Thr Ser Cys Asn Met Vai Thr 65 70 75 80 t-

Ala Ser Asn Ser Met Thr Ile Asp Ala Thr Ser Pro Asn Thr Gly Gin 85 90 95

Cys Asn Cys Ser Ser Ala Αερ Thr Ile Cys Asn Cys Ala Vai Gin Asn 100 105 110

Gly Thr Gin Vai Thr Gly His Thr Leu Ala Cys His Ser Gin Gin Pro 115 120 125

Gly Cys Met Gin Ser Leu Ser Gly Ser Ser Leu Thr Gin Ala Met Ile 130 135 140 4

Asp His Ile Asn Gly Vai Met Ala His Cys Thr Gly Thr Ile Vai Gin 145 150 155 160

Cys Asp Vai Vai Asn Ser Ala Cys Ala Asp Gly Asn Ser Gly Gly Thr 165 170 175 • · · . * Thr Asp Ser Asn Leu Gin Thr Thr Gly Asn Asp Cys Ile Ser Vai Ala *** 180 185 190 » · · ♦ ·*** Cys Thr Thr Ala Thr Asn Ala Asp Pro Asn Ala Thr Leu Cys Cys Asn i 195 200 205 • · ’·*·*. Asp cyS Asn ne ser Asn Cys Asn Cys Ala Thr Thr Gin Gly Vai Cys : * 210 215 220 • * j ♦ » ·** * Asn Met Vai Thr Asp Cys Thr Gin Thr Gly Vai Pro Ile Asp Cys Vai .*·.*. 225 230 235 240 • · *

Gly Cys Gin Ser His Cys Asn Ser Gly Ser Pro Thr Asn Ser Asn Cys 245 250 255 • * · *·ϊ·* Thr Thr Thr Leu Gin Asn Cys Ala Ala Leu Gly Vai Asp Vai Ala Ile .**.·. 260 265 270 « · * t Thr Ser Leu Asp Ile Gin Gly Ala Ser Pro Thr Thr Cys Ala Asn Vai ·:*·; -275 280 285 {***· Vai Asn Asp Cys Leu Ala Vai Ser Thr Cys Leu Gly Ile Thr Vai Cye ··* 290 295 300 a · : ·.. , a • ...

• · * · · • · 92 118009

Gly Vai Thr Asp Thr Asp Ser Cys Thr Ser Asp Gin Thr Pro Leu Leu 305 310 31S 320

Cys Asp Gly Asn Gly Asn Thr Thr Ala Ala Cys Ser Ala Val Leu Asn 325 330 335

Ala Leu Asn Gly Gly Gly Thr Ser Ser Pro Pro Pro Ala Ser Asp Ala 340 345 350

Gly Thr lie Thr Gly Val Gly Ser Gly Thr Cys Leu Asp Val Pro Asn 355 360 365

Ala Ser Thr Ser Asp Gly Val Gin Leu Gin Leu Cys Asp Cys His Gly 370 375 380

Gly Thr Asn Gin Gin Cys Thr Cys Thr Asp Ser Gin Ser Leu Thr Val 385 390 395 400

Cys Gly Asn Thr Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Gly Asn Gly Thr Thr 405 410 415

Val Gin lie * · ··* • * * * · · · • · • · a · «· · · : * : ♦ · * · · • » ♦ · *·· • · · • · t • · · ♦ ·· * * ♦ ♦ * · * ···«« • · ···, t : a · * «· ·*·>· • * f ' ; ‘ . i .·

Claims (13)

118009

1. Menetelmä kasvibiomassan kemialliseksi käsittelemiseksi, t u n n e 11 u siitä, että mainittu kemiallinen käsittely on entsyymiavusteinen valkaisu, jossa mainittu biomassa saatetaan kosketukseen Actinomadura sp. FC7:n XYL I ja/tai XYL II ksylanaasin kanssa yli 50°C:n lämpötilassa ja pH-arvossa alle 6,0.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH-arvo on välillä 4,0 - 6,0.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH-arvo on 4,0.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on 50 - 80 °C.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötila on 70 °C.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ksylanaasi on Actinomadura sp. FC7:n XYL II, jota koodaa 1/«// nukleotidisekvenssi SEK.V. ID NO.l.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ksylanaasi on Actinomadura sp. FC7:n XYL II, jolla on aminohapposekvenssi SEK.V. ID N0.2.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ί·».# ksylanaasi on Actinomadura sp. FC7:n XYL I, jota koodaa DNA-sekvenssi, joka *···1 on talletettuna pJFl-plasmidissatalletusnumero ATCC 69670. * ♦ · «

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e 11 u siitä, että mainittu *·“1 ksylanaasi on Actinomadura sp. FC7:n XYL II, jota koodaa DNA-sekvenssi, joka : on talletettuna pJF6-plasmidissa talletusnumero ATCC 69671. • 1

« · · :·· : 10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu • « · ίφί I ksylanaasi on tuotettu rekombinantti-isännässä, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukaisella DNA-sekvenssillä. • Φ ·1···.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu .1·1. ksylanaasi on puhdistettu Actinomadura sp. FC7:n XYL I. * 1 1

·;··· 12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e 11 u siitä, että mainittu ... ksylanaasi on puhdistettu Actinomadura sp, FC7:n XYL II. * · * 1 1 * * · • · · • 1 · Mf · I · • · · • ·· * · 118009

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e 11 u siitä, että mainittu ksylanaasi on ravintoalusta, joka sisältää patenttivaatimuksen 10 mukaisesta rekombinantti-isännästä eritettyjä XYL Ija/tai XYLII entsyymejä. #·· • · • f • · · • · · « · « « • 1 · ·«· ·♦· • 1 · • 1 · • · • · • · • · 1 • · 1 ... • 1 · · * 1 1 * · · • 1 · * · f ·· !1· • · * 1 • · · * • · • · 1 • · • · * · 1 « · ··· • · · · j • · · • · · • · ' . 9b 118009