MX2010003600A

MX2010003600A - Xilanasas, acidos nucleicos que las codifican, y metodos para hacerlas y usarlas.

Info

Publication number: MX2010003600A
Application number: MX2010003600A
Authority: MX
Inventors: Kevin A Gray; Reinhard Dirmeier
Original assignee: Verenium Corp
Priority date: 2007-10-03
Filing date: 2008-08-01
Publication date: 2010-12-14
Also published as: NZ584967A; US20110016545A1; EP2205744B1; US8486680B2; BRPI0817811A2; CN101952437B; CN103757036A; US20140298499A1; EP2205744A2; CN101952437A; JP6484266B2; EP2708602B1; AU2008307371B2; DK2708602T3; WO2009045627A3; EP2708602A3; JP5744518B2; US20180334659A1; JP2017148044A; CN110577945A

Abstract

La invención se refiere a xilanasas y a polinucleótidos que codifican las xilanasas. En adición, también se proveen métodos de diseñar nuevas xilanasas y métodos de uso de las mismas. Las xilanasas tienen actividad y estabilidad incrementadas a valores pH y temperatura incrementados.

Description

XILANASAS , ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN, Y MÉTODOS PARA HACERLAS Y USARLAS Esta invención se refiere generalmente a enzimas, polinucleótidos que codifican las enzimas, el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, y mas específicamente a enzimas que tienen actividad de xilanasa, v.gr. , que catalizan la hidrólisis de eslabones ß-1 , 4 -xilosídicos o eslabones endo- -l,4-glucanasa .

Antecedentes Las xilanasas (por ejemplo, endo-1 , 4- ß -xilanasa, EC 3.2.1.8) hidrolizan los enlaces ß-1, 4 -xilosídicos internos del xilano para producir xilosa y xilo-oligómeros de más pequeño peso molecular. Los xilanos son polisacáridos formados a partir de las D-xilopiranosas enlazadas con 1, 4^-glicósido. Las xilanasas son de un valor comercial considerable, utilizándose en la industria de alimentos/ para hornear y para el procesamiento de frutas y verduras, para la descomposición de los desechos agrícolas, en la fabricación de alimento para animales, y en la producción de pulpa y papel. Las xilanasas son formadas por hongos y bacterias.

Las arabinoxilanasas son polisacáridos mayores de los cereales, que no son almidón, que representan del 2.5 al 7.1 por ciento en peso/peso, dependiendo de la variedad y de las condiciones de cultivo. Las propiedades fisicoquímicas de este polisacárido son tales que da lugar a soluciones viscosas o inclusive geles bajo condiciones oxidativas. En adición, los arabinoxilanos tienen una alta capacidad de enlace con agua, y pueden tener un papel en la estabilidad de la espuma de proteína.

Todas estas características presentan problemas para varias industrias, incluyendo la fabricación de cerveza, la repostería, la nutrición de animales, y la fabricación de papel. En las aplicaciones de fabricación de cerveza, la presencia de xilanp da como resultado cuestiones de filtrabilidad del mosto y formación de nebulosidad. En las aplicaciones de repostería (en especial para bizcochos y galletas) , estos arabinoxilanos crean masas pegajosas que son difíciles de maquilar y reducir al tamaño de bizcocho. En adición, este carbohidrato está implicado en la rápida rehidratación del producto horneado, dando como resultado pérdida de consistencia tostada y una vida de anaquel reducida. Para las aplicaciones de alimentos para animales monogástricos con dietas de cereales, el arabinoxilano es un importante factor contribuyente a la viscosidad del contenido del intestino, y de esta manera, afecta adversamente la digestibilidad del alimento y el índice de crecimiento del animal. Para los animales rumiantes, estos polisacáridos representan componentes sustanciales de ingestión de fibra, y la digestión más completa de los arabinoxilanos facilitaría la obtención de más altas eficiencias de conversión del alimento.

Las xilanasas se utilizan actualmente como aditivos (acondicionadores de masa) en el procesamiento de masa para la hidrólisis del arabinoxilano soluble en agua. En las aplicaciones de horneo (en especial para bizcochos y galletas) , el arabinoxilano crea masas pegajosas que son difíciles de maquilar y reducir al tamaño del bizcocho. En adición, este carbohidrato está implicado en la rápida rehidratación del producto horneado, dando como resultado pérdida de consistencia tostada y una vida de anaquel reducida.

La mejora de la digestión del xilano en el alimento para animales puede mejorar la disponibilidad y digestibilidad de los valiosos nutrientes de carbohidratos y proteínas del alimento. Para las aplicaciones de alimentos para animales monogástricos con dietas de cereales, el arabinoxilano es un importante factor contribuyente a la viscosidad del contenido del intestino, y de esta manera, afecta adversamente la digestibilidad del alimento y el índice de crecimiento del animal . Para los animales rumiantes, estos polisacáridos representan componentes sustanciales de ingestión de fibra, y la digestión más completa de los arabinoxilanos facilitaría la obtención de más altas eficiencias de conversión del alimento. Es deseable que las xilanasas de alimentos para animales sean activas en el estómago del animal. Esto requiere que la enzima del alimento tenga una alta actividad a 37°C y a un bajo pH para los monogástricos (pH de 2 a 4) , y a un pH casi neutro para los rumiantes (pH de 6.5 a 7) . La enzima también debe poseer resistencia a las xilanasas del intestino del animal y estabilidad a las más altas temperaturas involucradas en la granulación del alimento. Como tales, existe una necesidad en la materia de los aditivos de alimentos de xilanasa para alimento de monogástricos con una alta actividad específica, actividad a 35-40°C y pH de 2 a 4, una vida media mayor a 30 minutos en SGF, y una vida media >5 minutos a 85°C en el estado formulado. Para el alimento para rumiantes, existe una necesidad de aditivos de alimentos de xilanasa que tengan una alta actividad específica, una actividad a 35-40°C y pH de 6.5 a 7.0, una vida media mayor a 30 minutos en SRF, y estabilidad como un polvo seco concentrado.

Las xilanasas también se utilizan en un número de otras aplicaciones. Por ejemplo, las xilanasas se utilizan para mejorar la calidad y cantidad de producción de proteína de leche en las vacas lactantes (ver, por ejemplo, Kung, L., y colaboradores, J . Dairy Science, enero de 2000 83: 115-122), para aumentar la cantidad de sacáridos solubles en el estómago y en el intestino delgado de cerdos (ver, por ejemplo, van der Meulen, J. y colaboradores, Arch. Tierernahr, 2001 54: 101-115), para mejorar la eficiencia de producción de huevo tardía y los rendimientos de huevo en las gallinas (ver, por ejemplo, Jaroni, D. y colaboradores, Poult. Sci., junio de 1999 78: 841-847). Adicionalmente , se ha demostrado que las xilanasas son útiles en el bio-blanqueo y en el tratamiento de pulpas químicas (ver, por e emplo, i la patente US 5,202,249) , en el bio-blanqueo y tratamiento de pulpas de madera o papel (ver, por ejemplo, las patentes US 5,179,021; 5,116,746; 5,407,827; 5,405,769; 5,395,765; 5,369,024; 5,457,045; 5,434,071; 5,498,534; 5,591,304; 5,645,686; 5,725,732; 5,759,840; 5,834,301; 5,871,730, y 6,057,438), para reducir la lignina en la madera y para modificar la madera (ver, por ejemplo, las patentes US 5,486,468 y 5,770,012), como mej oradoras de harina, masa y pan (ver, por ejemplo, las patentes US 5,108,765 y 5,306,633), como aditivos de alimentos y/o complementos, como se señaló anteriormente (ver, por ejemplo, las patentes US 5,432,074; 5,429,828; 5,612,055; 5,720,971; 5,981,233; 5,948,667; 6,099,844; 6,132,727, y 6,132,716), en la fabricación de soluciones de celulosa (ver, por ejemplo, la patente US 5,760,211). Las composiciones detergentes que tienen actividad de xilanasa se utilizan para fruta, verduras, y/o fango y compuestos de arcilla (ver, por ejemplo, la patente US 5,786,316).

Las xilanasas también son útiles en un método de uso y composición de una carbohidrasa y/o una xilanasa para la fabricación de un agente para el tratamiento y/o la profilaxis de coccidiosis. El agente manufacturado puede estar en la forma de un alimento para animales basado en cereal (ver, por ejemplo, la patente US 5,624,678) . Los usos adicionales para las xilanasas incluyen el uso en la producción de fibra dietética soluble en agua (ver, por ejemplo, la patente US 5,622,738), para mejorar la filtrabilidad, separación y producción de almidón (ver, por ejemplo, las patentes US 4,960,705 y 5,023,176), en la industria de bebidas, para mejorar la filtrabilidad del mosto o cerveza (ver, por ejemplo, la patente US 4,746,517), en una composición enzimática para promover la secreción de leche del ganado y para mejorar la calidad de la leche (ver, por ejemplo, la patente US 4,144,354), para reducir la viscosidad del material de plantas (ver, por ejemplo, la patente US 5,874,274), para aumentar la viscosidad o la resistencia de gel de productos alimenticios tales como confitura, mermelada, jalea, jugo, pasta, sopa, salsa, etc. (ver, por ejemplo, la patente US 6,036,981). Las xilanasas también se pueden utilizar en la hidrólisis de hemi-celulosa para la cual son selectivas, en particular en la presencia de celulosa. Adicionalmente, el retentado rico en celulasa es adecuado para la hidrólisis de celulosa (ver, por ejemplo, la patente US 4,725,544).

Varios usos de las xilanasas incluyen la producción de etanol (ver, por ejemplo, las publicaciones internacionales O 00/43496 y WO 81/00857) , en la transformación de un microbio que produce etanol (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 99/46362) , en la producción de taninos enológicos y composiciones enzimáticas (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 01/64830) , para estimular las defensas naturales de las plantas (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 01/30161) , en la producción de azúcares a partir de sustratos de hemi-celulosa (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 92/03541) ,; en la limpieza de fruta, verduras, fango o suelos que contengan arcilla (ver, por ejemplo, la publicación internacional O 96/13568) , en la limpieza de membranas de filtración de cerveza (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 96/23579) , en un método para aniquilar o inhibir las células microbianas (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 97/32480) , y en la determinación de las características de aguas de proceso a partir del blanqueo de pulpa de madera, mediante la utilización de las proporciones de dos mediciones de absorción ultravioleta, y la comparación de los espectros (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO 98/40721) .

Con respecto a las xilanasas utilizadas en la industria de papel y pulpa, las xilanasas se han aislado a partir de muchas fuentes. En particular, ver las patentes US 6,083,733 y 6,140,095 y 6,346,407. En particular, se observa que la patente US 6,140,095 se refiere a las xilanasas tolerantes de álcali. Sin embargo, se observa que permanece una necesidad en el campo de las xilanasas para utilizarse en la industria de papel y pulpa, en donde la enzima sea activa en el intervalo de temperatura de 65°C a 75°C y a un pH de aproximadamente 10. Adicionalmente, una enzima de la invención útil en la industria de papel y pulpa reduciría la necesidad de productos químicos de blanqueo, tales como dióxido de cloro.

Las publicaciones descritas en la presente se proporcionan exclusivamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo contenido en la presente deberá interpretarse como una admisión de que la invención no tenga derecho a una fecha anterior a dicha divulgación en virtud de la invención anterior.

Compendio de la Invención La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 por ciento, 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento, 61 por ciento, 62 por ciento , 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento, 81 por ciento, 82 ¡por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento , 97 por ciento, 98 'por ciento, 99 por ciento, o más , o completa (100 por ciento) , con un ácido nucleico de ejemplo de la invención, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID N0:| 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, , SEQ ID NO : 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: : 105, SEQ ID NO : 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: : 113, SEQ ID NO : 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: : 121, SEQ ID NO : 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: : 129, SEQ ID NO : 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: : 137, SEQ ID NO : 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: : 145, SEQ ID NO : 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: : 153, SEQ ID NO : 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO : 199, SEQ ID NO: : 161, SEQ ID NO : 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: : 169, SEQ ID NO : 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: : 177, SEQ ID NO : 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183 , SEQ ID NO: : 185, SEQ ID NO : 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: : 193 , SEQ ID NO : 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: : 201, SEQ ID NO : 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ NO: 213, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO:: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: : 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: : 253, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: : 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: : 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO; : 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: : 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: : 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297 , SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: : 301, SEQ ID NO: 303 , SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: : 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: : 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: : 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: : 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO; : 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: : 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: : 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: : 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: ; 373 , SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379, sobre una región de <cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, o más residuos, que codifica cuando menos un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, y las identidades de secuencias se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante una inspección visual.

Los ácidos nucleicos de ejemplo de la invención también incluyen ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican un polipéptido que tiene una secuencia como se estipula en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID ¡NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SÉQ: ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122 , SEQ ID NO: 124 , SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, :SEQ I ID NO: 160 SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 166, ID NO: 168 SEQ ID NO: 170 SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 174, ID NO: 176 SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO: 182, ID NO: 184 SEQ ID NO: 186 SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO: 190, ID NO: 192 SEQ ID NO: 194 SEQ ID NO: 196 SEQ ID NO: 198, ID NO: 200 SEQ ID NO: 202 SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO: 206, ID NO: 208 SEQ ID NO: 210 SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 214, ID NO: 216 SEQ ID NO: 218 SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 222, ID NO: 224 SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 230, ID NO: 232 SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 238, ID NO: 240 SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 246, ID NO: 248 SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 254, ID NO: 256 SEQ ID NO: 258 SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 262, ID NO: 264 SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 270, ID NO: 272 SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO: 278, ID NO: 280 SEQ ID NO: 282 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 286, ID NO: 288 SEQ ID NO: 290 SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 294 ID NO: 296 SEQ ID NO: 298 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO: 302, ID NO: 304 SEQ ID NO: 306 SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO: 310, ID NO: 312 SEQ ID NO: 314 SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 318, ID NO: 320 SEQ ID NO: 322 SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO: 326, ID NO: 328 SEQ ID NO: 330 SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO: 334, ID NO: 336 SEQ ID NO: 338 SEQ ID NO: 340 SEQ ID NO: 342, ID NO: 344 SEQ ID NO: 346 SEQ ID NO: 348 SEQ ID NO: 350, ID NO: 352 SEQ ID NO: 354 SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO: 358, ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378 o SEQ ID NO: 380, y sub-secuencias de las mismas y variantes de las mismas. En un aspecto, el polipép-tido tiene una actividad de xilanasa.

En un aspecto, la invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican xilanasa, con una novedad común, en que se derivan de cultivos mixtos . La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican xilanasa aislados a partir de cultivos mixtos, los cuales comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, i 56 por ciento, 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento , 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento, 81 por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento , 99 por ciento, o más , o completa (100 por ciento) , con un ácido nucleico de ejemplo de la invención, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO : 85, SEQ ID NO: 87, SEQ IDi NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ : ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: : 109, SEQ ID NO : 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: ; 117, SEQ ID NO; : 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: : 125, SEQ ID NO : 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: : 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: ; 141, SEQ ID NO : 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: : 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: : 157, SEQ ID NO : 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID ÑO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: : 167 , SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: : 173, SEQ ID NO : 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: : 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: ; 189, SEQ ID NO : 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: : 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID ÑO: 203, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO 213 , SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 , SEQ ID NO 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO 253 , SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273 , SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO. 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363 , SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 O SEQ ID NO: 379, sobre una región de cuando menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, o más .

En un aspecto, la invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican xilanasa, con una novedad común, en que se derivan a partir de una fuente medio-ambiental, por ejemplo fuentes medio-ambientales mixtas, una fuente bacteriana y/o una fuente arqueal, ver la Tabla 3 más adelante. En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican xilanasa aislados a partir de una fuente medio-ambiental, por ejemplo una fuente medio-ambiental mixta, una fuente bacteriana y/o una fuente arqueal, los cuales comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 ;por ciento, 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento, 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento , 79 por ciento, 80 por ciento, 81 por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento , 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, o más, o completa (100 por ciento) , con un ácido nucleico de ejemplo de la invención sobre una región de cuando menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 o más residuos, en donde el ácido nucleico codifica cuando menos un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, y las identidades de secuencias se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante una inspección visual.

En un aspecto, la invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican xilanasa, con una novedad común, en que se derivan a partir de una familia de glicosidasa común, por ejemplo la familia 5, 6, 8, 10, 11, 26 o 30, como se estipula en la Tabla 5 más adelante.

En un aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2, en donde se establece una posición de filtración en blastall -p blastp -d "nr pataa" -FF, y todas las demás opciones se establecen como están por omisión. i Otro aspecto de la invención es un ácido nucleico i aislado o recombinante que incluye cuando menos 10 bases i consecutivas de una secuencia de ácido nucleico de la invención, secuencias sustancialmente idénticas a la misma, y las secuencias complementarias para la misma. : En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de los enlaces ß-1 , 4 -xilosídipos internos. En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende una actividad de endo-1, 4 - ß-xilanasa .

En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende hidrolizar un xilano para producir una xilosa y un xilo-oligómero de más pequeño peso molecular. En un aspecto, el xilano comprende un arabinoxilano, tal como un arabinoxilano soluble en agua. El arabinoxilano soluble en agua puede comprender un producto de masa o de pan. > En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende hidrolizar polisacáridos que comprenden D-xilopiranosas enlazadas por l,4- -glicósido. En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende hidrolizar hemi-celulosas . En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende hidrolizar hemi-celulosas en una pulpa de madera o papel, o en un producto de papel. En un aspecto, la invención proporciona métodos para reducir la lignina en madera o en un producto de madera, los cuales comprenden poner en contacto la madera o el producto de madera con un polipéptidó de la invención.

En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de xilanos en una bebida o en un alimento, o e'n un producto alimenticio. El alimento o el producto alimenticio puede comprender un alimento para animales basado en cereal, un mosto o una cerveza, leche o un producto de leche, una fruta o una verdura. En un aspecto, la invención proporciona una comida, alimento, o bebida, o un precursor de bebida, que comprende un polipéptidó de la invención. La comida puede ser una masa o un producto de pan. La bebida o el precursor de bebida puede ser una cerveza o un mosto.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para acondicionar masa, los cuales comprenden poner en contacto una masa o un producto de pan con cuando menos un polipéptido dé la invención bajo condiciones suficientes para acondicionar la masa. En un aspecto, la invención proporciona métodos de producción de bebidas, los cuales comprenden la administración de cuando menos un polipéptido de la invención a una bebida o a un precursor de bebida, bajo condiciones suficientes para reducir la viscosidad de la bebida.

En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de xilanos en una célula, por ejemplo en una célula de planta o en una célula microbiana.

En un aspecto, el ácido nucleico aislado o recombinante codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa que es termo-estable. El polipéptido puede retener una actividad de xilanasa bajo condiciones que comprendan una escala de temperatura de entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 95°C; entre aproximadamente 55°C y aproximadamente 85°C, entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 95°C, o entre aproximadamente 90°C y aproximadamente 95°C.

En otro aspecto, el ácido nucleico aislado o recombinante codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa que es termo-tolerante. El polipéptido puede retener una actividad de xilanasa después de exponerse a una temperatura, en el intervalo desde más de 37°C hasta aproximadamente 95°C, o en cualquier parte en el intervalo desde más de 55°C hasta aproximadamente 85°C. El polipéptido puede retener una actividad de xilanasa después de exponerse a una temperatura en el intervalo de entre aproximadamente 1°C y aproximadamente 5°C, entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 15°C, entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 25°C, entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 37°C, entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 95°C, entre aproximadamente 55°C y aproximadamente 85°C, entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 75°C, o entre aproximadamente 90°C y aproximadamente 95°C, o más. En un aspecto, el polipéptido retiene una actividad de xilanasa después de exponerse a una temperatura en el intervalo desde más de 90°C hasta aproximadamente 95 °C a un pH de 4.5.

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia que se híbrida bajo condiciones restringentes a un ácido nucleico que comprende una secuencia de la invención, por ejemplo una secuencia como se estipula en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO : 23,; SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ. ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO : 97, SEQ IE NO 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO : 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO : 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123 , SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO : 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO : 143 , SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO : 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO : 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO : 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO : 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO : 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO : 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ, ID NO: 197, SEQ ID NO 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ, ID NO: 205, SEQ ID NO : 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213 , SEQ ID NO 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO : 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO 231, SEQ ID NO: 233 , SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO : 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 , SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID.

NO: 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID ? NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353 , SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ: ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ IEi NO : 375, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379, O fragmentos o sub-secuencias de las mismas . En un aspecto, el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa. El ácido nucleico puede ser de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 o más residuos de longitud, o de la longitud completa del gen o de la transcripción. En un aspecto, las condiciones restringentes incluyen un paso de lavado que comprende un lavado en SSC 0.2X a una temperatura de aproximadamente 65°C durante aproximadamente 15 minutos .

La invención proporciona una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, en donde la sonda comprende cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia de la invención, o fragmentos o sub-secuencias de la misma, en donde la sonda identifica el ácido nucleico mediante enlace o hibridación. La sonda puede comprender un oligonucleóti-do que comprenda cuando menos de aproximadamente 10 a 50, de aproximadamente 20 a 60, de aproximadamente 30 a 70, de aproximadamente 40 a 80, o de aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia que comprenda una secuencia de la invención, o fragmentos o sub-secuencias de la misma.

La invención proporciona una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de xilanasa, en donde la sonda comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más residuos, que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, 51 por ciento, 5 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 por ciento, 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento, 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento, 81 por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, o más, o completa (100 por ciento) , con un ácido nucleico de la invención, en donde las identidades de secuencias1 se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de i secuencias o mediante inspección visual. , La sonda puede comprender un oligonucleótido ' que comprende cuando menos de aproximadamente 10 a 50, de aproximada-mente 20 a 60, de aproximadamente 30 a 70, de aproximadamente 40 a 80, o de aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de i una secuencia de ácido nucleico de la invención, o una sub-secueñcia de la misma.

La invención proporciona un par de cebadores de amplificación, para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, en donde par de cebadores es capaz de amplificar un ácido nucleico que comprenda una secuencia de la invención, o fragmentos o sub-secuencias de la misma. Uno o cada miembro del par de secuencias cebadoras de amplificación, puede comprender un oligonucleótido que comprenda cuando menos de aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia, o aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 O más bases consecutivas de la secuencia.

La invención proporciona pares de cebadores de amplificación, en donde el par de cebadores comprende un primer miembro que tiene una secuencia como se estipula por aproximadamente los primeros (los 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más residuos de un ácido nucleico de la invención, y un segundo miembro que tiene una secuencia como se estipula por aproximadamente los primeros (los 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más residuos de la cadena complementaria del primer miembro .

La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican xilanasa generados mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , utilizando un par de cebadores de amplificación de la invención. La invención proporciona xilanasas generadas mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , utilizando un primer par de cebadores de amplificación de la invención. La invención proporciona métodos para hacer una xilanasa mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , utilizando un primer par de cebadores de amplificación de la invención. En un aspecto, el par de cebadores de amplificación amplifica un ácido nucleico a partir de una biblioteca, por ejemplo una biblioteca genética, tal como una biblioteca medioambiental .

La invención proporciona métodos para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, los cuales comprenden la amplificación de un ácido nucleico de plantilla con un par de secuencias cebadoras de amplificación capaz de amplificar una secuencia de ácido nucleico de la invención, o fragmentos o sub-secuencias de la misma.

La invención proporciona casetes de expresión que comprenden un ácido nucleico de la invención o una sub-secuencia del mismo. En un aspecto, el cásete de expresión puede comprender el ácido nucleico que se enlaza operativamente con un promotor. El promotor puede ser un promotor viral, bacteriano, de mamífero, o de planta. En un aspecto, el promotor de planta puede ser un promotor de papa, arroz, maíz, trigo, tabaco, o cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. En otro aspecto, el promotor puede ser un promotor inducible. En un aspecto, el promotor puede ser un promotor específico de tejido o un promotor regulado por el medio ambiente o regulado por el desarrollo. Por consiguiente, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor específico de semillas, específico de hojas, específico de la raíz, específico del tallo, o inducido por abscisión. En un aspecto, el cásete de expresión puede comprender además un vector de expresión de planta o de virus de planta.

La invención proporciona vehículos de clonación que comprenden un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención, o un ácido nucleico de la invención. El vehículo de clonación puede ser un vector viral, un plásmido, un fago, un fagémido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago, o un cromosoma artificial. El vector viral puede comprender un vector de adenovirus, un vector retroviral, o un vector viral adeno-asociado. El vehículo de clonación puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC) , un plásmido, un vector derivado del bacteriófago Pl (PAC) , un cromosoma artificial de levadura (YAC) , o un cromosoma artificial de mamífero (MAC) .

La invención proporciona una célula transformada 1 que comprende un ácido nucleico de la invención y un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención, o un vehículo de clonación de la invención. En un aspecto, la célula transformada puede ser una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fungal, una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de planta. En un aspecto, la célula de planta puede ser una célula de cereal, papa, trigo, arroz, maíz, tabaco, o cebada .

La invención proporciona animales transgénicos no humanos que comprenden un ácido nucleico de la invención o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. En un aspecto, el animal es un ratón.

La invención proporciona plantas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la invención o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. La planta transgénica puede ser una planta de cereal, una planta de maíz, una planta de papa, una planta de jitomate, una planta de trigo, una planta de semilla de aceite, una planta de semilla de colza, una planta de semilla de soya, una planta de arroz, una planta de cebada, o una planta de tabaco.

La invención proporciona semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico de la invención o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. La semilla transgénica puede ser una semilla de planta de cereal, una semilla de maíz, un grano de trigo, una semilla de aceite, una semilla de colza, una semilla de soya, un grano de palmera, una semilla de girasol, una semilla de ajonjolí, una semilla de cacahuate o de planta de tabaco .

La invención proporciona un oligonucleótido ariti-sentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria para, o capaz de hibridarse bajo condiciones restringentes a, un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para inhibir la traducción de un mensaje de xilanasa en una célula, los cuales comprenden administrar a la célula, o expresar en la célula, un oligonucleótido anti- sentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria para, o capaz de hibridarse bajo condiciones restringentes a, un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, el oligonucleótido antisentido es de entre aproximadamente 10 y 50, entre aproximadamente 20 y 60, entre aproximadamente 30 y 70, entre aproximadamente 40 y 80, o entre aproximadamente 60 y 100 bases de longitud.

La invención proporciona métodos para inhibir la traducción de un mensaje de xilanasa en una célula, los cuales comprenden administrar a la célula, o expresar en la célula, un oligonucleótido anti-sentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria para, o capaz de hibridarse bajo condiciones restringentes a, un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona moléculas de ARN inhibidoras (ARNi) de doble cadena que comprenden una sub-secuencia de una secuencia de la invención. En un aspecto, el ARNi es de aproximadamente115, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos dúplex de longitud. La invención proporciona métodos para inhibir la expresión de una xilanasa en una célula, los cuales comprenden administrar a la célula, o expresar en la célula, un ARN inhibidor (ARNi) de doble cadena, en donde el ARN comprende una sub-secuencia de una secuencia de la invención.

La invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 por ciento 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento , 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento, 81 por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento , 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento , o más, o completa (100 por ciento) , con un polipéptido o péptido de ejemplo de la invención, sobre una región de cuando menos aproximadamente 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o más residuos, o sobre la longitud completa del polipéptido, y las identidades de secuencias se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias, o mediante inspección visual. Las secuencias de polipéptidos o de péptidos de ejemplo de la invención incluyen las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO : 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100 , SEQ ID NO 102, SEQ ID NO : 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108 , SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116 , SEQ ID NO 118, SEQ ID NO 120, SEQ ID NO: 122 , SEQ ID NO: 124 , SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO . 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132 ; SEQ ID NO 134; SEQ ID NO 136; SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 140 ; SEQ ID NO: 142; SEQ ID NO 144 ; SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148 , SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156 , SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO : 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164 , SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172 , SEQ ID NO174, SEQ ID NO : 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180 , SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188 , SEQ ID NO 190, SEQ ID NO : 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196 , SEQ ID NO: 198 , SEQ ID NO 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204 , SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212 , SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220 , SEQ ID NO. 222, SEQ ID NO 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 , SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 246 SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 254 SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258 SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 262 SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 270 SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290 SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 294 SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 298 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO: 302 SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306 SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO: 310 SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314 SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 318 SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322 SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO: 326 SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330 SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO: 334 SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338 SEQ ID NO: 340 SEQ ID NO: 342 SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346 SEQ ID NO: 348 SEQ ID NO: 350 SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354 SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO: 358 SEQ ID NO : 360, SEQ ID NO: 362 SEQ ID NO: 364 SEQ ID NO: 366 SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370 SEQ ID NO : 372 SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378 o SEQ ID NO: 380 y sub-secuencias de las mismas y variantes de las mismas. Los polipéptidos de ejemplo también incluyen fragmentos de cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 O más residuos de longitud, o sobre la longitud completa de una enzima. Las secuencias de polipéptidos o de péptidos de ejemplo de la invención incluyen la secuencia codificada por un ácido nucleico de la invención. Las secuencias de polipéptidos o de péptidos de ejemplo de la invención incluyen los polipéptidos o péptidos específicamente enlazados por un anticuerpo de la invención. En un aspecto, un polipéptido de la invención tiene cuando menos una actividad de xilanasa.

Otro aspecto de la invención proporciona un polipéptido o péptido aislado o recombinante que incluye cuando menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más bases consecutivas de una secuencia de polipéptido o péptido de la invención, secuencias sustancialmente idénticas a al misma, y las secuencias complementarias para la misma. El péptido puede ser, por ejemplo, un fragmento inmunogénico, un motivo (por ejemplo, un sitio de enlace) , una secuencia se señal, una secuencia prepro, o un sitio activo.

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa y una secuencia de señal, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de la invención. La secuencia de señal se puede derivar a partir de otra xilanasa o de una enzima que no sea xilanasa (heteróloga) . La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, en donde la secuencia no contiene una secuencia de señal, y el ácido nucleico comprende una secuencia de la invención.

En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de los enlaces ß-1 , 4 -xilosidicos internos. En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende una actividad de endo-1, 4-beta-xilanasa. En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende hidrolizar un xilano para producir una xilosa y un xilo-oligómero de más pequeño peso molecular. En un aspecto, el xilano comprende un arabinoxilano, tal como un arabinoxilano soluble en agua. El arabinoxilano soluble en agua puede comprender una masa o un producto de pan.

En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende hidrolizar polisacáridos que comprenden D-xilopiranosas enlazadas por 1, 4- -glicósido. En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende hidrolizar hemi-celulosas . En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende hidrolizar hemi-celulosas en madera o en pulpa de papel o en un producto de papel.

En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de xilanos en un alimento o e un producto alimenticio. El alimento o producto alimenticio puede comprender un alimento para animales basado en cereal, un mosto o una cerveza, leche o un producto de leche, una fruta o una verdura .

En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de xilanos en una célula, por ejemplo una célula de planta o una célula microbiana.

En un aspecto, la actividad de xilanasa es termo- estable. El polipéptido puede retener una actividad de xilanasa bajo condiciones que comprenden un intervalo de temperatura de entre aproximadamente 1°C y aproximadamente 5°C, entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 15°C, entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 25°C, entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 37°C, entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 95°C, entre aproximadamente 55°C y aproximadamente 85°C, entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 75°C, o entre aproximadamente 90°C y aproximadamente 95 °C, o más. En otro aspecto, la actividad de xilanasa puede ser termo-tolerante . El polipéptido puede retener una actividad de xilanasa después de exponerse a una temperatura en el intervalo desde más de 37°C hasta aproximadamente 95°C, o en el intervalo desde más de 55°C hasta aproximadamente 85°C. En un aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de xilanasa después de exponerse a una temperatura en el intervalo desde más de 90°C hasta aproximadamente 95°C a un pH de 4.51 En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinánte puede comprender al polipéptido de la invención, que carezca de una secuencia de señal. En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinánte puede comprender al polipéptido de la invención,' que comprenda una secuencia de señal heteróloga, tal como , una secuencia de señal heteróloga de xilanasa o que no sea de xilanasa .

En un aspecto, la invención proporciona proteínas quiméricas que comprenden un primer dominio que comprende una secuencia de señal de la invención y cuando menos un segundo dominio. La proteína puede ser una proteína de fusión. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser una xilanasa. 1 La invención proporciona polipéptidos quiméricos < que comprenden cuando menos un primer dominio que comprende un péptido de señal (SP) , una secuencia prepro, y/o un dominio catalítico (CD) de la invención, y cuando menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, en donde el polipéptido o péptido heterólogo no está naturalmente asociado con el péptido de señal (SP) , la secuencia prepro, : y/o el dominio catalítico (CD) . En un aspecto, el polipéptido o péptido heterólogo no es una xilanasa. El polipéptido o péptido heterólogo puede ser amino-terminal para, carboxi-terminal para, o puede estar sobre ambos extremos de, el péptido de señal (SP) , la secuencia prepro, y/o el dominio catalítico (CD) . | La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican un polipéptido quimérico, en donde el polipéptido quimérico comprende cuando menos un primer dominio que comprende un péptido de señal (SP) , un dominio prepro,; y/o un dominio catalítico (CD) de la invención, y cuando menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, donde el polipéptido o péptido heterólogo no está naturalmente asociado con el péptido de señal (SP) , el dominio prepro, y/o el dominio catalítico (CD) . ! La invención proporciona secuencias de señal aisladas 0 recombinantes (por ejemplo, péptidos de señal) , que consisten en una secuencia como se estipula en los residuos 1 a 14 , 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, l a 18, 1 a 19, 1 a 20, l a 21, 1 a 22, l a 23, 1 a 24, 1 a 25, l a 26, 1 a 27, 1 a 28, l a 28, 1 a 30, l a 31, 1 a 32, 1 a 33, l a 34, 1 a 35, 1 a 36, l a 37, 1 a 38, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43 o 1 a 44, de un polipéptido de la invención, por ejemplo, las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90 , SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 154 , SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO: 158 SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 166 SEQ ID NO: 168 SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 174 SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO: 182 SEQ ID NO: 184 SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO: 190 SEQ ID NO: 192 SEQ ID NO: 194 , SEQ ID NO: 196 SEQ ID NO: 198 SEQ ID NO: 200 SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO: 206 SEQ ID NO: 208 SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 214 SEQ ID NO: 216 SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 222 SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 246 SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 254 SEQ ID NO: 256 SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 262 SEQ ID NO: 264 SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 270 SEQ ID NO: 272 SEQ ID NO: 274 , SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO: 280 SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO: 288 SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 294 SEQ ID NO: 296 SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO: 302 SEQ ID NO: 304 SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO: 310 SEQ ID NO: 312 SEQ ID NO: 314 , SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 318 SEQ ID NO: 320 SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO: 326 SEQ ID NO: 328 SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO: 334 SEQ ID NO: 336 SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340 SEQ ID NO: 342 SEQ ID NO: 344 SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378 O SEQ ID NO: 380.

En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende una actividad específica a aproximadamente 37°C, en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 1200 unidades por mg de proteína, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 unidades por mg de proteína. En otro aspecto, la actividad de xilanasa comprende una actividad específica de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 unidades por mg de proteína, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 750 unidades por mg de proteína. De una manera alternativa, la actividad de xilanasa comprende una actividad específica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 750 unidades por mg de proteína, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por mg de proteína. En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende una actividad específica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 unidades por mg de proteína, o de aproximadamente 750 a aproximadamente 1000 unidades por mg de proteína. En otro aspecto, la actividad de xilanasa comprende una actividad específica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 250 unidades por mg de proteína. De una manera alternativa, la actividad de xilanasa comprende una actividad específica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 unidades por mg de proteína. En otro aspecto, la termo-tolerancia comprende la retención de cuando menos la mitad de la actividad de la xilanasa a 37 °C después de haberse calentado a la temperatura elevada. Alternativamente, la termo- tolerancia puede comprender una retención de la actividad específica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 1200 unidades por mg de proteína, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 unidades por mg de proteína, después de haberse calentado a la temperatura elevada. En otro aspecto, la termo- tolerancia puede comprender la retención de la actividad específica a 37°C en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 unidades por mg de proteína después de haberse calentado a la temperatura elevada.

La invención proporciona el polipéptido aislado o recombinante de la invención, donde el polipéptido comprende cuando menos un sitio de glicosilación . En un aspecto,, la glicosilación puede ser una glicosilación N-enlazada. En un aspecto, el polipéptido puede glicosilarse después de haberse expresado en P. pastoris o en S. poiribe .

En un aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de xilanasa bajo condiciones que comprendan aproximadamente un pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 o pH 4. En otro aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de xilanasa bajo condiciones que comprendan aproximadamente un pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5 o pH 11. En un aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de xilanasa después de exponerse a condiciones que comprendan aproximadamente un pH 6.5, pH 6, pH 5.5 , pH 5, pH 4.5 o pH 4. En otro aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de xilanasa después de exponerse a condiciones que comprendan aproximadamente un pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9 , pH 9.5 , pH 10, pH 10.5 o pH 11.

La invención proporciona preparaciones de proteína que comprenden un polipéptido de la invención, en donde la preparación de proteína comprende un líquido, un sólido, o un gel.

La invención proporciona heterodímeros que comprenden un polipéptido de la invención y una segunda proteína o dominio. El segundo miembro del heterodímero puede ser una fosfolipasa diferente, una enzima diferente, u otra proteína. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipéptido, y el heterodímero puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epítopo o una marca. En un aspecto, la invención proporciona homodímeros que comprenden un polipéptido de la invención.

La invención proporciona polipéptidos inmovilizados que tienen actividad de xilanasa, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de la invención, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o un polipéptido que comprende un polipéptido de la invención y un segundo dominio. En un aspecto, el polipéptido se puede inmovilizar sobre una célula, un metal, una resina, un polímero, una cerámica, un vidrio, un microelectrodo, una partícula grafitica, un granulo, un gel, una placa, una matriz, o un tubo capilar.

La invención proporciona matrices que comprenden un ácido nucleico inmovilizado de la invención. La invención proporciona matrices que comprenden un anti-cuerpo de, la invención.

I La invención proporciona anti-cuerpos aislados o recombinantes que se enlazan específicamente a un polipéptido de la invención, o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. El anti-cuerpo puede ser un anti-cuérpo monoclonal o policlonal . La invención proporciona hibridomaSj que comprenden un anti-cuerpo de la invención, por ejemplo un anticuerpo que se enlaza específicamente a un polipéptido de la invención, o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. ! La invención proporciona un método para aislar o identificar un polipéptido que tenga una actividad de xilanasa, el cual comprende los pasos de: (a) proporcionar un anticuerpo de la invención; (b) proporcionar una muestra que comprenda polipéptidos ; y (c) poner en contacto la muestra del paso (b) con el anti-cuerpo del paso (a) bajo condiciones en las que el anticuerpo pueda enlazarse específicamente con el polipéptido, aislando o identificando de esta manera un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa.

La invención proporciona métodos para hacer un anticuerpo anti-xilanasa, los cuales comprenden administrar a un animal no humano, un ácido nucleico de la invención o un polipéptido de la invención, o sub-secuencias de los mismos, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, haciendo de esta manera un anti-cuerpo anti-xilanasa. La invención proporciona métodos para hacer inmunidad anti-xilanasa, los cuales comprenden administrar a un animal no humano, un ácido nucleico de la invención o un polipéptido de la invención, o sub-secuencias de los mismos, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune.

La invención proporciona métodos para producir un polipéptido recombinante, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención operativamente enlazado con un promotor; y (b) expresar el ácido nucleico del paso (a) bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido, produciendo de esta manera un polipéptido recombinante:. En un aspecto, el método puede comprender además transformar una célula hospedera con el ácido nucleico del paso (a) , seguido por la expresión del ácido nucleico del paso (a) , produciendo de esta manera un polipéptido recombinante en una célula transformada.

La invención proporciona métodos para identificar un polipéptido que tenga una actividad de xilanasa, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato de xilanasa; y (c) poner en contacto el polipéptido o un fragmento o una variante del mismo del paso (a) con el sustrato del paso (b) , y detectar una reducción en la cantidad de sustrato, o un aumento en la cantidad de un producto de reacción, en donde una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reacción, detecta un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa.

La invención proporciona métodos para identificar un sustrato de xilanasa, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato de prueba; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el sustrato de prueba del paso (b) , y detectar una reducción en la cantidad de sustrato, o un aumento en la cantidad del producto de reacción, en donde una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reacción, identifica el sustrato de prueba como un sustrato de xilanasa.

La invención proporciona métodos para determinar si un compuesto de prueba se enlaza específicamente con un polipéptido, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) expresar un ácido nucleico o un vector que comprenda al ácido nucleico, bajo condiciones que permitan la traducción del ácido nucleico hasta un polipéptido, donde el ácido nucleico comprende un ácido nucleico de la invención, o proporcionar un polipéptido de la invención; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de prueba; y (d) determinar si el compuesto de prueba del paso (b) se enlaza específicamente con el polipéptido.

La invención proporciona métodos para identificar un modulador de una actividad de xilanasa, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el compuesto de prueba del paso (b) , y medir una actividad de la xilanasa, en donde un cambio en la actividad de xilanasa medida en la presencia del compuesto de prueba, comparada con la actividad en ausencia del compuesto de prueba, proporciona una determinación de que el compuesto de prueba modula la actividad de la xilanasa. En un aspecto, la actividad de la xilanasa se puede medir proporcionando un sustrato de xilanasa y detectando una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reacción, o un aumento en la cantidad del sustrato o una reducción en la cantidad del producto de reacción. Una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba, comparándose con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba, identifica el compuesto de prueba como un activador de la actividad de xilanasa. Un aumento en la cantidad del sustrato o una reducción en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba, comparándose con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba, identifica el compuesto de prueba como un inhibidor de la actividad de xilanasa.

La invención proporciona sistemas de computación que comprenden un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos, en donde este dispositivo de almacenamiento de datos tiene almacenada en el mismo una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención) . En un aspecto, el sistema de computación puede comprender además un algoritmo de comparación de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene cuando menos una secuenci de referencia almacenada en el mismo. En otro aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias comprende un programa de computadora que indica polimorfismos. En un aspecto, el sistema de computa-ción puede comprender además un identificador que identifica una o más características en dicha secuencia. La invención proporciona un medio legible por computadora que tiene almacenada en el mismo, una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para identificar una característica en una secuencia, los cuales comprenden los pasos de: (a) leer la secuencia utilizando un programa de computadora que identifica una o más características en una secuencia, en donde la secuencia comprende una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico de la invención; y (b) identificar una o más características en la secuencia con el programa de computadora. La invención proporciona métodos para comparar una primera secuencia con una segunda secuencia, los cuales comprenden los pasos de: (a) leer la primera secuencia y la segunda secuencia a través del uso de un programa de computadora, el cual comprara secuencias, en donde la primera secuencia comprende una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico de la invención; y (b) determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa de computadora. El paso de determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia, puede comprender además el paso de identificar polimorfismos. En un aspecto, el método puede comprender además un identificador que identifique una o más características en una secuencia. En otro aspecto, el método puede comprender leer la primera secuencia utilizando un programa de computadora, e identificar una o más características en la secuencia .

La invención proporciona métodos para aislar y recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa a partir de una muestra medio-ambiental, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporcionar un par de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una actividad de xilanasa, en donde el par de cebadores es capaz de amplificar un ácido nucleico de la invención; (b) aislar un ácido nucleico a partir de la muestra medio-ambiental o tratar la muestra medioambiental de tal manera que el ácido nucleico de la muestra, sea accesible para la hibridación al par de cebadores de amplificación; y (c) combinar el ácido nucleico del paso (b) con el par de cebadores de amplificación del paso (a) , y amplificar el ácido nucleico de la muestra medio-ambiental, aislando y recuperando de esta manera un ácido nucleico que codifica un polipéptido . que tiene una actividad de xilanasa, a partir de una muestra medioambiental . Uno o cada miembro del par de secuencias cebadoras de amplificación, puede comprender un oligonucleótido que comprenda cuando menos de aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de, una secuencia de la invención. En un aspecto, el par de secuencias cebadoras de amplificación es un par de amplificación de la invención. .

La invención proporciona métodos para aislar y recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, a partir de una muestra medioambiental, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporcionar una sonda de polinucleótido que comprende un ácido nucleico de la invención o una sub-secuencia del mismo; (b) aislar un ácido nucleico de la muestra medio-ambiental, o tratar la muestra raedio-ambiental de tal manera que el ácido nucleico de la muestra sea accesible para la hibridación a una sonda de polinucleótido del paso (a) ; (c) combinar el ácido nucleico aislado, o la muestra medio-ambiental tratada del paso (b) , con la sonda de polinucleótido del paso (a) ; y (d) aislar un ácido nucleico que se hibride específicamente con la sonda de polinucleótido del paso (a) , aislando o recuperando de esta manera un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, a partir de una muestra medio-ambiental. La muestra medio-ambiental puede comprender una muestra de agua, una muestra de líquido, una muestra de tierra, una muestra de aire, o una muestra biológica. En un aspecto, la muestra biológica se puede derivar a partir de una célula bacteriana, una célula de protozoario, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, una célula fúngica, o una célula de mamífero.

La invención proporciona métodos para generar una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporcionar un ácido nucleico de plantilla, el cual comprende un ácido nucleico de la invención; y (b) modificar, suprimir, o agregar uno o más nucleótidos en la secuencia de plantilla, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico de plantilla. En un aspecto, el método puede comprender además expresar el ácido nucleico variante para generar un polipéptido de xilanasa variante. Las modificaciones , adiciones, o supresiones, se pueden introducir mediante un método que comprende reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida por el oligonucleótido, reacción en cadena de la polimerasa de ensamble, mutagénesis con reacción en cadena de la polimerasa sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, re-ensamble genético (por ejemplo, Gene Reassembly®, ver, por ejemplo, la patente US 6,537,776), mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM®), reensamble de ligamiento sintético (SLR) , o una combinación de los mismos. En otro aspecto, las modificaciones, adiciones, o supresiones se introducen mediante un método que comprende recombinación, recombinación recursiva de secuencias, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de mal acoplamiento puntual, mutagénesis de cepa hospedera deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción- selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis genética artificial, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el método se puede repetir de una manera iterativa hasta que se produzca una xilanasa que tenga una actividad alterada o diferente, o una estabilidad alterada o diferente de aquélla de un polipéptido codificado por el ácido nucleico de plantilla. En un aspecto, el polipéptido de xilanasa variante es termo-tolerante, y retiene alguna actividad después de exponerse a una temperatura elevada. En otro aspecto, el polipéptido de xilanasa variante tiene una mayor glicosilación, comparándose con la xilanasa codificada por un ácido nucleico de plantilla. De una manera alternativa, el polipéptido de xilanasa variante tiene una actividad de xilanasa bajo una alta temperatura, en donde la xilanasa codificada por el ácido nucleico de plantilla no está activa bajo la alta temperatura. En un aspecto, el método se puede repetir de una manera iterativa hasta que se produzca una secuencia de codificación de xilanasa que tenga un uso de codones alterado desde aquél del ácido nucleico de plantilla. En otro aspecto, el método se puede repetir de una manera iterativa hasta que se produzca un gen de xilanasa que tenga un nivel más alto o más bajo de expresión de mensaje o estabilidad, desde aquél del ácido nucleico de plantilla.

En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 189, en donde la SEQ ID NO: 189 contiene una o más de las siguientes mutaciones: los nucleótidos en las posiciones 22 a 24 son TTC, los nucleótidos en las posiciones 31 a 33 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son TTG, los nucleótidos en las posiciones 49 a 51 son ATA, los nucleótidos en las posiciones 49 a 51 son ATA, los nucleóti-dos en las posiciones 31 a 33 son CAT, los nucleótidos en las posiciones 67 a 69 son ACG, los nucleótidos en las posiciones 178 a 180 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son TGT, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son GTA, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son GTT, los nucleótidos en las posiciones 193 a 195 son GTG, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCT, los nucleótidos en las posiciones 235 a 237 son CCA, o los nucleótidos en las posiciones 235 a 237 son CCC. En un aspecto, la invención proporciona métodos para hacer un ácido nucleico que comprende esta secuencia, en donde las mutaciones en la SEQ ID NO: 189 se obtienen mediante mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM®) .

En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden la SEQ ID NO: 190, en donde la SEQ ID NO: 190 contiene una o más de las siguientes mutaciones: el ácido aspártico en la posición del aminoácido 8 es fenilalanina, la glutamina en la posición del aminoácido 11 es histidina, la asparagina en la posición del aminoácido 12 es leucina, la glicina en la posición del aminoácido 17 es isoleucina, la treonina en la posición del aminoácido 23 es treonina codificada por un codón diferente del codón de tipo silvestre, la glicina en la posición del aminoácido 60 es histidina, la prolina en la posición del aminoácido 64 es cisteína, la prolina en la posición del aminoácido 64 es valina, la serina en la posición del aminoácido 65 es valina, la glicina en la posición del aminoácido 68 es isoleucina, la glicina en la posición del aminoácido 68 es alanina, o la valina en la posición del aminoácido 79 es prolina.

La invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, para aumentar su expresión en una célula hospedera, comprendiendo el método los siguientes pasos: '(a) proporcionar un ácido nucleico de la invención, que codifique, un polipéptido que tenga una actividad de xilanasa; y (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazarlo con un codón preferido o neutralmente utilizado que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, en donde un codón preferido es un codón sobre-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula hospedera, y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en las secuencias de codificación i de los genes de la célula hospedera, modificando de esta manera el ácido nucleico para aumentar su expresión en una célula hospedera.

La invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa; comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención; y (b) identificar un codón en el ácido nucleico del paso (a)' y I reemplazarlo con un codón diferente que codifique el mi¡smo aminoácido que el codón reemplazado, modificando de esta manera los codones en un ácido nucleico que codifique una xilanasa.

La invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, para aumentar su expresión en una célula hospedera, comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifique un polipéptido de xilanasa; y (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazar-lo con un codón preferido o neutralmente utilizado que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, en donde un codón preferido es un codón sobre-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula hospedera, y un codóm no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula hospedera, modificando de esta manera el ácido nucleico para aumentar! su expresión en una célula hospedera.

La invención proporciona métodos para modificar ' un codón en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, para reducir su expresión en una célula hospedera, comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención; y (b) identificar cuando menos un codón preferido en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazarlo con un codón no preferido o menos preferido que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, en donde un codón preferido es un codón sobre-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula hospedera, y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula hospedera, modificando de esta manera el ácido nucleico para reducir su expresión en una célula hospedera. En un aspecto, la célula hospedera puede ser una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, o una célula de mamífero .

La invención proporciona métodos para producir una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de xilanasa modificados o sitios de enlace de sustrato, en donde los sitios activos modificados o los sitios de enlace de sustrato se derivan a partir de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de enlace de sustrato, comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) proporcionar un primer ácido nucleico que codifique un primer sitio activo o un primer sitio de enlace de sustrato, en donde la secuencia del primer ácido nucleico comprende una secuencia que se híbrida bajo condiciones restringentes a un ácido nucleico de la invención, y el ácido nucleico codifica un sitio activo de xilanasa o un sitio de enlace de sustrato de xilanasa; (b) proporcionar un conjunto de oligonucleótidos mutagénicos que codifiquen variantes de aminoácidos que se presenten naturalmente en una pluralidad , de codones objetivos del primer ácido nucleico; y (c) utilizar: el conjunto de oligonucleótidos mutagénicos para generar un conjunto de ácidos nucleicos variantes que codifiquen el sitio activo o que codifiquen el sitio de enlace de sustrato, los cuales codifiquen un rango de variaciones de aminoácidos en cada codón de aminoácido que haya sido mutado, produciendo de esta manera una biblioteca de ácidos nucleicos que codifiquen una pluralidad de sitios activos de xilanasa o sitios de enlace de sustrato modificados. En un aspecto, el método comprende mutar el primer ácido nucleico del paso (a) mediante un método que comprende' un sistema optimizado de evolución dirigida, mutagénesis de saturación del sitio genético (GSSM®) , re-ensamble de ligamiento sintético (SLR) , reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida por el oligonucleótido, reacción en cadena de la polimerasa de ensamble, mutagénesis con reacción en cadena de la polimerasa sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, re-ensamble genético (GeneReassembly® , ver patente US 6,537,776), mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM®), reensamble de ligamiento sintético (SLR) , y una combinación de los mismos. En otro aspecto, el método comprende mutar el primer ácido nucleico del paso (a) o las variantes, mediante un método que comprende recombinación, recombinación recursiva de secuencias, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénésis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de mal acoplamiento puntual, mutagéne-sis de cepa hospedera deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción- selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis genética artificial, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y una combinación de las mismas.

La invención proporciona métodos para hacer una molécula pequeña, el cual comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una pluralidad de enzimas bio-sintéticas capaces de sintetizar o modificar una molécula pequeña, en donde una de las enzimas comprende una enzima xilanasa codificada por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato para cuando menos una de las enzimas del paso (a) ; y (c) hacer reaccionar el sustrato del paso (b) con las enzimas bajo condiciones que faciliten que una pluralidad de reacciones bio-catalíticas generen una molécula pequeña mediante una serie1 de reacciones bio-catalíticas . La invención proporciona métodos para modificar una molécula pequeña, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar una enzima xilanasa, en donde la enzima comprende un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o una sub-secuencia del mismo; (b) proporcionar una molécula pequeña; y (c) hacer reaccionar la enzima del paso (a) con la molécula pequeña del paso (b) bajo condiciones que faciliten una reacción enzimática catalizada por la enzima xilanasa, modificando de esta manera una molécula pequeña mediante una reacción enzimática de xilanasa. En un aspecto, el método puede comprender una pluralidad de sustratos de molécula pequeña para la enzima del paso (a) , generando de esta manera una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas mediante cuando menos una reacción enzimática catalizada por la enzima xilanasa. En un aspecto, el método puede comprender una pluralidad de enzimas adicionales bajo condiciones que faciliten una pluralidad de reacciones bio-catalíticas mediante las enzimas, para formar una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas por la pluralidad de reacciones enzimáticas . En otro aspecto, el método puede comprender además el paso de probar la biblioteca para determinar si una molécula pequeña modificada particular 'que exhiba una actividad deseada, está presente dentro de la biblioteca. El paso de probar la biblioteca puede comprender además los pasos de eliminar sistemáticamente todas salvo una de las reacciones bio-catalíticas utilizadas para producir una porción de la pluralidad de las moléculas pequeñas modificadas dentro de la biblioteca, mediante la prueba de la porción de la molécula pequeña modificada para determinar la presencia o la ausencia de la molécula pequeña modificada particular con una actividad deseada, e identificar cuando menos una reacción bio-catalítica específica que produzca la molécula pequeña modificada particular de la actividad deseada.

La invención proporciona métodos para determinar un fragmento funcional de una enzima xilanasa, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporcionar una enzima xilanasa, en donde la enzima comprende un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o una süb-secuencia del mismo; y (b) suprimir una pluralidad de residuos de aminoácidos de la secuencia del paso (a) , y probar la sub-secuencia restante para determinar una actividad de xilanasa, determinando de esta manera un fragmento funcional de una enzima xilanasa. En un aspecto, la actividad de xilanasa se mide proporcionando un sustrato de xilanasa y detectando una reducción en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reacción.

La invención proporciona métodos para diseñar células enteras de fenotipos nuevos o modificados, mediante la utilización de análisis de flujo metabólico en tiempo real, comprendiendo el método los siguientes pasos: (a) hacer una célula modificada mediante la modificación de la composición genética de una célula, en donde la composición genética se modifica mediante la adición a la célula de un ácido nucleico de la invención; (b) cultivar la célula modificada para generar una pluralidad de células modificadas; (c) medir cuando menos un parámetro metabólico de la célula mediante el monitoreo del cultivo celular del paso (b) en tiempo real; y (d) analizar los datos del paso (c) para determinar si el parámetro medido difiere de una medición comparable en una célula no modificada bajo condiciones similares, identificando de esta manera un fenotipo diseñado en la célula empleando análisis de flujo metabólico en tiempo real. En un aspecto, la composición genética de la célula puede modificarse mediante un método que comprende la supresión de una secuencia o la modificación de una secuencia en la célula, o eliminar la expresión de un gen. En un aspecto, el método puede comprender además seleccionar una célula que comprenda un fenotipo diseñado nuevo. En otro aspecto, el método puede comprender cultivar la célula seleccionada, generando de esta manera una nueva cepa celular que comprenda un fenotipo diseñado nuevo .

La invención proporciona métodos para aumentar la termo-tolerancia o la termo-estabilidad de un polipéptido de xilanasa, comprendiendo el método glicosilar un polipéptido [ de xilanasa, en donde el polipéptido comprende cuando menos treinta aminoácidos contiguos de un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico de la invención, aumentando de esta manera la termo-tolerancia o la termo-estabilidad del polipéptido de xilanasa. En un aspecto, la actividad específica de xilanasa puede ser termo-estable o termo-tolerante a una temperatura en el intervalo desde más . de aproximadamente 37°C hasta aproximadamente 95°C.

La invención proporciona métodos para sobre-expresar un polipéptido de xilanasa recombinante en una célula, los cuales comprenden expresar un vector que comprende un acido nucleico que comprende un ácido nucleico de la invención o una secuencia de ácido nucleico de la invención, en donde las identidades de secuencias se determinan mediante un análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual, en donde la sobre-expresión se efectúa mediante la utilización de un promotor de alta actividad, un vector dicistrónico, o mediante la amplificación genética del vector.

La invención proporciona métodos para hacer una planta transgénica, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) introducir una secuencia de ácido nucleico heterologa en la célula, en donde la secuencia de ácido nucleico heterologa comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, produciendo de esta manera una célula de planta transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula transformada. En un aspecto, el paso (a) puede comprender además introducir la secuencia de ácido nucleico heterologa mediante eletroporación o micro- inyección de protoplastos de células de plantas. En otro aspecto, el paso (a) puede comprender además introducir la secuencia de ácido nucleico heterologa directamente en el tejido de la planta mediante bombardeo de partículas del ADN. De una manera alternativa, el paso (a) puede comprender además introducir la secuencia de ácido nucleico heterologa en el ADN de la célula de planta utilizando un anfitrión de Agrojbacte ium turnefaciens . En un aspecto, la célula de planta puede ser una célula de papa, maíz, arroz, trigo, tabaco, o cebada.

La invención proporciona métodos para expresar una secuencia de ácido nucleico heterologa en una célula de planta, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) transformar la célula de planta con una secuencia de ácido nucleico heterologa operativamente enlazada a un promotor, en donde la secuencia de ácido nucleico heterologa comprende un ácido nucleico de la invención; (b) cultivar la planta bajo condiciones en las que se exprese la secuencia de ácido nucleico heterologa en la célula de planta.

La invención proporciona métodos para expresar una secuencia de ácido nucleico heterologa en una célula de planta, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) transformar la célula de planta con una secuencia de ácido nucleico heterologa operativamente enlazada a un promotor, en donde la secuencia de ácido nucleico heterologa comprende una secuencia de la invención; (b) cultivar la planta bajo condiciones en las que se exprese la secuencia de ácido nucleico heterologa en la célula de planta.

La invención proporciona métodos para hidrolizar, descomponer, o alterar una composición que comprende xilano, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tenga una actividad de xilanasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprenda xilano; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en las que la xilanasa hidrolice, descomponga, o altere la composición que comprende xilano. En un aspecto, la composición comprende una célula de planta, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de animal. Por consiguiente, ; la composición puede comprender cualquier planta o parte de planta, cualquier comida o alimento que contenga xilano, un producto de desecho, y similares. La invención proporciona métodos para licuar o remover una composición que comprende xilano, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tenga una actividad de xilanasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprenda xilano,- y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en las que la xilanasa remueva, ablande, o licué la composición que comprende xilano.

La composición proporciona composiciones detergentes que comprenden un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, en donde el polipéptido tiene una actividad de xilanasa. La xilanasa puede ser una xilanasa sin actividad superficial o una xilanasa con actividad superficial. La xilanasa se puede formular en una composición líquida no acuosa, un sólido vaciado, una forma granular, una forma de partículas, una tableta comprimida, una forma de gel, una pasta, o una forma de pasta acuosa. La invención proporciona métodos para lavar un objeto, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprenda un polipéptido de la invención que tenga una actividad de xilanasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un objeto; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el objeto del paso (b) bajo condiciones en las que la composición pueda lavar el objeto.

La invención proporciona textiles o telas, incluyendo, por ejemplo, hilos, que comprenden un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, los textiles o telas comprenden fibras que contienen xilano. La invención proporciona métodos para el tratamiento de un textil o tela (por ejemplo, removiendo una mancha de una composición) , los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprenda 1 un polipéptido de la invención que tenga una actividad de xilanasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un textil o tela que comprenda un xilano; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con : la composición del paso (b) bajo condiciones en las que la xilanasa pueda tratar el textil o la tela (por ejemplo, remover la mancha) . La invención proporciona métodos para mejorar el acabado de una tela, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar una composición que comprenda un polipéptido de la invención que tenga una actividad de xilanasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una tela; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con la tela del paso (b) bajo condiciones en las que el polipéptido pueda tratar la tela, mejorando de esta manera el acabado de la tela. En un aspecto, la tela es una lana o una seda.

La invención proporciona alimentos o comidas que comprenden un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para hidrolizar xilanos en un alimento o en una comida antes de que un animal lo consuma, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) obtener un material alimenticio que comprenda una xilanasa de la invención, o una xilanasa codificada por un ácido nucleico de la invención; y [h) agregar el polipéptido del paso (a) al alimento o al material alimenticio en una cantidad suficiente, durante un periodo de tiempo suficiente, para provocar la hidrólisis del xilano y la formación de un alimento o comida tratada, hidrolizando de esta manera los xilanos en la comida o el alimento antes de que el animal lo consuma. En un aspecto, la invención proporciona métodos para hidrolizar xilanos en un alimento o comida después de que un animal lo consuma, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) obtener un material alimenticio que comprenda una xilanasa de la invención, o una xilanasa codificada por un ácido nucleico de la invención; (b) agregar el polipéptido del paso (a) al alimento o al material alimenticio; y (c) administrar el alimento o el material alimenticio al animal, en donde, después del consumo, la xilanasa provoca la hidrólisis de los xilanos en el alimento o en la comida en el tracto digestivo del animal.; La comida o el alimento puede ser, por ejemplo, un cereal, un grano, maiz, y similares.

La invención proporciona complementos alimenticios o nutricionales para un animal, los cuales comprenden un polipéptido de la invención, por ejemplo un polipéptido codificado por1 el ácido nucleico de la invención. En un aspecto, el polipéptido. en el complemento alimenticio o nutricional puede estar glicosilado. La invención proporciona matrices de suministro de enzainas comestibles que comprenden un polipéptido de la invención, por ejemplo un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la matriz de suministro comprende un gránulo. En un aspecto, el polipéptido puede estar glicosilado. En un aspecto, la actividad de xilanasa es termo-tolerante . i En otro aspecto, la actividad de xilanasa es termo-estable.

La invención proporciona una comida, un alimento, o un complemento nutricional que comprende un polipéptido de ; la invención. La invención proporciona métodos para utilizar una xilanasa como un complemento nutricional en una dieta para animales, comprendiendo el método: preparar un complemento nutricional que contenga una enzima xilanasa que comprenda cuando menos treinta aminoácidos contiguos de un polipéptido de la invención; y administrar el complemento nutricional a un animal para aumentar la utilización de un xilano contenido en un alimento o en una comida ingerida por el animal. El animal puede ser un ser humano, un rumiante, o un animal monogástrico . La enzima xilanasa se puede preparar mediante la expresión de un polinucleótido que codifique la xilanasa en un organismo seleccionado a partir del grupo que consiste en una bacteria, una levadura, una planta, un insecto, un hongo, y un animal. El organismo se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en S. pombe, S. cerevisiae, Pichia pastoris, Pseudomonas sp. , E. coli. Streptomyces sp. , Bacillus sp. , y Lactobacillus sp.

La invención proporciona una matriz de suministro ? de enzimas comestible, la cual comprende una enzima xilanasa recombinante termo-estable, por ejemplo un polipéptido de la invención. La invención proporciona métodos para suministrar un complemento de xilanasa a un animal, comprendiendo el método: preparar una matriz de suministro de enzimas comestible en la forma de granulos que comprendan un vehículo comestible granulado y una enzima xilanasa recombinante termo-estable, en donde los granulos dispersan fácilmente la enzima xilanasa contenida en los misraos, en medios acuosos, y administrar la matriz de suministro de enzimas comestible al animal. La enzima xilanasa recombinante puede comprender un polipéptido de la invención. El vehículo comestible granulado puede comprender un vehículo seleccionado a partir del grupo que consiste en un germen de granos, un germen de granos agotado de aceite, un heno, una alfalfa, un fleo, una cáscara de soya, una harina de semilla de girasol, y un centro de trigo. El vehículo comestible puede comprender germen de granos que esté agotado de aceite. La enzima xilanasa se puede glicosilar para proporcionar termo-estabilidad en las condiciones de granulación. La matriz de suministro se puede formar mediante la granulación de una mezcla que comprenda un germen de granos y una xilanasa. Las condiciones de granulación pueden incluir la aplicación de vapor. Las condiciones de granulación pueden comprender la aplicación de una temperatura mayor de aproximadamente 80°C durante aproximadamente 5 minutos, y la enzima retiene una actividad específica de cuando menos 350 a aproximadamente 900 unidades por mg de enzima.

La invención proporciona métodos para mejorar la textura y el sabor de un producto lácteo, los cuales comprenden los pasos de: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tenga una actividad de xilanasa, o una xilanasa codificada por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un producto lácteo; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el producto lácteo del paso (b) bajo condiciones en las que la xilanasa pueda mejorar la textura o el sabor del producto lácteo. En un aspecto, el producto lácteo comprende un queso o un yogurt. La invención proporciona productos lácteos que comprenden una xilanasa de la invención, o que es codificada por un ácido nucleico de la invención.

La invención proporciona métodos para mejorar la extracción de aceite a partir de un material de planta rico en aceite, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tenga una actividad de xilanasa, o una xilanasa codificada por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un material de planta rico en aceite; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el material de planta rico en aceite. En un aspecto, el material de planta rico en aceite comprende una semilla rica en aceite. El aceite puede ser un aceite de semilla de soya, un aceite de olivo, un aceite de semilla de colza (cañóla) , o un aceite de girasol .

La invención proporciona métodos para preparar un jugo, jarabe, puré, o extracto de fruta o verdura, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tenga una actividad de xilanasa, o una xilanasa codificada por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición o un líquido que comprenda un material de fruta o verdura; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con la composición, preparando de esta manera el jugo, j árabe, puré, o extracto de fruta o verdura.

La invención proporciona papeles o productos de papel o pulpa de papel que comprenden una xilanasa de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para el tratamiento de un papel o de pulpa de papel o madera, los cuales comprenden los siguientes pasos: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tenga una actividad de xilanasa, o una xilanasa codificada por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprenda un papel o una pulpa de papel o madera; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) , bajo condiciones en las que la xilanasa pueda tratar el papel o la pulpa de papel o madera. En un aspecto, la composición farmacéutica actúa como un auxiliar digestivo o como un anti-microbiano (por ejemplo, contra Salmonella) . En un aspecto, el tratamiento es profiláctico. En un aspecto, la invención proporciona productos para el cuidado oral, los cuales comprenden un polipéptido de la invención que tiene una actividad de xilanasa, o una xilanasa codificada por un ácido nucleico de la invención. El producto para el cuidado oral puede comprender una pasta dental, una crema dental, un gel o un polvo dental, un odóntico, un enjuague bucal, una formulación de enjuague previo o, posterior al cepillado, una goma de mascar, una gragea, ó un dulce. La invención proporciona composiciones limpiadoras de lentes de contacto que comprenden un polipéptido de la invención que tiene una actividad de xilanasa, o una xilanasa codificada por un ácido nucleico de la invención.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para eliminar o proteger a los animales de un microorganismo, los cuales comprenden administrar un polipéptido de la invención. El microorganismo puede ser una bacteria que comprenda xilano, por ejemplo Sal onella.

La invención proporciona un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 189 y variantes de la misma que tengan una identidad de secuencia de cuando menos el 50 por ciento con la SEQ ID NO: 189, y que codifica polipéptidos que tienen actividad de xilanasa. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de xilanasa, por ejemplo una actividad de xilanasa termo-estable.

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden la SEQ ID NO: 189, en donde la SEQ ID NO: 189 comprende una o más de las siguientes variaciones de secuencia: los nucleótidos en las posiciones 22 a 24 son TTC, los nucleótidos en las posiciones 22 a 24 son TTT, los nucleótidos en las posiciones 31 a 33 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 31 a 33 son CAT, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son TTG, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son TTA, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son CTC, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son CTT, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son CTA, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son CTG, los nucleotidos en las posiciones 49 a 51 son ATA, los nucleotidos en las posiciones 49 a 51 son ATT, los nucleotidos en las posiciones 49 a 51 son ATC, los nucleotidos en las posiciones 178 a 180 son CAC, los nucleotidos en las posiciones 178 a 180 son CAT, los nucleotidos en las posiciones 190 a 192 son TGT, los nucleotidos en las posiciones 190 a 192 son TGC, los nucleotidos en las posiciones 190 a 192 son GTA, los nucleotidos en las posiciones 190 a 192 son GTT, los nucleotidos en las posiciones 190 a 192 son GTC, los nucleotidos en las posiciones 190 a 192 son GTG, los nucleotidos en las posiciones 193 a 195 son GTG, los nucleotidos en las posiciones 193 a 195 son GTC, los nucleotidos en las posiciones 193 a 195 son GTA, los nucleotidos en las posiciones 193 a 195 son GTT, los nucleotidos en las posiciones 202 a 204 son ATA, los nucleotidos en las posiciones 202 a 204 son ATT, los nucleotidos en las posiciones 202 a 204 son ATC, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCT, los nucleotidos en las posiciones 202 a 204 son GCG, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCC, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCA, los nucleótidos en las posiciones 235 a 237 son CCA, los nucleótidos en las posiciones 235 a; 237 i son CCC, o los nucleótidos en las posiciones 235 a 237 son CCG.

La invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de aminoácidos , que comprende la SEQ ID NO: 190, en donde la SEQ ID NO: 190 comprende una o más o todas las siguientes variaciones de secuencia: el ácido aspártico en la posición del aminoácido 8 es fenilalanina, la glutamina en la posición del aminoácido 11 es histidina, la asparagina en la posición del aminoácido 12 es leucina, la glicina en la posición del aminoácido 17 es isoleucina, la treonina en la posición del aminoácido 23 es treonina codificada por un codón diferente del codón de tipo silvestre, la glicina en la posición del aminoácido 60 es histidina, la prolina en la posición del aminoácido 64 es cisteína, la prolina en la posición del aminoácido 64 es valina, la serina en la posición del aminoácido 65 es valina, la glicina en la posición del aminoácido 68 es isoleucina, la glicina en la posición del aminoácido 68 es alanina, o la serina en la posición del aminoácido 79 es prolina. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de xilanasa, por ejemplo una actividad de xilanasa termo-estable.

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden la SEQ ID NO: 189, en donde la¦ SEQ ID NO: 189 comprende una o más o todas las variacionesi de secuencia estipuladas en la Tabla 1 o en la Tabla 2. La invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes codificados por los ácidos nucleicos que comprenden la SEQ ID NO: 189, en donde la SEQ ID NO: 189 comprende una o más o todas las variaciones de secuencia estipuladas en la Tabla 1 o en la Tabla 2. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de xilanasa, 1 por ejemplo una actividad de xilanasa termo-estable.

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que comprenden la SEQ ID NO: 379, en donde la SEQ ID NO: 379 comprende una o más o todas las siguientes variaciones de secuencia: los nucleótidos en las posiciones 22 a 24 son TTC, los nucleótidos en las posiciones 31 a 33 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 49 a 51 son ATA, los nucleótidos en las posiciones 178 a 180 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 193 a 195 son GTG, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCT.

La invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden la SEQ ID NO: 380, en donde la SEQ ID NO: 380 comprende una o más o todas las siguientes variaciones de secuencia: D8F, Q11H, G17I, G60H, S65V y/o G68A. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de xilanasa, por ejemplo, una actividad de xilanasa termo-estable.

Los ácidos nucleicos aislados o recombinantes de la invención también son referidos como "secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A" . La invención proporciona un ácido nucleico aislado que incluye cuando menos 10 bases consecutivas de una secuencia como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y las secuencias complementarias para las mismas.

Los polipéptidos aislados o recombinantes de la invención, los cuales incluyen fragmentos funcionales de las secuencias de ejemplo de la invención, también son referidos a como "secuencias de aminoácidos del Grupo B" . Otro aspecto de la invención es un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un polipéptido que tiene cuando menos 10 aminoácidos consecutivos de una secuencia como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido purificado que tiene una secuencia como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. Otro aspecto de la invención es un anti-cuerpo aislado o purificado que se enlaza específicamente con un polipéptido que tiene una secuencia como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas .

Otro aspecto de la invención es un anti-cuerpo aislado o purificado, o un fragmento de enlace del mismo, el cual se enlaza específicamente a un polipéptido que tiene cuando menos 10 aminoácidos consecutivos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

Otro aspecto de la invención es a método para hacer un polipéptido que tiene una secuencia como se estipula e , las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. El método incluye introducir un ácido nucleico que codifique al polipéptido en una célula hospedera, en donde el ácido nucleico se enlaza operativamente a un promotor, y cultivar la célula hospedera bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico. Otro aspecto de la invención es un método para hacer un polipéptido que tiene cuando menos 10 aminoácidos de una secuencia como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmen-te idénticas a las mismas. El método incluye introducir un ácido nucleico que codifique al polipéptido en una célula hospedera, en donde el ácido nucleico se enlaza operativamente a un promotor, y cultivar la célula hospedera bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo de esta manera el polipéptido.

Otro aspecto de la invención es un método para generar una variante, el cual incluye obtener un ácido nucleico que tenga una secuencia como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, secuencias complementarias para las secuencias de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, fragmentos que comprendan cuando menos 30 nucleótidos consecutivos de las secuencias anteriores, y cambiar uno o más nucleótidos de la secuencia por otro nucleótido, suprimir uno o más nucleótidos de la secuencia, o agregar uno o más nucleótidos a la secuencia.

Otro aspecto de la invención es un medio legible por computadora que tiene almacenada en el mismo una secuencia como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

Otro aspecto de la invención es un sistema de computación que incluye un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos, en donde el dispositivo de almacenamiento de datos tiene almacenada en el mismo una secuencia como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o un polipéptido que tiene una secuencia como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

Otro aspecto de la invención es un método para comparar una primera secuencia con una secuencia de referencia, en donde la primera secuencia es un ácido nucleico que tiene una secuencia como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o un código de polipéptido de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. El método incluye leer la primera secuencia y la secuencia de referencia a través del uso de un programa de computadora que compara secuencias; y determinar las diferencias entre la primera secuencia y la secuencia de referencia con el programa de computadora .

Otro aspecto de la invención es un método para identificar una característica en una secuencia como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o un polipéptido que tiene una secuencia como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas á las mismas, incluyendo leer la secuencia a través del uso* de un programa de computadora que identifica las características en las secuencias; e identificar las características en la secuencia con el programa de computadora. 1 Todavía otro aspecto de la invención es un método para catalizar la descomposición de xilano o un derivado del mismo, el cual comprende el paso de poner en contacto una muestra que contenga xilano o el derivado del mismo, con un polipéptido de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, bajo condiciones que faciliten la descomposición del xilano.

Otro aspecto de la invención es un ensayo para identificar fragmentos o variantes de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a , las mismas, el cual retiene la función enzimática de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas . El ensayo incluye poner en contacto el polipéptido de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o el fragmento o la variante del polipéptido, con una molécula de sustrato, bajo condiciones que permitan que funcione el fragmento o la variante del polipéptido, y detectar ya sea una reducción en el nivel de sustrato, o bien un aumento en el nivel del producto de reacción específico de la reacción entre el polipéptido y el sustrato, identificando de esta manera un fragmento o variante de estas secuencias.

Otro aspecto de la invención es una sonda de ácido nucleico de un oligonucleótido de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos de longitud, y que tiene un segmento de cuando menos 10 nucleótidos contiguos que es cuando menos el 50 por ciento complementaria para una región objetiva de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A; y que se híbrida a la región objetiva de ácido nucleico bajo condiciones moderadas a altamente restringentes , para formar un dúplex detectable de obj etivo : sonda .

Otro aspecto de la invención es una sonda de polinu-cleótido para el aislamiento o la identificación de genes de xilanasa que tengan una secuencia que sea igual a, o completamente complementaria para, cuando menos un fragmento de una de. las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona una preparación de proteína que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmen-te idénticas a las mismas, en donde la preparación de proteína es un líquido.

Todavía otro aspecto de la invención proporciona una preparación de proteína que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmen-te idénticas a las mismas, en donde el polipéptido es un sólido.

Todavía otro aspecto de la invención proporciona un método para modificar moléculas pequeñas, el cual comprende el paso de mezclar cuando menos un polipéptido codificado por un polinucleótido seleccionado a partir de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y las secuencias complementarias para las mismas, con cuando menos una molécula pequeña, con el fin de producir cuando menos una molécula pequeña modificada por medio de al menos una reacción bio-catalítica, en donde el cuando menos un polipéptido tiene actividad de xilanasa.

Otro aspecto de la invención es un vector de clonación de una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, seleccionándose esta secuencia a partir de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y las secuencias complementarias para las mismas.

Otro aspecto de la invención es una célula hospedera que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, seleccionándose esta secuencia a partir de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y las secuencias complementarias para las mismas .

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión capaz de replicarse en una célula hospedera, el cual comprende un polinucleótido que tiene una secuencia seleccionada a partir de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, secuencias complementarias para las mismas, y ácidos nucleicos aislados que se hibridan en los ácidos nucleicos que tienen cualquiera de las secuencias anteriores, bajo condiciones de astringencia baja, moderada, y alta.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para acondicionar masa, el cual comprende poner en contacto la masa con cuando menos un polipéptido de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, bajo condiciones suficientes para acondicionar la masa.

Otro aspecto de la invención es un método de producción de bebidas, el cual comprende la administración de cuando menos un polipéptido de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, bajo condiciones suficientes para disminuir la viscosidad del mosto o la cerveza.

Las xilanasas de la invención se utilizan para descomponer los arabinoxilanos de alto peso molecular en el alimento para animales. La adición de las xilanasas de la invención estimula los índices de crecimiento al mejorar la digestibilidad, lo cual también mejora la calidad del desecho del animal. La xilanasa funciona a través del tracto gastro- intestinal para reducir la viscosidad intestinal y aumentar la difusión de las enzimas pancreáticas. Adicionalmente, las xilanasas de la invención se pueden utilizar en el tratamiento de las paredes celulares del endosperma de las proteínas alimenticias de granos y verduras. En un aspecto de la invención, las xilanasas novedosas de la invención se administran a un animal con el objeto de aumentar la utilización del xilano en el alimento. Esta actividad de las xilanasas de la invención se puede utilizar para descomponer el material insoluble de la pared celular, liberando los nutrientes en las paredes celulares, que luego llegan a estar disponibles para el animal. También convierte la hemi-celulosa en azúcares nutritivos, de tal manera que se liberan ¦ los nutrientes anteriormente atrapados dentro de las paredes celulares. La xilanasa también produce compuestos que pueden ser una fuente nutritiva para la microflora del rumiante.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para utilizar la xilanasa como un complemento nutricional en, las dietas de animales, el cual comprende la preparación de un complemento nutricional que contiene una enzima xilanasa recombinante que comprende cuando menos 30 aminoácidos contiguos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y administrar el complemento nutricional a un animal con el fin de aumentar la utilización del xilano contenido en el alimento ingerido por el animal .

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para suministrar un complemento de xilanasa a un animal, en donde el método comprende preparar una matriz de suministro enzimático comestible en la forma de gránulos, los cuales comprenden un vehículo granulado comestible y una enzima xilanasa recombinante termo-estable, en donde las partículas dispersan fácilmente la enzima xilanasa contenida en las mismas en medios acuosos, y administrar la matriz de suministro enzimático comestible al animal . El vehículo granulado comestible puede comprender un vehículo seleccionado a partir del grupo que consiste en germen de granos agotado de aceite, heno, alfalfa, fleo, cáscara de soya, harina de semilla de girasol, y centro de trigo. La enzima xilanasa puede tener una secuencia de aminoáci-dos como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, en donde la secuencia se selecciona a partir de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, secuencias sustancialmente idénticas á las mismas, y las secuencias complementarias para las mismas, en donde la secuencia contiene una secuencia de señal. La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, en donde la secuencia se selecciona a partir de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y las secuencias complementarias para las mismas, en donde la secuencia contiene una secuencia de señal a partir de otra xilanasa.

Adicionalmente, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, en donde la secuencia se selecciona a partir de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y las secuencias complementarias para las mismas, en donde la secuencia no contiene una secuencia de señal.

Todavía otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico aislado que es una mutación de la SEQ ID NO: 189. Todavía otro aspecto proporciona una secuencia de aminoácidos que es una mutación de la SEQ ID NO: 190.

Los detalles de una o más modalidades de la invención se estipulan en los dibujos acompañantes y en la siguiente descripción. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción y de los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, secuencias GenBank, y depósitos en ATCC, citados en la presente, se incorporan expresamente a la presente como referencia para todos los propósitos.

Breve Descripción de los Dibujos Los siguientes dibujos son ilustrativos de los aspectos de la invención y no van a limitar el alcance de la invención, el cual es abarcado por las reivindicaciones.

El expediente de la patente o de la solicitud contiene cuando menos un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color sobre una solicitud y el pago de los derechos necesarios .

La Figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema de computación. j La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra^ un aspecto de un proceso para comparar una nueva secuencia de nucleótido o de proteína con una base de datos de secuencias, con el objeto de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias de la base de datos.

La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso en una computadora, para determinar si dos secuencias son homologas .

La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia.

La Figura 5 es una gráfica que compara la actividad de la secuencia de tipo silvestre (SEQ ID NOS: 189 y 190) con el mutante 8x (SEQ ID NOS: 375 y 376), una combinación de mutantes D, F, H, I, S, V, X y AA en la Tabla 1.

La^ Figura 6A ilustra los nueve mutantes de aminoácidos de un solo sitio de la SEQ ID NO: 378 (codificada por la SEQ ID NO: 377) generados por Gene Site Saturation Mutagenesis (GSSM®) , de la SEQ ID NO: 190 (codificada por la SEQ ID NO: 189) , como se describe con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante.

La Figura 6B ilustra el despliegue de las SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 378, en los experimentos de punto medio de transición de temperatura de fusión (Tm) , determinado mediante caloría de exploración diferencial (DSC) para cada enzima, como se describe con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante .

La Figura 7A ilustra los perfiles de actividad de pH y temperatura para las enzimas de las SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 378, como se describen con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante .

La Figura 7B ilustra la óptima de actividad de velocidad/temperatura para las enzimas de las SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 378, como se describe con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante.

La Figura 7C ilustra la tolerancia térmica/actividad residual para las enzimas de las SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 378, como se describe con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante .

La Figura 8A ilustra la biblioteca GeneReassembly® de todas las posibles combinaciones de las 9 mutaciones puntuales de GSSM®, que se construyó y se rastreó para determinar las variantes con una mejor tolerancia térmica y actividad, como se describe con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante .

La Figura 8B ilustra la actividad relativa de la variante "6X-2" y de la variante "9X" (SEQ ID NO: 378) , comparándose con la SEQ ID NO: 190 ("tipo silvestre"), a una temperatura óptima y a un pH de 6.0, como se describe con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante.

La Figura 9A ilustra las huellas obtenidas después de la hidrólisis de los oligoxilanos (Xyl)3, (Xyl)4, (Xyl)5, y (Xyl)6 por la SEQ ID NO: 190 ("tipo silvestre") y las enzimas de la variante "9X" (SEQ ID NO: 378), como se describe con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante.

La Figura 9B ilustra las huellas obtenidas después de la hidrólisis del xilano de madera de haya por la SEQ ID NO: 190 ("tipo silvestre"), y las enzimas de la variante "9X" (SEQ ID NO: 378), como se describen con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante.

La Figura 10A es un diagrama esquemático que ilustra el nivel de mejora en la estabilidad térmica (representada por Tm) sobre la SEQ ID NO: 190 ("tipo silvestre") , obtenido mediante evolución de GSSM®, como se describe con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante.

La Figura 10B ilustra un "diagrama de aptitud" de la mejora enzimática en la forma de las SEQ ID NO: 378 y SEQ ID NO: 380, como se obtiene mediante la combinación de las tecnologías GSSM® y GeneReassembly® , como se describe con detalle en el Ejemplo 5 que se encuentra más adelante.

La Figura 11 es un diagrama de flujo esquemático de un protocolo de rastreo de rutina de ejemplo, para determinar si una xilanasa de la invención es útil en el tratamiento previo de la pulpa de papel, como se describe con detalle en el Ejemplo 6 que se encuentra más adelante. , Los símbolos de referencia iguales en los diferentes dibujos indican elementos iguales. ; Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a xilanasas y a polinucleótidos que las codifican, y a métodos para hacerlas y usarlas. La actividad de xilanasa de los polipéptidos de la invención abarca las enzimas que tienen actividad de hidrolasa, por ejemplo las enzimas capaces de hidrolizar los enlaces glicosídicos presentes en el xilano, por ejemplo catalizando la hidrólisis de los enlaces ß-l, 4-xilosídicos internos. Las xilanasas de la invención se pueden utilizar para hacer y/o procesar comidas, alimentos, complementos nutricionales , textiles, detergentes, y similares. Las xilanasas de la invención se pueden utilizar en composiciones farmacéuticas y como auxiliares dietéticos. Las xilanasas de la invención son particularmente útiles en los procesos de repostería, alimento para animales, bebidas, y papel.

Definiciones El término "anti-cuerpo" incluye un péptido o polipép-tido derivado de, modelado después de, o sustancialmente codificado por, un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobu-lina, o fragmentos de los mismos, capaz de enlazarse específicamente con un antígeno o epítopo, ver, por ejemplo Fundamental Immunology, tercera edición, W. E. Paul, editor, Raven Press, N. Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol . Methods 175: 267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys . Methods 25: 85-97. El término "anti-cuerpo" incluye las porciones de enlace de antígeno; es decir, los "sitios de enlace de antígeno" (por ejemplo, fragmentos, sub- secuencias , regiones determinantes de complementariédad (CDRs) ) , que retengan su capacidad para enlazarse con el antígeno, incluyendo (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistente en los dominios VL, VH, CL, y CH1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende los dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd consistente en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anti-cuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores , (1989) Nature 341: 544-546), el cual consiste en un domino VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) . Los anti-cuerpos de una sola cadena también se incluyen como referencia en el término "anti-cuerpo" .

Los términos "matriz" o "micro-matriz" o "biochip" o "chip" , como se utilizan en la presente, son una pluralidad de elementos objetivos, comprendiendo cada elemento objetivo una cantidad definida de uno o más polipéptidos (incluyendo anticuerpos) o ácidos nucleicos inmovilizados sobre un área definida de una superficie de sustrato, como se describe con mayor detalle más adelante.

Como se utilizan en la presente, los términos "compüta-dora", "programa de computadora", y "procesador", se utilizan en sus contextos generales más amplios, e incorporan todos estos dispositivos, como se describen con detalle más adelante. Una "secuencia de codificación de" o una "secuencia codifica"( un polipéptido o proteína particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe y se traduce en un polipéptido o proteína cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas .

Las frases "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico", como se utilizan en la presente, se refieren a un oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido, o a un fragmento de cualquiera de éstos, al ADN o ARN de origen genómico o sintético que puede ser de una sola cadena o de doble cadena, y pueden representar una cadena en sentido o anti-sentido, al ácido nucleico peptídico (PNA) , o a cualquier material tipo ADN o tipo ARN, de origen natural o sintético. Las frases "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico", incluyen un oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido, o un fragmento de cualquiera de éstos, ADN o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, ARNi) de origen genómico o sintético, que pueden ser de una sola cadena o de doble cadena, y pueden representar una cadena en sentido o antisentido, ácido nucleico peptídico (PNA) , o cualquier material tipo ADN o tipo ARN, de origen natural o sintético, incluyendo, por ejemplo, ARNi, ribonucleoproteínas (por ejemplo, ARNis de doble cadena, por ejemplo iRNPs) . El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos , que contengan análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca estructuras de tipo ácido nucleico con estructuras bases sintéticas, ver, por ejemplo, Mata (1997) Toxicol . Appl . Pharmacol. 144: 189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153-156. "Oligonucleótido" incluye ya sea un polidesoxinucleótido de una sola cadena o dos cadenas de polidesoxinucleótido complementarias que se pueden sintetizar químicamente. Estos oligonucleótidos sintéticos no tienen 5' -fosfato, y por consi-guíente, no se ligarán a otro oligonucleótido sin agregar un fosfato con un ATP en la presencia de una quinasa. Un oligonu-cleótido sintético puede ligarse a un fragmento que no haya sido desfosforilado .

Una "secuencia de codificación de" o una "secuencia de nucleótidos que codifica" un polipéptido o proteína particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe y se traduce en un polipéptido o proteína cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas .

El término "gen" significa el segmento de ADN involu-erado en la producción de una cadena de polipéptido; incluye las regiones precedentes y siguientes a la región codificante (delantera y trasera) , así como, donde sea aplicable, las secuencias que intervienen (intrones) entre los segmentos codificantes individuales (exones) . "Operativamente enlazada", como se utiliza en la presente, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) . Normalmente, se refiere a la relación funcional de la secuencia reguladora de transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor se enlaza operativamente con una secuencia de codificación, tal como un ácido nucleico de la invención, si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula hospedera apropiada, o en otro sistema de expresión. En términos generales, las secuencias reguladoras de transcripción del promotor que se enlazan operativamente a una secuencia transcrita, están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de acción cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de transcripción, tales como las potenciadoras , no necesitan estar físicamente contiguas o localizadas en estrecha proximidad a las secuencias de codificación cuya transcripción potencian.

El término "cásete de expresión", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de nucleótidos que es capaz de afectar la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia de codificación de proteína, tal como una xilanasa de la invención) en un anfitrión compatible con estas secuencias. Los casetes de expresión incluyen cuando menos un promotor operativamente enlazado con la secuencia de codificación del polipéptido; y opcionalmente con otras secuencias, por ejemplo señales de terminación de transcripción. También se pueden utilizar factores adicionales necesarios o útiles para afectar la expresión, por ejemplo potenciadores . Por consiguiente, los casetes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes , cualquier forma de vector de "ADN desnudo" recombinante , y similares. Un "vector" comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, o transducir de una manera transitoria o permanente una célula. Se reconocerá que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico formando complejo con una proteína o lípido. El vector opcionalmente comprende ácidos nucleicos y/o proteínas virales o bacterianos, y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una envoltura de lípido viral, etc.) . Los vectores incluyen, pero no se limitan a, replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriófagos) a los cuales se les pueden unir fragmentos de ADN y llegan a replicarse. Por lo tanto, los vectores incluyen, pero no se limitan a, ARN, ADN o ARN circular o lineal de auto-réplica autónoma (por ejemplo, plásmidos, virus, y similares, ver, por ejemplo, la patente US 5,217,879), e incluyen plásmidos tanto de expresión como no de expresión. Cuando un microorganismo recombinante o un cultivo celular se describe como anfitrión de un "vector de expresión", esto incluye tanto ADN circular y lineal extra-cromosómico, como ADN que se haya incorporado en los cromosomas anfitriones. Cuando un vector está siendo mantenido por una célula hospedera, el vector puede ser establemente replicado por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, o bien se incorpora dentro del genoma de la hospedera.

Como se utiliza en la presente, el término "promotor" incluye todas las secuencias capaces de impulsar la transcripción de una secuencia de codificación en una célula, por ejemplo una célula de planta. Por consiguiente, los promotores utilizados en las construcciones de la invención incluyen los elementos; de control de transcripción de acción cis, y las secuencias reguladoras que están involucradas en la regulación o modulación del tiempo y/o velocidad de transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de transcripción de acción cis, incluyendo un potenciador, un promotor, un terminador de transcripción, un origen de réplica, una secuencia de integración cromosómica, las regiones no traducidas 5' y 3' , o una secuencia intrónica, que estén involucrados en la regulación de la transcripción. Estas secuencias de acción cis normalmente interactúan con las proteínas u otras biomoléculas para llevar a cabo (activar/ desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción. Los promotores "constitutivos" son aquéllos que impulsan la expresión continuamente bajo la mayoría de las condiciones medio-ambientales y estados de desarrollo o de diferenciación celular. Los promotores "inducibles" o "regulables" dirigen la expresión del ácido nucleico de la invención bajo la influencia de las condiciones medio-ambientales o de las condiciones del desarrollo. Los ejemplos de las condiciones medio-ambientales que pueden afectar la transcripción mediante promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, sequía, o la presencia de luz.

Los promotores "específicos del tejido" son elementos de control de transcripción que solamente están activos en células o tejidos u órganos particulares, por ejemplo en plantas o animales. La regulación específica del tejido se puede lograr mediante ciertos factores intrínsecos que aseguran que se expresen los genes que codifican proteínas específicas para un tejido dado. Se sabe que estos factores existen en mamíferos y plantas para permitir que se desarrollen tejidos específicos.

El término "planta" incluye plantas enteras, partes de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, flores, raíces, etc.), protoplastos de plantas, semillas, y células de plantas, y la progenie de las mismas. La clase de plantas que se puede utilizar en el método de la invención es en general tan amplia como la clase de plantas superiores susceptibles a las técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), así como gimnospermas . Incluye las plantas de una variedad de niveles ploideos, incluyendo los estados poliploide, diploide, haploide, y hemicigótico . Como se utiliza en la presente, el término "planta transgénica" incluye plantas o células de plantas en las que se haya insertado una secuencia de ácido nucleico heteróloga, por ejemplo los ácidos nucleicos y diferentes construcciones recombinantes (por ejemplo, casetes de expresión) de la invención.

Los "plásmidos" pueden estar comercialmente disponibles, públicamente disponibles sobre una base sin restricciones, o se pueden construir a partir de los plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Los plásmidos equivalentes a los descritos en la presente son conocidos en la materia y serán evidentes para el técnico en la materia.

"Aminoácido" o "secuencia de aminoácidos", como se utilizan en la presente, se refieren a una secuencia de oligopép-tido, péptido, polipéptido, o proteína, o a un fragmento, porción, o subunidad de cualquiera de éstos, y a moléculas que se presenten naturalmente o sintéticas.

"Aminoácido" o "secuencia de aminoácidos" incluyen una secuencia de oligopéptido, péptido, polipéptido, o proteína, o a un fragmento, porción, o subunidad de cualquiera de éstos, y a moléculas que se presenten naturalmente o sintéticas. El término "polipéptido", como se utiliza en la presente, se refiere a los aminoácidos unidos unos a otros por enlaces peptídicos o por enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos modificados diferentes de los 20 aminoácidos codificados por el gen. Los polipéptidos se pueden modificar ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento posterior a la traducción, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en este campo. Las modificaciones se pueden presentar en cualquier parte del polipéptido, incluyendo la estructura base del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos, y los términos amino o carboxilo. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo o diferentes grados en varios sitios de un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación con ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de un fosfitidilinositol , ciclación reticulante, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoila-ción, oxidación, pegilación, procesamiento de hidrolasa de xilano, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, y adición mediada por AR de transferencia de aminoácidos a la proteína, tal como arginilación. (Ver Creighton, T. E. , Proteins-Structure and Molecular Properties , 2a. edición, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993) ; Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, editor, Academic Press, Nueva York, páginas 1-12 (1983)). Los péptidos y polipéptidos de la invención también incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas" , como se describen con mayor detalle más adelante.

Como se utiliza en la presente, el término "aislado" significa que el material se remueve de su medio ambiente original (por ejemplo, el medio ambiente natural si se presenta naturalmente) . Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se presente naturalmente, presente en un animal vivo, no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Estos polinucleótidos podrían ser parte de un vector, y/o estos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición y todavía estar aislados, porque ese vector o composición no es parte de su medio ambiente natural.

Como se utiliza en la presente, el término "purificado" no requiere de una pureza absoluta; más bien, se pretende como una definición relativa. Los ácidos nucleicos individuales obtenidos a partir de una biblioteca, se han purificado convencionalmente hasta la homogeneidad electroforética . Las secuencias obtenidas a partir de estos clones no pudieron obtenerse de una manera directa, ya sea de la biblioteca o bien del ADN humano total. Los ácidos nucleicos purificados de la invención se han purificado a partir del resto del ADN genómico en el organismo por cuando menos 104 a 106 veces. Sin embargo, el término "purificado" también incluye los ácidos nucleicos que se han purificado del resto del ADN genómico, o de otras secuencias de una biblioteca, o de otro medio ambiente, por cuando menos un orden de magnitud, normalmente dos o tres órdenes, y más típicamente cuatro o cinco órdenes de magnitud.

Como se utiliza en la presente, el término "recombinan-te" significa que el ácido nucleico está adyacente a un ácido nucleico de "estructura base" al cual no está adyacente en su medio ambiente natural. Adicionalmente, para estar "enriqueci-dos", los ácidos nucleicos representarán el 5 pro ciento o más del número de insertos de ácidos nucleicos en una población de moléculas de estructuras bases de ácidos nucleicos. Las moléculas de estructuras bases de conformidad con la invención incluyen ácidos nucleicos tales como vectores de expresión, ácidos nucleicos auto-replicantes, virus, ácidos nucleicos de integra- ción, u otros vectores o ácidos nucleicos utilizados para mantener o manipular un inserto de ácido nucleico de interés. Normalmente, los ácidos nucleicos enriquecidos representan el 15 por ciento o más del número de insertos de ácidos nucleicos en la población de moléculas de estructuras bases recombinantes . Más típicamente, los ácidos nucleicos enriquecidos representan el 50 por ciento o más del número de insertos de ácidos nucleicos en la población de moléculas de estructuras bases recombinantes.- En un aspecto, los ácidos nucleicos enriquecidos representan el 90 por ciento o más del número de insertos de ácidos nucleicos en la población de moléculas de estructuras bases recombinantes.

Polipéptidos o proteínas "recombinantes" se refieren a los polipéptidos o proteínas producidas mediante técnicas de ADN recombinante ; es decir, producidas a partir de células transformadas mediante una construcción de ADN exógena que codifique el polipéptido o la proteína deseada. Los polipéptidos o proteínas "sintéticas" son aquéllas preparadas mediante síntesis química. También se pueden emplear métodos de síntesis química de péptidos en fase sólida, para sintetizar el polipéptido o los fragmentos de la invención. Estos métodos se han conocido en la materia desde principios de la década de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. , 85: 2149-2154, 1963), (ver también Stewart, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. edición, Pierce Chemical Co . , Rockford, Illinois, Estados Unidos, páginas 11-12) ) , y recientemente se han empleado en estuches de diseño y síntesis de péptidos de laboratorio comercialmente disponibles (Cambridge Research Biochemicals) . Estos estuches de laboratorio comercialmente disponibles han utilizado en general las enseñanzas de H. M. Geysen y colaborado-res, Proc. Nati. Acad. Sci., U.S.A., 81: 3998 (1984), y proporcionan la síntesis de péptidos sobre las puntas de una multitud de "varillas" o "picos", todos los cuales se conectan a una sola placa. Cuando se utiliza este sistema, se invierte una placa de varillas o picos, y se inserta en una segunda placa de pozos o depósitos correspondientes, que contienen soluciones para unir o anclar un aminoácido apropiado a las puntas de los picos o varillas. Mediante la repetición de este paso del proceso, es decir, invertir e insertar las puntas de las varillas y picos en las soluciones apropiadas, se construyen los aminoácidos hasta obtener los péptidos deseados. En adición, están disponibles un número de sistemas de síntesis de péptidos FMOC. Por ejemplo, se puede llevar a cabo el ensamble de un polipéptido o fragmento sobre un soporte sólido utilizando un sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems, Inc., modelo 431A. Este equipo proporciona un fácil acceso a los péptidos de la invención, ya sea mediante síntesis directa o bien mediante la síntesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar empleando otras técnicas conocidas .

Una secuencia promotora está "operativamente enlazada a" una secuencia de codificación, cuando la polimerasa de AR que inicia la transcripción en el promotor, transcribe la secuencia de codificación en el ARNm.

Los "plásmidos" están designados por una "p" minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida en la presente están comercialmente disponibles, están públicamente disponibles sobre una base sin restricciones, o se pueden construir a partir de los plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. En adición, en la materia se conocen plásmidos equivalentes a los descritos en la presente, y serán evidentes para el técnico en la materia.

"Digestión" del ADN se refiere a la disociación catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa solamente en ciertas secuencias del ADN. Las diferentes enzimas de restricción utilizadas en la presente están comercialmente disponibles, y se utilizaron sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos como serían conocidos por el técnico ordinario. Para propósitos analíticos, normalmente se utiliza 1 microgramo del plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 microlitros de solución reguladora del pH. Para el propósito de aislar los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, normalmente se digieren de 5 a 50 microgramos de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen más grande. Las cantidades apropiadas de reguladores del pH y de sustrato para las enzimas de restricción particulares son especificadas por el fabricante. Ordinariamente se emplean tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37°C, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión, se puede llevar a cabo eletroforesis en gel para aislar el fragmento deseado.

La frase " sustancialmente idéntica" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos , se refiere a dos o ;más secuencias que tienen, por ejemplo, una identidad de nucleótidos o residuos de aminoácidos (de secuencia) de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 por ciento; 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento , 60 por ciento, 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento , 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento, 81 ¡ por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 ; por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89' por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 ; por ciento, 94 por ciento , 95 por ciento, 96 por ciento, 97 ; por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, o más, al compararse y alinearse para una máxima correspondencia, al medirse utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias conocidos, o mediante inspección visual. Normalmente, existe una identidad sustancial sobre una región de cuando menos aproximadamente 100 residuos, y más comúnmente, las secuencias son sustancialmente idénticas sobre cuando menos aproximadamente 150 a 200 residuos. En algunos aspectos, las secuencias son sustancialmente idénticas sobre toda la longitud de las regiones codificantes.

Adicionalmente , una secuencia de aminoácidos "sustancialmente idéntica" es una secuencia que difiere, de una secuencia de referencia por una o más sustituciones, supresiones, o inserciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, en particular cuando esta sustitución se presenta en un sitio que no es el sitio activo de la molécula, y en el entendido de que el polipéptido retenga esencialmente sus propiedades funcionales. Por ejemplo, una sustitución de aminoácido conservadora sustituye un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, la sustitución de un aminoácido hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina, o metionina, por otro, o la sustitución de un aminoácido polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina) . Se pueden suprimir uno o más aminoácidos, ' por ejemplo, de un polipéptido de xilanasa, dando como resultado la modificación de la estructura del polipéptido, sin alterar de una manera significativa su actividad biológica. Por ejemplo, se pueden remover los aminoácidos amino- o carboxilo-terminales que no sean requeridos para la actividad biológica de la xilanasa. Las secuencias de polipéptidos modificadas de la invención se pueden ensayar para determinar la actividad biológica de la xilanasa, mediante cualquier número de métodos, incluyendo poner en contacto la secuencia de polipéptido modificada con un sustrato de xilanasa, y determinar si el polipéptido modificádo reduce la cantidad de sustrato específico en el ensayo, o aumenta los bioproductos de la reacción enzimática de un polipéptido de xilanasa funcional con el sustrato.

"Fragmentos", como se utilizan en la presente, son una porción de una proteína que se presenta naturalmente, los cuales pueden existir en cuando menos dos conformaciones diferentes. Los fragmentos pueden tener la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína que se presenta naturalmente. "Sustancialmente la misma" significa que 1 la secuencia de aminoácidos es en gran parte, pero no enteramente, la misma, pero retiene cuando menos una actividad funcional de la secuencia con la que está relacionada. En general, dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente la misma" o "sustancialmente homologas " si son cuando menos aproximadamente el 85 por ciento idénticas. También se incluyen los fragmentos que tengan estructuras tridimensionales diferentes de la protéína que se presente naturalmente. Un ejemplo de esto es una molécula de "pro-forma", tal como una proproteína de baja actividad , que se pueda modificar mediante disociación para producir una enzima madura con una actividad significativamente más alta.

"Hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de emparejamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas, de tal manera que se puede identificar una secuencia particular de interés, inclusive en muestras en las que esté presente en bajas concentraciones. Las condiciones adecuadamente restringentes se pueden definir, por ejemplo, por las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibridación y de hibridación, o por la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la materia. En particular, la astringencia se puede incrementar mediante la reducción de la concentración de sal, el incremento de la concentración de formamida, o la elevación de la temperatura de hibridación. En aspectos alternativos, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo diferentes condiciones de astringencia (por ejemplo, alta, media, y baja) , como se estipula en la presente.

Por ejemplo, se podría presentar una hibridación bajo condiciones de alta astringencia en aproximadamente el 50 por ciento de formamida a aproximadamente 37°C a 42°C. La hibridación se podría presentar bajo condiciones de astringencia reducida en de aproximadamente el 35 por ciento al 25 por ciento de formamida de aproximadamente 30°C a 35°C. En particular, la hibridación se podría presentar bajo condiciones de alta astringencia a 42°C en el 50 por ciento de formamida, SSPE 5X, SDS al 0.3 por ciento, y 200 n/ml de ADN de esperma de salmón desgarrado y desnatural!- zado. La hibridación podría presentarse bajo condiciones de astringencia reducida, como se describe anteriormente, pero en el 35 por ciento de formamida a una temperatura reducida de 35°C. El intervalo de temperatura correspondiente a un nivel particular de astringencia se puede estrechar adicionalmente mediante el cálculo de la proporción de purina a pirimidina del ácido nucleico de interés, y ajustando la temperatura de conformidad con lo mismo. Las variaciones sobre los intervalos y condiciones anteriores son bien conocidas en la materia.

El término "variante" se refiere a polinucleótidos o polipéptidos de la invención, modificados en uno o más pares de bases, codones, intrones, exones, o residuos de aminoácidos (respectivamente) , y no obstante, todavía retienen la actividad biológica de una xilanasa de la invención. Se pueden producir variantes mediante cualquier número de elementos incluidos los métodos tales como reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida por el oligonucleóti'do, reacción en cadena de la polimerasa de ensamble, mutagénesis con reacción en cadena de la polimerasa sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, re-ensamble genético (por ejemplo, GeneReassembly®, ver, por ejemplo, la patente US 6,537,776), GSSM®, y cualquier combinación de los mismos.

La Tabla 1 y la Tabla 2 enlistan las variantes obtenidas mediante la mutación de la SEQ ID NO: 189 (que codifica la SEQ ID NO: 190) mediante GSSM®. La invención proporciona ácidos nucleicos que tienen una o más de, o todas, las secuencias estipuladas en las Tablas 1 y 2, es decir, ácidos nucleicos que tiene secuencias que son variantes de la SEQ ID NO: 189, en donde las variaciones se estipulan en la Tabla 1 y en la Tabla 2, y los polipéptidos que son codificados por estas variantes.

Estas variantes de GSSM® (estipuladas en las Tablas 1 y 2) se probaron para determinar la tolerancia térmica (ver los Ejemplos más adelante) . Se encontró que los mutantes D, F, G, H, I, J, K, S, T, U, V, W, X, Y, Z, AA, DD y EE tienen la más alta tolerancia térmica entre los mutantes de la Tabla 1. Los mutantes también se pueden combinar para formar un mutante más grande . Por ejemplo, los mutantes D, F, H, I, S, V, X, y AA de la Tabla 1, se combinaron para formar un mutante más grande denominado "8x" con una secuencia como se estipula en la SEQ ID NO: 375 (ácido nucleico que codifica al polipéptido) y en la SEQ ID NO: 376 (secuencia de aminoácidos) . La Figura 5 es una gráfica que compara la actividad de la secuencia de tipo silvestre (SEQ ID NOS: 189 y 190) con la del mutante 8x (SEQ ID NOS: 259 y 260).

En la comparación del tipo silvestre y del mutante 8x, se descubrió que la temperatura óptima para ambos era de 65°C, y que el pH óptimo para ambos era de 5.5. Se encontró que la secuencia de tipo silvestre mantiene su estabilidad durante menos de 1 minuto a 65°C, mientras que se encontró que el mutante 8x (SEQ ID NOS: 375, 376) mantiene su estabilidad durante más de 10 minutos a 85°C. El sustrato utilizado fue AZO-AZO-xilano. En un aspecto, el mutante 8x (SEQ ID NOS : 375, 376) se hizo evolucionar mediante GSS ®. En otro aspecto, el tipo silvestre es un progenitor de GSSM® para la evolución de la tolerancia térmica.

Tabla 1 Mutante Mutación Sec.Tipo Silvestre Sec.GSSM® A A2F GCC TTT B A2D GCC GAC C A5H GCT CAC D D8F GAC TTC E Q11L CAA CTC F Q11H CAA CAC G N12L AAT TTG H N12L AAT TTG I G171 GGT ATA J Q11H, T23T CAA, ACC CAT, ACG K Q11H CAA CAT L S26P TCT CCG M S26P TCT CCA N S35F TCA TTT 0 Sin Cambio GTT GTA P A51P GCA CCG Q A51P GCA CCG R G60R GGA CGC S G60H GGA CAC T G60H GGA CAC U P64C CCG TGT V P64V CCG GTA W P64V CCG GTT X S65V TCC GTG Y QIIH CAA CAT Z G68I GGA ATA AA G68A GGA GCT BB A71G GCT GGA CC Sin Cambio AAT AAC DD S79P TCA CCA EE S79P TCA CCC FF T95S ACT TCT GG Y 8P TAT CCG HH T114S ACT AGC II Sin Cambio AAC AAC JJ Sin Cambio AGG AGA KK I142L ATT CTG LL S151I AGC ATC MM S138T,S151A TCG, AGC ACG, GCG K158R AAG CGG 00 K160V,V172I AAA, GTA GTT, ATA Las variantes de codones estipuladas en las Tabla 2 que produjeron las variantes (de la SEQ ID NO: 189) con la mejor variación o "mejora" sobre el "tipo silvestre" (SEQ ID NO: 189) en tolerancia térmica, están resaltadas. Como se observa anteriormente, la invención proporciona ácidos nucleicos, y los ? polipéptidos que los codifican, los cuales comprenden una, varias, o todas las variaciones estipuladas en la Tabla 2 y en la Tabla 1.

Tabla 2 Mutación Sec .Tipo Sec . de Otros codones que Silvestre GSSM® también codifican para el mismo ami noácido cambiado A2F GCC TTT TTC A2D GCC GAC GAT A5H GCT CAC CAT D8F GAC TTC TTT Q11L CAA CTC TTA, TTG, CTT, CTA, CTG Q11H CAA CAC, CAT - - N12L AAT TTG TTA, CTC, CTT, CTA, CTG G17I GGT ATA ATT, ATC T23T ACC ACG ACT, ACC, ACA S26P CT CCG, CCA CCC S35F TCA TTT TC A51P GCA CCG CCC, CCA G60R GGA CGC CGT , CGA, CGG, AGA, AGG G60H GGA CAC CAT P64C CCG TGT TGC P64V CCG GTA, GTT GTC, GTG S65V TCC GTG GTC, GTA, GTT G68I GGA ATA ATT, ATC G68A GGA GCT GCG, GCC,GCA A71G GCT GGA GGT, GGC , GGG S79P TCA CCA, CCC CCG T95S ACT TCT TCC , TCA, TCG, AGT, AGC Y98P TAT CCG CCC, CCA T114S ACT AGC TCC , TCA, TCG, AGT, TCT I142L ATT CTG TTA, CTC, CTT, CTA, TTG S151I AGC ATC ATT , ATA S138T TCG ACG ACT,ACC,ACA S151A AGC GCG GCT,GCC,GCA K158R AAG CGG CGT , CGA, CGC , AGA, AGG K160V AAA GTT GTC, GTA, GTG V172I GTA ATA ATT, ATC En un aspecto, la secuencia de aminoácidos de secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 208) de las secuencias aminoácidos del Grupo B se modifica mediante una sola mutación de aminoácido. En un aspecto específico, esta mutación es una mutación de asparagina a ácido aspártico. La secuencia de aminoácidos resultante y la secuencia de ácido nucleico corres-pondiente se estipulan como las SEQ ID NO: 252 y SEQ ID NO: 251, respectivamente. Con respecto a las xilanasas, en la materia se han mostrado las mutaciones de aminoácidos individuales con una mejora en el pH óptimo de la enzima, tal como la mutación de la SEQ ID NO: 208. (Ver, por ejemplo, Joshi, M . , Sidhu, G. , Pot, I., Brayer, G., Withers, S., Mclntosh, L., J. Mol. Bio. 299, 255-279 (2000) ) . También se observa que en estas mutaciones de aminoácidos individuales, se pueden remover porciones de las secuencias en el proceso de subclonación. Por ejemplo, las SEQ ID NO: 207 y SEQ ID NO: 251 difieren en solamente un nucleótido, sobre el área en la que se alinean las secuencias. Sin embargo, se observa que se removió un área de 78 nucleótidos en el término N de la SEQ ID NO: 207 desde el término N de la SEQ ID NO: 251 en la subclonación. Adicionalmente , los primeros tres nucleótidos de la SEQ ID NO: 251 se cambiaron a ATG, y luego se hizo la mutación puntual en el sexto nucleótido de la SEQ ID NO: 251.

El término "mutagénesis de saturación" , "mutagénesis saturada del sitio genético", o "GSSM®", incluye un método que utiliza cebadores de oligonucleótidos degenerados para introducir mutaciones puntuales en un polinucleótido, como se describe con detalle más adelante.

El término "sistema optimizado de evolución dirigida" o "evolución dirigida optimizada", incluye un método para re-ensamblar fragmentos de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas, por ejemplo genes relacionados, y se explica con detalle más adelante .

El término "re-ensamble de ligamiento sintético" o "SLR" incluye un método de ligamiento de fragmentos de oligonu-cleótidos en una forma no estocástica, y se explica con detalle más adelante.

Generación v Manipulación de Ácidos Nucleicos La invención proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ IDINO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:, 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117,' SEQ ID NO: 119 SEQ ID NO 121 SEQ ID NO: 123 SEQ ID NO: 125, ID NO: 127 SEQ ID NO 129 SEQ ID NO: 131 SEQ ID NO: 133 ID NO: 135 SEQ ID NO 137 SEQ ID NO: 139 SEQ ID NO: 141, ID NO: 143 SEQ ID NO 145 SEQ ID NO: 147 SEQ ID NO: 149, ID NO: 151 SEQ ID NO 153 SEQ ID NO: 155 SEQ ID NO: 157, ID NO: 159 SEQ ID NO 161 SEQ ID NO: 163 SEQ ID NO: 165, ID NO: 167 SEQ ID NO 169 SEQ ID NO: 171 SEQ ID NO: 173, ID NO: 175 SEQ ID NO 177 SEQ ID NO: 179 SEQ ID NO: 181, ID NO: 183 SEQ ID NO 185 SEQ ID NO: 187 SEQ ID NO: 189, ID NO: 191 SEQ ID NO 193 SEQ ID NO: 195 SEQ ID NO: 197, ID NO: 199 SEQ ID NO 201 SEQ ID NO: 203 SEQ ID NO: 205 ID NO: 207 SEQ ID NO 209 SEQ ID NO: 211 SEQ ID NO: 213 ID NO: 215 SEQ ID NO 217 SEQ ID NO: 219 SEQ ID NO: 221, ID NO: 223 SEQ ID NO 225 SEQ ID NO: 227 SEQ ID NO: 229, ID NO: 231 SEQ ID NO 233 SEQ ID NO: 235 SEQ ID NO: 237, ID NO: 239 SEQ ID NO 241 SEQ ID NO: 243 SEQ ID NO: 245, ID NO: 247 SEQ ID NO 249 SEQ ID NO: 251 SEQ ID NO: 253 ID NO: 255 SEQ ID NO 257 SEQ ID NO: 259 SEQ ID NO: 261, ID NO: 263 SEQ ID NO 265 SEQ ID NO: 267 SEQ ID NO: 269, ID NO: 271 SEQ ID NO 273 SEQ ID NO: 275 SEQ ID NO: 277, ID NO: 279 SEQ ID NO 281 SEQ ID NO: 283 SEQ ID NO: 285, ID NO: 287 SEQ ID NO 289 SEQ ID NO: 291 SEQ ID NO: 293 ID NO: 295 SEQ ID NO 297 SEQ : NO : 299, SEQ ID NO: 301, ID NO: 303 SEQ ID NO 305 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 309, ID NO: 311 SEQ ID NO 313 SEQ ID NO: 315 SEQ ID NO: 317, ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ D NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 O SEQ ID NO: 379, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos estipulados en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70,! SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO : 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO : 136, SEQ ID NO: 138 SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO 142 SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO: 146 SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO 150 SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 154 SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO 158 SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO 166 SEQ ID NO: 168 SEQ ID NO: 170 SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO 174 SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO 182 SEQ ID NO: 184 SEQ ID NO: 186 SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO 190 SEQ ID NO: 192 SEQ ID NO: 194 SEQ ID NO: 196 SEQ ID NO 198 SEQ ID NO: 200 SEQ ID NO: 202 SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO 206 SEQ ID NO: 208 SEQ ID NO: 210 SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO 214 SEQ ID NO: 216 SEQ ID NO: 218 SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO 222 SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO 230 SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO 238 SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO 246 SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO 254 SEQ ID NO: 256 SEQ ID NO: 258 SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO 262 SEQ ID NO: 264 SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO 270 SEQ ID NO: 272 SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO 278 SEQ ID NO: 280 SEQ ID NO: 282 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO 286 SEQ ID NO: 288 SEQ ID NO: 290 SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO 294 SEQ ID NO: 296 SEQ ID NO: 298 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO 302 SEQ ID NO: 304 SEQ ID NO: 306 SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO 310 SEQ ID NO: 312 SEQ ID NO: 314 SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO 318 SEQ ID NO: 320 SEQ ID NO: 322 SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO 326 SEQ ID NO: 328 SEQ ID NO: 330 SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO 334 SEQ ID NO: 336 SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378 o SEQ ID NO: 380) , incluyendo casetes de expresión tales como vectores de expresión, que codifican los polipéptidos de la invención. La invención también incluye métodos para descubrir nuevas secuencias de xilanasa utilizando los ácidos nucleicos de la invención. La invención también incluye métodos para inhibir la expresión de los genes, transcripciones y polipéptidos de xilanasa, utilizando los ácidos nucleicos de la invención. También se proporcionan métodos para modificar los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo mediante reensamble de ligamiento sintético, sistema optimizado de evolución dirigida, y/o mutagénesis de saturación.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden hacer, aislar, y/o manipular, por ejemplo, mediante la clonación y expresión de bibliotecas de ADNc, amplificación de mensaje o ADN genómico mediante reacción en cadena de la polimerasa, y similares. Por ejemplo, las siguientes secuencias de ejemplo de la invención inicialmente se derivaron a partir de las siguientes fuentes : Tabla 3 SEO ID NO: FUENTE 1, 2 Bacteria 101, 102 Medio-ambiental 103 104 Bacteria 105 106 Medio-ambiental 107 108 Bacteria 109 110 Medio-ambiental 11, 12 Medio-ambiental 111 112 Medio-ambiental 113 114 Medio-ambiental 115 116 Medio-ambiental 117 118 Medio-ambiental 119 120 Medio-ambiental 121 122 Medio-ambiental 123 124 Medio-ambiental 125 126 Medio-ambiental 127 128 Medio-ambiental 129 130 Bacteria 13, 14 Medio-ambiental 131 132 Medio-ambiental 133 134 Medio-ambiental 135 136 Medio-ambiental 137 138 Medio-ambiental 139 140 Medio-ambiental 141 142 Medio-ambiental 143 144 Bacteria 145 146 Eucariote 147 148 Medio-ambiental 149 150 Medio-ambiental 15, 16 Medio-ambiental 151 152 Medio-ambiental 153 154 Medio-ambiental 155 156 Medio-ambiental 157 158 Medio-ambiental 159 160 Medio-ambiental 161 162 Medio-ambiental 163 164 Medio-ambiental 165 166 Medio-ambiental 167 168 Medio-ambiental 169 170 Medio-ambiental 17, 18 Bacteria 171 172 Medio-ambiental 173 174 Medio-ambiental 175 176 Medio-ambiental 177 178 Medio-ambiental 179 180 Medio-ambiental 181 182 Medio-ambiental 183 184 Medio-ambiental 185 186 Medio-ambiental 187, 188 Medio-ambiental 189, 190 Medio-ambiental 19, 20 Medio-ambiental 191, 192 Medio-ambiental 193, 194 Medio-ambiental 195, 196 Medio-ambiental 197, 198 Medio-ambiental 199, 200 Medio-ambiental 201, 202 Medio-ambiental 203, 204 Medio-ambiental 205, 206 Medio-ambiental 207 , 208 Medio-ambiental 209, 210 Medio-ambiental 21, 22 Medio-ambiental 211, 212 Medio-ambiental 213 214 Medio-ambiental 215 216 Medio-ambiental 217 218 Medio-ambiental 219 220 Medio-ambiental 221 222 Medio-ambiental 223 224 Medio-ambiental 225 226 Medio-ambiental 227 228 Medio-ambiental 229 230 Medio-ambiental 23, 24 Medio-ambiental 231, 232 Bacteria 233, 234 Medio- ambiental 235, 236 Medio- ambiental 237, 238 Medio- ambiental 239, 240 Medio- ambiental 241, 242 Medio- ambiental 243, 244 Medio- ambiental 245, 246 Medio- ambiental 247, 248 Medio- ambiental 249, 250 Medio-•ambiental 25, 26 Medio- ambiental 251, 252 Medio-¦ambiental 253, 254 Medio- ambiental 255, 256 Medio-¦ambiental 257, 258 Medio-¦ambiental 259, 260 Medio- ambiental 261, 262 Medio-¦ambiental 263, 264 Medio- ambiental 265, 266 Medio- ambiental 267, 268 Bacteria 269, 270 Medio-¦ambiental 27, 28 Medio-¦ambiental 271, 272 Medio-¦ambiental 273, 274 Medio-¦ambiental 275, 276 Medio-¦ambiental 277, 278 Medio-ambiental 279, 280 Medio-ambiental 281, 282 Medio-ambiental 283, 284 Medio-ambiental 285, 286 Medio-ambiental 287, 288 Medio-ambiental 289, 290 Medio-•ambiental 29,30 Aquea 291, 292 Medio- ambiental 293, 294 Medio- ambiental 295, 296 Medio- ambiental 297, 298 Medio- ambiental 299, 300 Medio- ambiental 3, 4 Medio- ambiental 301, 302 Medio-¦ambiental 303, 304 Medio- ambiental 305, 306 Bacteria 307, 308 Medio- ambiental 309, 310 Medio- ambiental 31,32 Medio- ambiental 311, 312 Medio- ambiental 313, 314 Bacteria 315, 316 Medio- ambiental 317, 318 Medio- ambiental 319, 320 Medio- ambiental 321 322 Medio- ambiental 323 324 Medio- ambiental 325 326 Medio- ambiental 327 328 Medio- ambiental 329 330 Medio- ambiental 33, 34 Medio- ambiental 331 332 Medio- ambiental 333 334 Medio- ambiental 335 336 Medio- ambiental 337 338 Medio- ambiental 339 340 Medio- ambiental 341 342 Medio- ambiental 343 344 Medio- ambiental 345 346 Medio- ambiental 347 348 Medio- ambiental» 349 350 Medio- ambiental 35, 36 Medio- ambiental 351 352 Medio- ambiental 353 354 Medio- ambiental 355 356 Medio- ambiental 357 358 Medio-¦ambiental 359 360 Medio-¦ambiental 361 362 Medio-¦ambiental 363 364 Medio-•ambiental 365 366 Medio¬¦ambiental 367, 368 Medio-ambiental 369, 370 Medio-ambiental 37, 38 Medio-ambiental 371, 372 Medio-ambiental 373, 374 Medio-ambiental 375, 376 Artificial 377, 378 Artificial 39, 40 Medio-ambiental 41 42 Medio-ambiental 43 44 Medio-ambiental 45 46 Medio-ambiental 47 48 Medio-ambiental 49 50 Medio-ambiental 5, Medio-ambiental 51 52 Medio-ambiental 53 54 Bacteria 55 56 Medio-ambiental 57 58 Medio-ambiental 59 60 Medio-ambiental 61 62 Medio-ambiental 63 64 Medio-ambiental 65 66 Medio-ambiental 67 68 Medio-ambiental 69 70 Medio-ambiental 7, 8 Medio-ambiental 71, 72 Medio-ambiental 73, 74 Medio-ambiental 75, 76 Medio-ambiental 77, 78 Medio-ambiental 79, 80 Medio-ambiental 81, 82 Medio-ambiental 83, 84 Medio-ambiental 85, 86 Bacteria 87, 88 Medio-ambienta 89, 90 Bacteria 9, 10 Medio-ambiental 91, 92 Medio-ambiental 93, 94 Medio-ambiental 95, 96 Medio-ambiental 97, 98 Medio-ambiental 99, 100 Medio-ambiental En un aspecto, la invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican xilanasa con una novedad común, en que se derivan de una fuente medio-ambiental , o de una fuente bacteriana, o de una fuente arqueal .

En la práctica de los métodos de la invención, los genes homólogos se pueden modificar mediante la manipulación de un ácido nucleico de plantilla, como se describe en la presente. La invención se puede practicar en conjunto con cualquier método o protocolo o dispositivo conocido en la materia, los cuales se describen bien en la literatura científica y de patente.

Un aspecto de la invención es un ácido nucleico aislado que comprende una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, las secuencias complementarias para las mismas, o un fragmento que comprende cuando menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 bases consecutivas de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A (o las secuencias complementarias para las mismas) . Los ácidos nucleicos aislados pueden comprender ADN, incluyendo ADNc, ADN genómico, y ADN sintético. El ADN puede ser de doble cadena o de una sola cadena, y si es de una sola cadena, puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (anti-sentido) . De una manera alternativa, los ácidos nucleicos aislados pueden comprender ARN.

Como se describe con mayor detalle más adelante, los ácidos nucleicos aislados de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, se pueden utilizar para preparar uno de los polipép-tidos de una secuencia de aminoácidos del Grupo B, y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprendan cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

De conformidad con lo anterior, otro aspecto de la invención es un ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprenden cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B. Las secuencias de codificación de estos ácidos nucleicos pueden ser idénticas a una de las secuencias de codificación de uno de los ácidos nucleicos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, o un fragmento de las mismas, o pueden ser secuencias de codificación diferentes que codifiquen uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y fragmentos que tengan cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, como un resultado de la redundancia o degeneración del código genético. El código genético es bien conocido por los técnicos en este campo, y se puede obtener, por ejemplo, en la página 214 de B. Lewin, Genes VI , Oxford Univer-sity Press, 1997.

El ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, puede incluir, pero no se limita a: solamente la secuencia de codificación de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A and secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y secuencias de codificación adicionales, tales como secuencias delanteras o secuencias de proproteína y secuencias no codificantes, tales como intrones, o secuencias no codificantes 5' y/o 3' de la secuencia de codificación. Por consiguiente, como se utiliza en la presente, el término "polinucleótido que codifica un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye solamente la secuencia de codificación para el polipéptido, así como un polinucleótido que incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales .

De una manera alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, se pueden mutar empleando técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida al sitio, u otras técnicas familiares para los técnicos en la materia, con el fin de introducir cambios silenciosos en los polinucleótidos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. Gomo se utilizan en la presente, "cambios silenciosos" incluyen, por ejemplo, los cambios que no alteren la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido. Estos cambios pueden ser deseables con el objeto de aumentar el nivel del polipéptido producido por las células hospederas que contengan un vector que codifique al polipéptido, mediante la introducción de codones o pares de codones que se presenten con frecuencia en el organismo hospedero .

La invención también se refiere a los polinucleótidos que tienen cambios de nucleótidos que dan como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones, y truncaciones de aminoácidos en los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. Estos cambios de nucleótidos se pueden introducir empleando técnicas tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, supresión de exonucleasa III, y otras técnicas de ADN recombinante . De una manera alternativa, estos cambios de nucleótidos pueden ser variantes alélicas que se presenten naturalmente, las cuales se aislan mediante la identificación de los ácidos nucleicos que se hibriden específi-camente a las sondas que comprendan cuando menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 bases consecutivas de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas (o las secuencias complementarias para las mismas) , bajo condiciones de astringencia alta, moderada, o baja, como se dispone en la presente.

Técnicas Generales Los ácidos nucleicos utilizados para practicar esta invención, ya sean ARN, ARNi, ácido nucleico anti-sentido, ADNc, ADN genómico, vectores, virus o híbridos de los mismos, se pueden aislar a partir de una variedad de fuentes, se pueden diseñar genéticamente, se pueden amplificar, y/o se pueden expresar/generar de una manera recombinante . Los polipéptídos recombinantes (por ejemplo, xilanasas) generados a partir de estos ácidos nucleicos, se pueden aislar o clonar individualmente, y se pueden probar para determinar una actividad deseada. Se puede utilizar cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo los sistemas de expresión bacterianos, de mamífero, de levadura, o de células de insectos o plantas.

De una forma alternativa, estos ácidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro, mediante técnicas de síntesis química bien conocidas, como se describen, por ejemplo, en Adams (1983) J. Am. Chem. Soc . 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radie. Biol . Med. 19: 373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol . 68: 109; Beaüca-ge(1981) Tetra. Lett. 22:1859; patente US 4,458,066. , ! Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, subclonación, sondas marcadoras (por ejemplo, marcado con cebador aleatorio utilizando polimerasa Klenow, traducción simulada, amplificación) , secuenciación, hibridación, y similares, se describen bien en la literatura científica y de patente, ver, por ejemplo, Sambrook, editor, MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL (2a. edición) , Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) ,- CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, editor, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION ITH NUCLEIC ACID PROBES , Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, editor, Elsevier, N.Y. (1993) .

Otro medio útil para obtener y manipular los ácidos nucleicos para practicar los métodos de la invención, es clonar a partir de muestras genómicas y, si se desea, rastrear y volver a clonar los insertos aislados o amplificados a partir de, por ejemplo, clones genómicos o clones de ADNc. Las fuentes de ácidos nucleicos utilizadas en los métodos de la invención incluyen bibliotecas genómicas o de ADNc contenidas, por ejemplo, en los cromosomas artificiales de mamífero (MACs) , ver, por ejemplo, las patentes US 5,721,118; 6,025,155; en los cromosomas artificiales humanos, ver, por ejemplo, Rosenfeld (1997) Nat . Genet . 15: 333-335; en los cromosomas artificiales de levadura (YAC) ; en los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) ; en los cromosomas artificiales Pl, ver, por ejemplo, Woon (1998) Genomics 50: 306-316; en los vectores derivados de PI (PACs) , ver, . por ejemplo, Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; en los cósmidos, virus recombinantes , fagos, o plásmidos .

En un aspecto, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, se ensambla en la fase apropiada con una secuencia delantera capaz de dirigir la secreción del polipéptido traducido o fragmento del mismo.

La invención proporciona proteínas de fusión y ácidos nucleicos que las codifican. Un polipéptido de la invención se puede fusionar con un péptido o polipéptido heterólogo, tales como los péptidos de identif cación N-terminales , los cuales imparten las características deseadas, tales como una mayor estabilidad o una purificación simplificada. Los péptidos y polipéptidos de la invención también se pueden sintetizar y expresar como proteínas de fusión con uno o más dominios adicionales enlazados a las mismas, por ejemplo, para producir un péptido más inmunogénico, para aislar más fácilmente un péptido recombinantemente sintetizado, para identificar y aislar anti-cuerpos y células B que expresen anti-cuerpos , y similares. Los dominios que facilitan la detección y purificación incluyen, por ejemplo, péptidos quelantes de metales, tales como los tractos de polihistidina y los módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, los dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de extensión/purificación por afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle, Washington, Estados Unidos) . La inclusión de secuencias enlazadoras disociables, tales como el Factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, California, Estados Unidos) entre un dominio de purificación y el péptido o polipéptido 'que comprende el motivo, facilitan la purificación. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifique al epítopo enlazada con seis residuos de histidina, seguidos por una tiorredoxina y un sitio de disociación de enteroquinasa (ver, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 404-414). Los residuos de histidina facilitan la detección y purificación, mientras que el sitio de disociación de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el epítopo del resto de la proteína: de fusión. La tecnología perteneciente a los vectores que codifican proteínas de fusión, y la aplicación dé las proteínas de fusión, se describen bien en la literatura científica y de patente, ver, por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol. , 12: 441-53.

Secuencias de control de transcripción y traducción La invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos de la invención, operativamente enlazadas a secuencias de control de expresión (por ejemplo, de transcripción o de traducción) , por ejemplo, promotoras o potenciadoras , para dirigir o modular la síntesis/expresión de AR . La secuencia de control de expresión puede estar en un vector de expresión. Los promotores bacterianos de ejemplo incluyen lacl, lacZ, T3 , T7 , gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucarióticos de ejemplo incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, quinasa de timidina de HSV, SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón.

Los promotores adecuados para expresar un polipéptido en bacterias incluyen los promotores lac o trp de E. coli, el proraotor lacl, el promotor lacZ, el promotor T3 , el promotor T7, el promotor gpt, el promotor lambda PR, el promotor lambda PL, los promotores de operones que codifican enzimas glicolíticas , tales como quinasa de 3-fosfoglicerato (PGK) , el promotor de fosfatasa de ácido. Los promotores eucarióticos incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de quinasa de timidina de HSV, los promotores de choque por calor, el promotor SV40 temprano y tardío, los LTRs de retrovirus, y el promotor de metalotioneína-I de ratón. También se pueden utilizar otros promotores que se sepa que controlan la expresión de los genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. Los promotores adecuados para expresar el polipéptido o fragmento del mismo en bacterias incluyen los promotores lac o trp de E. coli, el promotor lacJ, el promotor T3, el promotor T7, el promotor gpt, el promotor lambda PR, el promotor lambda PL, los promotores de operones que codifican enzimas glicolíticas, tales como quinasa de 3 -fosfoglicerato (PGK) , y el promotor de fosfatasa de ácido. Los promotores fúngicos incluyen el promotor del factor alfa. Los promotores eucarióticos incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de quinasa de timidina de HSV, los promotores de choque por calor, el promotor SV40 temprano y tardío, los LTRs de retrovirus, y el promotor de metalotioneína- I de ratón. También se pueden utilizar otros promotores que se sepa que controlan la expresión de los genes en las células procarióticas o eucarióticas y sus virus.

Promotores de Plantas Específicos del Tejido La invención proporciona casetes de expresión que se pueden expresar de una manera específica del tejido, por ejemplo, que pueden expresar una xilanasa de la invención de una manera específica del tejido. La invención también proporciona plantas o semillas que expresan una xilanasa de la invención de una manera específica del tejido. La especificidad del tejido puede ser específica de la semilla, específica del tallo, específica de la hoja, específica de la raíz, específica de la fruta, y similares.

En un aspecto, se puede utilizar un promotor constitutivo, tal como el promotor 35S de CaMV, para expresarse en partes específicas de la planta o la semilla, o a través de toda la planta. Por ejemplo, para la sobre-expresión, se puede emplear un fragmento de promotor de planta que dirija la expresión de un ácido nucleico en algunos o todos los tejidos de una planta, por ejemplo una planta regenerada. Estos promotores son referidos en la presente como promotores "constitutivos", y son activos bajo la mayoría de las condiciones medio-ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de los promotores constitutivos incluyen la región de inicio1 de transcripción 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV) , el promotor 1' o 2' derivado de ADN-T de Agrobacterium tu efaciens , y otras regiones de inicio de transcripción de diferentes genes de plantas conocidos por los técnicos. Estos genes incluyen, por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33: 125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank No . U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet . 251: 196-203); el gen que codifica la proteína desaturasa portadora de estearoílo-acilo de Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocorabe (1994) Plant Physiol. 104: 1167-1176); GPcl de maíz (GenBank No. X15596; Martínez (1989) J. Mol. Biol. 208 : 551-565); el Gpc2 de maíz (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33: 97-112); los promotores de plantas descritos en las patentes US 4,962,028; 5,633,440.

La invención utiliza promotores específicos del tejido o constitutivos derivados a partir de virus, los cuales pueden incluir, por ejemplo, el promotor subgenómico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92: 1679-1683; el virus baciliforme tungro de arroz (RTBV) , el cual se replica solamente en las células de floema en las plantas de arroz infectadas, con su promotor que impulsa una fuerte expresión del gen reportero específica del floema; el promotor del virus de mosaico de vena cassava (CVMV) , con su más alta actividad en los elementos vasculares, en las células del mesófilo de las hojas, y en las puntas de las raíces (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-1139) .

De una manera alternativa, el promotor de planta puede dirigir la expresión del ácido nucleico que expresa xilanasa en un tejido, órgano, o tipo de célula específico (es decir, los promotores específicos del tejido) , o puede estar de otra manera bajo un control más preciso del medio ambiente o del desarrollo, o bajo el control de un promotor inducible. Los ejemplos de las condiciones medio-ambientales que pueden afectar la transcripción incluyen las condiciones anaeróbicas, la temperatura elevada la presencia de luz, o el rociado con productos químicos/hormonas. Por ejemplo, la invención incorpora al promotor de maíz inducible por sequía (Busk (1997) supra) ; el promotor de papa inducible 'por frío, sequía, y altas sales (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33 : 897-909) .

Los promotores específicos del tejido pueden promover la transcripción solamente dentro de cierto marco de tiempo de la etapa de desarrollo dentro de ese tejido. Ver, por ejemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10: 791-800, que caracteriza, al promotor del gen LEAFY de Arabidopsis . Ver también Cardón (1997) Plant J. 12: 367-77, que describe el factor de transcripción SPL3, el cual reconoce un motivo de secuencia conservado éñ la región promotora del gen de identidad de meristemo floral API de A. thaliana; y Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Volumen' 29, páginas 995-1004, que describe el promotor de meristemo eIF4:. Se pueden utilizar promotores específicos de tejido que sean activos a través de todo el ciclo de vida de un tejido particular. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se enlazan operativamente a un promotor activo primordialmente sólo en las células de fibra de algodón. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se enlazan operativamente a un promotor activo priraordialraente durante las etapas de elongación celular de la fibra de algodón, por ejemplo como es descrito por Rinehart (1996) supra. Los ácidos nucleicos se pueden enlazar operativamente al promotor del gen Fbl2A para expresarse preferencialmente en las células de la fibra de algodón {Ibid) , Ver también John (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89: 5769-5773; John y colaboradores, patentes US 5,608,148 y 5,602,321, que describen promotores específicos de fibra de algodón y métodos para la construcción de plantas de algodón transgénicas . También se pueden utilizar los promotores específicos de la raíz para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Los ejemplos de los promotores específicos de la raíz incluyen al promotor del gen de deshidrogenasa de alcohol (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol . 123: 39-60). Otros promotores que se pueden utilizar para expresar los ácidos nucleicos de la invención incluyen, por ejemplo, los promotores específicos del óvulo, específicos del embrión, específicos del endosperma, específicos del integumento, específicos del recubrimiento de las semillas, o algunas combinaciones de los mismos; un promotor específico de la hoja (ver, por ejemplo, Busk (1997) Plant J. 11: 1285-1295, que describe un promotor específico de la hoja en maíz) ; el promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes (el cual exhibe una alta actividad en las raíces, ver, por ejemplo, Hansen (1997) supra) ; un promotor específico del polen de maíz (ver, por ejemplo, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 161-168); se puede utilizar un promotor de jitomate activo durante la maduración de la fruta, la senectud, y la abscisión de las hojas, y hasta un menor grado, de las flores (ver, por ejemplo, Blume (1997) Plant J. 12:731-746) ; un promotor específico del pistilo del gen SK2 de la papa (ver, por ejemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35: 425-431); el gen Blec4 de chícharo, el cual es activo en el tejido epidérmico de los ápices de tallos vegetativos y florales de alfalfa transgénica, haciéndolo una útil herramienta para dirigir la expresión de los genes extraños a la capa epidérmica de los tallos o fibras en crecimiento activo; el gen BEL1 específico del óvulo (ver, por ejemplo, Reiser (1995) Cell 83 : 735-742, GenBank No. U39944) ; y/o, el promotor de Klee, patente US 5,589,583, que describe que una región promotora de plantas es capaz de conferir altos niveles de transcripción en el tejido meristémico y/o células de rápida división.

De una manera alternativa, se utilizan promotores de plantas que sean inducibles al exponerse a hormonas de plantas, tales como auxinas, para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Por ejemplo, la invención puede utilizar el fragmento promotor El de elementos de respuesta a auxina (AuxREs) en la semilla se soya (Glycine maxL) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397-407) ; el promotor GST6 de Arabidopsis que responde a auxina (que también responde al ácido salicílico y al peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); el promotor parC inducible por auxina a partir de tabaco (Sakai (1996) 37: 906-913) ; un elemento de respuesta a biotina de plantas (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact . 10: 933-937); y el promotor que responde al ácido abscísico de hormona por tensión (Sheen (1996) Science 274: 1900-1902).

Los ácidos nucleicos de la invención también se pueden enlazar operativamente a promotores de plantas, los cuales son inducibles al exponerse a reactivos químicos que se puedan aplicar a la planta, tales como herbicidas o antibióticos. Por ejemplo, se puede utilizar el promotor In2-2 de maíz, activado por inocuizantes de herbicidas de bencensulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); la aplicación de diferentes inocuizantes de herbicidas induce distintos patrones de expresión genética, incluyendo la expresión en la raíz, los hidátodos, y el meristemo apical del tallo. La secuencia de codificación puede estar bajo el control, por ejemplo, de un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo como se describe con las plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de descarboxilasa de arginina de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473) ; o un elemento que responde al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324). Utilizando promotores químicamente inducidos (por ejemplo por hormonas o plaguicidas) , es decir, un promotor que responda a un producto químico que se pueda aplicar a la planta transgénica en el campo, se puede inducir la expresión de un polipéptido de la invención en una etapa particular del desarrollo de la planta. Por consiguiente, la invención también proporciona plantas transgéni-cas que contienen un gen inducible que codifica para los polipéptidos de la invención cuyo rango de anfitriones está limitado a especies de plantas objetivas, tales como maíz, arroz, cebada, trigo, papa u otros cultivos, inducibles en cualquier etapa de desarrollo del cultivo.

Un técnico en la materia reconocerá que un promotor de planta específico del tejido puede impulsar la expresión de secuencias operativamente enlazadas en tejidos diferentes del tejido objetivo. Por consiguiente, un promotor específico del tejido es uno que impulsa la expresión de preferencia en el tejido objetivo o en el tipo de célula, pero también puede conducir a alguna expresión en otros tejidos.

Los ácidos nucleicos de la invención también se pueden enlazar operativamente a promotores de plantas que sean inducibles al exponerse a reactivos químicos. Estos reactivos incluyen, por ejemplo, herbicidas, auxinas sintéticas, o antibióticos, los cuales se pueden aplicar, por ejemplo rociar, sobre las plantas transgénicas . La expresión inducible de los ácidos nucleicos productores de xilanasa de la invención, permitirá al cultivador seleccionar las plantas con la expresión y/o actividad de xilanasa óptima. Por lo tanto, se puede controlar el desarrollo de las partes de las plantas. De esta manera, la invención proporciona el medio para facilitar la cosecha de plantas y partes de plantas. Por ejemplo, en diferentes modalidades, se utiliza el promotor In2-2 de maíz, activado por los inocuizantes de herbicidas de bencensulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); la aplicación de diferentes inocuizantes de herbicidas induce distintos patrones de expresión genética, incluyendo la expresión en la raíz, en los hidátodos, y en el meristemo apical del tallo. Las secuencias de codificación de la invención también están bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo como se describe con las plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de descarboxilasa de arginina de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. ,11: 465-473) ; o un elemento que responde al ácido salicílico (St nge (1997) Plant J. 11: 1315-1324) .

En algunos aspectos, la expresión apropiada ,del poliléptido puede requerir de la región de poliadenilación en el extremo 3' de la región codificante. La región de poliadenilación se puede derivar a partir del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas (o de animales u otros) , o de genes en el ADN-T de Agrobacteria.

Vectores de expresión y vehículos de clonación La invención proporciona vectores de expresión y vehículos de clonación que comprenden los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo las secuencias que codifican las xilanasas de la invención. Los vectores de expresión y los vehículos de clonación de la invención pueden comprender partículas virales, baculovirus, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, ADN viral (por ejemplo, vacuna, adenovirus, virus de varicela de aves de corral, pseudo-rabia, y derivados de SV40) , cromosomas artificiales basados en Pl, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualesquiera otros vectores específicos para anfitriones específicos de interés (tales como Bacillus, Aspergillus y levadura) . Los vectores de la invención pueden incluir secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas, y sintéticas. Los técnicos en este campo conocen grandes números de vectores adecuados, y están comercialmente disponibles. Los vectores de ejemplo incluyen: bacterianos: vectores pQE (Qiagen) , plásmidos pBlues-cript, vectores pNH, vectores lambda-ZAP (Stratagene) ; ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucarióticos : pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3 , pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro plásmido u otro vector, siempre que se pueda replicar y sea viable en el anfitrión., Con la presente invención se pueden emplear vectores de bajo número de copias o de alto número de copias .

El vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de enlace de ribosoma para el inicio de traducción, y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Los vectores de expresión de mamífero pueden comprender un origen de réplica, cualesquiera sitios de enlace de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de empalme, secuencias de terminación de transcripción, y secuencias no transcritas de flanqueo 5'. En algunos aspectos, se pueden utilizar secuencias de ADN derivadas a partir de los sitios de empalme y poliadenilación de SV40, para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

En un aspecto, los vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores seleccionables para permitir la selección de las células hospederas que contengan al vector. Estos marcadores seleccionables incluyen genes que codifican reductasa de dihidrofolato, o genes que confieren resistencia a la neomicina para cultivo celular eucariótico, genes que confieren resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en E. coli, y el gen TRP1 de S. cerevisiae . Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado, utilizando vectores de transferasa de cloranfenicol (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables.

Los vectores para expresar el polipéptido o fragmento del mismo en células eucarióticas también pueden contener potenciadores para aumentar los niveles de expresión. Los potenciadores son elementos de acción cis del ADN, usualmente de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 pares de bases de longitud, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 sobre el lado tardío de los pares de bases 100 a 270 del origen de réplica, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma sobre el lado tardío del origen de réplica, y los potenciadores de adenovirus .

Se puede insertar una secuencia de ácido nucleico en un vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia se liga a la posición deseada en el vector en seguida de la digestión del inserto y el vector con las endonu-cleasas de restricción apropiadas.

De una manera alternativa, se pueden ligar los extremos romos tanto en el inserto como en el vector. En este ámbito se conocen una variedad de técnicas de clonación, por ejemplo como se describen en Ausubel y Sambrook. Estos procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de los técnicos en este campo.

El vector puede estar en la forma de un plásmido, una partícula viral, o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas , no cromosómicas y sintéticas, derivados de SV40; plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados a partir de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como vacuna, adenovirus, virus de varicela de aves de corral, y pseudo-rabia . Una variedad de vectores de clonación y expresión para utilizarse con anfitriones procarióticos y eucarióticos son descritos, por ejemplo, por Sambrook.

Los vectores bacterianos particulares que se pueden utilizar incluyen los plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017) , pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) , GEMI (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, Estados Unidos) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) , pDlO, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene) , ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Los vectores eucarióticos particulares incluyen pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene), pSVK3 , pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia) . Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector, siempre que se pueda replicar y sea viable en la célula hospedera .

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden expresar en casetes de expresión, vectores o virus, y se pueden expresar de una manera temporal o estable en células y semillas de plantas. Un sistema de expresión temporal de ejemplo utiliza sistemas de expresión episomal, por ejemplo el AR viral del virus de mosaico de coliflor (CaMV) generado en el núcleo mediante la transcripción de un mini-cromosoma episomal que contenga al ADN super-enrollado , ver, por ejemplo, Covey (1990) Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A. 87: 1633-1637. De una manera alternativa, se pueden insertar secuencias de codificación, es decir, todos o los sub- fragmentos de las secuencias de' la invención, en un genoma de célula hospedera de planta que llegue a ser una parte integral del ADN cromosómico hospedero. Las transcripciones en sentido o anti-sentido se pueden expresar de esta manera. Un vector que comprenda las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones codificantes) de los ácidos nucleicos de la invención, puede comprender un gen marcador que confiera un fenotipo seleccionable a una célula o a una semilla de planta. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, en particular resistencia a antibióticos, tal como resistencia a canamicina, G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a herbicidas, tal como resistencia al clorosulfurón o al Basta.

Los vectores de expresión capaces de expresar ácidos nucleicos y proteínas en plantas son bien conocidos en la materia, y pueden incluir, por ejemplo, los vectores a partir de Agrrojacfcerium spp., virus X de papa (ver, por ejemplo, Angelí (1997) EMBO J. 16: 3675-3684), virus de mosaico de tabaco (ver, por ejemplo, Casper (1996) Gene 173: 69-73), virus de atrofia de arbusto de jitomate (ver, por ejemplo, Hillman (1989) Virology 169: 42-50), virus de marca de tabaco (ver, por ejemplo, Dolja (1997) Virology 234: 243-252), virus de mosaico dorado de frijol (ver, por ejemplo, Morinaga (1993) Microbiol Immunol . 37: 471-476) , virus de mosaico de coliflor (ver, por ejemplo, Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact . 10: 1094-1101), elemento transpondible Ac/Ds de maíz (ver, por ejemplo, Rubin (1997) Mol. Cell. Biol . 17: 6294-6302; Kunze (1996) Curr . Top. Microbiol. Immunol. 204: 161-194), y el elemento transpondible supresor-mutador (Spm) de maíz (ver, por ejemplo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32: 717-725); y derivados de los mismos.

En un aspecto, el vector de expresión puede tener dos sistemas de réplica para permitir que se mantenga en dos organismos, por ejemplo en células de mamífero o de insecto para la expresión, y en un anfitrión procariótico para clonación y amplificación. Adicionalmente, para integrar los vectores t de expresión, el vector de expresión puede contener cuando menos una secuencia homologa al genoma de la célula hospedera. Puede í contener dos secuencias homologas que flanqueen la construcción de expresión. El vector de integración se puede dirigir hacia un lugar específico de la célula hospedera mediante la selección de la secuencia homologa apropiada para incluirse en el vector. 'Las construcciones para integrar vectores son bien conocidas en este campo .

Los vectores de expresión de la invención también pueden incluir un gen marcador seleccionable para permitir1 la selección de cepas bacterianas que se hayan transformado, por I ejemplo genes que hagan que las bacterias sean resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina, neomicina, y tetraciclina . Los marcadores selecciona-bles también pueden incluir genes bio-sintéticos, tales como i aquéllos en las sendas bio-sintéticas de histidina, triptófáno, y leucina. ' La secuencia de ADN en el vector de expresión se enlaza operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada (promotora) para dirigir la síntesis del AR . Los promotores bacterianos mencionados particulares incluyen lacT, lacZ, T3 ,' T7, gpt, lambda PR/ PLr y trp. Los promotores eucarióticos incluyen el temprano inmediato de CMV, quinasa de timidina de HSV, SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y del promotor apropiados está bien dentro del nivel de la experiencia ordinaria en la materia. El vector de expresión también contiene un sitio de enlace , de ribosoma para el inicio de la traducción, y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado utilizando vectores de transferasa de cloranfenicol (CAT) , u otros vectores con marcadores seleccionables . En adición, los vectores de expresión de preferencia contienen uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células hospederas transformadas, tales como reductasa de dihidrofolato o resistencia a neomicina para el cultivo celular eucariótico, o tal como la resistencia á la tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Los vectores de expresión de mamífero también pueden comprender un origen de réplica, cualesquiera sitios de enlace de ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de empalme, secuencias de terminación de transcripción, y secuencias no transcritas de flanqueo 5'. En algunos aspectos, se pueden utilizar secuencias de ADN derivadas a partir de los sitios de empalme y poliadenilación de SV40, para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

Los vectores para expresar el polipéptido o fragmento del mismo en células eucarióticas también pueden contener potenciadores para aumentar los niveles de expresión. Los potenciadores son elementos de ADN de acción cis, usualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 pares de bases de longitud, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 sobre el lado tardío de los pares de bases 100 a 270 del origen de réplica, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma sobre el lado tardío del origen de réplica, y los potenciadores de adenovirus .

En adición, los vectores de expresión normalmente contienen uno o más genes marcadores seleccionables para permitir la selección de las células hospederas que contengan al vector.

Estos marcadores seleccionables incluyen genes que codifican reductasa de dihidrofolato, o genes que confieren resistencia a la neomicina para el cultivo celular eucariótico, genes que confieren resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae.

En algunos aspectos, el ácido nucleico que codifica uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprenden cuando menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, se ensambla en la fase apropiada con una secuencia delantera capaz de dirigir la secreción del polipéptido traducido o fragmento del mismo. Opcionalmente , el ácido nucleico puede codificar un polipéptido de fusión en donde uno de los polipépti-dos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos : que comprendan cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, se fusione con péptidos o polipéptidos heterólogos, tales como péptidos de identificación N-terminales que impartan las características deseadas, tales como una mayor estabilidad o una purificación simplificada .

La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se liga a la posición deseada en el vector en seguida de la digestión del inserto, y se puede ligar el vector. Se dan a conocer una variedad de técnicas de clonación en Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, 503, John iley & Sons, Inc. 1997, y Sambrook y colaboradores, Molecular Clonincr : A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) . Estos procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de los técnicos en la materia.

Por ejemplo, el vector puede estar en la forma de un plásmido, una partícula viral, o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas , no cromosómicas y sintéticas, derivados de SV40; plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovi-rus, plásmidos de levadura, vectores derivados a partir de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como vacuna, adenovirus, virus de varicela de aves de corral, y pseudo-rabia . Una variedad de vectores de clonación y expresión para utilizarse con anfitriones procarióticos y eucarióticos son descritos por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning : A Laboratorv Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor, N.Y. , (1989) . Células hospederas y células transformadas La invención también proporciona una célula transformada que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención, por ejemplo una secuencia que codifica una xilanasa de la invención, o un vector de la invención. La célula hospedera puede ser cualquiera de las células hospederas familiares para los técnicos en este campo, incluyendo células procarióticas , células eucarióticas tales como células bacterianas, células fúngicas, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, o células de planta. Las células bacterianas de ejemplo incluyen E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diferentes especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus . Las células de insecto de ejemplo incluyen Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Las células de animales de ejemplo incluyen CHO, COS, o melanoma de Bowes, o cualquier línea celular de ratón o humana. La selección de un anfitrión apropiado está dentro de las capacidades de los técnicos en la materia. Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y se describen en la literatura técnica y científica. Ver, por ejemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet . 22: 421-477; patente US 5,750,870.

El vector se puede introducir en las células hospederas utilizando cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo transformación, transfeccion, transducción, infección viral, pistolas genéticas, o transferencia genética mediada por Ti. Los métodos particulares incluyen transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-Dextrano, lipofección, o eletropo-ración (Davis, L., Dibner, M . , Battey, I., Basic ethods in Molecular Biology, (1986)).

En un aspecto, los ácidos nucleicos o vectores de la invención se introducen en las células para el rastreo y, por lo tanto, los ácidos nucleicos entran en las células de una manera adecuada para la expresión subsecuente del ácido nucleico. El método de introducción es en gran parte dictado por el tipo de célula objetivo. Los métodos de ejemplo incluyen precipitación en CaP04, fusión de liposoma, lipofección (por ejemplo LIPOFEC-TIN®) , electroporación, infección viral, etc. Los ácidos nucleicos candidatos pueden integrarse establemente en el genoma de la célula hospedera (por ejemplo, con introducción retrovi-ral) , o pueden existir ya sea temporalmente o bien establemente en el citoplasma (es decir, a través del uso de plásmidos tradicionales, utilizando secuencias reguladoras estándares, marcadores de selección, etc.). Se pueden utilizar tantos rastreos farmacéuticamente importantes que requieran objetivos celulares humanos o de mamíferos modelos como vectores retrovira-les capaces de transfectar estos objetivos.

Cuando sea apropiado, las células hospederas diseñadas se pueden cultivar en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes de la invención. En seguida de' la transformación de una cepa hospedera adecuada y del crecimiento de la cepa hospedera hasta una densidad celular apropiada,! se puede inducir el promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) , y 'las células se pueden cultivar durante un periodo · adicional para permitirles producir el polipéptido deseado o fragmento idel mismo. 1 Las células se pueden cosechar mediante centrif gación, se alteran por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para una purificación adicional. : Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas se pueden alterar mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclado de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica, o uso de agentes de lisis celular. Estos métodos, son bien conocidos por los técnicos en la materia. El polipéptido expresado o el fragmento del mismo se puede recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía con hidroxilapatita, y cromatografía con lectina. Se pueden emplear pasos de repliegue de proteína, como sean necesarios, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, se puede emplear cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) para los pasos finales de purificación. j Las construcciones en las células hospederas se pueden utilizar de una manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante . Dependiendo del hospedero empleado en un procedimiento de producción I recombinante, los polipéptidos producidos por las células hospederas que contienen al vector pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos de la invención pueden o no incluir también un residuo de aminoácido de metionina adicional. > También se pueden emplear sistemas de traduqción exentos de células para producir un polipéptido de la invención. Los sistemas de traducción exentos de células pueden utilizar ARNms transcritos a partir de una construcción de ADN que comprenda un promotor operativamente enlazado a un ácido nucleico que codifique el polipéptido o fragmento del mismo. En algunos aspectos, la construcción de ADN se puede linearizar antes de conducir una reacción de transcripción in vi tro. Luego se incuba el ARNm transcrito con un extracto de traducción exento de células apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células hospederas transformadas, tales como reductasa de dihidrofolato o resistencia a la neomicina para el cultivo celular eucariótico, o tales como resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en E. coli.

Las células hospederas que contienen los polinucleóti-dos de interés, por ejemplo los ácidos nucleicos de la invención, se pueden cultivar en un medio nutriente convencional, según sea apropiado, para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son las previamente utilizadas con la célula hospedera seleccionada para la expresión, y serán aparentes para el técnico en la materia. Entonces se pueden secuenciar los clones que se identifiquen por tener la actividad enzimática especificada, con el fin de identificar la secuencia de polinucleótido que codifique una enzima que tenga la actividad potenciada .

La invención proporciona un método para sobre-expresar una xilanasa recombinante en una célula, el cual comprende expresar un vector que comprende un ácido nucleico de la invención, por ejemplo un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico con una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 por ciento, 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento, 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento, 81 por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento , 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, o más, 'con una secuencia de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A sobre una región de cuando menos aproximadamente 100 residuos, en donde las identidades de secuencias se determinan mediante un análisis con un algoritmo de comparación de secuencias, o mediante inspección visual, o un ácido nucleico que se hibride bajo condiciones restringentes a una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, o una sub-secuencia de las mismas. La sobre-expresión se puede efectuar por cualquier medio, por ejemplo el uso de un promotor de alta actividad, un vector dicistrónico, o mediante amplificación genética del vector.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden expresar, o sobre-expresar, en cualquier sistema de expresión in vi tro o in vivo. Se pueden emplear cualesquiera sistemas de cultivo celular para expresar, o sobre-expresar, proteína recombinante, incluyendo cultivos bacterianos, de insectos, de levadura, fúngicos, o de mamífero. La sobre-expresión se puede efectuar mediante la elección apropiada de promotores, potencia-dores, vectores (por ejemplo, el uso de vectores de replicones, vectores dicistrónicos (ver, por ejemplo, Gurtu (1996) Biochem. Biophys . Res. Commun. 229: 295-8), medios, sistemas de cultivo, y similares. En un aspecto, se utiliza amplificación genética utilizando marcadores de selección, por ejemplo sintetasa de glutamina (ver, por ejemplo, Sanders (1987) Dev. Biol . Stand. 66: 55-63) , en sistemas celulares, para sobre-expresar los polipépti-dos de la invención.

Los detalles adicionales con respecto a este planteamiento están en la literatura pública y/o son conocidos por el técnico. En una ejemplificación no limitante particular, esta literatura públicamente disponible incluye la patente europea EP 0659215 (publicación internacional WO 94/03612 Al) (Nevalainen y colaboradores); Lapidot, A., Mechaly, A., Shoham, Y., "Overex-pression and single-step purification of a thermostable xylañase from Bacillus stearothernzophilus T-6", J. Biotechnol . Nov 51: 259-64 (1996); Luthi , E . , Jasmat, N. B . , Bergquist, P. L . , "Xylanase from the extremely thermophilic bacterium Caldocellum saccharolyticum overexpression of the gene in Escherichia coli and characterization of the gene product", Appl . Environ. Microbiol. Sep 56: 2677-83 (1990); y Sung, W. L., Luk, C. K. , Zahab, D. M . , Wakarchuk, W. , "Overexpression of the Bacillus subtilis and circulans xylanases in Escherichia coli", Protein Expr. Purif. Jun 4: 200-6 (1993), aunque estas referencias no enseñan las enzimas inventivas de la presente solicitud.

La célula hospedera puede ser cualquiera de las células hospederas familiares para los técnicos en este campo, incluyendo células procarióticas , células eucarióticas , células de mamífero, células de insecto, o células de planta. Como los ejemplos representativos de los anfitriones apropiados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimuriu y diferentes especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococ-cus, células fúngicas, tales como levadura, células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células de animales tales como CHO, COS, o melanoma de Bowes, y adenovirus. La selección de un anfitrión apropiado está dentro de las capacidades de los técnicos en la materia.

El vector se puede introducir en las células hospederas empleando cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo transformación, transfección, transducción, infección viral, pistolas genéticas, o transferencia genética mediada por Ti. Los métodos particulares incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, lipofección, o eletropo-ración (Davis, L., Dibner, M. , Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986) ) .

Cuando sea apropiado, las células hospederas diseñadas se pueden cultivar en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes de la invención. En seguida de la transformación de una cepa hospedera adecuada, y del crecimiento de la cepa hasta una densidad celular apropiada, se puede inducir el promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) , y las células se pueden cultivar durante un periodo adicional para permitirles producir el polipéptido deseado o el fragmento del mismo.

Las células normalmente se cosechan mediante centrifugación, se alteran por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para una purificación adicional. Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas se pueden alterar mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclado de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica, o uso de agentes de lisis celular. Estos métodos son bien conocidos por los técnicos en la materia. El polipéptido expresado o el fragmento del mismo se puede recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía con hidroxilapatita, y cromatografía con lectina. Se pueden emplear pasos de repliegue de proteína, como sean necesarios, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, se puede emplear cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) para los pasos finales de purificación.

Se pueden emplear también diferentes sistemas de cultivo celular de mamífero para expresar la proteína recombinan-te. Los ejemplos de los sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono (descritos por Gluzman, Cell, 23.: 175, 1981) , y otras líneas celulares capaces de expresar proteínas a partir de un vector compatible, tales como las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. ; Las construcciones en las células hospederas se pueden utilizar de una manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante . Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por las células hospederas que contengan al vector, pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos de la invención pueden o no incluir también un residuo de aminoácido de metionina inicial .

De una manera alternativa, los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmen-te idénticas a las mismas, o fragmentos que comprendan cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, se pueden producir sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales. En otros aspectos, se pueden emplear fragmentos o porciones de los polipéptidos para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos; por consiguiente, los fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa.

También se pueden emplear sistemas de traducción exentos de células para producir uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmen-te idénticas a las mismas, o fragmentos que comprendan cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, utilizando ARNms transcritos a partir de una construcción de ADN que comprenda un promotor operativamente enlazado a un ácido nucleico que codifique el polipéptido o el fragmento del mismo. En algunos aspectos, la construcción de ADN se puede linearizar antes de conducir una reacción de transcripción in vitro. Luego se incuba el ARNm transcrito con un extracto de traducción exento de células apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Amplificación de Ácidos Nucleicos En la práctica de la invención, los ácidos nucleicos de la invención, y los ácidos nucleicos que codifican las xilanasas de la invención, o los ácidos nucleicos modificados de la invención, se pueden reproducir mediante amplificación. También se puede utilizar la amplificación para clonar o modificar los ácidos nucleicos de la invención. Por consiguiente, la invención proporciona pares de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar los ácidos nucleicos de la invención. Un técnico en este campo puede diseñar pares de secuencias cebadoras de amplificación para cualquier parte, o la longitud completa, de estas secuencias.

En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico amplificado mediante un par de cebadores de la invención, por ejemplo un par de cebadores como se estipula por aproximadamente los primeros (los 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 residuos de un ácido nucleico de la invención, y aproximadamente los primeros (los 5') 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 residuos de la cadena complementaria .

La invención proporciona un par de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, en donde el par de cebadores es capaz de amplificar un ácido nucleico que comprenda una secuencia de la invención, o fragmentos o sub-secuencias de la misma. Uno o cada miembro del par de secuencias cebadoras de amplificación, puede comprender un oligonucleótido que comprenda cuando menos de aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia, o aproximadamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 bases consecutivas de la secuencia. La invención proporciona pares de cebadores de amplificación, en donde el par de cebadores comprende un primer miembro que tiene una secuencia como se estipula por aproximada-mente los primeros (los 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 residuos de un ácido nucleico de la invención, y un segundo miembro que tiene una secuencia como se estipula por aproximadamente los primeros (los 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 residuos de la cadena complementaria del primer miembro. La invención proporciona xilanasas generadas mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , utilizando un par de cebadores de amplificación. La invención proporciona métodos para hacer una xilanasa mediante amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , utilizando un par de cebadores de amplificación de la invención. En un aspecto, el par de cebadores de amplificación amplifica un ácido nucleico a partir de una biblioteca, por ejemplo una biblioteca genética, tal como una biblioteca medio-ambiental .

También se pueden emplear reacciones de amplificación para cuantificar la cantidad de ácido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra celular) , marcar el ácido nucleico (por ejemplo, aplicarlo a una matriz o a una mancha) , detectar el ácido nucleico, o cuantificar la cantidad de un ácido nucleico específico en una muestra. En un aspecto de la invención, se amplifica el mensaje aislado a partir de una célula o de una biblioteca de ADNc .

El técnico puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación de oligonucleótidos adecuados. Los métodos de amplificación son bien conocidos en la materia, e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , (ver, por ejemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO ETHODS AND APPLICATIONS, Innis, editor, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), Innis, editor, Academic Press, Inc., N.Y., reacción en cadena de la ligasa (LCR) (ver, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4: 560; Landegren (1988) Science 241: 1077; Barringer (1990) Gene 89: 117); amplificación de transcripción (ver, por ejemplo, kwoh (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 86:1173); y réplica de secuencia auto-sostenida (ver, por ejemplo, Guatelli (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 87 : 1874); amplificación con replicasa Q Beta (ver, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol . 35 : 1477-1491) , ensayo automatizado de amplificación con replicasa Q-beta (ver, por ejemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257-271) , y otras técnicas mediadas por polimerasa de ARN (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario, Canadá) ; ver también Berger (1987) Methods Enzymol . 152: 307-316; Sambrook; Ausubel; patentes US 4,683,195 y 4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563-564.

Determinación del grado de identidad de secuencia La invención proporciona ácidos nucleicos que tienen una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, si :por ciento, 52 por ciento, 53 por ¦ ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 por ciento, 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento, 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento, 81 por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento , 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98: por ciento, 99 por ciento, o más, o completa (100 por ciento) ,; con un ácido nucleico de ejemplo de la invención (por ejemplo, las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ' ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97 , SEQ ID NO : 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: ni, SEQ ID NO : 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO : 137 , SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO : 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, iSEQ ID NO: 151, SEQ ID NO : 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, ; SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO : 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID. NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, 1 SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO : 185 , SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, ' SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, ' SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO : 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213 , SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO : 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, : SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, ¡ SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ' ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ : NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313 , SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ D i NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, , SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: : 377 o SEQ ID NO: 37S ») , sobre una región de cuando menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más residuos. La invención proporciona polipéptidos que comprenden secuencias que tienen una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 por ciento, 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento, 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento , 81 por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, o más I, o completa (100 por ciento) , con un polipéptido de ejemplo de la invención. El grado de identidad de secuencia (homología) se puede determinar utilizando cualquier programa de computación y los parámetros asociados, incluyendo los descritos en la presente, tales como BLAST 2.2. 2. o FASTA versión 3.0t78, con los parámetros por omisión.

Las secuencias de ácidos nucleicos también son referidas como secuencias de ácidos nucleicos del "Grupo A", las cuales incluyen las secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, así Gomo las secuencias homologas a las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, y fragmentos de las mismas, y secuencias complementarias a todas las secuencias anteriores. Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden comprender cuando menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 nucleótidos consecutivos de una secuencia de ejemplo de la invención (por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A) y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. Las secuencias homologas y los fragmentos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustan-cialmente idénticas a las mismas, se refieren a una secuencia que tiene cuando menos el 99 por ciento, 98 por ciento, 97 por ciento, 96 por ciento, 95 por ciento, 90 por ciento, 85 por ciento, 80 por ciento, 75 por ciento, 70 por ciento, 65 por ciento, 60 por ciento, 55 por ciento, o 50 por ciento de homología con estas secuencias. La homología se puede determinar utilizando cualquiera de los programas de computadora y los parámetros descritos en la presente, incluyendo FASTA versión 3.0t78 con los parámetros por omisión. Las secuencias homologas también incluyen las secuencias de ARN en las que las uridinas reemplazan a las timinas en las secuencias de ácidos nucleicos estipuladas en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A. Las secuencias homologas se pueden obtener utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en la presente, o pueden resultar de la corrección de un error de secuenciación . Se apreciar 'que las secuencias de ácidos nucleicos estipuladas en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, pueden estar representadas en el formato de un solo carácter tradicional (ver la contra-portada interna de Stryer, Lubert, Biochemistry, 3a. edición, W. H. Freeman & Co., N.Y.) o en cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleótidos en una secuencia.

Se contemplan en particular diferentes programas de comparación de secuencias identificados en cualquier otra parte en esta memoria descriptiva de patente para utilizarse en este aspecto de la invención. Se pueden evaluar homologías de secuencias de proteínas y/o ácidos nucleicos utilizando cualquiera de la variedad de algoritmos de comparación de secuencias y programas conocidos en la materia. Estos algoritmos y programas incluyen, pero por ningún medio se limitan a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85(8) : 2444-2448, 1988; Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410, 1990; Thompson y colaboradores, Nucleic Acids Res. 22 (2) : 4673-4680, 1994; Higgins y colaboradores, Methods Enzymol. 266 : 383-402 , 1996; Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215 (3) : 403-410, 1990; Altschul y colaboradores, Nature Genetics 2: 266-272, 1993) .

La homología o identidad se mide con frecuencia utilizando un software de análisis de secuencias (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, Estados Unidos). Este software empareja secuencias similares asignando grados de homología con diferentes supresiones, sustituciones, y otras modificaciones. Los términos "homología" e "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos , se refieren a dos o más secuencias o sub-secuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales cuando se comparan y se alinean para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación o región designada, medida utilizando cualquier número de algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en una computadora, se designan las coordenadas de la sub-secuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por omisión, o se pueden designar parámetros alternativos. Luego el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencias para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa .

Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas a partir del grupo que consiste en de 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en donde se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que quedan óptimamente alineadas las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación, son bien conocidos en este campo. Se puede conducir una alineación óptima de secuencias para comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl . Math. 2: 482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48.: 443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson & Lipman, Proc . Nat ' 1. Acad. Sci. U.S. A. 85: 2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el isconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, Estados Unidos) , o mediante alineación manual e inspección visual. Otros algoritmos para determinar la homología o la identidad incluyen, por ejemplo, en adición a un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (Herramienta Básica de Búsqueda de Alineación Local) en el National Center for Biologi-cal Information (Centro Nacional para Información Biológica) ) , ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences (Análisis de Secuencias Múltiplemente Alineadas) ) , AMPS (Protein Múltiple Sequence Alignment (Alineación de Múltiples Secuencias de Proteína) ) , ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool (Herramienta de Evaluación Estadística de Segmento Alineado) , BANDS, BESTSCOR, BIOSCA (Biological Sequence Comparative Analysis Node (Nodo de Análisis Comparativo de Secuencias Biológicas) ) , BLIMPS (BLocks IMProved Searcher (Buscador Mejorado de Bloques) ) , FASTA, Intervals & Points (Intervalos y Puntos) , BMB , CLUSTAL V, CLUSTALW, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, algoritmo de Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo de Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool (Herramienta de Alineación Forzada de Nucleótidos) ) , Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package (Paquete de Análisis de Secuencias de Fristensky) ) , GAP (Global Alignment Program (Programa de Alineación Global) ) , GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison (Comparación Sensible de Secuencias) ) , LALIGN (Local Sequence Alignment (Alineación Local de Secuencias) ) , LCP (Local Content Program (Programa de Contenido Local) ) , MACAW (Múltiple Alignment Construction & Analysis Workbench (Banco de Trabajo de Construcción y Análisis de Múltiples Alineaciones) ) , MAP (Múltiple Alignment Program (Programa de Alineación Múltiple) ) , MBLKP, MBLKN, PIMA (Pat-tern-Induced Multi -sequence Alignment (Alineación de Múltiples Secuencias Inducida por el Patrón) ) , SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm (Alineación de Secuencias mediante el Algoritmo Genético)) y WHAT-IF. Estos programas de alineación también se pueden utilizar para rastrear bases de datos de genomas con el fin de identificar secuencias de polinucleótidos que tengan secuencias sustancialmente idénticas. Está disponible un número de bases de datos de genomas, por ejemplo, está disponible una porción sustancial del genoma humano como parte del Human Genome Sequencing Project (Proyecto de Secuenciación del Genoma Humano) (J. Roach, http : //weber . u . Washington. edu/-roach/human_genome_ progress2.html) (Gibbs, 1995) . Ya se han secuenciado cuando menos otros veintiún genomas, incluyendo, por ejemplo, M. genitaliuxn (Fraser y colaboradores, 1995) , M. jannaschii (Bult y colaboradores, 1996) , H. influenzae (Fleischmann y colaboradores, 1995) , E. coli (Blattner y colaboradores, 1997), y levadura (S.cerevi-siae) (Mewes y colaboradores, 1997) , y D. melanogaster (Adams y colaboradores, 2000) . También se ha hecho un progreso significativo en la secuenciación de los genomas del organismo modelo, tal como ratón, C. elegans y Arabidopsis sp. Varias bases de datos que contienen información genómica anotada con alguna información funcional son mantenidas por diferentes organizaciones, y están accesibles por medio de Internet.

Un ejemplo de un algoritmo útil es el de los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul y colaboradores, Nuc. Acids Res. 25 : 3389-3402, 1977, y Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215 : 403-410, 1990, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información de Biotecnología) . Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencias de alto puntaje (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia investigada, las cuales se emparejan o bien satisfacen algún puntaje umbral T de valor positivo al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de puntaje de palabra vecina (Altschul y colaboradores, supra) . Estos impactos de palabra vecina iniciales actúan como siembras para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar pares de secuencias de alto puntaje más largos que los contengan. Los impactos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda incrementar el puntaje acumulativo de alineación. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos emparejados; siempre >0) . Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntaje con el fin de calcular el puntaje acumulativo.

La extensión de los impactos de palabra en cada dirección se detienen cuando: el puntaje acumulativo de alineación cae fuera por la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; el puntaje acumulativo va hasta cero o menos, debido a la acumulación de, una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo; o se liega al final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como omisiones una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10 , M = 5 , N 0 -4 , y una comparación de ambas cadenas . Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como omisiones una longitud de palabra de 3 , y expectativas (E) de 10, y la matriz de puntaje BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89= 10915, 1989), alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, Ipor ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 90: 5873, 1993). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentaría por azar un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si. la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.2, más preferiblemente menor que aproximadamente 0.01, y muy preferiblemente menor que aproximadamente 0.001.

En un aspecto, se evalúan las homologías de secuencias de proteínas y de ácidos nucleicos utilizando la Basic Local Alignment Search Tool (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica) ("BLAST") . En particular, se utilizan cinco programas BLAST específicos para llevar a cabo la siguiente tarea: (1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de aminoácidos investigada contra una base de datos de secuencias de proteínas; (2) BLASTN compara una secuencia de nucleótidos investigada contra una base de datos de secuencias de nucleótidos ; (3) BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de nucleótidos investigada (ambas cadenas) contra una base de datos de secuencias de proteínas; (4) TBLASTN compara una secuencia de proteína investigada contra una base de datos de secuencias de nucleótidos i traducida en los seis marcos de lectura (ambas cadenas) ; y i (5) TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de nucleótidos investigada contra las traduccio-nes de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos.

Los programas BLAST identifican secuencias homologas mediante la identificación de segmentos similares, los cuales son referidos en la presente como "pares de segmentos de alto puntaje", entre una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico investigada y una secuencia de prueba, la cual de preferencia se obtiene de una base de datos de secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos. De preferencia se identifican pares, de segmentos de alto puntaje (es decir, se alinean) por medio de una matriz de puntaje, muchas de las cuales son conocidas en la materia. De preferencia, la matriz de puntaje utilizada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet y colaboradores, Science 256 : 1443-1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17: 49-61, 1993) . De una manera menos preferible, también se pueden utilizar las matrices PAM o PAM250 (ver, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds . , 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships : Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation) . Los programas BLAST son accesibles a través de la i U. S. National Library of Medicine (Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos) .

Los parámetros utilizados con los algoritmos anteriores se pueden adaptar dependiendo de la longitud de la secuencia y del grado de homología estudiado. En algunos aspectos, los parámetros pueden ser los parámetros por omisión utilizados por los algoritmos en ausencia de instrucciones del usuario.

Sistemas de computación y productos de programas de computadora Con el fin de determinar e identificar las identidades de secuencias, las homologías estructurales, los motivos y similares en silicio, una secuencia de ácido nucleico o polipép-tido de la invención se puede almacenar, registrar, y manipular en cualquier medio que pueda ser leído y accesado por una computadora .

De conformidad con lo anterior, la invención proporcio- na computadoras, sistemas de computación, medios legibles por computadora, productos de programas de computadora, y similares, que registran o almacenan en los mismos las secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención. Como se utilizan en la presente, las palabras "registrar" y "almacenar" se refieren a un proceso para almacenar información en un medio de computadora. Un técnico puede adoptar fácilmente cualesquiera métodos conocidos para registrar información en un medio legible por computadora con el fin de generar manufacturas que comprendan una o más de las secuencias de ácidos nucleicos y/o de polipéptidos de la invención.

Los polipéptidos de la invención incluyen las secuencias de polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, las secuencias de ejemplo de la invención, y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y fragmentos de cualquiera de las secuencias anteriores. Las secuencias de polipéptidos sustancialmente idénticas u homologas se refieren a una secuencia de polipéptido que tiene una identidad de secuencia de cuando i menos el 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 por ciento, 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento, 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento, 81 por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, o más, o completa (100 por ciento) con una secuencia de ej emplo de la invención, por ejemplo, una secuencia de polipéptido de las secuencias de aminoácidos del Grupo B.

La homología se puede determinar utilizando cualquiera de los programas de computadora y parámetros descritos en la presente, incluyendo FASTA versión 3.0t78 con los parámetros por omisión o con cualesquiera parámetros modificados. Las secuencias homologas se pueden obtener utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en la presente, o pueden resultar de la corrección de un error de secuenciación. Los fragmentos de polipéptidos comprenden cuando menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más aminoácidos consecutivos de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustan-cialmente idénticas a las mismas. Se apreciará que los códigos del polipéptido como se estipulan en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, se pueden representar en el formato de un solo carácter tradicional o en el formato de tres letras (ver la contra-portada interna de Stryer, Lubert, Biochemistry, 3a. edición, W. H. Freeman & Co., N.Y.) o en cualquier otro formato que relacione la identidad de los polipéptidos en una secuencia.

Una secuencia de ácido nucleico o de polipéptido de la invención se puede almacenar, registrar, y manipular en cualquier medio que pueda ser leído y accesado por una computadora. Como se utilizan en la presente, las palabras "registrar" y "almacenar" se refieren a un proceso para almacenar información en un medio de computadora. Un técnico puede adoptar fácilmente cualquiera de los métodos actualmente conocidos para registrar información en un medio legible por computadora con el fin de generar manufacturas que comprendan una o más de las secuencias de ácidos nucleicos como se estipulan en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, una o más de las secuencias de polipéptidos como se estipulan en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. Otro aspecto de la invención es un medio legible por computadora que tiene registradas en el mismo cuando menos 2, 5, 10, 15, o 20 o más secuencias de ácidos nucleicos como se estipulan en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

Otro aspecto de la invención es un medio legible por computadora que tiene registradas en el mismo una o más de las secuencias de ácidos nucleicos como se estipulan en las secuen- cias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas . Otro aspecto de la invención es un medio legible por computadora que tiene registradas en el mismo una o más de las secuencias de polipéptidos como se estipulan en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. Otro aspecto de la invención es un medio legible por computadora que tiene registradas en el mismo cuando menos 2, 5, 10, 15, o 20 o más de las secuencias estipuladas anteriormente .

Los medios legibles por computadora incluyen medios magnéticamente legibles, medios ópticamente legibles, medios electrónicamente legibles, y medios magnéticos/ópticos. Por ejemplo, el medio legible por computadora puede ser un disco duro, un disco flexible, una cinta magnética, CD-ROM, Disco Versátil Digital (DVD) , Memoria de Acceso Aleatorio (RAM) , o Memora de Sólo Lectura (ROM) , así como otros tipos de otros medios conocidos por los técnicos en este campo.

Los aspectos de la invención incluyen sistemas (por ejemplo, sistemas basados en Internet), en particular sistemas de computación, los cuales almacenan y manipulan la información de secuencias descrita en la presente. Un ejemplo de un sistema de computación 100 se ilustra en forma de diagrama de bloques en la Figura 1. Como se utiliza en la presente, "un sistema de computación" se refiere a los componentes de hardware, los componentes de software, y los componentes de almacenamiento de datos utilizados para analizar una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B. El sistema de computación 100 normalmente incluye un procesador para procesar, accesar, y manipular los datos de secuencia. El procesador 105 puede ser cualquier tipo bien conocido de unidad de procesamiento central, tal como, por ejemplo, el Pentium III de Intel Corporation, o un procesador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD o International Business Machines.

Normalmente, el sistema de computación 100 es un sistema para propósitos generales que comprende el procesador 105 y uno o más componentes de almacenamiento de datos internos 110 para almacenar datos, y uno o más dispositivos de recuperación de datos para recuperar los datos almacenados en los componentes de almacenamiento de datos. Un técnico puede apreciar fácilmente que es adecuado cualquiera de los sistemas de computación actualmente disponibles.

En un aspecto particular, el sistema de computación 100 incluye un procesador 105 conectado a una barra colectora, la cual se conecta a una memoria principal 115 (de preferencia implementada como RAM) , y uno o más dispositivos de almacenamiento de datos internos 110, tales como un disco duro y/u otro medio legible por computadora que tenga datos registrados en el mismo.

En algunos aspectos, el sistema de computación 100 incluye además uno o más dispositivos de recuperación de datos 118 para leer los datos almacenados en los dispositivos de almacenamiento de datos internos 110.

El dispositivo de recuperación de datos 118 puede representar, por ejemplo, una unidad de disco flexible, una unidad de disco compacto, una unidad de cinta magnética, o un módem capaz de conectarse a un sistema de almacenamiento de datos remoto (por ejemplo, por medio de la Internet), etc. En algunos aspectos, el dispositivo de almacenamiento de datos interno 110 es un medio legible por computadora removible tal como un disco flexible, un disco compacto, una cinta magnética, etc., que contenga la lógica de control y/o los datos registrados en el mismo. El sistema de computación 100 puede incluir de una manera conveniente, o se puede programar mediante, un software apropiado, para leer la lógica de control y/o los datos desde el componente de almacenamiento de datos una vez insertado en el dispositivo de recuperación de datos.

El sistema de computación 100 incluye un despliegue visual 120, el cual se utiliza para exhibir la salida para un usuario de la computadora. También se debe observar que el sistema de computación 100 puede estar enlazado a otros sistemas de computación 125a-c en una red o en una red de área amplia, con el fin de proporcionar un acceso centralizado al sistema de computación 100.

El software para accesar y procesar las secuencias de nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas (tales como herramientas de búsqueda, herramientas de comparación, y herramientas de modelación, etc.), puede residir en la memoria principal 115 durante la ejecución.

En algunos aspectos, el sistema de computación 100 puede comprender además un algoritmo de comparación de secuencias, para comparar una secuencia de ácido nucleico comó se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, almacenada en un medio legible por computadora, con una secuencia de nucleótidos o de polipéptido de referencia almacenada en un medio legible por computadora. Un "algoritmo de comparación de secuencias" se refiere a uno o más programas que se implementan (localmente o remotamente) en el sistema de computación 100, para comparar una secuencia de nucleótidos con otras secuencias de nucleótidos y/o compuestos almacenados dentro de un medio de almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparación de secuencias puede comparar las secuencias de nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, almacenadas en un medio legible por computadora, con secuencias de referencia almacenadas en un medio legible por computadora, con el fin de identificar las homologías o los motivos estructurales .

La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una nueva secuencia de nucleótidos o de proteína con una base de datos de secuencias, con el objeto de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias de la base de datos . La base de datos de secuencias puede ser una base de datos privada almacenada dentro del sistema de computación 100, o una base de datos pública tal como GENBANK que está disponible a través de la Internet .

El proceso 200 empieza en un estado de inicio 201 y luego se mueve hasta un estado 202, en donde la nueva secuencia que se va a comparar se almacena en una memoria de un sistema de computación 100. Como se describió anteriormente, la memoria podría ser cualquier tipo de memoria, incluyendo RAM o un dispositivo de almacenamiento interno.

Entonces el proceso 200 se mueve hasta un estado 204, en donde se abre la base de datos de secuencias para el análisis y la comparación. Luego el proceso 200 se mueve hasta un estado 206, en donde se lee la primera secuencia almacenada en la base de datos, en una memoria de la computadora. Luego se lleva a cabo una comparación en un estado 210 para determinar si la primera secuencia es la misma que la segunda secuencia. Es importante observar que este paso no se limita a llevar a cabo una comparación exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia de la base de datos. Los métodos bien conocidos son sabidos por los técnicos en la materia para comparar dos secuencias de nucleóti-dos o de proteínas, inclusive si no son idénticas. Por ejemplo, se pueden introducir huecos en una secuencia con el objeto de elevar el nivel de homología entre las dos secuencias probadas. Normalmente el usuario del sistema de computación introduce los parámetros que controlan si se introducen huecos u otras características en una secuencia durante la comparación.

Una vez que se ha llevado a cabo una comparación de las dos secuencias en el estado 210, se hace una determinación en un estado de decisión 210 de si las dos secuencias son iguales.' Por supuesto, el término "iguales" no se limita a las secuencias que son absolutamente idénticas . Las secuencias que estén dentro de los parámetros de homología introducidos por el usuario, se marcarán como "iguales" en el proceso 200.

Si se hace una determinación de que las dos secuencias son iguales, el proceso 200 se mueve hasta un estado 214, en donde se exhibe para el usuario el nombre de la secuencia desde la base de datos. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre exhibido satisface las limitaciones de homología que se introdujeron. Una vez que se exhibe para el usuario el nombre de la secuencia almacenada, el proceso 200 se mueve hasta un estado de decisión 218, en donde se hace una determinación de si existen más secuencias en la base de datos. Si no existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en un estado de final 220. Sin embargo, si existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 se mueve hasta un estado 224, en donde se mueve un señalador hasta la siguiente secuencia de la base de datos, de tal manera que se pueda comparar con la nueva secuencia. De esta manera, la nueva secuencia se alinea y se compara con cada secuencia de la base de datos.

Se debe observar que, si se hubiera hecho una determinación en el estado de decisión 212 de que las secuencias no eran homologas, entonces el proceso 200 se movería inmediatamente hasta el estado de decisión 218 con el objeto de determinar si estaban disponibles cualesquiera otras secuencias en la basé de datos para la comparación.

De conformidad con lo anterior, un aspecto de la invención es un sistema de computación que comprende un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenada en el mismo una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenadas recuperablemente en el mismo secuencias de nucleóti-dos o secuencias de polipéptidos de referencia para compararse con una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y un comparador de secuencias para conducir la comparación. El comparador de secuencias puede indicar un nivel de homología entre las secuencias comparadas, o puede identificar los motivos estructurales en el código de ácido nucleico anteriormente descrito de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o puede identificar los motivos estructurales en las secuencias que se comparan con estos códigos de ácidos nucleicos y códigos de polipéptidos. En algunos aspectos, el dispositivo de almacenamiento de datos puede tener almacenadas en el mismo las secuencias de cuando menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 o 40 o más de las secuencias de ácidos nucleicos estipuladas en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o las secuencias de polipéptidos como se estipulan en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

Otro aspecto de la invención es un método para determinar el nivel de homología entre una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, y una secuencia de nucleótidos de referencia. El método incluye leer el código del ácido nucleico o el código del polipéptido, y la secuencia de nucleótidos o del polipéptido de referencia a través del uso de un programa de computadora que determine los niveles de homología, y determinar la homología entre el código del ácido nucleico o el código del polipéptido y la secuencia de nucleótidos o del polipéptido de referencia con el programa de computadora. El programa de computadora puede ser cualquiera de un número de programas de computadora para V determinar niveles de homología, incluyendo aquéllos específicamente enumerados en la presente (por ejemplo, BLAST2N con los parámetros por omisión o con cualesquiera parámetros modificados) . El método se puede implementar utilizando los sistemas de computación descritos anteriormente. El método también se puede llevar a cabo leyendo cuando menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 o 40 o más de las secuencias de ácidos nucleicos anteriormente descritas, como se estipulan en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A, o las secuencias de polipéptidos como se estipulan en las secuencias de aminoácidos del Grupo B, a través del uso del programa de computadora, y determinando la homología entre los códigos de los ácidos nucleicos o los códigos de los polipéptidos y las secuencias de nucleótidos o las secuencias de polipéptidos de referencia.

La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 250 en una computadora para determinar si dos secuencias son homologas. El proceso 250 empieza en un estado de inicio 252 y luego se mueve hasta un estado 254 en donde se almacena en una memoria una primera secuencia que se vaya a comparar. Luego se almacena en una memoria la segunda secuencia que se vaya a comparar, en el estado 256. Entonces el proceso 250 se mueve hasta un estado 260, en donde se lee el primer carácter de la primera secuencia, y luego hasta un estado 262 en donde se i lee el primer carácter de la segunda secuencia. Se debe entender que, si la secuencia es una secuencia de nucleótidos, entonces el carácter normalmente sería cualquiera de A, T, C, G o U. Si la secuencia es una secuencia de proteína, entonces de preferencia está en el código de aminoácidos de una sola letra, de tal manera que se pueden comparar fácilmente las primera y las siguientes secuencias.

Después se hace una determinación, en el estado de decisión 264, de si los dos caracteres son iguales. Si son iguales, entonces el proceso 250 se mueve hasta un estado 268, en donde se leen los siguientes caracteres de las primera y segunda secuencias . Luego se hace una determinación de si los siguientes caracteres son iguales. Si lo son, entonces el proceso 250 continúa este ciclo hasta que dos caracteres no sean iguales. Si se hace una determinación de que los siguientes dos caracteres no son iguales, el proceso 250 se mueve hasta el estado de decisión 274, para determinar si hay más caracteres de cualquier secuencia por leer.

Si no hay más caracteres por leer, entonces el proceso 250 se mueve hasta el estado 276, en donde se exhibe para el usuario el nivel de homología entre las primera y segunda secuencias. El nivel de homología se determina calculando la proporción de caracteres entre las secuencias que fueron iguales del número total de secuencias en la primera secuencia. Por consiguiente, si cada carácter de una primera secuencia de, 100 nucleótidos queda alineado con cada carácter de una segunda secuencia, el nivel de homología sería del 100 por ciento.

De una manera alternativa, el programa de computadora puede ser un programa de computadora que compare las secuencias de nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico como se estipula en la invención, con una o más secuencias de nucleótidos de referencia, con el objeto de determinar si el código del ácido nucleico de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, difiere de una secuencia de ácido nucleico de referencia en una o más posiciones. Opcionalmente, este programa registra la longitud y la identidad de los nucleótidos insertados, suprimidos, o sustituidos, con respecto a la secuencia, ya sea de la secuencia del polinucleótido o del ácido nucleico de referencia, como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. En un aspecto, el programa de computadora puede ser un programa que determine si una secuencia de ácido nucleico como se determina en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) con respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia.

De conformidad con lo anterior, otro aspecto de la invención es un método para determinar si una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, difiere en uno o más nucleótidos de una secuencia de nucleótidos de referencia, el cual comprende los pasos de leer el código del ácido nucleico y la secuencia de nucleótidos de referencia a través del uso de un programa de computadora que identifica las diferencias entre las secuencias de ácidos nucleicos, e identifica las diferencias entre el código del ácido nucleico y la secuencia de nucleótidos de referencia con el programa' de computadora. En algunos aspectos, el programa de computadora es un programa que identifica los polimorfismos de un solo nucleóti-do. El método puede ser implementado por los sistemas de computación descritos anteriormente, y en el método ilustrado en la Figura 3. El método también se puede llevar a cabo leyendo cuando menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, o 40 o más de las secuencias de ácidos nucleicos como se estipulan en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A and secuencias sustancial-mente idénticas a las mismas, y las secuencias de nucleótidos de referencia, mediante el uso del programa de computadora, e identificando las diferencias entre los códigos de los ácidos nucleicos y las secuencias de nucleótidos de referencia con el programa de computadora.

En otros aspectos, el sistema basado en computadora puede comprender además un identificador para identificar las características dentro de una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas .

Un "identificador" se refiere a uno o más programas que identifican ciertas características dentro de una secuencia de ácido nucleico, como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustan-cialmente idénticas a las mismas. En un aspecto, el identificador puede comprender un programa que identifique un marco de lectura abierta en una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia. El proceso 300 empieza en un estado de inicio 302, y luego se mueve hasta un estado 304, en donde una primera secuencia que se vaya a verificar por sus características, se almacena en una memoria 115 en el sistema de computación 100. Entonces el proceso 300 se mueve hasta un estado 306, en donde se abre una base de datos de características de secuencias . Esta base de datos incluiría una lista de los atributos de cada característica, junto con el nombre de la característica. Por ejemplo, el nombre de, una característica podría ser "Codón de Inicio" y el atributo sería "ATG" . Otro ejemplo sería el nombre de característica "Cuadro TAATAA" y el atributo de la característica sería "TAATAA" . Un ejemplo de una base de datos como ésta es producido por el University of Wisconsin Genetics Computer Group (Grupó de Computación de Genética de la Universidad de Wisconsin) . De una manera alternativa, las características pueden ser motivos de polipéptido estructurales, tales como hélices alfa, hojas beta, o motivos de polipéptido funcionales tales como sitios de actividad enzimática, motivos de hélice-vuelta-hélice, u otros motivos conocidos por los técnicos en la materia.

Una vez que se abre la base de datos de características en el estado 306, el proceso 300 se mueve hasta un estado 308, en donde se lee la primera característica de la base de datos. Entonces se hace una comparación del atributo de la primera característica con la primera secuencia en el estado 310. Luego se hace una determinación, en el estado de decisión 316, de si el atributo de la característica se encontró en la primera secuencia. Si se encontró el atributo, entonces el proceso 300 se mueve hasta el estado 318, en donde se exhibe para el usuario el nombre de la característica encontrada.

Después, el proceso 300 se mueve hasta un estado de decisión 320, en donde se hace una determinación de si existen más características en la base de datos. Si no existen más características, entonces el proceso 300 termina en el estado de final 324. Sin embargo, si existen más características en la base de datos, entonces el proceso 300 lee la siguiente característica de la secuencia en el estado 326, y cicla de regreso hasta el estado 310, en donde se compara el atributo de la siguiente característica contra la primera secuencia. Se debe observar que, si no se encuentra el atributo de la característica en la primera secuencia en el estado de decisión 316, el proceso 300 se mueve directamente hasta el estado de decisión 320, con el objeto de determinar si existen más características en la base de datos.

De conformidad con lo anterior, otro aspecto de la invención es un método para identificar una característica dentro de una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustan-cialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, el cual comprende leer los códigos de los ácidos nucleicos o los códigos de los polipéptidos mediante el uso de un programa de computadora que identifica las características en los mismos, e identificar las características dentro de los códigos de los ácidos nucleicos con el programa de computadora. En un aspecto, el programa de computadora comprende un programa de computadora que identifica marcos de lectura abierta. El método se puede llevar a cabo leyendo una sola secuencia de cuando menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, o 40 de las secuencias de ácidos nucleicos como se estipulan en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o las secuencias de polipéptidos como se estipulan en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, mediante el uso del programa de computadora, e identificando las características dentro de los códigos de ácidos nucleicos o los códigos de polipéptidos con el programa de computadora.

Una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustan-cialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, se puede almacenar y manipular en una variedad de programas procesadores de datos en una variedad de formatos. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, se puede almacenar como texto en un archivo de procesamiento de palabras, tal como Microsoft-WORD® o WORDPERFECT® o como un archivo ASCII en una variedad de programas de bases de datos familiares para los técnicos en la materia, tales como DB2®, SYBASE®, u ORACLE®. En adición, se pueden utilizar muchos programas de computadora y bases de datos como algoritmos de comparación de secuencias, identificadores , o fuentes de secuencias de nucleótidos o secuencias de polipépti-dos de referencia para compararse con una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o una secuencia de polipéptido como se estipula en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. La siguiente lista no pretende limitar la invención sino proporcionar guía para los programas y bases de datos que son útiles con las secuencias de ácidos nucleicos como se estipulan en las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o las secuencias de polipéptidos como se estipulan en las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

Los programas y bases de datos que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a: MacPattern (EMBL) , DiscoveryBase (Molecular Applications Group) , GeneMine (Molecular Applications Group) , Look (Molecular Applications Group) , MacLook (Molecular Applications Group) , BLAST y BLAST2 (NCBI) , BLASTN y BLASTX (Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol . 215 : 403, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A., 85.: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag y colaboradores, Comp. App. Biosci. 6.: 237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/ SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2 DBAccess (Molecular Simulations Inc.)', HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Félix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Siraulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), la base de datos MDL Available Chemicals Directory, la base de datos MDL Drug Data Report, la base de datos Comprehensive Medicinal Chemistry, la base de datos Derwents's World Drug, la base de datos BioByteMasterFile , la base de datos Genbank, y la base de datos Genseqn. Muchos otros programas y bases de datos serán aparentes para un técnico en la materia, dada la presente divulgación .

Los motivos que se pueden detectar utilizando los programas anteriores incluyen las secuencias que codifican cremalleras de leucina, motivos de hélice-vuelta-hélice, sitios de glicosilación, sitios de ubiquitinación, hélices alfa y hojas beta, secuencias de señales que codifican péptidos de señales que dirigen la secreción de las proteínas codificadas, secuencias implicadas en la regulación de la transcripción, tales como homeocuadros, estiramientos ácidos, sitios de actividad enzimáti-ca, sitios de enlace de sustrato, y sitios de disociación enzimática.

Hibridación de ácidos nucleicos La invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que se hibridan bajo condiciones restringentes a una secuencia de ejemplo de la invención (por ejemplo, las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO 137 , SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143 , SEQ ID NO 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO 161, SEQ ID NO: 163 , SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO 177 , SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183 , SEQ ID NO 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO: 203 , SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213 , SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ : NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303 , SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323 , SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ D NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363 , SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379 . Las condiciones restringentes pueden ser condiciones altamente restringentes , condiciones de astringencia mediana, y/o condiciones de baja astringencia, incluyendo las condiciones de astringencia alta y reducida descritas en la presente. En un aspecto, es la astringencia de las condiciones de lavado la que estipula las condicio nes que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance de la invención, como se describe más adelante.

En aspectos alternativos, los ácidos nucleicos de la invención, como se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones restringentes, pueden ser de entre aproximadamente cinco residuos y la longitud completa del ácido nucleico de la invención; por ejemplo, pueden ser de cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,1 000, o más residuos de longitud. También se incluyen ácidos nucleicos más cortos que la longitud completa. Estos ácidos nucleicos pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas de hibridación, sondas marcadoras, sondas de oligonucleótidos de reacción en cadena de la polimerasa, ARNi (de una sola cadena o de doble cadena) , anti- sentido o secuencias que codifican péptidos de enlace de anti-cuerpos (epítopos) , motivos, sitios activos, y similares.

En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de alta astringencia, que comprenden condiciones de aproximadamente 50 por ciento de formamida a aproximadamente 37°C a 42°C. En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de astringencia reducida que comprenden de aproximadamente el 35 por ciento al 25 por ciento de formamida a aproximadamente 30°C a 35°C.

De una manera alternativa, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de alta astringencia que comprenden el 50 por ciento de formamida a 42°C, SSPE 5X, SDS al 0.3 por ciento, y un ácido nucleico de bloqueo de secuencia repetitiva, tal como cot-1 o ADN de esperma de salmón (por ejemplo, 200 n/ml de ADN de esperma de salmón desgarrado y desnaturalizado) . En un aspecto, los ácidos nucleicos de la invención se definen por su capacidad para hibridarse bajo condiciones de astringencia reducida que comprenden el 35 por ciento de formamida a una temperatura reducida de 35°C.

En las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, las condiciones empleadas para alcanzar un nivel particular de astringencia variarán dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se estén hibridando. Por ejemplo, en la selección de las condiciones de hibridación, se pueden considerar la longitud, el grado de complementariedad, la composición dé la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC contra AT) , y el ácido nucleico (por ejemplo, ARN contra ADN) de las regiones que se estén hibridando de los ácidos nucleicos. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos está inmovilizado, por ejemplo sobre un filtro.

La hibridación se puede llevar a cabo bajo condiciones de astringencia baja, astringencia moderada, o astringencia alta. Como un ejemplo de la hibridación del ácido nucleico, primero se pre-hibrida una membrana polimérica que contenga los ácidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados durante 30 minutos a 45°C en una solución consistente en NaCl 0.9 M, NaH2P04 50 mM, pH de 7.0, Na2EDTA 5.0 mM, SDS al 0.5 por ciento, Denhardt ' s 10X, y 0.5 mg/ml de ácido polirriboadenílico . Luego se agregan a la solución aproximadamente 2 X 107 cpm (actividad específica de 4-9 X 108 cpm/microgramo) de sonda de oligonucleótido marcada en los extremos con 32P. Después de 12 a 16 horas de incubación, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente en SET IX (NaCl 150 mM, Clorhidrato de Tris 20 mM, pH de 7.8, Na2EDTA 1 mM) conteniendo SDS al 0.5 por ciento, seguido por un lavado de 30 minutos en SET IX fresco a una Tra de -10°C para la sonda de oligonucleótido. Entonces la membrana se expone a una película auto-radiográfica para la detección de las señales de hibridación .

Todas las hibridaciones anteriores se considerarían como bajo condiciones de alta astringencia.

En seguida de la hibridación, se puede lavar un filtro para remover cualquier sonda detectable no específicamente enlazada. La astringencia empleada para lavar los filtros también se puede variar dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se estén hibridando, la longitud de los ácidos nucleicos que se estén hibridando, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC contra AT) , y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN contra ADN) . Los ejemplos de los lavados en condiciones de astringencia progresivamente más altas son como siguen: SSC 2X, SDS al 0.1 por ciento a temperatura ambiente durante 15 minutos (astringencia baja); SSC 0.1X, SDS al 0.5 por ciento a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (astringencia moderada); SSC 0.1X, SDS al 0.5 por ciento durante 15 a 30 minutos entre la temperatura de hibridación y 68 °C (astringencia alta); y NaCl 0.15 M durante 15 minutos a 72°C (astringencia muy alta) . Se puede conducir un lavado de baja astringencia final en SSC 0. IX a temperatura ambiente. Los ejemplos anteriores son meramente ilustrativos de un conjunto de condiciones que se pueden emplear para lavar los filtros. Un técnico en la materia sabrá que existen numerosas recetas para lavados de diferente astringencia. Algunos otros ejemplos se dan más adelante.

Los ácidos nucleicos que se han hibridado a la sonda se identifican mediante autorradiografía u otras técnicas convencionales .

El procedimiento anterior se puede modificar para identificar ácidos nucleicos que tengan niveles decrecientes de homología con la secuencia de sonda. Por ejemplo, con el fin de obtener ácidos nucleicos de homología decreciente con la sonda detectable, se pueden emplear condiciones menos restringentes . Por ejemplo, la temperatura de hibridación se puede reducir en incrementos de 5°C desde 68°C hasta 42°C en un regulador de hibridación que tenga una concentración de Na+ de aproximadamente 1 M. En seguida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 2X, SDS al 0.5 por ciento, a la temperatura de la hibridación. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" arriba de 50°C, y como condiciones "bajas" debajo de 50°C. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se conduce a 55°C. Un ejemplo específico de las condiciones de hibridación de "baja astringencia" es cuando la hibridación anterior se conduce a 45°C.

De una manera alternativa, la hibridación se puede llevar a cabo en reguladores, tales como SSC 6X conteniendo formamida, a una temperatura de 42 °C. En este caso, la concentración de la formamida en el regulador de hibridación se puede reducir en incrementos del 5 por ciento desde el 50 por ciento hasta el 0 por ciento, con el fin de identificar los clones que tengan niveles decrecientes de homología con la sonda. En següida de la hibridación, el filtro se puede lavar con SSC 6X, SDS al 0.5 por ciento, a 50°C. Estas condiciones se consideran como condiciones "moderadas" arriba del 25 por ciento de formamida, y como condiciones "bajas" debajo del 25 por ciento de formamida. Un ejemplo específico de las condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se conduce con el 30 por ciento de formamida. Un ejemplo específico de las condiciones de hibridación de "baja astringencia" es cuando la hibridación anterior se conduce con el 10 por ciento de formamida.

Sin embargo, la selección del formato de hibridación no es crítica -es la astringencia de las condiciones de lavado la que estipula las condiciones que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance de la invención. Las condiciones de lavado empleadas para identificar ácidos nucleicos dentro del alcance de la invención incluyen, por ejemplo: una concentración de sal de aproximadamente 0.02 molar a un pH de 7, y a una temperatura de cuando menos aproximadamente 50°C o aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C; o una concentración de sal de NaCl a aproximadamente 0.15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos; o una concentración de sal SSC aproximadamente 0.2X, a una temperatura de cuando menos aproximadamente 50°C o aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 15 a aproximadamente 20 minutos; o el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución con una concentración de sal SSC aproximadamente 2X conteniendo SDS al 0.1 por ciento, a temperatura ambiente durante 15 minutos, y luego se lava dos veces con SSC 0. IX conteniendo SDS al 0.1 por ciento a 68°C durante 15 minutos; o condiciones equivalentes. Ver Sambrook, Tijssen y Ausubel para una descripción del regulador SSC y de las condiciones equivalentes .

Estos métodos se pueden emplear para aislar los ácidos nucleicos de la invención. Por ejemplo, los métodos anteriores se pueden emplear para aislar ácidos nucleicos que tengan una secuencia con cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 75 por ciento, cuando menos el 70 por ciento, cuando menos el 65 por ciento, cuando menos el 60 por ciento, cuando menos el 55 por ciento, o cuando menos el 50 por ciento de homología con una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprendan cuando menos aproximada-mente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 bases consecutivas de las mismas, y las secuencias complementarias para las mismas. La homología se puede medir utilizando el algoritmo de alineación. Por ejemplo, los polinu-cleótidos homólogos pueden tener una secuencia de codificación que sea una variante alélica que se presente naturalmente de una de las secuencias de codificación descritas en la presente. Estas variantes alélicas pueden tener una sustitución, supresión, o adición de uno o más nucleótidos, al compararse con los ácidos nucleicos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A p las secuencias complementarias para las mismas.

Adicionalmente , los procedimientos anteriores se pueden emplear para aislar ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos que tengan cuando menos aproximadamente el 99 por ciento, el 95 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 75 por ciento, cuando menos el 70 por ciento, cuando menos el 65, por ciento, cuando menos el 60 por ciento, cuando menos el 55 por ciento, o cuando menos el 50 por ciento de homología con un polipéptido que tenga la secuencia de una de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprenden cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, determinado utilizando un algoritmo de alineación de secuencias (por ejemplo, tal como el algoritmo FASTA versión 3.0t78 con los parámetros por omisión).

Sondas de oliqonucleótidos y métodos para utilizarlas La invención también proporciona sondas de ácidos nucleicos que se pueden utilizar, por ejemplo, para identificar ácidos nucleicos que codifiquen un polipéptido con una actividad de xilanasa, o fragmentos del mismo, o para identificar genes de xilanasa. En un aspecto, la sonda comprende cuando menos 10 bases consecutivas de un ácido nucleico de la invención. De una manera alternativa, una sonda de la invención puede ser de cuando menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, | 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 o aproximadamente 10 a 50, aproximadamente 20 a 60, aproximadamente 30 a 70, bases consecutivas de una secuencia como se estipula en un ácido nucleico dé la invención. Las sondas identifican un ácido nucleico mediante enlace y/o hibridación. Las sondas se pueden utilizar en matrices de la invención, ver la descripción más adelante, incluyendo, por ejemplo, matrices capilares. Las sondas de la invención también se pueden utilizar para aislar otros ácidos nucleicos o polipép-tidos .

Los ácidos nucleicos aislados de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, las secuencias complementarias para las mismas, o un fragmento que comprenda cuando menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 bases consecutivas de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o las secuencias complementarias para las mismas, también se pueden utilizar como sondas para determinar si una muestra biológica, tal como una muestra de tierra, contiene un organismo que tenga una secuencia de ácido nucleico de la invención, o un organismo a partir del cual se obtuvo el ácido nucleico. En estos procedimientos, se obtiene una muestra biológica que aloje potencialmen-te al organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, y de la muestra se obtienen los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se ponen en contacto con la sonda bajo condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a cualesquiera secuencias complementarias a partir de las cuales estén presentes .

Cuando sea necesario, se pueden determinar las condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a las secuencias complementarias, mediante la colocación de, la sonda en contacto con las secuencias complementarias de las muestras que se sepa que contienen la secuencia complementaria, así como las secuencias de control que no contengan la secuencia complementaria. Las condiciones de hibridación, tales como la concentración de sal del regulador de hibridación, la concentración de formamida del regulador de hibridación, o la temperatura de hibridación, se pueden variar para identificar las condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a los ácidos nucleicos complementarios.

Si la muestra contiene el organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, entonces se detecta la hibridación específica de la sonda. La hibridación se puede detectar marcando la sonda con un agente detectable, tal como un isótopo radioacti-vo, un tinte fluorescente, o una enzima capaz de catalizar la formación de un producto detectable. ¡ Muchos métodos para utilizar las sondas marcadas ' con el fin de detectar la presencia de los ácidos nucleicos complementarios en una muestra, son familiares para los técnicos en este campo. Éstos incluyen Manchas Southern, Manchas Northern, procedimientos de hibridación de colonias y manchas de puntos . Los protocolos para cada uno de estos procedimientos se proporcionan en Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, 503 John iley & Sons, Inc. (1997) y Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) .

De una manera alternativa, se puede utilizar más de una sonda (cuando menos una de las cuales sea capaz de hibridarse específicamente a cualesquiera secuencias complementarias que estén presentes en la muestra de ácido nucleico) en una reacción de amplificación, para determinar si la muestra contiene un organismo que contenga una secuencia de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico) . Normalmente, las sondas comprenden oligonu-cleótidos. En un aspecto, la reacción de amplificación puede comprender una reacción en cadena de la polimerasa. Los protocolos de la reacción en cadena de la polimerasa se describen en Ausubel y Sambrook, supra. De una manera alternativa, la amplificación puede comprender una reacción en cadena de la ligasa, 3SR, o una reacción de desplazamiento de cadena. (Ver Barany, F., "The Ligase Chain Reaction in a PCR World",! PCR Methods and Applications 1: 5-16, 1991; E. Fahy y colaboradores, "Self- sustained Sequence Replication (3SR) : An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR" , PCR Methods and Applications 1: 25-33, 1991; y Walker G. T. y colaboradores, "Strand Displacement Amplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique", Nucleic Acid Research 20 : 1691-1696, 1992). En estos procedimientos, los ácidos nucleicos de la muestra se ponen en contacto con las sondas, se efectúa la reacción de amplificación, y se detecta cualquier producto de amplificación resultante. El producto de la amplificación se puede detectar mediante la realización de electroforesis en gel sobre los productos de reacción, y tiñendo el gel con un intercalador, tal como bromuro de etidio. De una manera alternativa, una o más de las sondas se pueden marcar con un isótopo radioactivo, y se puede detectar la presencia de un producto de amplificación radioactivo mediante auto-radiografía después de la electroforesis en gel.

Las sondas derivadas de las secuencias cerca de los extremos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, también se pueden utilizar en los procedimientos de avance de cromosomas para identificar los clones que contengan secuencias genómicas localizadas adyacentes a las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas . Estos métodos permiten el aislamiento de genes que codifican proteínas adicionales a partir del organismo hospedero.

Los ácidos nucleicos aislados de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, las secuencias complementarias para las mismas, o un fragmento que comprenda cuando menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, o 500 bases consecutivas de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o las secuencias complementarias para las mismas, se pueden utilizar como sondas para identificar y aislar los ácidos nucleicos relacionados. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos relacionados pueden ser ADNcs o ADNs genómicos de organismos diferentes de aquél a partir del cual se aisló el ácido nucleico. Por ejemplo, los otros organismos pueden ser organismos relacionados. En estos procedimientos, una muestra de ácido nucleico se pone en contacto con la sonda bajo condiciones que permitan que la sonda se hibride específicamente a las secuencias relacionadas . Entonces se detecta la hibridación de la sonda a los ácidos nucleicos del organismo relacionado empleando cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

Mediante la variación de la astringencia de 1 las condiciones de hibridación empleadas para identificar ácidos nucleicos, tales como ADNcs o ADNs genómicos, los cuales se hibridan a la sonda detectable, se pueden identificar y aislar los ácidos nucleicos que tengan diferentes niveles de homología con la sonda. La astringencia se puede variar mediante la conducción de la hibridación a diferentes temperaturas debajo de las temperaturas de fusión de las sondas. La temperatura de fusión, Tm, es la temperatura (bajo la concentración iónica y pH definidos) a la cual se híbrida el 50 por ciento de la secuencia objetiva a una sonda perfectamente complementaria. Se seleccionan condiciones muy restringentes para ser iguales a, o aproximadamente 5°C más bajas que, la Tm para una sonda particular. La temperatura de fusión de la sonda se puede calcular utilizando las siguientes fórmulas: Para las sondas de entre 14 y 70 nucleótidos de longitud, la temperatura de fusión (Tm) se calcula utilizando la fórmula: Tm = 81.5 + 16.6 (log[Na+]) + 0.41 (fracción G + C) -(600/N) , en donde N es la longitud de la sonda.

Si la hibridación se lleva a cabo en una solución que contenga formamida, la temperatura de fusión se puede calcular utilizando la ecuación: Tm = 81.5 + 16.6 (log[Na+]) + 0.41 (fracción G + C) - (0.63 por ciento de formamida) - (600/N), en donde N es la longitud de la sonda.

La pre-hibridación se puede llevar a cabo en SSC 6X, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0.5 por ciento, 100 microgramos de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado o SSC 6X, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0.5 por ciento, 100 microgramos de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, formamida al 50 por ciento. Las fórmulas para SSC y soluciones de Denhardt se enlistan en Sambrook y colaboradores, supra.

La hibridación se conduce mediante la adición de la sonda detectable a las soluciones de prehibridación enlistadas anteriormente . Cuando la sonda comprende ADN de doble cadena, se desnaturaliza antes de agregarse a la solución de hibridación. El filtro se pone en contacto con la solución de hibridación durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la sonda se hibride a los ADNcs o a los ADNs genómicos que contengan secuencias complementarias para la misma u homologas a la misma.

Para sondas de más de 200 nucleótidos de longitud, la hibridación se puede llevar a cabo de 15 °C a 25 °C debajo de la Tm. Para sondas más cortas, tales como sondas de oligonucleótidos, la hibridación se puede conducir de 5°C a 10°C debajo de la Tm. Típicamente, para las hibridaciones en SSC 6X, la hibridación se conduce a aproximadamente 68 °C. Usualmente, para las hibridaciones en soluciones que contengan formamida al 50 por ciento, la hibridación se conduce a aproximadamente 42°C.

Inhibición de la Expresión de Xilanasas La invención proporciona ácidos nucleicos complementarios para (por ejemplo, secuencias anti-sentido para) los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo ácidos nucleicos 'que codifican xilanasa. La inhibición se puede efectuar a través de la dirección del ADN genómico o del ARN mensajero. La transcripción o función del ácido nucleico objetivo se puede inhibir, por ejemplo, mediante hibridación y/o disociación. Un conjunto de inhibidores particularmente útil proporcionado por la presente invención, incluye oligonucleótidos que son capaces ya sea de enlazarse con un gen o con un mensaje de xilanasa, impidiendo o inhibiendo en cualquier caso la producción o función de la xilanasa. La asociación puede ser a través de hibridación específica de la secuencia. Otra clase útil de inhibidpres incluye oligonucleótidos que causan la inactivación o disociación del mensaje de xilanasa. El oligonucleótido puede tener actividad enzimática, la cual causa esta disociación, tal como de ribozi- mas. El oligonucleótido se puede modificar químicamente o conjugar con una enzima o composición capaz de disociar el ácido nucleico complementario. Se puede rastrear un grupo de muchos de estos oligonucleótidos diferentes para determinar aquéllos con la actividad deseada. Por consiguiente, la invención proporciona diferentes composiciones para la inhibición de la expresión de xilanasa a un nivel del ácido nucleico y/o de la proteína, por ejemplo las secuencias de xilanasa anti-sentido, de ARNi, y que comprenden ribozimas de la invención, y los anti-cuerpos anti-xilanasa de la invención.

La inhibición de la expresión de xilanasa puede tener una variedad de aplicaciones industriales. Por ejemplo,1 la inhibición de la expresión de xilanasa puede hacer más lenta o prevenir la corrupción. La corrupción puede presentarse cuando se degradan enzimáticamente los polisacáridos , por ejemplo los polisacáridos estructurales. Esto puede conducir al deterioro, o putrefacción, de frutas y verduras. En un aspecto, el us de las composiciones de la invención que inhiben la expresión' y/o i actividad de las xilanasas, por ejemplo, anti-cuerpos, oligonucleótidos anti-sentido, ribozimas, y ARNi, se utilizan para hacer más lenta o prevenir la corrupción. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona métodos y composiciones, que comprenden la aplicación a una planta o producto de planta '(por ejemplo, un cereal, un grano, una fruta, semilla, raíz, hoja, etc.), de anti-cuerpos, oligonucleótidos anti-sentido, ribozimas, y ARNi de la invención, para hacer más lenta o prevenir la corrupción. Estas composiciones también pueden ser expresadas por la planta (por ejemplo, una planta transgénica) u otro organismo (por ejemplo, una bacteria u otro microorganismo transformado con un gen de xilanasa de la invención) .

Las composiciones de la invención para la inhibición de la expresión de xilanasa (por ejemplo, anti-sentido, ARNi, ribozimas, anti-cuerpos) , se pueden utilizar como composiciones farmacéuticas, por ejemplo como agentes anti-patógenos o en otras terapias, por ejemplo como anti-microbianos para, por ejemplo, Salmonella.

Oligonucleótidos Anti-Sentido La invención proporciona oligonucleótidos anti-sentido capaces de enlazarse con un mensaje de xilanasa que puede inhibir la actividad de hidrolasa de xilano (por ejemplo, catalizando la hidrólisis de los enlaces ß-l, 4-xilosídicos internos) mediante la dirección al ARNm. Las estrategias para diseñar oligonucleótidos anti-sentido están bien descritas en la literatura científica y de patente, y el técnico puede diseñar estos oligonucleótidos de xilanasa utilizando los reactivos novedosos de la invención.

Por ejemplo, los protocolos de avance de genes/mapeo de ARN para rastrear oligonucleótidos anti-sentido efectivos, son bien conocidos en la materia; ver, por ejemplo, Ho (2000) Me hods Enzymol . 314: 168-183, que describe un ensayo de mapeo de ARN, el cual se basa en técnicas moleculares convencionales para proporcionar un método fácil y confiable para una selección potente de secuencias anti-sentido. Ver también Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11: 191-198.

Los ácidos nucleicos que se presentan naturalmente, se utilizan como oligonucleótidos anti-sentido. Los oligonucleótidos anti-sentido pueden ser de cualquier longitud; por ejemplo, en los aspectos alternativos, los oligonucleótidos anti-sentido están entre aproximadamente 5 y 100, entre aproximadamente 10 y 80, entre aproximadamente 15 y 60, entre aproximadamente 18 y 40. La longitud óptima se puede determinar mediante rastreó de rutina. Los oligonucleótidos anti-sentido pueden estar presentes en cualquier concentración. La concentración óptima puede determinarse mediante rastreo de rutina. Se conoce una amplia variedad de análogos de nucleótidos y ácidos nucleicos sintéti-eos, que no se presentan naturalmente, los cuales pueden resolver este problema potencial. Por ejemplo, se pueden utilizar ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) que contengan estructuras bases no iónicas, tales como unidades de N- (2 -aminoetil) glicina . También se pueden utilizar oligonucleótidos anti-sentido que tengan enlaces de fosforotioato, como se describen en las publicaciones internacionales WO 97/03211 y WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144: 189-197; Antisense Therapeutics , Agrawal, editor (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Los oligonucleótidos anti-sentido que tienen análogos sintéticos de estructura base de ADN proporcionados por la invención, también pueden incluir ácidos nucleicos de fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamida-to, alquil-fosfotriéster, sulfaraato, 3 ' -tioacetal, metilen (metilimino) , 31 -N-carbamato, y morfolino-carbamato, como se describe anteriormente .

Se puede emplear la metodología de la química de combinación para crear grandes números de oligonucleótidos, que se pueden rastrear rápidamente para oligonucleótidos específicos que tengan afinidades de enlace y especificidades apropiadas hacia cualquier objetivo, tales como las secuencias de xilanasa en sentido y anti-sentido de la invención (ver, por ejemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270: 13581-13584) .

Ribozimas Inhibidoras La invención proporciona ribozimas capaces de enlazarse con un mensaje de xilanasa. Estas ribozimas pueden inhibir la actividad de xilanasa, por ejemplo, dirigiéndose al ARNm. ; Las estrategias para diseñar ribozimas y seleccionar la secuencia anti-sentido específica de xilanasa para la dirección, están bien descritas en la literatura científica y de patente, y el técnico puede diseñar estas ribozimas utilizando los reactivos novedósos de la invención. Las ribozimas actúan mediante el enlace a un ARN objetivo a través de la porción de enlace de ARN objetivo de una ribozima, la cual se mantiene en estrecha proximidad a una porción enzimática del ARN que disocia el ARN objetivo. · Por consiguiente, la ribozima reconoce y se enlaza a un ARN objetivo a través de emparejamiento de bases complementario, y una vez enlazado al sitio correcto, actúa enzimáticamente para disociar e inactivar el ARN objetivo. La disociación de un ARN objetivo de esta manera, destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada si la disociación se presenta en la secuencia de codificación. Después de que una ribozima se ha enlazado con, y ha disociado, su ARN objetivo, se puede liberar desde ese ARN para enlazarse con, y disociar, nuevos objetivos repetidamente .

En algunas circunstancias, la naturaleza enzimática de una ribozima puede ser conveniente sobre otras tecnologías, tales como la tecnología anti-sentido (en donde una molécula de ácido nucleico simplemente se enlaza a un objetivo de ácido nucleico para bloquear su transcripción, su traducción, o su asociación con otra molécula) , debido a que la concentración efectiva de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapéutico puede ser más baja que aquélla de un oligonucleótido anti-sentido . Esta ventaja potencial refleja la capacidad de la ribozima para actuar enzimáticamente . Por consiguiente, una sola molécula de ribozima es capaz de disociar muchas moléculas de ARN objetivo. En adición, una ribozima es normalmente un inhibidor altamente específico, dependiendo la especificidad de la inhibición no solamente del mecanismo de enlace de emparejamiento de bases, sino también del mecanismo mediante el cual la molécula inhibe la expresión del ARN con el que se enlaza. Es decir, la inhibi-ción es causada por la disociación del ARN objetivo, y de esta manera, la especificidad se define como la proporción del índice de disociación del ARN dirigido sobre el índice de disociación del ARN no dirigido. Este mecanismo de disociación depende de factores adicionales a los involucrados en el emparejamiento de bases. Por consiguiente, la especificidad de acción de una ribozima puede ser mayor que aquélla del oligonucleótido anti-sentido que se enlaza al mismo sitio de ARN.

La ribozima de la invención, por ejemplo una molécula de ARN de ribozima enzimática, se puede formar en un motivo de cabeza de martillo, un motivo de horquilla, como un motivo de virus delta de hepatitis, un motivo de intrón del grupo I, y/o un ARN tipo ARNsaP en asociación con una secuencia de guía de ARN. Los ejemplos de los motivos de cabeza de martillo son descritos, por ejemplo, por Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8: 183; los motivos de horquilla por Hampel (1989) Biochemistry 28: 4929, y Hampel (1990) Nuc . Acids Res. 18: 299; el motivo del virus delta de hepatitis por Perrotta (1992) Biochemistry 31: 16; el motivo de ARNsaP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35: 849; y el intrón del grupo I por Cech, patente US 4,987,071. La cita de estos motivos específicos no pretende ser limitante. Los técnicos en la materia reconocerán que una ribozima de la invención, por ejemplo, una molécula de ARN enzimática de esta invención, puede tener un sitio de enlace de sustrato específico complementario para una o más de las regiones de ARN del gen objetivo. Una ribozima de la invención puede tener una secuencia de nucleótidos dentro de, o rodeando a, ese sitio de enlace de sustrato que imparte una actividad de disociación de ARN a la molécula.

Interferencia de ARN (ARNi) En un aspecto, la invención proporciona una molécula inhibidora de ARN, una denominada molécula de "ARNi", la cual comprende una secuencia de xilanasa de la invención. La molécula de ARNi comprende una molécula de ARN de doble cadena (ARNds) . El ARNi puede inhibir la expresión de un gen de xilanasa. En un aspecto, el ARNi es de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos dúplex de longitud. Aunque la invención no está limitada por cualquier mecanismo de acción particular, el ARNi puede entrar en una célula y provocar la degradación de un ARN de una sola cadena (ARNss) de secuencias similares o idénticas, incluyendo ARNms endógenos.

Cuando se expone una célula al ARN de doble cadena (ARNds) , el ARNm del gen homólogo se degrada selectivamente mediante un proceso denominado interferencia de ARN (ARNi)'. Un posible mecanismo básico detrás del ARNi es el rompimiento de un ARN de doble cadena (ARNds) que se empareja con una secuencia genética específica en pedazos cortos denominados ARN de interferencia corto, los cuales desencadenan la degradación del ARNm que se empareja con su secuencia. En un aspecto, los ARNis de la invención se utilizan en la terapia de silenciamiento genético, ver, por ejemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7: i 1040-1046. En un aspecto, la invención proporciona métodos para degradar selectivamente el ARN utilizando los ARNis de , la invención. El proceso se puede practicar in vitro, ex vivo, o in vivo. En un aspecto, las moléculas de ARNi de la invención se i pueden utilizar para generar una mutación de pérdida de función I en una célula, un órgano, o un animal. Los métodos para hacer y usar moléculas de ARNi para degradar selectivamente el ARN, son bien conocidos en este campo; ver, por ejemplo, las patentes US 6,506,559; 6,511,824; 6,515,109; 6,489,127. , Modificación de Ácidos Nucleicos La invención proporciona métodos para generar variantes de los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo aquéllas que codifican una xilanasa. Estos métodos se pueden repetir o emplear en diferentes combinaciones para generar xilanasas que tengan una actividad alterada o diferente, o una estabilidad alterada o diferente, de aquélla de una xilanasa codificada por el ácido nucleico de plantilla. Estos métodos también se pueden repetir o emplear en diferentes combinaciones, por ejemplo para genprar variaciones en la expresión de genes/mensajes, en la traducción de mensajes, o en la estabilidad de los mensajes. En otro aspecto, se altera la composición genética de una célula, , por ejemplo, mediante la modificación de un gen homólogo ex vivo, seguida por si reinserción en la célula. 1 Un ácido nucleico de la invención se puede alterar por cualquier medio. Por ejemplo, por métodos aleatorios o estocásti- ¦ i cos, o métodos no estocásticos o de "evolución dirigida", ver, por ejemplo, la patente US 6,361,974. Los métodos para la mutación aleatoria de genes son bien conocidos en la materia, ver, por ejemplo, la patente US 5,830,696. Por ejemplo, se pueden utilizar mutágenos para mutar aleatoriamente un gen. Los mutágenos incluyen, por ejemplo, luz ultravioleta o irradiación gamma, o un mutágeno químico, por ejemplo mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoactivados , solos o en combinación, para inducir rompimientos de ADN susceptibles de reparación mediante recombinación. Otros mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina, o ácido fórmico. Otros mutágenos son análogos de precursores de nucleótidos, por ejemplo nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina, o acridina. Estos agentes se pueden agregar a una reacción en cadena de la polimerasa en lugar del precursor de nucleótidos, mutando de esta manera la secuencia. También se pueden utilizar agentes intercaladores , tales como proflavina, acriflavina, quinacrina, y similares.

Se puede emplear cualquier técnica de biología molecular, por ejemplo, mutagénesis con reacción en cadena de la polimerasa aleatoria; ver, por ejemplo, Rice (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89: 5467-5471; o mutagénesis múltiple de cásete de combinación, ver, por ejemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18: 194-196. De una manera alternativa, los ácidos nucleicos/ por ejemplo los genes, se pueden re-ensamblar después de la fragmen- tación aleatoria o "estocástica" , ver, por ejemplo, las patentes US 6,291,242; 6,287,862; 6,287,861; 5,955,358; 5,830,721; 5,824,514; 5,811,238; 5,605,793. En los aspectos alternativos, se introducen modificaciones, adiciones, o supresiones mediante reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, mezcla, mutagénesis dirigida por el oligonucleótido, reacción en cadena de la polimerasa de ensamble, mutagénesis con reacción en cadena de la polimerasa sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recursivo, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamble genético (por ejemplo, GeneReassembly® ver, por ejemplo, la patente US 6,537,776) , mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM®, re-ensamble de ligamiento sintético (SLR) , recombinación, recombinación recursiva de secuencias, mutagénesis de ADN modificado por fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de mal acoplamiento puntual, mutagénesis de cepa hospedera deficiente en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis ! de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis genética artificial, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y/o una combinación de estos y otros métodos .

Las siguientes publicaciones describen una variedad de procedimientos y/o métodos de recombinación recursiva que se pueden incorporar en los métodos de la invención: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4: 1-4; Ness (1999) Nature Biotechno-logy 17: 893-896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" , Nature Biotechnology 17: 793-797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding", Current Opinión in Chemical Biology 3: 284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling", Nature Biotechnology 17: 259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution", Nature 391: 288-291 ; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling, "Nature Biotechnology 15: 436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosi-dase by DNA shuffling and screening", Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94: 4504-4509; Patten y colaboradores (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines", Current Opinión in Biotechnology 8: 724-733; Crameri y colaboradores (1996) "Construction and evolution of antibody-phage librarles by DNA shuffling", Nature Medicine 2: 100-103; Gates y colaboradores (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide librarles through display on a lac repressor 'headpiece dimer'", Journal of Molecular Biology 255: 373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" En: The Encyclopediá of Molecular Biology. VCH Publishers, N.Y., páginas 447-457; Crameri y Stemmer (1995) "Combinatorial múltiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes", BioTechniques 18: 194-195; Stemmer y colaboradores (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers ofoligodeoxyribonucleotides" , Gene, 164: 49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" , Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13: 549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling", Nature 370: 389-391; y Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution", Proc . Nati. Acad. Sci.

U.S. A. 91: 10747-10751.

Los métodos mutacionales para generar diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Ling y colaboradores (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an over-view" , Anal. Biochem. 254(2): 157-178; Dale y colaboradores (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using , the phosphorothioate method" , Methods Mol. Biol . 57: 369-374; Smith (1985)", In vitro mutagenesis", Ann. Rev. Genet . 19: 423-462; Botstein y Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis", Science 229: 1193-1201; Cárter (1986) "Site-directed mutagenesis", Biochem. J. 237: 1-7; y Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M. J. eds . , Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis usando planti- llas que contienen uracilo (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", Proc . Nati. Acad. Sci . U.S.A. 82: 488-492; Kunkel y colaboradores (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", Methods in Enzyraol. 154, 367-382; y Bass y colaboradores (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" , Science 242: 240-245); mutagénesis dirigida al oligonucleótido (Methods in Enzymol . 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 -derived vectors : an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment", Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500; Zoller y Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors", Methods in Enzymol. 100: 468-500; y Zoller (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a sin-gle-stranded DNA témplate", Methods in Enzymol. 154: 329-350); mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato (Taylor (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA", Nucí. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA", Nucí. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibi-tion of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorot-hioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" , Nucí. Acids Res . 14: 9679-9698; Sayers (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagénesis", Nucí. Acids Res. 16: 791-802; y Sayers y colaboradores (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioa-te-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide", Nucí. Acids Res. 16: 803-814) ; mutagénesis usando ADN dúplex con huecos (Kramer y colaboradores (1984) "The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" , Nucí. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer y Fritz (1987) Methods in Enzymol . "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA" 154: 350-367; Kramer (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations", Nucí. Acids Res. 16: 7207; y Fritz (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure ithout enzymatic reactions in vitro", Nucí. Acids Res. 16: 6987-6999).

Los protocolos adicionales que se pueden emplear para practicar la invención incluyen reparación de mal emparejamiento puntual (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" , Cell 38 : 879-887) , mutagénesis utilizando cepas hospederas deficientes en reparación (Cárter y colaboradores (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagénesis using M13 vectors", Nucí. Acids ÍRes. 13: 4431-4443; y C rter (1987) " Improved oligonucleotide-directed mutagénesis using M13 vectors", Methods in Enzymol. 154: 382-403) , mutagénesis de supresión (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to genérate large deletions", Nucí. Acids Res. 14: 5115), restricción-selección y restricción-purificación (Wells y colaboradores, (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin", Phil. Trans . R. Soc . Lond. A 317: 415-423), mutagénesis mediante síntesis genética total (Nambiar y colaboradores (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein "Science 223: 1299-1301; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transdu-cin)", Nucí. Acids Res. 14:6361-6372; Wells y colaboradores (1985) "Cassette mutagénesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites", Gene 34: 315-323; y Grundstrom y colaboradores (1985) "Oligonucleotide-directed mutagénesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis "Nucí. Acids Res. 13: 3305-3316), reparación de rompimiento de doble cadena (Mandecki (1986) ; Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments Current Opinión in Biotechnology 4: 450-455. "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagénesis", Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 83: 7177-7181). Los detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores se pueden encontrar en Methods in Enzymology, Volumen 154, el cual también describe controles útiles para resolver problemas con diferentes métodos de mutagénesis.

Los protocolos que se pueden emplear para practicar la invención se describen, por ejemplo, en la patente US 5,605,793 a Stemmer (Febrero 25, 1997), "Methods for In Vitro Recombina-tion" ; en la patente US 5,811,238 a Stemmer y colaboradores (septiembre 22, 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination" ; en la patente US 5,830,721 a Stemmer y colaboradores (noviembre 3, 1998) , "DNA Mutagénesis by Random Fragmenta-tion and Reassembly"; en la patente US 5,834,252 a Stemmer y colaboradores (noviembre 10, 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction" ; patente US 5,837,458 a Minshull y colaboradores (noviembre 17,1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering" ; publicación internacional WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagénesis by Random Fragmentation and Reassembly"; publicación internacional WO 96/33207 por Stemmer y Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; publicación internacional WO 97/20078 por Stemmer y Crameri", Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; publicación internacional WO 97/35966 por Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; publicación internacional WO 99/41402 por Punnonen y colaboradores "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"; publicación internacional WO 99/41383 por Punnonen y colaboradores "Antigen Library Immuniza- tion"; publicación internacional WO 99/41369 por Punnonen y colaboradores "Genetic Vaccine Vector Engineering" ; publicación internacional WO 99/41368 por Punnonen y colaboradores "Optimiza-tion of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; patente europea EP 752008 por Stemmer y Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly" ; patente europea EP 0 932 670 por Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination" ; publicación internacional WO 99/23107 por Stemmer y colaboradores, "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling" ; publicación internacional WO 99/21979 por Apt y colaboradores, "Human Papillomavirus Vectors"; publicación internacional WO 98/31837 por del Cardayre y colaboradores "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; publicación internacional WO 98/27230 por Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"; publicación internacional WO 98/2,7230 por Stemmer y colaboradores, "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection" ; publicación internacional WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries" ; publicación internacional WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences" ; publicación internacional WO 98/42832 por Arnold y colaboradores, "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random o Defined Primers"; publicación internacional WO 99/29902 por Arnold y colaboradores, "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences"; publicación internacional WO 98/41653 por Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library" ; publicación internacional WO 98/41622 por Borchert y colaboradores, "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling" ; y en la publicación internacional WO 98/42727 por Pati y Zarling, "Sequence Altera-tions using Homologous Recombination" .

Los protocolos que se pueden emplear para llevar la invención a la práctica (que proporcionan detalles con respecto a diferentes métodos generadores de diversidad) se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente US 09/407,800, "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" por Patten y colaboradores, presentada el 28 de septiembre de 1999; "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" por del Cardayre y colaboradores, patente US 6,379,964; "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" por Crameri y colaboradores, las patentes US 6,319,714; 6,368,861; 6,376,246; 6,423,542; 6,426,224, y la publicación internacional PCT/US00/01203 ; "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" por Welch y colaboradores, patente US 6,436,675; "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS , POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov y colaboradores, presentada el 18 de enero de 2000, (publicación internacional PCT/US00/01202) y, por ejemplo, "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov y colaboradores, presentada el 18 de julio de 2000 (solicitud' de patente US 09/618,579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS 11 por Selifonov y Stemmer, presentada el 18 de enero de 2000 (publicación internacional PCT/US00/01138) ; y " SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" por Affholter, presentada el 6 de septiembre de 2000 (solicitud de patente US 09/656,549); y patentes US 6,177,263 y 6,153,410.

Los métodos no estocásticos o de "evolución dirigida" incluyen, por ejemplo, mutagénesis de saturación (GSSM®) , reensamble de ligamiento sintético (SLR) , o una combinación de los mismos, y se utilizan para modificar los ácidos nucleicos de la invención con el fin de generar xilanasas con propiedades nuevas o alteradas (por ejemplo, actividad bajo condiciones altamente ácidas o alcalinas, temperaturas altas o bajas, y similares) . Los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos modificados se pueden rastrear para determinar una actividad antes de probar para la hidrólisis de xilano u otra actividad. Se puede emplear cualquier modalidad o protocolo de prueba, por ejemplo, utilizando una plataforma de matriz capilar. Ver, por ejemplo, las patentes US 6,361,974; 6,280,926; 5,939,250.

Mutagénesis de saturación o GSSM® En un aspecto, se utilizan cebadores de codones que contengan una secuencia N,N,G/T degenerada para introducir mutaciones puntuales en un polinucleótido, por ejemplo una xilanasa o un anti-cuerpo de la invención, con el objeto de generar un conjunto de polipéptidos de progenie en donde esté representado un intervalo completo de sustituciones de aminoácidos individuales en cada posición de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido en un sitio de actividad enzimática o sitio de enlace de ligando dirigido para modificarse. Estos oligonu-cleótidos pueden comprender una primera secuencia homologa contigua, una secuencia N, , G/T degenerada, y opcionalmente, una segunda secuencia homologa. Los productos de traducción de la progenie corriente abajo a partir del uso de estos oligonucleóti-dos incluyen todos los cambios de aminoácidos posibles en cada sitio de aminoácido a lo largo del polipéptido, debido a que la degeneración de la secuencia N,N,G/T incluye codones para los 20 aminoácidos. En un aspecto, se utiliza uno de estos nucleótidos degenerados (comprendido, por ejemplo, de un cásete N, N, G/T degenerado) para someter a cada codón original de una plantilla de polinucleótido progenitora, a un intervalo completo de sustituciones de codones. En otro aspecto, se utilizan cuando menos dos casetes degenerados -ya sea en el mismo oligonucleótido o no, para someter cuando menos a dos codones originales de una plantilla de polinucleótido progenitora a un intervalo completo de sustituciones de codones. Por ejemplo, más de una secuencia N,N,G/T puede estar contenida en un oligonucleótido para introducir mutaciones de aminoácidos en más de un sitio. Esta pluralidad de secuencias N, , G/T pueden estar directamente contiguas, o pueden estar separadas por una o más secuencias de nucleótidos adicionales. En otro aspecto, se pueden utilizar oligonucleótidos que puedan servir para introducir adiciones y supresiones, ya sea solos o bien en combinación con los codones que contengan una secuencia N, , G/T, con el fin de introducir cualquier combinación o permutación de adiciones, supresiones, y/o sustituciones de aminoácidos.

En un aspecto, se hace mutagénesis simultánea de dos o más posiciones de aminoácidos contiguos utilizando un oligonu-cleótido que contenga tripletes de N, , G/T contiguos, es decir, una secuencia (N,N,G/T)n degenerada. En otro aspecto, se utilizan casetes degenerados que tengan menos degeneración que la secuencia N,N,G/T. Por ejemplo, puede ser deseable, en algunos casos, utilizar (por ejemplo, en un oligonucleótido) una secuencia triplete degenerada comprendida solamente de un N, en donde este N puede estar en la primera, segunda, o tercera posición del triplete. Se pueden utilizar cualesquiera otras bases, incluyendo cualesquiera combinaciones y permutaciones de las mismas, en las dos posiciones restantes del triplete. De una manera alternativa, puede ser deseable, en algunos casos, utilizar (por ejemplo, en un oligonucleótido) una secuencia triplete ?,?,? degenerada.

En un aspecto, el uso de tripletes degenerados (por ejemplo, los tripletes N, , G/T) permite que haya una generación sistemática y fácil de un intervalo completo de aminoácidos naturales posibles (para un total de 20 aminoácidos) en cada una y toda posición de aminoácido de un polipéptido (en los aspectos alternativos, los métodos también incluyen la generación de menos que todas las posibles sustituciones por residuo de aminoácido o posición de codón) . Por ejemplo, para un polipéptido de 100 aminoácidos, se pueden generar 2000 especies distintas (es decir, 20 aminoácidos posibles por posición X 100 posiciones de aminoácidos) . A través del uso de un oligonucleótido o de un conjunto de oligonucleótidos que contengan un triplete N,N,G/T degenerado, 32 secuencias individuales pueden codificar para los 20 posibles aminoácidos naturales. Por consiguiente, en un recipiente de reacción en el cual una secuencia de polinucleótido progenitora se someta a mutagénesis de saturación utilizando cuando menos uno de estos oligonucleótidos, se generan 32 polinucleótidos de progenie distintos que codifican 20 polipépti-dos distintos. En contraste, el uso de un oligonucleótido no degenerado en la mutagénesis dirigida al sitio, conduce solamente a un producto de polipéptido de progenie por recipiente de reacción. Los oligonucleótidos no degenerados pueden utilizarse opcionalmente en combinación con los cebadores degenerados dados a conocer; por ejemplo, se pueden utilizar oligonucleótidos no degenerados para generar mutaciones puntuales específicas en un polinucleótido de trabajo. Esto proporciona un medio para generar mutaciones puntuales silenciosas específicas, mutaciones puntuales que conduzcan a los cambios de aminoácidos correspon- dientes, y mutaciones puntuales que ocasionen la generación de codones de paro y la expresión correspondiente de los fragmentos de polipéptidos .

En un aspecto, cada recipiente de reacción de mutagéne-sis de saturación contiene polinucleótidos que codifican cuando menos 20 moléculas de polipéptido de progenie (por ejemplo, xilanasas) , de tal manera que están representados los 20 aminoácidos naturales en la posición específica de aminoácidos correspondiente a la posición del codón mutado en el polinucleó-tido progenitor (otros aspectos utilizan menos que las 20 combinaciones naturales) . Los polipéptidos de progenie degenerados 32 veces, generados a partir de cada recipiente de reacción de mutagénesis de saturación, se pueden someter a amplificación clonal (por ejemplo, se pueden clonar en un anfitrión adecuado, por ejemplo un anfitrión de E. coli, utilizando, por ejemplo, un vector de expresión) , y se pueden someter a rastreo de expresión. Cuando se identifica un polipéptido de progenie indivi'dual mediante rastreo para exhibir un cambio favorable en ! las propiedades (cuando se compara con el polipéptido progenitor, tal como una mayor actividad de hidrólisis de xilano bajo condiciones alcalinas o acidas) , se puede secuenciar para identificar la sustitución de aminoácido correspondientemente favorable contenida en el mismo.

En un aspecto, después de mutar cada una y toda posición de aminoácido en un polipéptido progenitor utilizando mutagénesis de saturación como se da a conocer en la presente, se pueden identificar cambios de aminoácidos favorables en más de una posición de aminoácido. Se pueden generar una o más nuevas moléculas de progenie que contengan una combinación de todas o una parte de estas sustituciones de aminoácidos favorables. Por ejemplo, si se identifican 2 cambios de aminoácidos favorables específicos en cada una de 3 posiciones de aminoácidos en un polipéptido, las permutaciones incluyen 3 posibilidades en cada posición (no hay cambios desde el aminoácido original, y cada uno de dos cambios favorables) y 3 posiciones. Por consiguiente, son 2 x 3 x 3 o 27 posibilidades totales, incluyendo 7 que fueron previamente examinadas -6 mutaciones puntuales individuales (es decir, 2 en cada una de tres posiciones) , y ningún cambio en cualquier posición.

En todavía otro aspecto, se puede utilizar mutagénesis de saturación del sitio junto con mezcla, quimerización, recombinación, y otros procesos de mutagenización, junto1 con rastreo. Esta invención proporciona el uso de cualesquiera procesos de mutagenización, incluyendo mutagénesis de saturación, de una manera iterativa. En una ejemplificación, se hace el uso iterativo de cualesquiera procesos de mutagenización en combinación con el rastreo.

La invención también proporciona el uso de cebadores de codones patentados (que contienen una secuencia ?,?,? degenerada) para introducir mutaciones puntuales en un polinu- cleótido, para generar un conjunto de polipéptidos de progenie en donde está representado el intervalo completo de sustituciones de aminoácidos individuales, en cada posición de aminoácido (mutagénesis saturada del sitio genético (GSSM®) ) . Los oligonu-cleótidos utilizados están comprendidos contiguamente a una primera secuencia homologa, una secuencia ?,?,? degenerada, y de preferencia, pero no necesariamente, una segunda secuencia homologa. Los productos de traducción de progenie corriente abajo a partir del uso de estos oligonucleótidos incluyen todos los cambios de aminoácidos posibles en cada sitio de aminoácido del polipéptido, debido a que la degeneración de la secuencia ?,?,? incluye codones para los 20 aminoácidos.

En un aspecto, se utiliza un oligonucleótido degenerado (comprendido de un cásete ?,?,? degenerado) para someter a cada codón original de una plantilla de oligonucleótido progenitpra, a un intervalo completo de sustituciones de codones. En otro aspecto, se utilizan cuando menos dos casetes ?,?,? degenerados -ya sea en el mismo oligonucleótido o no-, para someter a cuándo menos dos codones originales de una plantilla de polinucleótido progenitora, a un intervalo completo de sustituciones de codones.

Por consiguiente, puede haber más de una secuencia ?,?,? contenida en el oligonucleótido para introducir mutaciones de aminoácidos en más de un sitio. Esta pluralidad de secuencias ?,?,? pueden estar directamente contiguas, o pueden estar separadas por una o más secuencias de nucleótidos adicionales.

En otro aspecto, se pueden utilizar oligonucleótidos que sirvan para introducir adiciones y supresiones, ya sea solos 0 en combinación con los codones que contengan una secuencia ?,?,?, con el fin de introducir cualquier combinación o permutación de adiciones, supresiones, y/o sustituciones de aminoácidos.

En una ej emplificación particular, es posible mutar simultáneamente dos o más posiciones de aminoácidos contiguas utilizando un oligonucleótido que contenga tripletes ?,?,? contiguos, es decir, una secuencia (N,N,N)n degenerada.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de casetes degenerados que tienen menos degeneración que la secuencia ?,?,?. Por ejemplo, puede ser deseable, en algunos casos, utilizar (por ejemplo, en un oligonucleótido) una secuencia triplete degenerada comprendida solamente de un N, en donde N puede estar en la primera, segunda, o tercera posición del triplete. Se pueden utilizar cualesquiera otras bases, incluyendo cualesquiera combinaciones y permutaciones de las mismas, en las dos posiciones restantes del triplete. De; una manera alternativa, en algunos casos, puede ser deseable utilizar (por ejemplo, en un oligonucleótido) una secuencia triplete ?,?,? degenerada, N,N,G/T, o una secuencia triplete N,N,G/C.

Sin embargo, se aprecia que el uso de un triplete degenerado (tal como N,N,G/T o una secuencia triplete N,N,G/C), como se da a conocer en la presente invención, es conveniente por varias razones. En un aspecto, esta invención proporciona un medio para generar sistemáticamente y muy fácilmente, la sustitución del intervalo completo de aminoácidos posibles (para un total de 20 aminoácidos) en cada una y toda posición de aminoácido de un polipéptido. Por consiguiente, para un polipép-tido de 100 aminoácidos, la invención proporciona una manera de generar de una forma sistémica y muy fácil, 2000 especies distintas (es decir, 20 posibles aminoácidos por posición por 100 posiciones de aminoácidos) . Se aprecia que se proporcionan, a través del uso de un oligonucleótido que contenga una secuencia triplete N,N,G/T o N,N,G/C degenerada, 32 secuencias individuales que codifican para 20 posibles aminoácidos. Por consiguiente, en un recipiente de reacción en donde se someta a una secuencia de polinucleótido progenitora a mutagénesis de saturación utilizando uno de estos oligonucleótidos , se generan 32 polinucleótidos de progenie distintos que codifican 20 polipéptidos distintos. En contraste, el uso de un oligonucleótido no degenerado en la mutagénesis dirigida al sitio, conduce solamente a un producto de polipéptido de progenie por recipiente de reacción.

Esta invención proporciona el uso de oligonucleótidos no degenerados, los cuales se pueden utilizar opcionalmente en combinación con los cebadores degenerados dados a conocer. Se aprecia que, en algunas situaciones, es conveniente utilizar oligonucleótidos no degenerados para generar mutaciones puntuales específicas en un polinucleótido de trabajo. Esto proporciona un medio para generar mutaciones puntuales silenciosas específicas, mutaciones puntuales que conduzcan a cambios de aminoácidos correspondientes, y mutaciones puntuales que causen la generación de codones de paro y la expresión correspondiente de fragmentos de polipéptidos .

Por consiguiente, en un aspecto de esta invención, cada recipiente de reacción de mutagénesis de saturación contiene polinucleótidos que codifican cuando menos 20 moléculas de polipéptido de progenie, de tal manera que los 20 aminoácidos están representados en la posición de aminoácido específica correspondiente a la posición de codón mutada en el polinucleóti-do progenitor. Los polipéptidos de progenie degenerados 32 veces, generados a partir de cada recipiente de reacción de mutagénesis de saturación, se pueden someter a amplificación clonal (por ejemplo, se pueden clonar en un anfitrión de E. coli adecuado, utilizando un vector de expresión) , y se pueden someter a rastreo de expresión. Cuando se identifica un polipéptido de progenie individual mediante rastreo para exhibir un cambio favorable en las propiedades (cuando se compara con el polipéptido progenitor) , se puede secuenciar con el fin de identificar la sustitución de aminoácidos correspondientemente favorable contenida en el mismo.

Se aprecia que, después de mutar cada una y toda posición de aminoácido en un polipéptido progenitor empleando mutagénesis de saturación, como se da a conocer en la presente, se pueden identificar cambios de aminoácidos favorables en más de una posición de aminoácido. Se pueden generar una o más nuevas moléculas de progenie que contengan una combinación de todas o una parte de estas sustituciones de aminoácidos favorables. Por ejemplo, si se identifican 2 cambios de aminoácidos favorables específicos en cada una de 3 posiciones de aminoácidos en un polipéptido, las permutaciones incluyen 3 posibilidades en cada posición (sin cambios del aminoácido original, y cada uno de dos cambios favorables), y 3 posiciones. Por consiguiente, hay 3 x 3 x 3 o 27 posibilidades en total, incluyendo 7 que fueron previamente examinadas -6 mutaciones puntuales individuales (es decir, 2 en cada una de tres posiciones) y ningún cambio en cualquier posición.

Por consiguiente, en una ejemplificación no limitante, esta invención proporciona el uso de mutagénesis de saturación en combinación con procesos de mutación adicionales, tales como un proceso en donde se introducen dos o más polinucleótidos relacionados en una célula hospedera adecuada, de tal manera que se genere un polinucleótido híbrido mediante recombinación y reclasificación reductiva.

En adición a efectuar mutagénesis a lo largo de toda la secuencia de un gen, la presente invención dispone que se puede emplear la mutagénesis para reemplazar a cada una de cualquier número de bases en una secuencia de polinucleótido, en donde el número de bases que se vayan a mutar de preferencia es cada entero de 15 a 100,000. Por consiguiente, en lugar de mutar cada posición a lo largo de una molécula, se puede someter a cada una o a un número discreto de bases (de preferencia un subconjunto que totalice de 15 a 100,000) a mutagénesis. De preferencia, se utiliza un nucleótido separado para mutar cada posición o grupo de posiciones a lo largo de una secuencia de polinucleóti-do. Un grupo de 3 posiciones que se vaya a mutar, puede ser un codón. Las mutaciones de preferencia se introducen utilizando un cebador mutagénico, que contenga un cásete heterólogo, también referido como un cásete mutagénico. Los casetes de ejemplo pueden tener de 1 a 500 bases. Cada posición de nucleótido en estos casetes heterólogos es N, A, C, G, T, A/C, A/G, A/T, C/G, C/T, G/T, C/G/T, A/G/T, A/C/T, A/C/G, o E, en donde E es cualquier base que no sea A, C, G, o T (E puede ser referido como un oligonucleótido diseñador) .

En un sentido general, la mutagénesis de saturación está comprendida de mutar un conjunto completo de casetes mutagénicos (en donde cada cásete de preferencia es de aproximadamente 1 a 500 bases de longitud) en la secuencia de polinucleó-tido definida que se vaya a mutar (en donde la secuencia que se vaya a mutar de preferencia es de aproximadamente 15 a 100,000 bases de longitud) . Por consiguiente, se introduce un grupo de mutaciones (que van de 1 a 100 mutaciones) en cada cásete que se vaya a mutar. Una agrupación de mutaciones que se vaya a introducir en un cásete, puede ser diferente o igual a una segunda agrupación de mutaciones que se vaya a introducir en un segundo cásete durante la aplicación de una ronda de mutagénesis de saturación. Estas agrupaciones se ejemplifican mediante supresiones, adiciones, agrupaciones de codones particulares, y agrupaciones de casetes de nucleótidos particulares.

Las secuencias definidas que se van a mutar incluyen un gen entero, una senda, un ADNc, un marco de lectura abierta entero (ORF) y un promotor entero, potenciador, represor/ transactivador, origen de réplica, intrón, operador, o cualquier grupo funcional de polinucleótidos . En términos generales, una "secuencia definida" para este propósito, puede ser cualquier polinucleótido que tenga una secuencia de polinucleótido de 15 bases, y secuencias de polinucleótidos de longitudes de entre 15 bases y 15,000 bases (esta invención nombra específicamente a cada entero entre las mismas) . Las consideraciones en la selección de las agrupaciones de codones incluyen los tipos de aminoácidos codificados por un cásete mutagénico degenerado.

En una ejemplificación de una agrupación de mutaciones que se pueda introducir en un cásete mutagénico, esta invención dispone específicamente sustituciones de codones degenerados (utilizando oligonucleótidos degenerados) que codifican para 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 aminoácidos en cada posición, y una biblioteca de polipéptidos codificados por los mismos.

Re-Ensamble de Ligamiento Sintético (SLR) La invención proporciona un sistema de modificación genética no estocástico denominado como "re-ensamble de ligamiento sintético", o simplemente "SLR", un "proceso de evolución dirigida", para generar polipéptidos , por ejemplo las xilanásas o los anti-cuerpos de la invención, con propiedades nuevas o alteradas .

El re-ensamble de ligamiento sintético es un método para ligar fragmentos de oligonucleótidos entre sí de una manera no estocástica. Este método difiere de la mezcla estocástica de oligonucleótidos en que los bloques de construcción de ácidos nucleicos no se mezclan, concatenan, ni quimerizan de una manera aleatoria, sino que en su lugar se ensamblan de una manera no estocástica. Ver, por ejemplo, la solicitud de patente US 09/ 332,835, intitulada "Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution", y presentada el 14 de junio de 1999 ("USSN 09/ 332,835") . En un aspecto, el re-ensamble de ligamiento sintético comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un polinucleóti-do de plantilla, en donde el polinucleótido de plantilla comprende una secuencia que codifica un gen homólogo; , (b) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos de bloque de construcción, en donde los polinucleótidos de bloque de construcción se diseñan para re-ensamblarse cruzadamente con el polinucleótido de plantilla en una secuencia previamente determinada, y un polinucleótido de bloque de construcción comprende una secuencia que es una variante del gen homólogo, y una secuencia homologa al polinucleótido de plantilla que flanquea a la secuencia variante; (c) combinar un polinucleótido de bloque de construcción con un polinucleótido de plantilla, de tal manera que el polinucleótido de bloque de construcción se re-ensamble cruzadamente con el polinucleótido de plantilla para generar polinucleótidos que comprendan variaciones de secuencias genéticas homologas .

El re-ensamble de ligamiento sintético no depende de la presencia de altos niveles de homología entre los polinucleótidos que se vayan a reconfigurar . Por consiguiente, este método se puede utilizar para generar, de una manera no estocástica, bibliotecas (o conjuntos) de moléculas de progenie comprendidas de más de 10100 quimeras diferentes. El re-ensamble de ligamiento sintético se puede utilizar para generar bibliotecas comprendidas de más de io1000 quimeras de progenie diferentes. Por consiguiente, los aspectos de la presente invención incluyen métodos no estocásticos para producir un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamble global que se selecciona por diseño. Este método incluye, los pasos de generar por diseño una pluralidad de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos que tengan extremos ligables mutuamente compatibles que puedan servir, y ensamblar estos bloques de construcción de ácidos nucleicos, de tal manera que se logre un orden de ensamble global designado.

Los extremos ligables mutuamente compatibles de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se van a ensamblar, se consideran como "servibles" para este tipo de ensamble ordenado si hacen posible que se acoplen los bloques de construcción en órdenes previamente determinados. Por lo tanto, el orden de ensamble global en el que se pueden acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos es especificado por diseño de los extremos ligables. Si se va a emplear más de un paso de ensamble, entonces el orden de ensamble global en el que se pueden acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos también es especificado por el orden secuencial de los pasos de ensamble. En un aspecto, las piezas de construcción templadas se tratan con una enzima, tal como una ligasa (por ejemplo, ligasa de ADN T4) , para lograr el enlace covalente de las piezas de construcción.

En un aspecto, el diseño de los bloques de construcción de oligonucleótidos se obtiene mediante el análisis de un conjunto de plantillas de secuencias de ácidos nucleicos progenitoras que sirvan como una base para producir un conjunto de progenie de polinucleótidos quiméricos finalizados. Estas plantillas de oligonucleótidos progenitores, por consiguiente, sirven como una fuente de información de secuencia que ayuda en el diseño de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se vayan a mutar, por ejemplo, a quimerizar o a mezclar. En un aspecto de este método, se alinean las secuencias de una pluralidad de plantillas de ácidos nucleicos progenitoras, con el objeto de seleccionar uno o más puntos de demarcación. Los puntos de demarcación se pueden localizar en un área de homología, y están comprendidos de uno o más nucleótidos. Estos puntos de demarcación de preferencia son compartidos por cuando menos dos de las plantillas progenitoras . Los puntos de demarcación se pueden utilizar de esta manera para delinear los límites de los bloques de construcción de oligonucleótidos que se vayan a generar, con el fin de reconfigurar los polinucleótidos progenitores. Los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas progenitoras sirven como puntos de quimerización potenciales en el ensamble de las moléculas de progenie quiméricas finales. Un punto de demarcación puede ser un área de homología (comprendida de cuando menos una base de nucleótido homologa) compartida por cuando menos dos secuencias de polinucleótidos progenitoras. De una manera alternativa, un puntó de demarcación puede ser un área de homología que es compartida por cuando menos la mitad de las secuencias de polinucleótidos progenitoras, o puede ser un área de homología que es compartida por cuando menos dos terceras partes de las secuencias de polinucleótidos progenitoras. Incluso de una manera más prefierí-ble, un punto de demarcación servible es un área de homología que es compartida por cuando menos tres cuartas partes de t las secuencias de polinucleótidos progenitoras, o puede ser compartida por casi todas las secuencias de polinucleótidos progenitoras. En un aspecto, un punto de demarcación es un área de homología que es compartida por todas las secuencias de polinucleótidos progenitoras .

En un aspecto, se lleva a cabo exhaustivamente un proceso de re-ensamble de ligamiento con el objeto de generar una biblioteca exhaustiva de polinucleótidos quiméricos de progenie. En otras palabras, todas las posibles combinaciones ordenadas de los bloques de construcción de ácidos nucleicos están representadas en el conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizados. Al mismo tiempo, en otro aspecto, el orden de ensamble (es decir, el orden de ensamble de cada bloque de construcción en la secuencia de 51 a 3 ' de cada ácido nucleico quimérico finalizado) en cada combinación es por diseño (o no estocástico) , como se describe anteriormente. Debido a la naturaleza no estocástica de esta invención, se reduce mucho la posibilidad de productos secundarios indeseados.

En otro aspecto, el método de re-ensamble de ligamiento se lleva a cabo sistemáticamente. Por ejemplo, el método se lleva a cabo con el objeto de generar una biblioteca sistemáticamente compartimentalizada de moléculas de progenie, con compartimientos que se puedan rastrear de manera sistemática, por ejemplo uno por uno. En otras palabras, esta invención dispone que, a través del uso selectivo y juicioso de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos, junto con el uso selectivo y juicioso de reacciones de ensamble secuencialmente escalonadas, se puede lograr un diseño en donde se hagan conjuntos específicos de productos de progenie en cada uno de varios recipientes de reacción. Esto permite que se lleve a cabo un procedimiento sistemático de examen y rastreo. Por consiguiente, estos métodos permiten que se examine sistemáticamente un número potencialmente muy grande de moléculas de progenie en grupos más pequeños . Debido a su capacidad para realizar quimerizaciones de una manera que es altamente flexible y no obstante también exhaustiva y sistemática, en particular cuando hay un bajo nivel de homología entre las moléculas progenitoras , estos métodos proporcionan la generación de una biblioteca (o conjunto) comprendida de un gran número de moléculas de progenie . Debido a la naturaleza no estocástica del re-ensamble de ligamiento de la presente invención, las moléculas de progenie generadas de preferencia comprenden una biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos quiméricos finalizados que tienen un orden de ensamble global que se selecciona por diseño. También se pueden emplear los métodos de mutagénesis de saturación y de evolución dirigida optimizada, para generar diferentes especies moleculares de progenie. Se aprecia que la invención proporciona libertad de elección y control con respecto a la selección de los puntos de demarcación, el tamaño, y el número de bloques de construcción de ácidos nucleicos, y el tamaño y diseño de los acoplamientos. Adiciohal-mente, se aprecia que el requerimiento de homología intermolecular es altamente relajado para la operabilidad de esta invención. De hecho, inclusive se pueden seleccionar puntos de demarcación en áreas de poca o ninguna homología intermolecular. Por ejemplo, debido a la fluctuación de los codones, es decir, a la degeneración de los codones, se pueden introducir sustituciones de nucleótidos en los bloques de construcción de ácidos nucleicos sin alterar el aminoácido originalmente codificado en la plantilla progenitora correspondiente. De una manera alternativa, se puede alterar un codón de tal manera que se altere la codificación para un aminoácido original . Esta invención dispone que estas sustituciones se pueden introducir en el bloque de construcción de ácido nucleico con el objeto de aumentar la incidencia de puntos de demarcación homólogos intermoleculares y, por lo tanto, para permitir que se alcance un mayor número de acoplamientos entre los bloques de construcción, lo cual a su vez permite que se genere un mayor número de moléculas quiméricas de progenie .

Re-Ensamble genético sintético En un aspecto, la presente invención proporciona un método no estocástico denominado como re-ensamble genético sintético (por ejemplo, GeneReassembly®, ver, por ejemplo, la patente US 6,537,776), el cual difiere de la mezcla estocástica en que los bloques de construcción de ácidos nucleicos no se mezclan ni se concatenan ni se quimerizan de una manera aleatoria, sino que más bien se ensamblan de una forma no estocástica.

El método de re-ensamble genético sintético no depende de la presencia de un alto nivel de homología entre los polinu-cleótidos que se vayan a mezclar. La invención se puede utilizar para generar, de una manera no estocástica, bibliotecas (o conjuntos) de moléculas de progenie comprendidas de más de 10100 quimeras diferentes. De una manera concebible, el re-ensamble genético sintético se puede inclusive utilizar para generar bibliotecas comprendidas de más de io1000 quimeras de progenie diferentes .

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un método no estocástico para producir un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricos finalizados que tienen un orden de ensamble global que se selecciona por diseño, cuyo método está comprendido de los pasos de generar por diseño una pluralidad de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos que tengan extremos ligables mutuamente compatibles servibles, y ensamblar estos bloques de construcción de ácidos nucleicos, de tal manera que se logre un orden de ensamble global designado.

En un aspecto, el re-ensamble genético sintético comprende un método de: 1) preparar una generación de progenie de moléculas (incluyendo una molécula que comprenda una secuencia de polinucleótido, por ejemplo una molécula que comprenda una secuencia de codificación de polipéptido) , que se mute para lograr cuando menos una mutación puntual, adición, supresión, y/o quimerización, a partir de una o más plantillas de generación ancestral o progenitora 2) rastrear las moléculas de la generación de progenie, por ejemplo utilizando un método de 'alta producción, para determinar cuando menos una propiedad de interés (tal como una mejora en la actividad enzimática) ; 3) opcionalmen-te obtener y/o catalogar la información estructural y/o funcional con respecto a las moléculas de la generación progenitora y/o de progenie; y 4) opcionalmente repetir cualquiera de los pasos 1) a 3) . En un aspecto, se genera (por ejemplo, a partir de una plantilla de polinucleótido progenitora) , en lo que se denomina "mutagénesis de saturación del sitio del codón" , una generación de progenie de polinucleótidos , cada uno teniendo cuando ménos un conjunto de hasta tres mutaciones puntuales contiguas (es decir, bases diferentes que comprenden un nuevo codón), de¦ tal manera que cada codón (o cada familia de codones degenerados que codifiquen el mismo aminoácido) esté representado en cada posición de codón. Correspondiendo con, y codificados por, esta generación de progenie de polinucleótidos, también se genera un conjunto de polipéptidos de progenie, cada uno teniendo cuando menos una mutación puntual de un solo aminoácido. En un aspecto, se genera, en lo que se denomina "mutagénesis de saturación del sitio de aminoácidos", un polipéptido mutante por cada una de las 19 sustituciones de alfa-aminoácidos formadores del polipéptido naturalmente codificados en cada una y toda posición de aminoácido a lo largo del polipéptido. Esto produce, por cada una y toda posición de aminoácido a lo largo del polipéptido progenitor, un total de 20 polipéptidos de progenie distintos, incluyendo el aminoácido original, o potencialmente más de 21 polipéptidos de progenie distintos si se utilizan aminoácidos adicionales, ya sea en lugar de, o bien en adición a, los 20 aminoácidos naturalmente codificados .

Por consiguiente, en otro aspecto, este planteamiento también sirve para generar mutantes que contengan, en adición a, y/o en combinación con, los 20 alfa-aminoácidos formadores del polipéptido naturalmente codificados, otros aminoácidos y derivados de aminoácidos raros y/o no naturalmente codificados. En todavía otro aspecto, este planteamiento también sirve para generar mutantes mediante el uso de, en adición a, y/o en combinación con, los sistemas de reconocimiento de codones naturales o no alterados de anfitriones adecuados, o sistemas de reconocimiento de codones alterados, mutados, y/o designados (tales como en una célula hospedera con una o más moléculas de ARNt alteradas .

En todavía otro aspecto, esta invención se refiere a la recombinación, y más específicamente a un método para preparar polinucleótidos que codifiquen un polipéptido mediante un método de reclasificación in vivo de secuencias de polinucleótidos que contengan regiones de homología parcial, ensamblar los polinucleótidos para formar cuando menos un polinucleótido, y rastrear los polinucleótidos para determinar la producción de polipéptidos que tengan una propiedad útil.

En todavía otro aspecto, esta invención sirve para analizar y catalogar, con respecto a cualquier propiedad molecular (por ejemplo, una actividad enzimática) o combinación de propiedades permitidas por la tecnología actual, los efectos de cualquier cambio mutacional logrado (incluyendo en particular la mutagénesis de saturación) . Por consiguiente, se proporciona un método comprensivo para determinar el efecto de cambiar cada aminoácido de un polipéptido progenitor en cada una de cuando menos 19 sustituciones posibles. Esto permite que cada aminoácido de un polipéptido progenitor se caracterice y se catalogue de acuerdo con su espectro de efectos potenciales sobre una propiedad mensurable del polipéptido.

En un aspecto, se puede introducir un intrón en una molécula de progenie quimérica por medio de un bloque de construcción de ácido nucleico. Los intrones con frecuencia tienen secuencias en consenso en ambos términos, con el objeto de hacerlas operativas. En adición, para hacer posible el empalme genético, los intrones pueden servir para un propósito adicional al proporcionar sitios de homología a otros ácidos nucleicos para hacer posible la recombinación homologa. Para este propósito, y potencialmente para otros, algunas veces puede ser deseable generar un gran bloque de construcción de ácido nucleico para introducir un intrón. Si el tamaño es demasiado grande, generándose fácilmente mediante síntesis química directa de dos oligonucleótidos de una sola cadena, este bloque de construcción de ácido nucleico especializado también se puede generar mediante síntesis química directa de más de dos oligonucleótidos de una sola cadena, o mediante la utilización de una reacción de amplificación basada en la polimerasa.

Los extremos ligables mutuamente compatibles de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se van a ensamblar, se consideran "servibles" para este tipo de ensamble ordenado, si hacen posible que se acoplen los bloques de construcción en órdenes previamente determinados. Por consiguiente, en un aspecto, el orden de ensamble global en el que se pueden acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos es especificado por el diseño de los extremos ligables, y, si se va a emplear más de un paso de ensamble, entonces el orden de ensamble global en el que se puedan acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos también es especificado por el orden secuencial de los pasos de ensamble. En un aspecto de la invención, las piezas de construcción templadas se tratan con una enzima, tal como una ligasa (por ejemplo, ligasa de ADN T4) para lograr el enlace covalente de las piezas de construcción.

El acoplamiento puede ocurrir de una manera que no haga uso de cada nucleótido de una colgadura participante. El acoplamiento es particularmente vivo para sobrevivir (por ejemplo, en un anfitrión transformado) si se refuerza el acoplamiento mediante su tratamiento con una enzima de ligasa para formar lo que puede ser referido como un "ligamiento de hueco" o un "ligamiento con huecos". Este tipo de acoplamiento puede contribuir a la generación de productos de fondo indesea- dos, pero también se puede utilizar con ventaja para incrementar la diversidad de la biblioteca de progenie generada por el reensamble de ligamiento diseñado. Ciertas colgaduras son capaces de sufrir auto-acoplamiento para formar un acoplamiento palindró-mico. Un acoplamiento se refuerza sustancialmente mediante el tratamiento con una enzima de ligasa. La falta de fosfatos 5' sobre estas colgaduras, se puede utilizar con ventaja para prevenir este tipo de auto-ligamiento palindrómico . De conformidad con lo anterior, esta invención dispone que se pueden hacer químicamente (u ordenar) bloques de construcción de ácidos nucleicos que carezcan de un grupo fosfato 5 ' . De una manera alternativa, se pueden remover, por ejemplo, mediante su tratamiento con una enzima de fosfatasa, tal como una fosfatasa alcalina intestinal de becerro (CIAP) , con el objeto de prevenir los auto- ligamientos palindrómicos en los procesos de re-ensamble de ligamiento. i En otro aspecto, se obtiene el diseño de bloques de construcción de ácidos nucleicos sobre el análisis de las secuencias de un conjunto de plantillas de ácidos nucleicos progenitoras que sirven como una base para producir un conjunto de progenie de moléculas de ácidos nucleicos quiméricos finalizados . Estas plantillas de ácidos nucleicos progenitoras , - por consiguiente, sirven como una fuente de información de secuencia que ayuda en el diseño de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se vayan a mutar, es decir, a quimerizar o a mezclar .

En una ejemplificación, la invención proporciona la quimerización de una familia de genes relacionados y su familia codificada de productos relacionados. En una ej emplificación particular, los productos codificados son enzimas. Las xilanasas de la presente invención se pueden mutar de acuerdo con los métodos descritos en la presente.

Por consiguiente, de conformidad con un aspecto de la invención, se alinean las secuencias de una pluralidad de plantillas de ácidos nucleicos progenitoras (por ejemplo, los polinucleótidos de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A) , con el objeto de seleccionar uno o más puntos de demarcación, cuyos puntos de demarcación se pueden localizar en un área de homología. Los puntos de demarcación se pueden utilizar para delinear los límites de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se vayan a generar. Por consiguiente, los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas progenitoras sirven como puntos de quimerización potenciales en el ensamble de las moléculas de progenie.

Normalmente, un punto de demarcación servible es un área de homología (comprendida de cuando menos una base de nucleótido homologa) compartida por cuando menos dos plantillas progenitoras, pero el punto de demarcación puede ser un área de homología que sea compartida pro cuando menos la mitad de las plantillas progenitoras, cuando menos dos terceras partes de las plantillas progenitoras , cuando menos tres cuartas partes de las plantillas progenitoras, y de preferencia casi todas las plantillas progenitoras. Incluso de una manera todavía más preferible, un punto de demarcación servible es un área de homología que es compartida por todas las plantillas progenitoras .

En un aspecto, el proceso de re-ensamble genético se lleva a cabo de una manera exhaustiva, con el objeto de generar una biblioteca exhaustiva. En otras palabras, todas las combinaciones ordenadas posibles de los bloques de construcción de ácidos nucleicos están representadas en el conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricos finalizados. Al mismo tiempo, el orden de ensamble (es decir, el orden de ensamble de cada bloque de construcción en la secuencia de 51 a 3' de cada ácido nucleico quimérico finalizado) en cada combinación, es por diseño (o no estocástico) . Debido a la naturaleza no estocástica del método, se reduce mucho la posibilidad de productos secundarios indesea-dos .

En otro aspecto, el método dispone que el proceso de re-ensamble genético se lleve a cabo sistemáticamente, por ejemplo, para generar una biblioteca sistemáticamente comparti-mentalizada con compartimientos que se puedan rastrear de manera sistemática, por ejemplo uno por uno. En otras palabras > la invención dispone que, a través del uso selectivo y juicioso de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos, junto con el uso selectivo y juicioso de reacciones de ensamble secuencialmente escalonadas, se puede lograr un diseño experimental en donde se hagan conjuntos específicos de productos de progenie en cada uno de varios recipientes de reacción. Esto permite que se lleve a cabo un procedimiento sistemático de examen y rastreo. Por consiguiente, se permite que se examine sistemáticamente un número potencialmente muy grande de moléculas de progenie en grupos más pequeños .

Debido a su capacidad para realizar quimerizaciones de una manera que es altamente flexible y no obstante también exhaustiva y sistemática, en particular cuando hay un bajo nivel de homología entre las moléculas progenitoras , la presente invención proporciona la generación de una biblioteca (o conjunto) comprendida de un gran número de moléculas de progenie. Debido a la naturaleza no estocástica del re-ensamble genético de la presente invención, las moléculas de progenie generadas de preferencia comprenden una biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos quiméricos finalizados que tienen un orden de ensamble global que se selecciona por diseño. En un aspecto particular, esta biblioteca generada está comprendida de más de 103 hasta más de io1000 especies moleculares de progenie diferentes.

En un aspecto, un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricos finalizados, producidas como se describe, está comprendido de un polinucleótido que codifica un polipépti-do. De conformidad con un aspecto, este polinucleótido es un gen, el cual puede ser un gen hecho por el hombre. De acuerdo con otro aspecto, este polinucleótido es una senda genética, la cual puede ser una senda genética hecha por el hombre. La invención dispone que se pueden incorporar uno o más genes hechos por el hombre generados mediante la invención, en una senda genética hecha por el hombre, tal como la senda operativa en un organismo eucarióti-co (incluyendo una planta) .

En otra ej emplificación, la naturaleza sintética del paso en el que se generan los bloques de construcción permite el diseño y la introducción de nucleótidos (por ejemplo, uno o más nucleótidos, que pueden ser, por ejemplo, codones o intrones o secuencias reguladoras) que posteriormente se pueden remover de manera opcional en un proceso in vitro (por ejemplo, mediante mutagénesis) o en un proceso in vivo (por ejemplo, mediante la utilización de la capacidad de empalme de genes de un organismo anfitrión) . Se aprecia que, en muchos casos, también puede ser deseable la introducción de estos nucleótidos por otra muchas razones en adición al beneficio potencial de crear un punto de demarcación servible.

Por consiguiente, de acuerdo con otro aspecto, la invención dispone que se puede utilizar un bloque de construcción de ácido nucleico para introducir un intrón. Por lo tanto, la invención dispone que se pueden introducir intrones funcionales en un gen hecho por el hombre de la invención. La invención también dispone que se pueden introducir intrones funcionales en una senda genética hecha por el hombre de la invención. De conformidad con lo anterior, la invención dispone la generación de un polinucleótido quimérico que es un gen hecho por el hombre que contiene uno (o más) intrón(es) artificialmente introduci-do(s) .

De conformidad con lo anterior, la invención también dispone la generación de un polinucleótido quimérico que es, una senda genética hecha por el hombre que contiene uno (o más) intrón(es) artificialmente introducido (s) . De preferencia, el uno (o más) intrón(es) artificialmente introducido (s) es (son) funcional (es) en una o más células hospederas para empalme de genes, de una manera muy parecida a la forma en que los intrones que se presentan naturalmente sirven funcionalmente en el empalme de genes. La invención proporciona un proceso para producir polinucleótidos que contienen intrones hechos por el hombre ¡ para introducirse en organismos anfitriones para recombinación y/o empalme .

Un gen hecho por el hombre producido utilizando la invención, también puede servir como un sustrato para recombinar-se con otro ácido nucleico. De la misma manera, una senda genética hecha por el hombre, producida utilizando la invención, también puede servir como un sustrato para recombinarse con otro ácido nucleico. En un aspecto, la recombinación es facilitada por, o se presenta en, las áreas de homología entre el gen que contiene intrones hecho por el hombre, y un ácido nucleico, el cual sirve como un componente de recombinación. En un aspecto, el componente de recombinación también puede ser un ácido nucleico generado mediante la invención, incluyendo un gen hecho por el hombre o una senda genética hecha por el hombre. La recombinación puede ser facilitada por, o puede presentarse en, las áreas de homología que existen en el uno (o más) intrón(es) artificialmente introducido (s) en el gen hecho por el hombre.

El método de re-ensamble genético sintético de la invención utiliza una pluralidad de bloques de construcción de ácidos nucleicos, cada uno de los cuales tiene de preferencia dos extremos ligables. Los dos extremos ligables de cada bloque de construcción de ácido nucleico pueden ser dos extremos romos (es decir, cada uno teniendo una colgadura de cero nucleótidos) , o de preferencia un extremo romo y una colgadura, o más preferiblemente todavía, dos colgaduras.

Una colgadura útil para este propósito puede ser una colgadura 3' o una colgadura 5'. Por consiguiente, un bloque de construcción de ácido nucleico puede tener una colgadura 31 o alternativamente una colgadura 5 ' o alternativamente dos colgaduras 3 ' o alternativamente dos colgaduras 51. El orden global en el que se ensamblan los bloques de construcción de ácidos nucleicos para formar una molécula de ácido nucleico quimérico finalizado es determinado mediante el diseño experimental intencional y no es aleatorio.

En un aspecto, se genera un bloque de construcción de ácido nucleico mediante la síntesis química de dos ácidos nucleicos de una sola cadena (también referidos como oligonucleó-tidos de una sola cadena) , y el contacto de ellos como para permitirles templarse con el fin de formar un bloque de construc-ción de ácido nucleico de doble cadena.

Un bloque de construcción de ácido nucleico de doble cadena puede ser de un tamaño variable. Los tamaños de estos bloques de construcción pueden ser pequeños o grandes. Los tamaños de ejemplo para los bloques de construcción están en el intervalo desde 1 par de bases (sin incluir colgaduras) hasta 100,000 pares de bases (sin incluir colgaduras). También se proporcionan otros intervalos de tamaños de ejemplo, los cuales tienen límites inferiores desde 1 par de bases hasta 10,000 pares de bases (incluyendo todos los valores enteros entre los mismos) , y límites superiores desde 2 pares de bases hasta 100,000 pares de bases (incluyendo todos los valores enteros entre los mismos) .

Existen muchos métodos mediante los cuales se puede generar un bloque de construcción de ácido nucleico de doble cadena que sea servible para la invención; y éstos son conocidos en la materia y pueden ser llevados a cabo fácilmente por el técnico.

De acuerdo con un aspecto, se genera un bloque de construcción de ácido nucleico de doble cadena generando primero dos ácidos nucleicos de una sola cadena, y permitiéndoles templarse con el fin de formar un bloque de construcción de ácido nucleico de doble cadena. Las dos cadenas de un bloque de construcción de ácido nucleico de doble cadena pueden ser complementarias en cada nucleótido aparte de cualquiera que forme una colgadura, no conteniendo por consiguiente malos emparejamientos, aparte de cualesquiera colgaduras. De acuerdo con otro aspecto, las dos cadenas de un bloque de construcción de ácido nucleico de doble cadena son complementarias en menos que cada nucleótido aparte de cualquiera que forme una colgadura. Por consiguiente, de acuerdo con este aspecto, se puede utilizar un bloque de construcción de ácido nucleico de doble cadena para introducir la degeneración de codones. De preferencia, la degeneración de codones se introduce utilizando la mutagénesis de saturación del sitio descrita en la presente, utilizando uno o más casetes N,N,G/T, o alternativamente utilizando uno o más casetes ?,?,?.

El método de recombinación in vivo de la invención se puede llevar a cabo ciegamente sobre un grupo de híbridos o alelos desconocidos de un polinucleótido o secuencia específica. Sin embargo, no es necesario conocer la secuencia de ADN o ARN real del polinucleótido específico. i El planteamiento de emplear recombinación dentro de una población mixta de genes, puede ser útil para la generación de cualesquiera proteínas útiles, por ejemplo, interleucina I, anticuerpos, tPA, y hormona de crecimiento. Este planteamiento se puede emplear para generar proteínas que tengan una especificidad o actividad alterada. El planteamiento también puede ser útil para la generación de secuencias de ácidos nucleicos híbridos, por ejemplo regiones promotoras, intrones, exones, secuencias potenciadoras , regiones no traducidas 3', o regiones no traducidas 5' de los genes. Por lo tanto, este planteamiento se puede emplear para generar genes que tengan mayores índices de expresión. Este planteamiento también puede ser útil en el estudio de secuencias de ADN repetitivas. Finalmente, este planteamiento puede ser útil para mutar ribozimas o aptámeros .

En un aspecto, la invención descrita en la presente se dirige al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación, y selección, que permiten la evolución molecular dirigida de secuencias lineales altamente complejas, tales como ADN, ARN, o proteínas, a través de la recombinación. i Sistema Optimizado de Evolución Dirigida La invención proporciona un sistema de modificáción genética no estocástico denominado como "sistema optimizado de evolución dirigida" para generar polipéptidos , por ejemplo,; las xilanasas o los anti-cuerpos de la invención, con propiedades nuevas o alteradas. La evolución dirigida optimizada se refiere al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación, y selección, que permiten la evolución molecular dirigida de los ácidos nucleicos a través de la recombinación. La evolución dirigida optimizada permite la generación dé. una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada se enriquece de una manera significativa para las secuencias que tengan un número previamente determinado de eventos de cruce .

Un evento de cruce es un punto en una secuencia quimérica en donde se presenta un cambio en la secuencia desde una variante progenitora hasta otra variante progenitora. Este punto normalmente está en la unión en donde se ligan entre sí los oligonucleótidos de dos progenitoras para formar una sola secuencia. Este método permite hacer el cálculo de las concentraciones correctas de. secuencias de oligonucleótidos, de tal manera que se enriquezca la población quimérica final de secuencias para el número seleccionado de eventos de cruce. Esto proporciona más control sobre la selección de las variantes quiméricas que tengan un número previamente determinado de eventos de cruce .

En adición, este método proporciona un medio conveniente para explorar una cantidad tremenda de espacios variantes de proteína posibles en comparación con otros sistemas. Anteriormente, si se generaban, por ejemplo, 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, era extremadamente difícil probar este número tan alto de variantes quiméricas para determinar una actividad particular. Más aún, una porción significativa de la población de progenie tendría un número muy alto de eventos de cruce, lo cual daría como resultado proteínas que tendrían menos probabilidades de tener niveles incrementados de una actividad particular. Mediante el empleo de estos métodos, se puede enriquecer la población de quiméricas para las variantes que tengan un número particular de eventos de cruce. Por consiguiente, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas seleccionadas para un análisis adicional más probablemente tendrá, por ejemplo, solamente tres eventos de cruce. Debido a que se puede desfasar la población de progenie resultante para tener un número previamente determinado de eventos de cruce, se reducen los límites sobre la variedad funcional entre las moléculas quiméricas. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula cuál oligonucleótido de los polinucleótidos progenitores originales podría ser responsable de afectar un rasgo particular.

Un método para crear una secuencia de polinucleótido de progenie quimérica es crear oligonucleótidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia progenitora. 'Cada oligonucleótido incluye de preferencia una región de traslape única, de modo que la mezcla de los oligonucleótidos entre sí da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. También se puede encontrar información adicional, por ejemplo, en la solicitud de patente US 09/332,835; y en la patente US 6,361,974.

El número de oligonucleótidos generados por cada variante progenitora tiene una relación con el número total de cruces resultantes en la molécula quimérica que se crea finalmente. Por ejemplo, se podrían proporcionar tres variantes de secuencia de nucleótidos progenitoras para someterse a una reacción de ligamiento con el objeto de encontrar una variante quimérica que tenga, por ejemplo, una mayor actividad a alta temperatura. Como un ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias de oligonucleótidos que correspondan a cada porción de la variante progenitora. De conformidad con lo anterior, durante el proceso de re-ensamble de ligamiento, podría haber hasta 50 eventos de cruce dentro de cada una de las secuencias quiméricas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleóti-dos quiméricos generados contenga oligonucleótidos a partir de cada variante progenitora en orden alternado, es muy baja. Si cada fragmento de oligonucleótido está presente en la reacción de ligamiento en la misma cantidad molar, es probable que, en algunas posiciones, los oligonucleótidos del mismo polinucleótido progenitor se liguen unos enseguida de otros, y por lo tanto, no den como resultado un evento de cruce. Si se mantiene constante la concentración de cada oligonucleótido de cada progenitor durante cualquier paso de ligamiento de este ejemplo, hay 1/3 de oportunidad (asumiendo 3 progenitores) de que un oligonucleótido a partir de la misma variante progenitora se ligue dentro de la secuencia quimérica y no produzca ningún cruce.

De conformidad con lo anterior, se puede determinar una función de densidad de probabilidad (PDF) con el fin de predecir la población de eventos de cruce que es posible que ocurran durante cada paso en una reacción de ligamiento, dado un número establecido de variantes progenitoras , correspondiendo un número de oligonucleótidos a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada paso de la reacción de ligamiento. Las estadísticas y las matemáticas detrás de la determinación de la función de densidad de probabilidad se describen más adelante. Mediante la utilización de estos métodos, se puede calcular esta función de densidad de probabilidad, y por lo tanto, se puede enriquecer la población de la progenie quimérica para un número previamente determinado de eventos de cruce resultantes de una reacción de ligamiento particular. Más aún, se puede determinar previamente un número objetivo de eventos de cruce, y luego se programa el sistema para calcular las cantidades iniciales de cada oligonucleótido progenitor durante cada paso en la reacción de ligamiento, para dar como resultado una función de densidad de probabilidad que se centre en el número previamente determinado de eventos de cruce. Estos métodos se dirigen al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación, y selección, que permiten la evolución molecular dirigida de un ácido nucleico que codifica un polipéptido a través de la recombinación. Este sistema permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada se enriquece de una manera significativa para las secuencias que tengan un número previamente determinado de eventos de cruce. Un evento de cruce es un punto en una secuencia quimérica en donde se presenta un cambio en la secuencia desde una variante progenitora hasta otra variante progenitora. Este punto normalmente está en la unión en donde se ligan entre sí los oligonucleótidos de dos progenitoras para formar una sola secuencia. El método permite hacer el cálculo de las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos, de tal manera que se enriquezca la población quimérica final de secuencias para el número seleccionado de eventos de cruce. Esto proporciona más control sobre la selección de las variantes quiméricas que tengan un número previamente determinado de eventos de cruce .

En adición, estos métodos proporcionan un medio conveniente para explorar una cantidad tremenda de espacios variantes de proteína posibles en comparación con otros sistemas. Mediante el empleo de los métodos descritos en la presente, se puede enriquecer la población de quiméricas para las variantes que tengan un número particular de eventos de cruce . 1 Por consiguiente, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas seleccionadas para un análisis adicional más probablemente tendrá, por ejemplo, solamente tres eventos de cruce. Debido a que se puede desfasar la población de progenie resultante para tener un número previamente determinado de eventos de cruce, se reducen los límites sobre la variedad funcional entre las moléculas quiméricas. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula cuál oligonucleótido de los polinucleótidos progenitores originales podría ser responsable de afectar un rasgo particular.

En un aspecto, el método crea una secuencia de polinucleótido de progenie quimérica mediante la creación de oligonucleótidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia progenitora. Cada oligonucleótido incluye de preferencia una región de traslape única, de modo que la mezcla de los oligonucleótidos entre sí da como resultado una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. Ver también la solicitud de patente US 09/ 332, 835.

Determinación de Eventos de Cruce Los aspectos de la invención incluyen un sistema y software que reciben una función de densidad de probabilidad (PDF) de cruce deseada, el número de genes progenitores que se van a re-ensamblar, y el número de fragmentos en el re-ensamble como entradas. La salida de este programa es una "PDF de fragmentos" (función de densidad de probabilidad de fragmentos) que se puede utilizar para determinar una receta para producir genes re-ensamblados , y la función de densidad de probabilidad de cruce estimada de estos genes. El procesamiento descrito en la presente de preferencia se lleva a cabo en MATLAB® (The Mathworks, Natick, Massachusetts , Estados Unidos), un lenguaje de programación y ambiente de desarrollo para computación técnica .

Procesos Iterativos En la práctica de la invención, estos procesos se pueden repetir de una manera iterativa. Por ejemplo, un ácido nucleico (o, el ácido nucleico) responsable de un fenotipo de xilanasa alterado o nuevo, se identifica, se vuelve a aislar, se modifica nuevamente, y se vuelve a probar para determinar su actividad. Este proceso se puede repetir de una manera iterativa hasta que se diseñe un fenotipo deseado. Por ejemplo, se puede diseñar una senda anabólica o catabólica bioquímica entera en una célula, incluyendo, por ejemplo, la actividad de xilanasa.

De una manera similar, si se determina que un oligonu-cleótido particular no tiene efecto alguno sobre el rasgo deseado (por ejemplo, un nuevo fenotipo de xilanasa) , se puede remover como una variable mediante la síntesis de oligonucleótidos progenitores más grandes que incluyan la secuencia que se ,vaya a remover. Debido a que la incorporación de la secuencia dentro de una secuencia más grande previene cualesquiera eventos de cruce, ya no habrá variación alguna de esta secuencia en los polinucleótidos de progenie. Esta práctica iterativa para determinar cuáles oligonucleótidos están más relacionados con el rasgo deseado, y cuáles no están relacionados, permite hacer una exploración más eficiente de todas las variantes de proteína posibles que podrían proporcionar un rasgo o actividad particular.

Mezcla In Vivo La mezcla de moléculas in vivo se utiliza en los métodos de la invención que proporcionan variantes de polipépti-dos de la invención, por ejemplo anti-cuerpos , xilanasas, y similares. La mezcla in vivo se puede llevar a cabo utilizando la propiedad natural de las células para recombinar multímeros . Aunque la recombinación in vivo ha proporcionado la principal ruta natural hacia la diversidad molecular, la recombinación genética sigue siendo un proceso relativamente complejo , que involucra: 1) el reconocimiento de homologías; 2) disociación de cadena, invasión de cadena, y pasos metabólicos que conducen a la producción de quiasma recombinante,- y finalmente 3) la resolución de quiasma en moléculas recombinadas separadas. La formación del quiasma requiere del reconocimiento de secuencias homologas .

En otro aspecto, la invención incluye un método para producir un polinucleótido híbrido a partir de cuando menos un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido. La invención se puede utilizar para producir un polinucleótido híbrido mediante la introducción de cuando menos un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido, los cuales comparten cuando menos una región de homología de secuencia parcial (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 1.71, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257 y combinaciones de las mismas) en una célula hospedera adecuada. Las regiones de homología de secuencia parcial promueven procesos que dan como resultado una reorganización de la secuencia, produciendo un polinucleótido híbrido. El i término "polinucleótido híbrido", como se utiliza en la presente, es cualquier secuencia de nucleótidos que resulte del método de la presente invención, y que contenga una secuencia a partir de cuando menos dos secuencias de polinucleótidos originales. Estos polinucleótidos híbridos pueden resultar de eventos de recombinación intermolecular que promuevan la integración de la secuencia entre las moléculas de ADN. En adición, estos polinucleótidos híbridos pueden resultar de procesos de reclasificación reductiva intramolecular, los cuales utilizan secuencias repetidas para alterar una secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ADN. I La reclasificación in vivo se enfoca en los procesos "inter-moleculares" colectivamente referidos como "recombinación" en bacterias, y se ve en general como un fenómeno "dependiente de RecA" . La invención se puede apoyar en los procesos de recombinación de una célula hospedera para recombinar y reclasi-ficar las secuencias, o la capacidad de las células para mediar los procesos reductivos con el fin de reducir la complejidad de las secuencias casi-repetidas en la célula mediante supresión. Este proceso de "reclasificación reductiva" se presenta mediante un proceso " intra-molecular" independiente de RecA.

Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, se pueden generar polinucleótidos novedosos mediante el proceso de reclasificación reductiva. El método implica la generación de construcciones que contienen secuencias consecutivas (secuencias de codificación originales) , su inserción en un vector apropiado, y su introducción subsecuente en una célula hospedera apropiada. La reclasificación de las identidades moleculares individuáles se presenta mediante procesos de combinación entre las secuencias consecutivas de la construcción que posee regiones de homología, o entre las unidades casi-repetidas. El proceso de reclasificación recombina y/o reduce la complejidad y la extensión de las secuencias repetidas, y da como resultado la producción de especies moleculares novedosas. Se pueden aplicar diferentes tratamientos para mejorar el índice de reclasificación. Éstos podrían incluir el tratamiento con luz ultra-violeta, o con productos químicos dañinos del ADN, y/o el uso de líneas celulares hospederas que exhiban mejores niveles de "inestabilidad genética". Por consiguiente, el proceso de reclasificación puede involucrar recombinación homologa o la propiedad natural de las secuencias casi-repetidas para dirigir su propia evolución.

Las secuencias repetidas o "casi-repetidas" tienen un papel en la inestabilidad genética. En la presente invención, las "casi-repeticiones" son repeticiones que no están restringidas a su estructura unitaria original. Las unidades casi-repetidas pueden presentarse como una matriz de secuencias en una construcción; en unidades consecutivas de secuencias similares. Una vez ligadas, las uniones entre las secuencias consecutivas llegan a ser esencialmente invisibles, y la naturaleza casi-repetitiva de la construcción resultante es ahora continua al nivel molecular. El proceso de supresión que realiza la célula para reducir la complejidad de la construcción resultante, opera entre las secuencias casi-repetidas. Las unidades casi-repetidas proporcionan un repertorio prácticamente ilimitado de plantillas sobre las cuales pueden presentarse eventos de deslizamiento. Por consiguiente, las construcciones que contienen las casi-repeticiones efectivamente proporcionan suficiente elasticidad molecular para que los eventos de supresión (y potencialmente de inserción) puedan presentarse virtualmente en cualquier parte dentro de las unidades casi-repetitivas .

Cuando se ligan todas las secuencias casi-repetidas en la misma orientación, por ejemplo cabeza con cola o viceversa, la célula no puede distinguir las unidades individuales. En consecuencia, se puede presentar el proceso reductivo a través de todas las secuencias. En contraste, por ejemplo, cuando las unidades se presentan cabeza con cabeza, en lugar de cabeza con cola, la inversión delinea los puntos de extremo de la unidad adyacente, de modo que la formación de supresión favorecerá la pérdida de unidades separadas. Por consiguiente, es preferible, con el presente método, que las secuencias estén en la misma orientación. La orientación aleatoria de las secuencias casi-repetidas dará como resultado la pérdida de eficiencia de reclasificación, mientras que una orientación consistente de las secuencias ofrecerá la eficiencia más alta. Sin embargo, aunque el tener menos de las secuencias contiguas en la misma orientación reduce la eficiencia, todavía puede proporcionar suficiente elasticidad para una recuperación efectiva de las moléculas novedosas. Se pueden hacer construcciones con las secuencias casi-repetidas en la misma orientación para permitir una eficiencia más alta.

Las secuencias se pueden ensamblar en una orientación de cabeza con cola empleando una variedad de métodos, incluyendo los siguientes: a) Se pueden utilizar cebadores que incluyan una cabeza poli-A y una cola poli-T que, cuando se hagan de una sola cadena, proporcionen la orientación. Esto se lleva a cabo haciendo que las primeras pocas bases de los cebadores se hagan a partir del ARN, y de allí se remueve fácilmente el ARNsaH. b) Se pueden utilizar cebadores que incluyan sitios de disociación de restricción únicos. Se requerirían múltiples sitios, una batería de secuencias únicas, y pasos repetidos de síntesis y ligamiento. c) Las pocas bases internas del cebador se podrían tiolar, y se podría utilizar una exonucleasa para producir moléculas de colas apropiadas .

La recuperación de las secuencias reclasificadas se apoya en la identificación de vectores de clonación con un índice repetitivo (RI) reducido. Las secuencias de codificación reclasificadas se pueden recuperar entonces mediante amplificación. Los productos se vuelven a clonar y se expresan; La recuperación de los vectores de clonación con un índice repetitivo reducido puede ser afectada por: 1) El uso de vectores sólo establemente mantenidos cuando se reduce la complejidad de la construcción. 2) La recuperación física de vectores acortados mediante procedimientos físicos. En este caso, el vector de clonación se recuperaría empleando procedimientos de aislamiento de plásmidos convencionales, y el tamaño se fraccionaría sobre un gel de agarosa, o bien en columna con un corte de peso molecular bajo empleando procedimientos convencionales. 3) La recuperación de vectores que contengan genes interrumpidos que se puedan seleccionar cuando se reduzca el tamaño del inserto. 4) El uso de técnicas de selección directa con un vector de expresión y la selección apropiada.

Las secuencias de codificación (por ejemplo, genes) de los organismos relacionados pueden demostrar un alto grado de homología, y codifican productos de proteína muy diversos. Estos tipos de secuencias son particularmente útiles en la presente invención como casi-repeticiones . Sin embargo, aunque los ejemplos ilustrados más adelante demuestran la reclasificación de secuencias de codificación originales casi idénticas (casi-repeticiones) , este proceso no se limita a esas repeticiones casi idénticas .

El siguiente ejemplo demuestra un método de , la invención. Se describen secuencias de codificación de ácidos nucleicos (casi-repeticiones) derivadas a partir de tres (3) especies únicas. Cada secuencia codifica una proteína con un conjunto distinto de propiedades. Cada una de las secuencias difiere por un solo o unos cuantos pares de bases en una posición única de la secuencia. Las secuencias casi-repetidas se amplifican por separado o colectivamente, y se ligan en ensambles aleatorios, de tal manera que estén disponibles todas las permutaciones y combinaciones posibles en la población de moléculas ligadas. El número de unidades de casi-repeticiones se puede controlar mediante las condiciones de ensamble. El número promedio de las unidades casi-repetidas en una construcción se define como el índice repetitivo (RI) .

Una vez formadas, las construcciones pueden o no fraccionarse por tamaños sobre un gel de agarosa de acuerdo con los protocolos publicados, se insertan en un vector de clonación, y se transfectan en una célula hospedera apropiada. Luego las células se propagan y se efectúa la "reclasificación reductivá". El índice del proceso de reclasificación reductivá se puede estimular mediante la introducción de daño del ADN, si se desea. No es sustancial el hecho de que la reducción en el índice repetitivo sea mediada por formación de supresión entre las secuencias repetidas mediante un mecanismo " intra-molecular":, o sea mediada por eventos de tipo recombinación a través ; de mecanismos " inter-moleculares" . El resultado final es 1 la reclasificación de las moléculas en todas las combinaciones posibles.

De una manera opcional, el método comprende el paso adicional de rastrear los miembros de la biblioteca del grupo mezclado, para identificar los miembros de la biblioteca mezclados individuales que tengan la capacidad para enlazarse o para interactuar de otra manera, o para catalizar una reacción particular (por ejemplo, tal como el dominio catalítico de¡ una enzima) con una macromolécula previamente determinada, tal cpmo, por ejemplo, un receptor proteináceo, un oligosacárido, virión, u otro compuesto o estructura previamente determinada.

Los polipéptidos que se identifiquen a partir de estas bibliotecas se pueden utilizar para propósitos terapéuticos, de diagnóstico, de investigación, y propósitos relacionados . (por ejemplo, catalizadores, solutos para incrementar la osmolaridad de una solución acuosa, y similares) , y/o se pueden someter a uno o más ciclos adicionales de mezcla y/o selección.

En otro aspecto, se prevé que antes o durante la recombinación o la reclasificación, los polinucleótidos generados mediante el método de la invención se pueden someter a agentes o procesos que promuevan la introducción de mutaciones en los polinucleótidos originales. La introducción de estas mutaciones aumentaría la diversidad de los polinucleótidos híbridos resultantes y polipéptidos codificados a partir de los mismos. Los agentes o procesos que promueven la mutagénesis pueden incluir, pero no se limitan a: ( +)-CC-1065, o un análogo sintético, tal como (+) -CC-1065- (N3-Adenina (ver Sun y Hurley, (1992)); un aducto de ' -fluoro-4 -aminobifenilo N-acetilado o desacetilado capaz de inhibir la síntesis del ADN (ver, por ejemplo, van de Poli y colaboradores (1992)); o un aducto de 4-aminobifenilo N-acetilado o desacetilado capaz de inhibir la síntesis del ADN (ver también, van de Poli y colaboradores (1992) , páginas 751-758) ; cromo trivalente, una sal de cromo trivalente, un aducto de ADN de hidrocarburo aromático policícli-co (PAH) capaz de inhibir la réplica del ADN, tal como 7-bromometil-benz [a] antraceno ( "BMA" ) , tris (2 , 3-dibromopro-pil) fosfato ("Tris-BP"), 1, 2-dibromo-3-cloropropano ("DBCP"), 2-bromoacroleína (2BA) , benzo [a] pireno-7 , 8-dihidro-diol-9-10-epóxido ( "BPDE" ) , una sal de halógeno de platino (II), N-hidroxi-2-amino-3-metilimidazo [4, 5-f] -quinolina ("N-hidroxi-IQ") y N-hidroxi-2-amino-l-metil-6-fenilimidazo [4 , 5-f] -piridina ( MN-hidroxi-PhIP" ) . Los medios de ejemplo para hacer más lenta o detener la amplificación con reacción en cadena de la polimerasa consisten en luz ultra-violeta (+)-CC-1065 y (+) -CC-1065- (N3-Adenina) . Se abarcan en particular los aductos de ADN o polinucleótidos que comprendan a los aductos de ADN a partir de los polinucleótidos o grupo de polinucleótidos, que se puedan liberar o remover mediante un proceso que incluya el calentamiento de la solución que comprenda a los polinucleótidos antes de un procesamiento adicional.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir proteínas recombinantes que tengan actividad biológica, mediante el tratamiento de una muestra que comprende polinucleótidos de plantilla de doble cadena que codifican una proteína de tipo silvestre, bajo condiciones de acuerdo con la invención, que proporcionen la producción de polinucleótidos híbridos o reclasificados .

Producción de variantes de secuencias La invención también proporciona métodos adicionales para hacer variantes de secuencias de las secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, xilanasa) de la invención. La invención también proporciona métodos adicionales para aislar xilanasas utilizando los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención. En un aspecto, la invención proporciona variantes de una secuencia de codificación de xilanasa (por ejemplo, un gen, ADNc, o un mensaje) de la invención, las cuales se pueden alterar por cualquier medio, incluyendo, por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos , o métodos no estocásticos o de "evolución dirigida", como se describen anteriormente.

Las variantes aisladas se pueden presentar naturalmente. También se pueden crear variantes in vitro. Se pueden crear variantes empleando técnicas de diseño genético tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de supresión de Exonucleasa III, y técnicas de clonación convencionales. De una manera alternativa, estas variantes, fragmentos, análogos, o derivados se pueden crear empleando procedimientos de síntesis o modificación química. Otros métodos para hacer variantes también son familiares para los técnicos en este campo. Éstos incluyen procedimientos en donde se modifican las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas a partir de aislados naturales, para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen características que mejoran su valor en las aplicaciones industriales y de laboratorio. En estos procedimientos, se generan y caracterizan un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida a partir del aislado natural. Estas diferencias de nucleótidos pueden dar como resultado cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos a partir de los aislados naturales. : Por ejemplo, se pueden crear variantes empleando reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error. En la reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error, la reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo bajo condiciones en las que la fidelidad de copiado de la polimerasa de ADN es baja, de tal manera que se obtiene un alto índice de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de la reacción en cadena de la polimerasa. La reacción en cadena de la polimerasa susceptible a error se describe, por ejemplo, en Leung, D. W., y colaboradores, Technique, 1: 11-15, 1989) y Caldwell, R. C. y Joyce G. F., PCR Methods Applic, 2: 28-33, 1992. Brevemente, en estos procedimientos, los ácidos nucleicos que se vayan a mutar se mezclan con los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa, el regulador de reacción, MgCl2, MnCl2, polimerasa Taq, y una concentración apropiada de dNTPs ¡para lograr un alto índice de mutación puntual a lo largo de toda la longitud del producto de la reacción en cadena de la polimerasa. Por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo utilizando 20 fmoles de ácido nucleico que se vaya a mutar, 30 picomolés de cada cebador de reacción en cadena de la polimerasa, un regulador de reacción que comprenda KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH de 8.3) y gelatina al 0.01 por ciento, MgCl2 7 mM, MnCl2 0.5 mM, 5 unidades de polimerasa Taq, dGTP 0.2 mM, dATP 0.2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. La reacción en cadena de la polimerasa se puede llevar a cabo durante 30 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 45 °C durante 1 minuto, y 72 °C durante 1 minuto. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar como sea apropiado. Los ácidos nucleicos mutados se clonan en un vector apropiado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutados.

También se pueden crear variantes empleando mutagénesis dirigida al oligonucleótido para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés . La mutagénesis de oligonucleótidos se describe, por ejemplo, en Reidhaar-Olson (1988) Science 241: 53-57. Dicho de una manera breve, en estos procedimientos, se sintetiza una pluralidad de oligonucleótidos de doble cadena que tengan una o más mutaciones que se vayan a introducir en el ADN clonado, y se insertan en el ADN clonado que se vaya a mutar. Se recuperan los clones que contengan el ADN mutado, y se evalúan las actividades de los polipéptidos , que codifiquen.

Otro método para generar variantes es la reacción en cadena de la polimerasa de ensamble. La reacción en cadena de la polimerasa de ensamble implica el ensamble de un producto de reacción en cadena de la polimerasa a partir de una mezcla de fragmentos de ADN pequeños . Se presenta un gran número de reacciones en cadena de la polimerasa diferentes en paralelo en el mismo frasco, cebando los productos de una reacción a los productos de otra reacción. La reacción en cadena de la polimerasa de ensamble se describe, por ejemplo, en la patente US 5,965,408.

Todavía otro método para generar variantes es la mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual. En la mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual, se presenta una recombinación homóloga forzada entre las moléculas de ADN de una secuencia de ADN diferente pero altamente relacionada in vitro, como un resultado de la fragmentación aleatoria de la molécula de ADN, basándose en la homología de secuencias, seguido por fijación del cruce mediante extensión del cebador en una reacción en cadena de la polimerasa. ,' La mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa sexual; se describe, por ejemplo, en Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 91: 10747-10751. Brevemente, en estos procedimientos, una pluralidad de ácidos nucleicos que se vayan a recombinar, se digieren con ADNsa con el fin de generar fragmentos que tengan un tamaño promedio de 50 a 200 nucleótidos. Los fragmentos ¡ del tamaño promedio deseado se purifican y se vuelven a suspender en i una mezcla de reacción en cadena de la polimerasa. La reacción en cadena de la polimerasa se conduce bajo condiciones que faciliten la recombinación entre los fragmentos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa se puede llevar a cabo volviendo a suspender los fragmentos purificados en una concentración de 10 a 30 nanogramos/microlitro en una solución de 0.2 mM de cada dNTP, MgCl2 2.2 mM, KC1 50 m , Tris-HCl 10 mM, pH de 9.0, y Tritón X-100 al 0.1 por ciento. Se agregan 2.5 unidades de polimerasa Taq por 100:1 de mezcla de reacción, y la reacción en cadena de la polimerasa se realiza empleando el siguiente régimen: 94°C durante 60 segundos, 94 °C durante 30 segundos, 50-55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (30 a 45 veces), y 72°C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros se pueden variar según sea apropiado. En algunos aspectos, se pueden incluir oligonucleótidos en las reacciones en cadena de la polimerasa. En otros aspectos, se puede utilizar el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN en un primer conjunto de reacciones en cadena de la polimerasa, y se puede utilizar la polimerasa Taq en un conjunto subsecuente de reacciones en cadena de la polimerasa. Se aislan las secuencias recombinantes , y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifican.

También se pueden crear variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunos aspectos, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de interés mediante la propagación de la secuencia de interés en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, la cual lleva mutaciones en una o más de las sendas de reparación del ADN. Estas cepas "mutadoras" tienen un índice de mutación aleatoria más alto que aquél de una progenitora de tipo silvestre. La propagación del ADN en una de estas cepas eventualmente generará mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para utilizarse para la mutagénesis in vivo se describen en la publicación internacional WO 91/16427, publicada el 31 de octubre de 1991, intitulada "Methods for Phenotype Creation from Múltiple Gene Populations " .

También se pueden crear variantes utilizando mutagénesis de cásete. En la mutagénesis de cásete, una pequeña región de una molécula de ADN de doble cadena es reemplazada con un "cásete" de oligonucleótido sintético que difiera de la secuencia nativa. El oligonucleótido con frecuencia contiene la secuencia nativa completamente y/o parcialmente aleatorizada .

También se puede emplear mutagénesis de ensamble recursivo para generar variantes. La mutagénesis de ensamble recursivo es un algoritmo para el diseño de proteínas (mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes fenotípicamente relacionados cuyos miembros difieran en la secuencia de aminoácidos. Este método utiliza un mecanismo de retroalimentación para controlar las rondas sucesivas de mutagénesis de cásete de combinación. La mutagénesis de ensamble recursivo se describe en Arkin, A. P. y Youvan, D. C. , PNAS, U.S.A., 89: 7811-7815, 1992.

En algunos aspectos, se crean variantes empleando mutagénesis de ensamble exponencial. La mutagénesis de ensamble exponencial es un proceso para generar bibliotecas de combinación con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en donde pequeños grupos de residuos se aleatorizan en paralelo para identificar, en cada posición alterada, los aminoácidos que conduzcan a las proteínas funcionales. La mutagénesis de ensamble exponencial se describe en Delegrave, S. y Youvan, D.C., Biotechnology Research, 11: 1548-1552, 1993. La mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio se describe en Arnold, F.H., Current Opinión in Biotechnology, 4: 450-455, 1993.

En algunos aspectos, las variantes se crean empleando procedimientos de mezcla, en donde se fusionan entre sí porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos distintos, con el fin de crear secuencias de ácidos nucleicos quiméricas que codifiquen los polipéptidos quiméricos, como se describe en la patente US 5,965,408, presentada el 9 de julio de 1996, intitulada "Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis", y en la patente US 5,939,250, presentada el 22 de mayo de 1996, intitulada "Production of Enzymes Having Desired Activities by Mutagénesis" .

Las variantes de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B pueden ser variantes en las que uno p más de los residuos de aminoácidos de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B son sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (de preferencia un residuo de aminoácido conservado) , y este residuo de aminoácido sustituido puede o no ser codificado por el código genético .

Las sustituciones conservadoras son aquéllas que sustituyen a un aminoácido dado en un polipéptido, por otro aminoácido de características similares. Normalmente vistos como sustituciones conservadoras, son los siguientes reemplazos: reemplazos de un aminoácido alif tico, tales como Alanina, Valina, Leucina, e Isoleucina, con otro aminoácido alifático; reemplazo de una Serina con una Treonina o viceversa; reemplazo de un residuo ácido, tal como Ácido aspártico y Ácido glutámico, con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que lleve un grupo amida, tal como Asparagina y Glutamina, con otro residuo que lleve un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como Lisina y Arginina, con otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático, tal como Fenilalanina y Tirosina, con otro residuo aromático .

Otras variantes son aquéllas en las que uno o más de los residuos de aminoácidos de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, incluyen un grupo sustituyente .

Todavía otras variantes son aquéllas en las que el polipéptido está asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) .

Las variantes adicionales son aquéllas en las que se fusionan aminoácidos adicionales con el polipéptido, tal como una secuencia delantera, una secuencia secretora, una secuencia de proproteína, o una secuencia que facilite la purificación, enriquecimiento, o estabilización del polipéptido.

En algunos aspectos, los fragmentos, derivados, y análogos, retienen la misma función o actividad biológica que los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. En otros aspectos, el fragmento, derivado, o análogo, incluye una proproteína, de tal manera que el fragmento, derivado, o análogo, se puede activar mediante la disociación de la porción de proproteína para producir un polipéptido activo.

Optimización de codones para alcanzar altos niveles de expresión de proteína en las células hospederas La invención proporciona métodos para modificar ácidos nucleicos que codifican xilanasa, con el fin de modificar el uso de codones. En un aspecto, la invención proporciona métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una xilanasa, con el fin de incrementar o disminuir su expresión en una célula hospedera. La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican una xilanasa modificada, con el fin de aumentar su expresión en una célula hospedera, la xilanasa así modificada, y métodos para hacer las xilanasas modificadas. El método comprende identificar un codón "no preferido" o "menos preferido" en el ácido nucleico que codifica xilanasa, y reemplazar uno o más de estos codones no preferidos o menos preferidos con un "codón preferido" que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado, y cuando menos un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico ha sido reemplazado por un codón preferido que codifique el mismo aminoácido. Un codón preferido es un codón sobre-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula hospedera, y un codón no preferido o menos preferido está sub-representado en las secuencias de codificación de los genes de la célula hospedera.

Las células hospederas para expresar los ácidos nucleicos, casetes de expresión, y vectores de la invención incluyen bacterias, levadura, hongos, células de plantas, células de insectos, y células de mamífero. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para optimizar el uso de codones en todas estas células, ácidos nucleicos con los codones alterados y polipéptidos hechos por los ácidos nucleicos con los codones alterados. Las células hospederas de ejemplo incluyen bacterias gram-negativas , tales como Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens; bacterias gram-positivas, tales como Streptojnyces diversa, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis . Las células hospederas de ejemplo también incluyen organismos eucarióticos , por ejem lo, varias levaduras, tales como Saccharomyces sp., incluyendo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, y Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger, y células y líneas celulares de mamífero, y células y líneas celulares de insectos. Por consiguiente, la invención también incluye ácidos nucleicos y polipéptidos optimizados para expresarse en estos organismos y especies.

Por ejemplo, los codones de un ácido nucleico que codifica una xilanasa aislada a partir de una célula bacteriana, se modifican de tal manera que el ácido nucleico se expresa de una manera óptima en una célula bacteriana diferente de la bacteria a partir de la cual se derivó la xilanasa, una levadura, un hongo, una célula de planta, una célula de insecto, o una célula de mamífero. Los métodos para optimizar codones son bien conocidos en la materia; ver, por ejemplo, la patente US 5,795,737; Baca (2000) Int. J. Parasitol . 30: 113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif . 12: 185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253. Ver también Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253, que describe la optimización de codones en sistemas de ratón; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24: 18-24, que describe la optimización de codones en levadura; Feng (2000) Biochemistry 39: 15399-15409, que describe la optimización de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20: 252-264, que describe la optimización del uso de codones que afecta la secreción en E. coli.

Animales no humanos transgénicos La invención proporciona animales no humanos transgénicos que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (por ejemplo, una xilanasa) , un cásete de expresión, o un vector, o una célula transfectada o transformada de la invención. La invención también proporciona métodos para hacer y usar estos animales no humanos transgénicos.

Los animales no humanos transgénicos pueden ser, por ejemplo, cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas y ratones, que comprendan los ácidos nucleicos de la invención. Estos animales pueden utilizarse, por ejemplo, como modelos in vivo para estudiar la actividad de la xilanasa, o como modelos para rastrear agentes que cambien la actividad de la xilanasa in vivo.

Las secuencias de codificación para que los polipéptidos se expresen en los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar para ser constitutivas, o para estar bajo el control de factores reguladores de transcripción específicos del tejido, específicos del desarrollo, o inducibles. Los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar y generar empleando cualquier método conocido en la materia; ver, por ejemplo, las patentes US 6,211,428; 6,187,992; 6,156,952; 6,118,044; 6,111,166; 6,107,541; 5,959,171; 5,922,854; 5,892,070; 5,880,327; 5,891,698; 5,639,940; 5,573,933; 5,387,742; 5,087,571, que describen la fabricación y utilización de células y huevos transformados, y ratones, ratas, conejos, ovejas, cerdos, y vacas. Ver también, por ejemplo, Pollock (1999) J. Immunol . Methods 231: 147-157, que describé la producción de proteínas recombinantes en la leche de animales lecheros transgénicos; Baguisi (1999) Nat . Biotechnol. 17: 456-461, que demuestra la producción de cabras transgénicas . La patente US 6,211,428, describe la fabricación y utilización de mamíferos no humanos transgénicos que expresan en sus cerebros una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN. La patente US 5,387,742, describe la inyección de secuencias de ADN clonadas, recombinantes , o sintéticas en huevos de ratón fertilizados, la implantación de los huevos inyectados en hembras pseudo-preñadas , y el crecimiento a término de los ratones transgénicos que expresen proteínas relacionadas con la patología de la enfermedad de Alzheimer. La patente US 6,187,992, describe la fabricación y utilización de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una alteración del gen que codifica la proteína precursora de amiloide (APP) .

También se pueden utilizar "animales con eliminación genética" para practicar los métodos de la invención. Por ejemplo, en un aspecto, los animales transgénicos o modificados de la invención comprenden un "animal con eliminación genética", por ejemplo un "ratón con eliminación genética", diseñado para no expresar un gen endógeno, el cual es reemplazado con un gen que expresa una xilanasa de la invención, o una proteína de fusión que comprende una xilanasa de la invención.

Plantas v Semillas Transaénicas La invención proporciona plantas y semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (por ejemplo, una xilanasa) , un cásete o vector de expresión, o una célula transfectada o transformada de la invención. La invención también proporciona productos de plantas, por ejemplo aceites, semillas, hojas, extractos y similares, que comprenden un ácido nucleico y/o un polipéptido (por ejemplo, una xilanasa) de la invención. La planta transgénica puede ser una dicotiledónea (dicot) o una monocotiledónea (monocot) . La invención también proporciona métodos para hacer y usar estas plantas y semillas transgénicas . La planta o célula de planta transgénica que exprese un polipéptido de la presente invención, se puede construir de acuerdo con cualquier método conocido en la materia. Ver, por ejemplo, la patente US 6,309,872.

Los ácidos nucleicos y construcciones de expresión de la invención se pueden introducir en una célula de planta por cualquier medio. Por ejemplo, los ácidos nucleicos o construcciones de expresión se pueden introducir en el genoma de una planta hospedera deseada, o los ácidos nucleicos o construcciones de expresión pueden ser episomas. La introducción en el genoma de una planta deseada puede ser tal que la producción de xilanasa de la hospedera sea regulada por elementos de control de transcripción o traducción endógenos. La invención también proporciona "plantas con eliminación genética", en donde la inserción de la secuencia genética, por ejemplo, mediante recombinación homologa, tenga alterada la expresión del; gen endógeno. Los medios para generar plantas "con eliminación genética" son bien conocidos en la materia; ver, por ejemplo, Strepp (1998) Proc Nati. Acad. Sci . U.S. A. 95: 4368-4373; Miao (1995) Plant J. 7: 359-365. Ver la descripción sobre las plantas transgénicas más adelante.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar para conferir rasgos deseados a esencialmente cualquier planta, por ejemplo a plantas productoras de almidón, tales como papa, trigo, arroz, cebada, y similares. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar para manipular las sendas metabólicas de una planta con el objeto de optimizar o alterar la expresión de xilanasa de la hospedera. Pueden cambiar la actividad de xilanasa en una planta. De una manera alternativa, una xilanasa de la invención se puede utilizar en la producción de una planta transgénica para producir un compuesto no naturalmente producido por esa planta. Esto puede bajar los costos de producción o crear un producto novedoso.

En un aspecto, el primer paso en la producción de una planta transgénica implica hacer una construcción de expresión para expresarse en una célula de planta. Estas técnicas son bien conocidas en este campo. Pueden incluir la selección y clonación de un promotor, una secuencia de codificación para facilitar el enlace eficiente de ribosomas al AR m, y la selección de secuencias terminadoras de genes apropiadas. Un promotor constitutivo de ejemplo es el CaMV35S, del virus de mosaico de coliflor, el cual en general da como resultado un alto grado de expresión en plantas. Otros promotores son más específicos y responden a claves en el medio ambiente interno o externo de la planta. Un promotor inducible por luz de ejemplo es el promotor del gen cab, que codifica la proteína de enlace mayor de clorofila a/b.

En un aspecto, el ácido nucleico se modifica para lograr una mayor expresión en una célula de planta. Por ejemplo, es posible que una secuencia de la invención tenga un porcentaje más alto de pares de nucleótidos A-T, comparándose con lo que se ve en una planta, algunas de las cuales prefieren pares de nucleótidos G-C. Por consiguiente, los nucleótidos A-T en' la secuencia de codificación pueden ser sustituidos con nucleótidos G-C sin cambiar de una manera significativa la secuencia de aminoácidos para mejorar la producción del producto genético en las células de la planta.

Se puede agregar un gen marcador seleccionable a la construcción genética con el objeto de identificar células o tejidos de plantas que hayan integrado con éxito el transgén. Esto puede ser necesario debido a que el logro de la incorporación y expresión de los genes en células de plantas es un evento raro, que ocurre solamente en un pequeño porcentaje de los tejidos o células objetivos. Los genes marcadores seleccionables codifican proteínas que proporcionan resistencia a agentes que normalmente son tóxicos para las plantas, tales como antibióticos o herbicidas. Solamente las células de plantas que tengan integrado el gen marcador seleccionable sobrevivirán cuando se cultiven en un medio que contenga el antibiótico o herbicida apropiado. Como para otros genes insertados, los genes marcadores también requieren de secuencias promotoras y de terminación para una función apropiada.

En un aspecto, el hacer plantas o semillas transgénicas comprende incorporar secuencias de la invención y, opcionalmente , genes marcadores, en una construcción de expresión objetiva (por ejemplo, un plásmido) , junto con la colocación del promotor y las secuencias terminadoras . Esto puede implicar transferir el gen modificado a la planta a través de un método adecuado. Por ejemplo, se puede introducir una construcción directamente en el ADN genómico de la célula de la planta empleando técnicas tales como electroporacion y micro-inyección de protoplastos de células de plantas, o se pueden introducir las construcciones directamente en el tejido de la planta empleando métodos balísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN. Por ejemplo, ver, Christou (1997) Plant Mol. Biol . 35: 197-203; Pa lowski (1996) Mol. Biotechnol . 6: 17-30; Klein (1987) Nature 327: 70-73; Takumi (1997) Genes Genet . Syst . 72: 63-69, que describen el uso de bombardeo de partículas para introducir transgenes en trigo; y Adam (1997) supra, para el uso de bombardeo de partículas con el fin de introducir cromosomas artificiales de levadura (YACs) en células de plantas. Por ejemplo, Rinehart (1997) supra, utilizó bombardeo de partículas para generar plantas de algodón transgénicas . El aparato para acelerar las partículas se describe en la patente US 5,015,580; y el instrumento de aceleración de partículas BioRad (Biolistics) PDS-2000 comercialmente disponible; ver también John, patente US 5,608,148; y Ellis, patente US 5,681,730, que describen la transformación de gimnospermas mediada por partículas.

En un aspecto, se pueden inmovilizar protoplastos e inyectarse con un ácido nucleico, por ejemplo, una construcción de expresión. Aunque no es fácil la regeneración de plantas a partir de protoplastos con los cereales, es posible la regeneración de plantas en legumbres empleando embriogénesis somática a partir de callo derivado del protoplasto. Los tejidos organizados se pueden transformar con ADN desnudo utilizando la técnica de pistola genética, en donde se recubre el ADN con micro-proyectiles de tungsteno, se disparan a 1/100 del tamaño de las células, las cuales llevan el ADN profundo hacia adentro de las células y los organelos. Luego se induce el tejido transformado para regenerarse, usualmente mediante embriogénesis somática. Esta técnica ha tenido éxito en varias especies de cereal, incluyendo maíz y arroz.

Los ácidos nucleicos, por ejemplo las construcciones de expresión, también se pueden introducir en células de plantas utilizando virus recombinantes . Las células de plantas se pueden transformar utilizando vectores virales, tales como, por ejemplo, vectores derivados de virus de mosaico de tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol . 33: 989-999), ver Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants", Mol. Biotechnol. 5: 209-221.

De una manera alternativa, los ácidos nucleicos, por ejemplo una construcción de expresión, se pueden combinar con regiones de flanqueo de ADN-T adecuadas, y se pueden introducir en un vector hospedero de Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del anfitrión de Agrrojbacterium tumefaciens dirigirán la inserción de la construcción y del marcador adyacente en el ADN de la célula de la planta cuando la célula sea infectada por la bacteria. Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desarmado y uso de vectores binarios, se describen bien en la literatura científica. Ver, por ejemplo, Horsch (1984) Science 233: 496-498; Fraley (1983) Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80: 4803 (1983); Gene Transfer a Plants, Potrykus, editor (Springer-Verlag, Berlín 1995) . El ADN en una célula de A. tumefaciens está contenido en el cromosoma bacteriano así como en otra estructura conocida como un plásmido Ti (inductor de tumor) . El plásmido Ti contiene un estiramiento de ADN denominado ADN-T (de aproximadamente 20 kb de largo) que se transfiere a la célula de planta en el proceso de infección, y una serie de genes vir (de virulencia) que dirigen el proceso de infección. A. tumefaciens solamente puede infectar una planta mediante heridas: cuando se lastima una raíz o tallo de una planta, da ciertas señales químicas, en respuesta a las cuales, los genes vir de A. tumefaciens llegan a activarse y a dirigir una serie de eventos necesarios para la transferencia del ADN-T a partir del plásmido Ti hasta el cromosoma de la planta. Luego el ADN-T entra en la célula de la planta a través de la herida. Una especulación es que el ADN-T espera hasta que se está replicando o transcribiendo el ADN de la planta, y luego se inserta él mismo en el ADN expuesto de la planta. Con el objeto de utilizar A. turnefaciens como un vector transgénico, se tiene que remover la sección inductora de tumor del ADN-T, mientras que se retengan las regiones de borde del ADN-T y los genes vir. Entonces se inserta el transgén entre las regiones de borde del ADN-T, en donde se transfiere a la célula de la planta y llega a integrarse en los cromosomas de la planta.

La invención proporciona la transformación de plantas monocotiledóneas utilizando los ácidos de la invención, incluyendo cereales importantes, ver Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35: 205-218. Ver también, por ejemplo, Horsch, Science (1984) 233: 496; Fraley (1983) Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4803; Thykjaer (1997) supra,- Park (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1135-1148, que describe la integración del ADN-T en el ADN genómico.

Ver también D'Halluin, patente US - 5 , 712 , 135 , que describe un proceso para la integración estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de un cereal, u otra planta monocotiledónea .

En un aspecto, el tercer paso puede involucrar la selección y regeneración de plantas enteras capaces de transmitir el gen objetivo incorporado a la siguiente generación. Estas técnicas de regeneración se apoyan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido; que normalmente se apoya en un marcador de biocida y/o herbicida que se haya introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas . La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans y colaboradores, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, MacMillilan Publishing Company, N.Y., 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21-73, CRC Press, Boca Ratón, 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callo, explantes, y órganos de plantas, o partes de los mismos. Estas técnicas de regeneración se describen en general en Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys . 38: 467-486. Con el fin de obtener plantas enteras a partir de tejidos transgénicos , tales como embriones inmaduros, se pueden cultivar bajo condiciones medio-ambientales controladas en una serie de medios que contengan nutrientes y hormonas, un proceso conocido como cultivo de tejido. Una vez que se generan las plantas enteras y producen semillas, se inicia la evaluación de la progenie .

Después de que se incorpora establemente el cásete de expresión en las plantas transgénicas , se puede introducir en otras plantas mediante cruza sexual. Se puede emplear cualquiera de un número de técnicas de reproducción convencionales, dependiendo de las especies que se vayan a cruzar. Debido a que la expresión transgénica de los ácidos nucleicos de la invención conduce a cambios fenotípicos, las plantas que comprendan los ácidos nucleicos recombinantes de la invención se pueden cruzar sexualmente con una segunda planta para obtener un producto final. Por consiguiente, la semilla de la invención se puede derivar a partir de una cruza entre dos plantas transgénicas de la invención, o una cruza entre una planta de la invención y otra planta. Los efectos deseados (por ejemplo, la expresión de los polipéptidos de la invención para producir una planta en la que se altere el comportamiento del florecimiento) se pueden mejorar cuando ambas plantas progenitoras expresen los polipéptidos (por ejemplo, una xilanasa) de la invención. Los efectos deseados se pueden pasar a generaciones futuras de plantas por medios de propagación convencionales.

Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención se expresan o se insertan en cualquier planta o semilla. Las plantas transgénicas de la invención pueden ser dicotiledóneas o monocotiledóneas . Los ejemplos de las plantas transgénicas monocotiledóneas de la invención son pastos, tales como pasto para prados (pasto azul, Poa) , pastos de forraje, tales como festuca, lolium, pasto templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz (elote) . Los ejemplos de las plantas transgénicas dicotiledóneas de la invención son tabaco, legumbres tales como lupinas, papa, remolacha azucarera, chícharo, frijol y semilla de soya, y plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado de Arabidopsis thaliana. por consiguiente, las plantas y semillas transgénicas de la invención incluyen un amplio rango de plantas, incluyendo, pero no limitándose a, especies de los géneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea.

En las modalidades alternativas, los ácidos nucleicos de la invención se expresan en plantas que contienen células de fibra, incluyendo, por ejemplo, algodón, árbol de algodón de seda (Kapok, Ceiba pentandra) , sauce del desierto, arbusto de creosota, madera de invierno, balsa, ramio, cáñamo, fibra de cáñamo, rosella, yute, sisal abacá, y lino. En las modalidades alternativas, las plantas transgénicas de la invención pueden ser miembros del género Gossypium, incluyendo los miembros de cualquier especie de Gossypium, tales como G. arboreum; G. herbaceum, G. barbadense, y G. hirsutum.

La invención también proporciona plantas transgénicas para utilizarse para producir grandes cantidades de los polipéptidos (por ejemplo, una xilanasa o anti-cuerpo) de la invención. Por ejemplo, ver Palmgren (1997) Trends Genet. 13: 348; Chong (1997) Transgenic Res. 6: 289-296 (Producción de proteína de leche humana beta-caseína en plantas de papa transgénicas utilizando un promotor de sintasa de manopina bidireccional (masl',2') inducible por auxina, con métodos de transformación de disco de hoja mediada por Agrrojacterium tumefaciens.

Empleando los procedimientos conocidos, un técnico puede rastrear las plantas de la invención mediante la detección del incremento o reducción del ARNm o proteína del transgén en las plantas transgénicas . Los medios para la detección y cuantificación de ARNms o proteínas son bien conocidos en este campo .

Polipéptidos v péptidos En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que tienen identidad de secuencia (por ejemplo, una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, 51 por ciento, 52 por ciento, 53 por ciento, 54 por ciento, 55 por ciento, 56 por ciento, 57 por ciento, 58 por ciento, 59 por ciento, 60 por ciento, 61 por ciento, 62 por ciento, 63 por ciento, 64 por ciento, 65 por ciento, 66 por ciento, 67 por ciento, 68 por ciento, 69 por ciento, 70 por ciento, 71 por ciento, 72 por ciento, 73 por ciento, 74 por ciento, 75 por ciento, 76 por ciento, 77 por ciento, 78 por ciento, 79 por ciento, 80 por ciento, 81 por ciento, 82 por ciento, 83 por ciento, 84 por ciento, 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, o más, o completa (100 por ciento) con una secuencia de ejemplo de la invención, por ejemplo, proteínas que tienen una secuencia como se estipula en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: ,102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO: 162 , SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168 SEQ ID NO: 170 , SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO: 178 , SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184 SEQ ID NO: 186 , SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192 SEQ ID NO: 194 , SEQ ID NO: 196 SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 SEQ ID NO: 202 , SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208 SEQ ID NO: 210 , SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 216 SEQ ID NO: 218 , SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 226 , SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 234 , SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO: 242 , SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 250 , SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 254 , SEQ ID NO: 256 SEQ ID NO: 258 , SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 264 SEQ ID NO: 266 , SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272 SEQ ID NO: 274 , SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 280 SEQ ID NO: 282 , SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288 SEQ ID NO: 290 , SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 296 SEQ ID NO: 298 , SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 30.4 SEQ ID NO: 306 , SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312 SEQ ID NO: 314 , SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320 SEQ ID NO: 322 , SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 328 SEQ ID NO: 330 , SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 336 SEQ ID NO: 338 , SEQ ID NO: 340 SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344 SEQ ID NO: 346 , SEQ ID NO: 348 SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352 SEQ ID NO: 354 , SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO: '358, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378 o SEQ ID NO: 380. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de xilanasa, por ejemplo, puede hidrolizar un enlace glicosídico en un polisacárido, por ejemplo un xilano. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de xilanasa que comprende catalizar la hidrólisis de enlaces ß-1 , 4 -xilosídicos internos. En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende una actividad de endo- 1 , 4 -beta-xilanasa . En un aspecto, la actividad de xilanasa comprende hidrolizar un xilano para producir una xilosa de más pequeño peso molecular y un xilo-oligómero . En un aspecto, el xilano comprende t un arabinoxilano, tal como un arabinoxilano soluble.

Los polipéptidos de la invención incluyen xilanasas en una forma activa o inactiva. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención incluyen proproteínas antes de la "maduración", o el procesamiento de secuencias prepro, por ejemplo mediante una enzima de procesamiento de proproteína, tal como una convertasa de proproteína para generar una proteína madura "activa". Los polipéptidos de la invención incluyen xilanasas inactivas por otras razones, por ejemplo, antes de la "activación" por un evento de procesamiento posterior a la traducción, por ejemplo una acción de endo- o exo-peptidasa o proteinasa, un evento de fosforilación, una amidación, una glicosilación o una sulfatación, un evento de dimerización, y similares. Los polipéptidos de la invención incluyen todas las formas activas, incluyendo las sub-secuencias activas, por ejemplo, dominios catalíticos o sitios activos, de la xilanasa. ; Los métodos para identificar las secuencias de dominio "prepro" y las secuencias de señal, son bien conocidos en, la materia; ver, por ejemplo, Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2): 115-136. Por ejemplo, con el fin de identificar una secuencia prepro, la proteína se purifica a partir del espacio extracelular, y se determina la secuencia de proteína N-terminal y se compara con la forma no procesada.

La invención incluye polipéptidos con o sin !una secuencia de señal y/o una secuencia prepro. La invención incluye polipéptidos con secuencias de señal y/o secuencias prepro heterólogas. La secuencia prepro (incluyendo una secuencia de la invención utilizada como un dominio prepro heterólogo) se puede localizar sobre el extremo amino-terminal o carboxi-terminal de la proteína. La invención también incluye secuencias de señal aisladas o recombinantes , secuencias prepro, y dominios catalíticos (por ejemplo, "sitios activos") que comprenden1 las secuencias de la invención. 1 El porcentaje de identidad de secuencia puede ser de más que la longitud completa del polipéptido, o la identidad puede estar sobre una región de cuando menos aproximadamenté 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o más residuos. Los polipéptidos de la invención también pueden ser más cortos que la longitud completa de los polipéptidos de ejemplo. En los aspectos alternativos, la invención proporciona polipéptidos (péptidos, fragmentos) de tamaños en el intervalo entre aproximadamente 5 y la longitud completa de un polipéptido, por ejemplo una enzima, tal como una xilanasa; los tamaños de ejemplo son de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 8¾ , 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, o más residuos, por ejemplo los residuos contiguos de una xilanasa de ejemplo de la invención.

Los péptidos de la invención (por ejemplo, una sub-secuencia de un polipéptido de ejemplo de la invención) , pueden ser útiles como, por ejemplo, sondas marcadoras, antígenos, tolerágenos, motivos, sitios activos de xilanasa (por ejemplo, "dominios catalíticos"), secuencias de señales, y/o dominios prepro .

Los polipéptidos y péptidos de la invención se pueden aislar a partir de fuentes naturales, sean éstas sintéticas, o pueden ser polipéptidos recombinantemente generados. Los péptidos y proteínas se pueden expresar de una manera recombinante in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos de la invención se pueden hacer y aislar empleando cualquier método conocido en la materia. Los polipéptidos y péptidos de la invención también se pueden sintetizar, del todo o en parte, empleando métodos químicos bien conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K. , Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancastér, Pennsylvania, Estados Unidos. Por ejemplo, se puede efectuar síntesis de péptidos empleando diferentes técnicas en fase sólida (ver, por ejemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol . 289: 3-13), y se puede lograr la síntesis automatizada, por ejemplo, utilizando en Sintetizador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) , de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Los péptidos y polipéptidos de la invención también se pueden glicosilar. La glicosilación se puede agregar después de la traducción, ya sea químicamente o bien mediante mecanismos bio-sintéticos celulares, en donde éstos últimos incorporan el uso de motivos de glicosilación conocidos, los cuales pueden ser nativos para la secuencia, o se pueden agregar como un péptido, o se pueden agregar en la secuencia de codificación del ácido nucleico. La glicosilación puede ser O-enlazada o N-enlazada.

Los péptidos y polipéptidos de la invención, como se definen anteriormente, incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas" . Los términos "miméticas" y "peptidomiméticas" se refieren a un compuesto químico sintético que tenga sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos de la invención. El mimético puede estar enteramente compuesto de análogos no naturales sintéticos de aminoácidos, o bien es una molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturales y análogos parcialmente no naturales de aminoácidos. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácidos naturales, siempre que estas sustituciones tampoco alteren de una manera sustancial la estructura y/o actividad del mimético. Como con los polipéptidos de la invención que son variantes conservadoras, la experimentación de rutina determinará si un mimético está dentro del alcance de la invención, es decir, que no se altere sustancialmente su estructura y/o función. Por consiguiente, en un aspecto, una composición mimética de la invención está dentro del alcance de la invención si tiene una actividad de xilanasa.

Las composiciones miméticas de polipéptidos de la invención pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales. En un aspecto alternativo, las composiciones miméticas de la invención incluyen uno o todos los siguientes grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos diferentes de los enlaces de amida naturales ("enlace peptídico") ; b) residuos no naturales en lugar de los residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente; o c) residuos que inducen mimetismo estructural secundario, es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, por ejemplo, una vuelta beta, vuelta gamma, hoja beta, conformación de hélice alfa, y similares. Por ejemplo, un polipéptido de la invención se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos se unen por medios químicos diferentes de los enlaces peptídicos naturales. Los residuos peptidomiméticos individuales se pueden unir mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos, o medios de acoplamiento, por ejemplo, glutaraldehído, N-hidroxisuccinimida-ésteres, maleimidas bifuncionales, ?,?'-diciclohexilcarbodi-imida (DCC) , o ?,?' -di-isopropilcarbodi-imida (DIC) . Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa para los enlaces de amida tradicionales ("enlace peptídico") incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=0)-CH2- para -C(=0)-NH-) , aminometileno (CH2-NH) , etileno, olefina (CH=CH) , éter (CH2-0) , tioéter (CH2-S) , tetrazol (CN4-)( tiazol, retroamida, tioamida, o éster (ver, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Volumen 7, páginas 267-357, "Peptide Backbone Modif cations " , Marcell Dekker, N. Y. ) .

Un polipéptido de la invención también se puede caracterizar como un mimético al contener todos o algunos residuos no naturales en lugar de los residuos de aminoácidos que se presentan naturalmente. Los residuos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patente; unas cuantas composiciones no naturales de ejemplo útiles como miméticos de residuos de aminoácidos naturales y lineamientos se describen más adelante. Los miméticos de aminoácidos aromáticos se pueden \ generar mediante reemplazo, por ejemplo, por D- o L-naftilalanina; D- o L-fenilglicina; D- o L-2-tienilalanina; D-o L-l, -2, -3, o 4 -pirenilalanina; D- o L- (2-piridinil) -alanina; D- o L- (3 -piridinil) -alanina; D- o L- (2-pirazinil) -alanina; D-o L- (4-isopropil) -fenilglicina; D- ( trifluorometil) -fenilglicina; D- (trifluorometil) -fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D- o L-p-bifenilfenilalanina; D- o L-p-metoxi-bifenilfenilalanina; D-o L-2-indol (alquil) alaninas; y D- o L-alquilalaninas, en donde alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, isobutilo, isobutilo secundario, isopentilo, sustituidos o insustituidos, o un aminoácido no ácido. Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, y piridilo.

Se pueden generar miméticos de aminoácidos ácidos mediante sustitución, por ejemplo, por aminoácidos que no sean carboxilato, mientras que mantengan una carga negativa; ( fosfono) alanina; treonina sulfatada. Los grupos laterales de carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) también se pueden modificar selectivamente mediante su reacción con carbodi- imidas (R1 -N-C-N-R ' ) , tales como, por ejemplo, l-ciclohexil-3 (2-morfolinil- (4-etil) carbodi-imida o l-etil-3 (4-azonia-4 , 4-dimetilpentil) carbodi-imida . Aspartilo o glutamilo también se pueden convertir a residuos de asparaginilo y glutamihilo mediante su reacción con iones de amonio. Los miméticos de aminoácidos básicos se pueden generar mediante sustitución, por ejemplo, con (en adición a lisina y arginina) los aminoácidos ornitina, citrulina, o ácido (guanidino) -acético, o ácido (guanidino) alquil-acético, en donde alquilo se define anteriormente. El derivado de nitrilo (por ejemplo, que contenga la fracción CN en lugar de COOH) puede sustituir a asparagina o glutamina. Los residuos de asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar hasta los residuos correspondientes de aspartilo o glutamilo. Los miméticos de residuos de arginina se pueden generar mediante la reacción de arginilo con, por ejemplo, uno o más reactivos convencionales, incluyendo, por ejemplo, fenilglioxal, 2 , 3 -butanodiona, 1, 2-ciclo-hexanodiona, o ninhidrina, de preferencia bajo condiciones alcalinas. Los miméticos de residuos de tirosina se pueden generar mediante la reacción de tirosilo con, por ejemplo, compuestos de diazónio aromáticos o tetranitrometano . Se pueden utilizar N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de 0-acetil-tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los miméticos de residuos de cisteína se pueden generar mediante la reacción de residuos de cisteinilo con, por ejemplo, alfa-haloacetatos , tales como ácido 2-cloroacético o cloroacetamida y las aminas correspondientes ; para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo . Los miméticos de residuos de cisteína también se pueden generar mediante la reacción de residuos de cisteinilo con, por ejemplo, bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta- (5-imidazoil) -propiónico; fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas , disulfuro de 3-nitro-2-piridilo; disulfuro de metil-2-piridilo; p-cloromercuribenzoato ; 2-cloromercuri-4-nitrofenol; o cloro-7-nitrobenzo-oxa-l, 3-diazol . Los miméticos de lisina se pueden generar (y los residuos amino-terminales se pueden alterar) mediante la reacción de lisinilo con, por ejemplo, anhídridos de ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. También se pueden generar miméticos de lisina y otros residuos que contengan alfa-amino, mediante la reacción con imidoésteres , tales como picolinimidato de metilo, piridoxal-fosfato, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitro-bencensulfónico, O-metilisourea, 2 , 4 -pentanodiona, y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Los miméticos de metionina se pueden generar mediante la reacción con, por ejemplo, sulfóxido de metionina. Los miméticos de prolina incluyen, por ejemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidin-carboxílico, 3- o 4-hidroxi-prolina, deshidroprolina, 3- o 4-metilprolina, o 3 , 3 -dimetilprolina . Los mimético¿ de residuos de histidina se pueden generar mediante la reacción de histidilo con, por ejemplo, procarbonato de dietilo o bromuro de para-bromofenacilo . Otros miméticos incluyen, por ejemplo, aquéllos generados mediante la hidroxilación de prolina y lisina; la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos de serilo o treonilo; la metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina, e histidina; la acetilación de la amina N- terminal; la metilación de los residuos de amida de la cadena principal, o la sustitución con N-metil-aminoácidos ; o la amidación de los grupos carboxilo C-terminales .

Un residuo, por ejemplo, un aminoácido, de un polipéptido de la invención, también puede ser reemplazado por un aminoácido (o residuo peptidomimético) de la quiralidad opuesta. Por consiguiente, cualquier aminoácido que se presente naturalmente en la configuración L (que también puede ser referida como R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) puede ser reemplazado con el aminoácido del mismo tipo químico estructural o un peptidomimético, pero de la quiralidad opuesta, referido como el D-aminoácido, pero también puede ser referido como de la forma R o S.

La invención también proporciona métodos para modificar los polipéptidos de la invención, ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento posterior a la traducción (por ejemplo, fosforilación, acilación, etc.), o bien mediante técnicas de modificación química, y los polipéptidos modificados resultantes. Las modificaciones pueden presentarse en cualquier parte del polipéptido, incluyendo la estructura base del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos, y los términos amino o carboxilo. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o en diferentes grados, en varios sitios de un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación-ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de un fosfatidilinositol , ciclación reticulante, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, y adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a la proteína, tal como arginilación. Ver, por ejemplo, Creighton, T. E., Proteins-Structure and Molecular Properties, 2a. edición, . H. Freeman and Company, N.Y. (1993) ; Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B .. C. Johnson, editor, Academic Press, N.Y. , páginas 1-12 (1983).

También se pueden emplear métodos de síntesis química en fase sólida de péptidos con el fin de sintetizar el polipéptido o los fragmentos de la invención. Estos métodos se han conocido en la materia desde principios de la década de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc . , 85: 2149-2154, 1963) (ver también Stewart, J.M. y Young, J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. edición, Pierce Chemical Co . , Rockford, Illinois, Estados Unidos, páginas 11-12)) y recientemente se han empleado en estuches de diseño y síntesis de péptidos de laboratorio comercialmente disponibles (Cambridge Research Biochemicals) . Estos estuches de laboratorio comercialmente disponibles han empleado en general las enseñanzas de H.M. Geysen y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci., U.S.A., 81: 3998 (1984) y proporcionan la síntesis de péptidos sobre las puntas de una multitud de "varillas" o "picos", todos los cuales se conectan a una sola placa. Cuando se utiliza este sistema, se invierte una placa de varillas o picos, y se inserta en una segunda placa de pozos o depósitos correspondientes, que contienen soluciones para unir o anclar un aminoácido apropiado a las puntas de los picos o varillas. Mediante la repetición de este paso del proceso, es decir, invertir e insertar las puntas de las varillas y picos en las soluciones apropiadas, se construyen los aminoácidos hasta obtener los péptidos deseados. En adición, están disponibles un número de sistemas de síntesis de péptidos FMOC. Por ejemplo, se puede llevar a cabo el ensamble de un polipéptido o fragmento sobre un soporte sólido utilizando un sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems, Inc., Modelo 431A®. Este equipo proporciona un fácil acceso a los péptidos de la invención, ya sea mediante síntesis directa o bien mediante la síntesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar empleando otras técnicas conocidas .

La invención incluye las xilanasas de la invención con y sin señal. El polipéptido que comprende una secuencia de señal de la invención puede ser una xilanasa de la invención u otra xilanasa u otra enzima u otro polipéptido.

La invención incluye xilanasas inmovilizadas, anticuerpos anti-xilanasa, y fragmentos de los mismos. La invención proporciona métodos para inhibir la actividad de xilanasa, por ejemplo, utilizando mutantes negativos dominantes o anti-cuerpos anti-xilanasa de la invención. La invención incluye heterocomplejos , por ejemplo proteínas de fusión, heterodímeros , etc., que comprenden las xilanasas de la invención.

Los polipéptidos de la invención pueden tener una actividad de xilanasa bajo diferentes condiciones, por ejemplo, extremos en pH y/o temperatura, agentes oxidantes, y similares. La invención proporciona métodos que conducen a preparaciones alternativas de xilanasa con diferentes eficiencias catalíticas y estabilidades, por ejemplo, hacia la temperatura, los agentes oxidantes, y las condiciones de lavado cambiantes. En un aspecto, se pueden producir variantes de xilanasa empleando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria. En un aspecto, se puede emplear evolución dirigida para producir una gran variedad de variantes de xilanasa con especificidades y estabilidad alternativas.

Las proteínas de la invención también son útiles como reactivos de investigación para identificar moduladores de xilanasa, por ejemplo activadores o inhibidores de la actividad de xilanasa. Dicho de una manera breve, se agregan muestras de prueba (compuestos, caldos, extractos, y similares) a los ensayos de xilanasa, para determinar su capacidad para inhibir la disociación del sustrato. Los inhibidores identificados de esta manera se pueden utilizar en la industria y la investigación para reducir o prevenir la proteólisis indeseada. Como con las xilanasas, los inhibidores se pueden combinar para aumentar el espectro de actividad.

Las enzimas de la invención también son útiles como reactivos de investigación, con el fin de digerir las proteínas, o en la secuenciación de proteínas. Por ejemplo, las xilanasas se pueden utilizar para romper los polipéptidos en fragmentos más pequeños para la secuenciación, utilizando, por ejemplo, un secuenciador automatizado.

La invención también proporciona métodos para descubrir nuevas xilanasas utilizando los ácidos nucleicos, polipéptidos, y anti-cuerpos de la invención. En un aspecto, se rastrean las bibliotecas de fagémidos para el descubrimiento basado en la expresión de las xilanasas. En otros aspecto, se rastrean las bibliotecas de fagos lambda para el descubrimiento basado eh la expresión de las xilanasas. El rastreo de las bibliotecas de fagos o fagémidos puede permitir la detección de clones tóxicos; un mejor acceso al sustrato; una necesidad reducida de diseño de un anfitrión; derivación del potencial para cualquier tendencia resultante de la excisión de masa de la biblioteca; y un crecimiento más rápido en las bajas densidades del clon. El rastreo de bibliotecas de fagos o fagémidos puede ser en fase líquida o en fase sólida. En un aspecto, la invención proporciona el rastreo en fase líquida. Esto da una mayor flexibilidad en las condiciones de ensayo; una flexibilidad adicional del sustrato; una mayor sensibilidad para los clones débiles; y facilidad de automatización sobre el rastreo en fase sólida.

La invención proporciona métodos de rastreo utilizando las proteínas y ácidos nucleicos de la invención y automatización robótica, para hacer posible la ejecución de muchos miles de reacciones bio-catalíticas y ensayos de rastreo en un corto periodo de tiempo, por ejemplo por día, así como para asegurar un alto nivel de precisión y reproducibilidad (ver la descripción de las matrices más adelante) . Como un resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en materia de semanas. Para obtener más enseñanzas sobre la modificación de moléculas, incluyendo moléculas pequeñas, ver la publicación internacional PCT/US94/09174.

Otro aspecto de la invención es un polipéptido aislado o purificado que comprende la secuencia de una de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprendan cuando menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas . Como se describió anteriormente, estos polipéptidos se pueden obtener mediante la inserción de un ácido nucleico que codifique al polipéptido en un vector, de tal manera que la secuencia de codificación se enlace operativamente a una secuencia capaz de impulsar la expresión del polipéptido codificado en una célula hospedera adecuada. Por ejemplo, el vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de enlace de ribosoma para el inicio de traducción, y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Otro aspecto de la invención es de polipéptidos o fragmentos de los mismos, que tienen cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, cuando menos aproximadamente el 55 por ciento, cuando menos aproximadamente el 60 por ciento, cuando menos aproximadamente el 65 por ciento, cuando menos aproximadamente el 70 por ciento, cuando menos aproximadamente el 75 por ciento, cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, o más de aproximadamente el 95 por ciento de homología con uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o un fragmento que comprenda cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas. La homología se puede determinar utilizando cualquiera de los programas descritos anteriormente, que alinee los polipéptidos o fragmentos que se estén comparando, y determine la extensión de identidad de aminoácidos o similitud entre ellos. Se apreciará que la "homología" de aminoácidos incluye sustituciones de aminoácidos conservadoras, tales como las descritas anteriormente .

Los polipéptidos o fragmentos que tienen homología con uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o un fragmento que comprenda cuando menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, se pueden obtener mediante el aislamiento de los ácidos nucleicos que los codifican, empleando las técnicas descritas anteriormente.

De una manera alternativa, los polipéptidos homólogos o los fragmentos se pueden obtener a través de procedimientos de enriquecimiento bioquímico o purificación. La secuencia de polipéptidos o fragmentos potencialmente homólogos se puede determinar mediante digestión con hidrolasa de xilano, electroforesis en gel, y/o microsecuenciación. La secuencia del polipéptido o fragmento homólogo prospectivo se puede comparar con uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o un fragmento que comprenda cuando menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas utilizando cualquiera de los programas descritos anteriormente .

Otro aspecto de la invención es un ensayo para identificar fragmentos o variantes de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, que retengan la función enzimática de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas. Por ejemplo, los fragmentos o variantes de estos polipéptidos, se pueden utilizar para catalizar reacciones bioquímicas, las cuales indican que el fragmento o la variante retiene la actividad enzimática de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B.

El ensayo para determinar si los fragmentos de las variantes retienen la actividad enzimática de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, incluye los pasos de: poner en contacto el fragmento o variante de polipéptido con una molécula de sustrato bajo condiciones que permitan que funcione el fragmento o variante de polipéptido, y detectar ya sea una reducción en el nivel de sustrato, o bien un aumento en el nivel del producto de reacción específico de la reacción entre el polipéptido y el sustrato.

Los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas o los fragmentos que comprenden cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, se pueden utilizar en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, los polipéptidos o fragmentos de los mismos se pueden utilizar para catalizar las reacciones bioquímicas. De conformidad con un aspecto de la invención, se proporciona un proceso para utilizar los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas o polinucleótidos que codifiquen estos polipéptidos, para hidrolizar enlaces glicosídicos . En estos procedimientos, se pone en contacto una sustancia que contenga un enlace glicosídico (por ejemplo, un almidón), con uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, o secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, bajo condiciones que faciliten la hidrólisis del enlace glicosídico.

La presente invención explota las propiedades catalíticas únicas de las enzimas. Aunque el uso de bio-catalizadores (es decir, enzimas purificadas o crudas, células no vivas o vivas) en las transformaciones químicas normalmente requiere de la identificación de un bio-catalizador particular que reaccione con un compuesto de partida específico, la presente invención utiliza bio-catalizadores seleccionados y condiciones de reacción que son específicos para los grupos funcionales que están presentes en muchos compuestos de partida, tales como moléculas pequeñas. Cada bio-catalizador es específico para un grupo funcional, o para varios grupos funcionales relacionados, y puede reaccionar con muchos compuestos de partida que contengan este grupo funcional.

Las reacciones bio-catalíticas producen una población de derivados a partir de un solo compuesto de partida. Estos derivados se pueden someter a otra ronda de reacciones bio-catalíticas para producir una segunda población de compuestos derivados. Se pueden producir miles de variaciones de la molécula pequeña o compuesto original con cada iteración de la derivación bio-catalítica . ¡ Las enzimas reaccionan en sitios específicos de un compuesto de partida sin afectar al resto de la molécula, un proceso que es muy difícil de lograr utilizando métodos químicos tradicionales. Este alto grado de especificidad bio-catalítica proporciona el medio para identificar un solo compuesto activo dentro de la biblioteca. La biblioteca se caracteriza por la serie de reacciones bio-catalíticas utilizadas para producirla, una denominada "historia bio-sintética" . El rastreo de la biblioteca para determinar las actividades biológicas, y el rastreo de la historia bio-sintética, identifican la secuencia de reacción específica que produce el compuesto activo. La secuencia de reacción se repite, y se determina la estructura, del compuesto sintetizado. Este modo de identificación, a diferencia de otros planteamientos de síntesis y rastreo, no requiere de tecnologías de inmovilización, y los compuestos se pueden sintetizar y probar libres en solución utilizando virtualmente cualquier tipo de ensayo de rastreo. Es importante observar que el alto grado de especificidad de las reacciones enzimáticas sobre los grupos funcionales permite el "rastreo" de las reacciones enzimáticas específicas que forman la biblioteca bio-catalíticamente producida.

Muchos de los pasos de procedimiento se llevan a cabo utilizando automatización robótica que hace posible la ejecución de muchos miles de reacciones bio-catalíticas y ensayos de rastreo por día, así como se asegura un alto nivel de precisión y reproducibilidad. Como un resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en materia de semanas, los cuales tomarían años para producirse empleando los métodos químicos actuales.

En un aspecto particular, la invención proporciona un método para modificar moléculas pequeñas, el cual comprende poner en contacto un polipéptido codificado por un polinucleótido descrito en la presente, o fragmentos enzimáticamente activos del mismo, con una molécula pequeña, para producir una molécula pequeña modificada. Se prueba una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas para determinar si está presente una molécula pequeña modificada dentro de la biblioteca, que exhiba una actividad deseada. Se identifica una reacción bio-catalítica específica que produzca la molécula pequeña modificada de la actividad deseada, mediante la eliminación sistemática de las reacciones bio-catalíticas empleadas para producir una porción de la biblioteca, y luego se prueban las moléculas pequeñas producidas en la porción de la biblioteca, para determinar la presencia o ausencia de la molécula pequeña modificada con la actividad deseada. Opcionalmente, se repiten las reacciones bio-catalíticas específicas que produzcan la molécula pequeña modificada de la actividad deseada. Las reacciones bio-catalíticas se conducen con un grupo de bio-catalizadores que reaccionan con distintas fracciones estructurales encontradas dentro de la estructura de una molécula pequeña; cada bio-catalizador es específico para una fracción estructural o un grupo de fracciones estructurales relacionadas; y cada bio-catalizador reacciona con muchas moléculas pequeñas diferentes que contengan la fracción estructural distinta.

Secuencias de señales de xilanasa, dominios prepro y catalíticos La invención proporciona secuencias de señales de xilanasa (por ejemplo, péptidos de señales (SPs) ) , dominios prepro, y dominios catalíticos (CDs) . Los péptidos de señales, los dominios prepro, y/o los dominios catalíticos de la invención se pueden aislar, o los péptidos recombinantes pueden ser parte de una proteína de fusión[ por ejemplo, como un dominio heterólogo en una proteína quimérica. La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican estos dominios catalíticos (CDs) , dominios prepro, y secuencias de señales (SPs, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia que comprende/que consiste en los residuos amino-terminales de un polipéptido de la invención) . En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de señal que comprende un péptido que comprende/que consiste en una secuencia como se estipula en los residuos 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, l a 21, 1 a 22, 1 a 23, l a 24, 1 a 25, l a 26, 1 a 27, 1 a 28, l a 29, 1 a 30, 1 a 31, l a 32, 1 a 33, l a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, l a 38, 1 a 39, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43 , 1 a 44 de un polipéptido de la invención.

En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de señal que comprende un péptido que comprende/que consiste en una secuencia como es estipula en la Tabla 4 que se encuentra más adelante. Por ejemplo, al leer la Tabla 4, la invención proporciona una secuencia de señal que comprende/que consiste en los residuos 1 a 23 de la SEQ ID NO: 102 (codificada por la SEQ ID NO: 101) , una secuencia de señal que comprende/que consiste en los residuos 1 a 41 de la SEQ ID NO: 104 (codificada por la SEQ ID NO: 103) , etc.

Tabla 4: Secuencias de señales de ejemplo de la invención.

Secuencia de señal SEQ ID NO: (posiciones de aminoácidos) 101,102 1-23 103,104 1-41 105,106 1-22 109,110 1-26 11,12 1-28 113,114 1-28 119,120 1-33 121,122 1-20 123,124 1-20 131,132 1-26 135,136 1-25 139,140 1-24 141,142 1-25 143,144 1-32 147, 148 1-28 149, 150 1-18 15, 16 1-20 151, 152 1-21 153 , 154 1-16 155, 156 1-21 157, 158 1-29 159, 160 1-23 161, 162 1-32 163, 164 1-26 165, 166 1-23 167, 168 1-36 169, 170 1-24 17, 18 1-31 171, 172 1-29 173, 174 1-22 175, 176 1-27 177, 178 1-26 179, 180 1-19 181, 182 1-25 183, 184 1-32 185, 186 1-27 187, 188 1-28 19, 20 1-29 191, 192 1-27 193, 194 1-21 195, 196 1-23 197, 198 1-28 199, 200 1-30 203, 204 1-30 205, 206 1-29 207, 208 1-27 209, 210 1-25 21, 22 1-28 211, 212 1-29 215, 216 1-31 217,218 1-29 219, 220 1-23 221, 222 1-24 223, 224 1-28 225, 226 1-25 227, 228 1-39 229, 230 1-28 23, 24 1-29 231, 232 1-41 233, 234 1-26 235, 236 1-28 237, 238 1-32 239, 240 1-30 241, 242 1-28 243, 244 1-33 245, 246 1-32 249, 250 1-33 253, 254 1-24 255,256 1-51 259, 260 1-24 261, 262 1-26 263 , 264 1-29 267,268 1-30 27,28 1-27 271, 272 1-22 273, 274 1-74 277,278 1-19 279,280 1-22 283,284 1-28 287,288 1-23 289,290 1-22 295, 296 1-26 299,300 1-24 301, 302 1-28 303, 304 1-74 305, 306 1-32 309, 310 1-20 311, 312 1-33 313, 314 1-22 315, 316 1-28 319, 320 1-27 325, 326 1-27 327, 328 1-29 329, 330 1-35 33, 34 1-23 331,332 1-28 333, 334 1-30 335,336 1-50 339, 340 1-23 341, 342 1-45 347, 348 1-20 349, 350 1-20 351, 352 1-73 353,354 1-18 355 , 356 1-21 357,358 1-25 359,360 1-31 361, 362 1-26 365,366 1-65 367, 368 1-23 369,370 1-27 39,40 1-24 41,42 1-37 45,46 1-25 47,48 1-26 5,6 1-47 51, 52 1-30 53, 54 1-37 55, 56 1-24 57, 58 1-22 59,60 1-21 63, 64 1-20 65, 66 1-22 67, 68 1-28 69,70 1-25 7,8 1-57 73, 74 1-21 75, 76 1-22 77, 78 1-27 79, 80 1-36 83, 84 1-30 87,88 1-29 89, 90 1-40 9, 10 1-36 95, 96 1-24 99, 100 1-33 Las secuencias de señales de xilanasa (SPs) y/o las secuencias prepro de la invención, pueden ser péptidos aislados, o secuencias unidas a otra xilanasa o a un polipéptido que no sea xilanasa, por ejemplo, como una proteína de fusión (quimérica) . En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos 'que comprenden secuencias de señales de xilanasa de la invención. En un aspecto, los polipéptidos que comprenden secuencias de señales de xilanasa SPs y/o prepro de la invención, comprenden secuencias heterólogas a una xilanasa de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende un péptido de señal y/o prepro de la invención, y secuencias de otra xilanasa o de una proteína que no sea xilanasa) . En un aspecto, la invención proporciona xilanasas de la invención con péptidos de señales heterólogos y/o secuencias prepro, por ejemplo, secuencias con una secuencia de señal de levadura. Una xilanasa de la invención puede comprender un péptido de señal heterólogo y/o prepro en un vector, por ejemplo, un vector de la serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) .

En un aspecto, los péptidos de señales y/o las secuencias prepro de la invención, se identifican siguiendo la identificación de los polipéptidos novedosos de xilanasa. Las sendas mediante las cuales se seleccionan las proteínas y' se transportan hasta su localización celular apropiada, con frecuencia son referidas como sendas de dirección de proteína. Uno de los elementos más importantes en todos estos sistemas de dirección, es una secuencia de aminoácidos corta en el término amino de un polipéptido recién sintetizado denominado como la secuencia de señal. Esta secuencia de señal dirige una proteína hasta su localización apropiada en la célula, y se remueve durante el transporte, o cuando la proteína llega a su destino final. La mayoría de las proteínas lisosomales, de membrana, o secretadas, tienen una secuencia de señal amino-terminal que las marca para translocalizarse en el lumen del retículo endoplásmico . Se han determinado más de 100 secuencias de señales para las proteínas de este grupo. Las secuencias de señales pueden variar en su longitud desde 13 hasta 36 residuos de aminoácidos. Los técnicos en este campo conocen varios métodos de reconocimiento de secuencias de señales. Por ejemplo, en un aspecto, se identifican los péptidos de señales de xilanasa novedosos mediante un método referido como SignalP. SignalP utiliza una red neural combinada que reconoce tanto los péptidos de señales como sus sitios de disociación. (Nielsen y colaboradores, "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites". Protein Engineering, Volumen 10, Número 1, páginas 1-6 (1997).

Se debe entender que, en algunos aspectos, las xilanasas de la invención pueden no tener péptidos de señales y/o secuencias prepro, o "dominios". En un aspecto, la invención proporciona las xilanasas de la invención que carecen de todo o parte de un péptido de señal y/o dominio prepro. En un aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señal (SP) y/o prepro, a partir de una xilanasa operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico de una xilanasa diferente, u opcionalmente , se puede desear una secuencia de señal (SPs) y/o un dominio prepro a partir de una proteína que no sea xilanasa.

La invención también proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden secuencias de señales (SPs) , dominios prepro, y/o dominios catalíticos (CDs) de la invención y secuencias heterólogas . Las secuencias heterólogas son secuencias no naturalmente asociadas (por ejemplo, a una xilanasa) con un péptido de señal, dominio prepro, y/o dominio catalítico. La secuencia con la que no está naturalmente asociado el péptido de señal, el dominio prepro, y/o el dominio catalítico, puede estar sobre el extremo amino-terminal , el extremo carboxi- terminal , y/o sobre ambos extremos del péptido de señal, el dominio prepro, y/o el dominio catalítico. En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende (o consiste en) un polipéptido que comprende una secuencia de señal (SP) , un dominio prepro, y/o un dominio catalítico (CD) de la invención, con la condición de que no esté asociado con cualquier secuencia con la que esté naturalmente asociado (por ejemplo, una secuencia de xilanasa) . De una manera similar, en un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipéptidos . Por consiguiente, en un aspecto, el ácido nucleico aislado o recombinante de la invención comprende la secuencia de codificación para una secuencia de señal (SP) , un dominio prepro, y/o un dominio catalítico (CD) de la invención, y una secuencia heteróloga (es decir, una secuencia no naturalmente asociada con una secuencia de señal (SP) , un dominio prepro, y/o un dominio catalítico (CD) de la invención) . La secuencia heteróloga puede estar sobre el extremo terminal 3', el extremo terminal 5', y/o sobre ambos extremos del péptido de señal, el dominio prepro, y/o la secuencia de codificación del dominio catalítico.

Bibliotecas híbridas (quiméricas) de xilanasas y péptidos En un aspecto, la invención proporciona xilanasas híbridas y proteínas de fusión, incluyendo bibliotecas de péptidos, las cuales comprenden secuencias de la invención! Las bibliotecas de péptidos de la invención se pueden utilizar para aislar moduladores peptídicos (por ejemplo, activadores o inhibidores) de objetivos, tales como sustratos de xilanasa, receptores, enzimas. Las bibliotecas de péptidos de la invención se pueden utilizar para identificar los componentes de enlace formales de los objetivos, tales como ligandos, por ejemplo, citocinas, hormonas, y similares. En un aspecto, la invención proporciona proteínas quiméricas que comprenden una secuencia de señal (SP) , un dominio prepro, y/o un dominio catalítico (CD) de la invención, o una combinación de los mismos, y una secuencia heteróloga (ver anteriormente) .

En un aspecto, las proteínas de fusión de la invención (por ejemplo, la fracción peptídica) se estabilizan conformacionalmente (en relación con los péptidos lineales) para permitir tener una más alta afinidad de enlace para los objetivos. La invención proporciona fusiones de xilanasas de la invención y otros péptidos, incluyendo péptidos conocidos y aleatorios . Se pueden fusionar de tal manera que no se perturbe significativamente la estructura de las xilanasas, y se estabilice conformacionalmente el péptido de una manera metabólica o estructural. Esto permite la creación de una biblioteca de péptidos que se monitorea fácilmente, tanto por su presencia dentro de las células como por su cantidad.

Las variantes de secuencias de aminoácidos dé la invención se pueden caracterizar por una naturaleza previamente determinada de la variación, una característica que las establece aparte de una forma que se presente naturalmente, por ejemplo una variación alélica o inter-especies de una secuencia de xilanasa. En un aspecto, las variantes de la invención exhiben la misma actividad biológica cualitativa que el análogo que se presenta naturalmente. De una manera alternativa, las variantes se pueden seleccionar por tener características modificadas. En un aspecto, aunque se determine previamente el sitio o la región para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos, no se necesita determinar previamente la mutación por sí misma. Por ejemplo, con el objeto de optimizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se puede conducir mutagénesis aleatoria en el codón o región objetiva, y se pueden rastrear las variantes de xilanasa expresadas para obtener la combinación óptima de la actividad deseada. Se conocen bien las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios previamente determinados del ADN que tengan una secuencia conocida, como; se describen en la presente, por ejemplo la mutagénesis de cebador M13 y la mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa. El rastreo de los mutantes se puede hacer utilizando, por ejemplo, ensayos de hidrólisis de xilano. En los aspectos alternativos, las sustituciones de aminoácidos pueden ser residuos individuales; las inserciones pueden ser del orden de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, aunque se pueden hacer inserciones considerablemente más grandes. Las supresiones pueden ser desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70 residuos o más. Con el fin de obtener un derivado final con las propiedades óptimas, se pueden emplear sustituciones, supresiones, inserciones, o cualquier combinación de las mismas. En general, estos cambios se hacen sobre unos cuantos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, , se pueden tolerar cambios mayores en ciertas circunstancias.

La invención proporciona xilanasas en las que se ha modificado la estructura base del polipéptido, la estructura secundaria o terciaria, por ejemplo, una estructura de hélice-alfa u hoja-beta. En un aspecto, se ha modificado la carga o la hidrofobicidad . En un aspecto, se ha modificado el volumen de una cadena lateral. Se hacen cambios sustanciales en la función o en la identidad inmunológica mediante la selección de sustituciones que sean menos conservadoras. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones que afecten de una manera mas significativa a: la estructura base del polipéptido en el área de la alteración, por ejemplo, una estructura de hélice-alfa o de hoja-beta; una carga o un sitio hidrófobo de la molécula, que puede ser un sitio activo; o una cadena lateral. La invención proporciona sustituciones en el polipéptido de la invención en donde (a) un residuo hidrófilo, por ejemplo serilo o treonilo, sustituye a (o es sustituido por) un residuo hidrófobo, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo, o alanilo; (b) una cisteína o prolina sustituye a (o es sustituida por) cualquier otro residuo,- (c) un residuo que tenga una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histidilo, sustituye a (o es sustituido por) un residuo electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tenga una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, sustituye a (o es sustituido por) uno que no tenga cadena lateral, por ejemplo glicina. Las variantes pueden exhibir la misma actividad biológica cualitativa (es decir, actividad de xilanasa) , aunque se pueden seleccionar variantes para modificar las características de las xilanasas como sea necesario.

En un aspecto, las xilanasas de la invención comprenden epítopos o marcas de purificación, secuencias de señales, u otras secuencias de fusión, etc. En un aspecto, las xilanasas de la invención se pueden fusionar con un péptido aleatorio para formar un polipéptido de fusión. "Fusionado" u "operativamente enlazado" significa en la presente que el péptido aleatorio y la xilanasa se enlazan entre sí, de tal manera que se minimiza la alteración de la estabilidad de la estructura de la xilanasa, por ejemplo, retiene su actividad de xilanasa. El polipéptido de fusión (o el polinucleótido de fusión que codifica el polipéptido de fusión) puede comprender también componentes adicionales, incluyendo múltiples péptidos en múltiples ciclos.

En un aspecto, los péptidos y los ácidos nucleicos que los codifican, se seleccionan aleatoriamente, ya sea de una manera completamente aleatoria, o se fuerzan en su selección aleatoria, por ejemplo, en general en la frecuencia de nucleótidos/residuos , o por posición. "Aleatoriamente seleccionado" significa que cada ácido nucleico y péptido consiste en nucleótidos y aminoácidos esencialmente aleatorios, respectivamente. En un aspecto, los ácidos nucleicos que dan lugar a los péptidos se pueden sintetizar químicamente, y por consiguiente, pueden incorporar a cualquier nucleótido , en cualquier posición. El proceso sintético se puede diseñar para generar ácidos nucleicos aleatoriamente seleccionados, para permitir la formación de todas o la mayoría de las combinaciones posibles sobre la longitud del ácido nucleico, formando de esta manera una biblioteca de ácidos nucleicos aleatoriamente seleccionados. La biblioteca puede proporcionar una población suficientemente diversa estructuralmente de productos de expresión aleatoriamente seleccionados para afectar a un rango probabilísticamente suficiente de respuestas celulares para proporcionar una o más células que exhiban una respuesta deseada. Por consiguiente, la invención proporciona una biblioteca de interacción suficientemente grande para que cuando menos uno de sus miembros tenga una estructura que le dé afinidad para alguna molécula, proteína, u otro factor.

Las xilanasas son enzimas de múltiples dominios que consisten opcionalmente en un péptido de señal, un módulo de enlace de carbohidrato, un dominio catalítico de xilanasa, un enlazador, y/u otro dominio catalítico.

La invención proporciona un medio para generar polipéptidos quiméricos que pueden codificar polipéptidos híbridos biológicamente activos (por ejemplo, xilanasas híbridas) . En un aspecto, los polinucleótidos originales codifican polipéptidos biológicamente activos. El método de la invención produce nuevos polipéptidos híbridos mediante la utilización de procesos celulares que integran la secuencia de los polinucleótidos originales, de tal manera que el polinucleótido híbrido resultante codifica un polipéptido que demuestra actividades derivadas de los polipéptidos biológicamente activos originales. Por ejemplo, los polinucleótidos originales pueden codificar una enzima particular a partir de diferentes microorganismos. Una enzima codificada por un primer polinucleótido a partir de un organismo o variante, por ejemplo, puede funcionar efectivamente bajo una condición medioambiental particular, por ejemplo, una alta salinidad. Una enzima codificada por un segundo polinucleótido a partir de un organismo o variante diferente, puede funcionar efectivamente bajo una condición medio-ambiental diferente, tal como temperaturas extremadamente altas . Un polinucleótido híbrido que conténga secuencias a partir del primero y del segundo polinucleótidos originales, puede codificar una enzima que exhiba las características de ambas enzimas codificadas por los polinucleótidos originales. Por consiguiente, la enzima codificada por el polinucleótido híbrido puede funcionar efectivamente bajo condiciones medio-ambientales compartidas por cada una de las enzimas codificadas por el primero y el segundo polinucleótidos , por ejemplo, una alta salinidad y temperaturas extremas .

Las enzimas codificadas por los polinucleótidos de la invención incluyen, pero no se limitan a, hidrolasas, tales como xilanasas. Las hidrolasas de glicosidasa fueron primeramente clasificadas en familias en 1991, ver, por ejemplo, Henrissat (1991) Biochem. J. 280: 309-316. Desde entonces, las clasificaciones se han actualizado continuamente, ver, por ejemplo, Henrissat (1993) Biochem. J. 293: 781-788; Henrissat (1996) Biochem. J. 316: 695-696; Henrissat (2000) Plant Physiology 124: 1515-1519. Existen 87 familias identificadas de hidrolasas de glicosidasa. En un aspecto, las xilanasas de la invención se pueden categorizar en las familias 8, 10, 11, 26 y 30. En un aspecto, la invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican xilanasa, con una novedad común en que se derivan de una familia común, por ejemplo la familia 5, 6, 8, 10, 11, 26 o 30, como se estipula en la siguiente Tabla 5.

Tabla 5 SEQ ID NO: FAMILIA 9, 10 8 I, 2 8 5,6 8 7,8 8 99,100 10 II, 12 10 127,128 10 27,28 10 97, 98 10 45,46 10 141, 142 10 107, 108 10 129, 130 10 93, 94 10 63, 64 10 25,26 10 49,50 10 67, 68 10 85, 86 10 29,30 10 51, 52 10 35,36 10 147, 148 10 119, 120 10 123 , 124 10 249, 250 10 149, 150 10 83, 84 10 43, 44 10 133, 134 10 113 , 114 10 105, 106 10 75, 76 10 111, 112 10 117, 118 10 115, 116 10 125, 126 10 137, 138 10 135, 136 10 69, 70 10 89, 90 10 31,32 10 13, 14 10 65, 66 10 57, 58 10 77, 78 10 73, 74 10 109, 110 10 59,60 10 71, 72 10 139, 140 10 55, 56 10 15, 16 10 131, 132 10 95, 96 10 101, 102 10 39,40 10 14 , 144 10 103, 104 10 17, 18 10 53, 54 10 21, 22 10 151,152 10 23, 24 10 121, 122 10 41, 42 10 47,48 10 247, 248 10 33, 34 10 19,20 10 87,88 10 81, 82 10 91, 92 10 61, 62 10 37,38 10 79,80 10 231, 232 11 157, 158 11 189, 190 11 167, 168 11 207, 208 11 251, 252 11 213,214 11 177 , 178 11 187, 188 11 205, 206 11 211, 212 11 197, 198 11 209, 210 11 185, 186 11 229, 230 11 223, 224 11 179, 180 11 193, 194 11 173, 174 11 217, 218 11 153, 154 11 219, 220 11 183 , 184 11 253 , 254 11 199, 200 11 255, 256 11 155, 156 11 169, 170 11 195, 196 11 215, 216 11 191, 192 11 175, 176 11 161, 162 11 221, 222 11 225, 226 11 163, 164 11 159, 160 11 233, 234 11 171, 172 11 203 , 204 11 181, 182 11 227, 228 11 165, 166 11 257, 258 26 237, 238 30 241, 242 30 239, 240 30 245, 246 30 235, 236 30 313, 314 30 345, 346 10 321, 322 10 323, 324 10 315, 316 10 201 202 10 265 266 10 145 146 10 287 288 10 293 294 10 351 352 10 311 312 10 279 280 10 289 290 10 283 284 10 373 374 10 337 338 10 371 372 10 291 292 10 3,4 10 307 308 10 343 344 10 349 350 10 329 330 10 355 356 10 339 340 10 295 296 10 333 334 10 281 282 10 361 362 10 347 348 10 319 320 10 357 358 10 365,366 10 273,274 10 277,278 10 271,272 10 285,286 10 259,260 10 325,326 10 331,332 10 359,360 10 303,304 10 363,364 10 305,306 10 341,342 10 375,376 11 377,378 11 379,380 11 301,302 11 309,310 11 263,264 11 269,270 11 353,354 11 299,300 11 367,368 11 261,262 11 369,370 11 267,268 11 317,318 11 297,298 11 327,328 5 275,276 6 Un polipéptido híbrido resultante del método de la invención puede exhibir una actividad enzimática especializada no exhibida en las enzimas originales. Por ejemplo, en seguida de la recombinación y/o reclasificación reductiva de los polinucleótidos que codifiquen las actividades de hidrolasa, el polipéptido híbrido resultante codificado por un polinucleótido híbrido puede rastrearse para determinar actividades de hidrolasa especializadas obtenidas a partir de cada una de las enzimas originales, es decir, el tipo de enlace sobre el cual actúa la hidrolasa, y la temperatura a la cual funciona la hidrolasa. Por consiguiente, por ejemplo, la hidrolasa se puede rastrear para aseverar las funcionalidades químicas que distingan a la hidrolasa híbrida de las hidrolasas originales, tales como: (a) amida (enlaces peptídicos) , es decir, xilanasas; (b) enlaces de éster, es decir, esterasas y lipasas; (c) acétales, es decir, glicosidasas y, por ejemplo, la temperatura, el pH, o la concentración de sal a la cual funciona el polipéptido híbrido.

Las fuentes de los polinucleótidos originales se pueden aislar a partir de los organismos individuales ("aislados"), de colecciones de organismos que se hayan cultivado en un medio definido ("cultivos de enriquecimiento"), o de organismos no cultivados ("muestras medio-ambientales"). Es más preferible el uso de un planteamiento independiente del cultivo para derivar polinucleótidos que codifiquen bio-actividades novedosas a partir de muestras medio-ambientales, debido a que permite tener acceso a los recursos destapados de la biodiversidad. ( Se generan "bibliotecas medio-ambientales" a partir de muestras medio-ambientales y representan genomas colectivos de organismos que se presentan naturalmente archivados en vectores de clonación que se pueden propagar en anfitriones procarióticos adecuados . Debido a que el ADN clonado inicialmente se extrae directamente de muestras medio-ambientales, las bibliotecas no se limitan a la pequeña fracción de procariotes que se pueden hacer crecer en un cultivo puro. Adicionalmente , una normalización del ADN medio-ambiental presente en estas muestras podría permitir una representación más igual del ADN a partir de todas las especies presentes en la muestra original. Esto puede aumentar dramáticamente la eficiencia de encontrar genes interesantes a partir de los constituyentes menores de la muestra que pueden estar sub-representados por varios órdenes de magnitud, comparándose con las especies dominantes.

Por ejemplo, se rastrean las bibliotecas genéticas generadas a partir de uno o más microorganismos no cultivados, para determinar una actividad de interés . Primero se capturan las sendas potenciales que codifiquen las moléculas bio-activas de interés, en células procarióticas , en la forma de bibliotecas de expresión genética. Los polinucleótidos que codifiquen las actividades de interés se aislan a partir de estas bibliotecas, y se introducen en una célula hospedera. La célula hospedera se cultiva bajo condiciones que promueven la recombinación y/o reclasificación reductiva, creando bio-moléculas potencialmente activas con actividades novedosas o mejoradas.

Adicionalmente , se puede llevar a cabo una sub-clonación para aislar adicionalmente secuencias de interés. En la sub-clonación, una porción de ADN se amplifica, se digiere, en general mediante enzimas de restricción, para cortar la secuencia deseada; la secuencia deseada se liga en un vector receptor, y se amplifica. En cada paso de la sub-clonación, la porción se examina para determinar la actividad de interés, con el objeto de asegurar que no se haya excluido el ADN que codifique la proteína estructural. El inserto se puede purificar en cualquier paso de la sub-clonación, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, antes de ligarse en un vector, o en donde las células que contengan al vector receptor y las células que no contengan al vector receptor, se coloquen sobre un medio selectivo que contenga, por ejemplo, un antibiótico, el cual mate a las células que no contengan al vector receptor. Los métodos específicos para la sub-clonación de insertos de ADNc en vectores son bien conocidos en este campo (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) . En otro aspecto, las enzimas de la invención son sub-clones. Estos sub-clones pueden diferir del clon progenitor, por ejemplo, por la longitud, una mutación, una marca, o una etiqueta.

En un aspecto, las secuencias de señales de la invención se identifican en seguida de la identificación de los polipéptidos de xilanasa novedosos. Las sendas mediante: las cuales se seleccionan las proteínas y se transportan hasta su localización celular apropiada, con frecuencia son referidas como sendas de dirección de proteínas. Uno de los elementos más importantes en todos estos sistemas de dirección es una secuencia de aminoácidos corta en el término amino de un polipéptido recién sintetizado denominado como la secuencia de señal. Esta secuencia de señal dirige una proteína hasta su localización apropiada en la célula, y se remueve durante el transporte, o cuando la proteína llega a su destino final. La mayoría de las proteínas lisosomales, de membrana, o secretadas, tienen una secuencia de señal amino-terminal que las marca para translocalizarse en el lumen del retículo endoplásmico . Se han determinado más de 100 secuencias de señales para las proteínas de este grupo. Las secuencias varían en longitud desde 13 hasta 36 residuos de aminoácidos. Los técnicos en la materia conocen varios métodos de reconocimiento de secuencias de señales. En un aspecto, los péptidos se identifican mediante un método referido como SignalP. SignalP utiliza una red neural combinada que reconoce tanto los péptidos de señales como sus sitios de disociación. Ver, por ejemplo, Nielsen (1997) "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites". Protein Engineering, Volumen 10, Número 1, páginas 1-6. Se debe entender que algunas de las xilanasas de la invención pueden o no contener secuencias de señales. Puede ser deseable incluir una secuencia de ácido nucleico que codifique una secuencia de señal a partir de una xilanasa operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico de una xilanasa diferente, u opcionalmente, se puede desear una secuencia de señal a partir de una proteína que no sea xilanasa.

Los microorganismos a partir de los cuales se puede preparar el polinucleótido incluyen microorganismos procarióticos , tales como Eubacteria y Archaebacteria, y microorganismos eucarióticos inferiores tales como hongos, algunas algas, y protozoarios . Se pueden aislar polinucleótidos a partir de muestras medio-ambientales, en cuyo caso, el ácido nucleico se puede recuperar sin cultivar un organismo, o se puede recuperar a partir de uno o más organismos cultivados. En un aspecto, estos microorganismos pueden ser extremófilos , tales como hipertermófilos, psicrófilos, psicrótrofos , halófilos, barófilos, y acidófilos. Se pueden utilizar polinucleótidos que codifiquen enzimas aisladas a partir de microorganismos extremófilos . Estas enzimas pueden funcionar a temperaturas arriba de 100°C en los manantiales calientes terrestres y en los vientos térmicos del mar profundo, a temperaturas debajo de 0°C en las aguas árticas, en el medio ambiente saturado de sal del Mar Muerto, en valores de pH alrededor de 0 en los depósitos de carbón y en los manantiales geotérmicos ricos en azufre, o en valores de pH mayores a 11 en el fango del alcantarillado. Por ejemplo, varias esterasas y lipasas clonadas y expresadas a partir de organismos extremófilos muestran una alta actividad a través de todo un amplio intervalo de temperaturas y pHs .

Los polinucleótidos seleccionados y aislados como se describen anteriormente en la presente, se introducen en una célula hospedera adecuada. Una célula hospedera adecuada es cualquier célula que sea capaz de promover la recombinación y/o la reclasificación reductiva. Los polinucleótidos seleccionados de preferencia ya están en un vector que incluya las secuencias de control apropiadas. La célula hospedera puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o de preferencia, la célula hospedera puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedera puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o electroporación (Davis y colaboradores, 1986) .

Como los ejemplos representativos de los anfitriones apropiados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium,- células fúngicás, tales como levadura; células de insecto, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales, tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; y células de plantas. La selección del anfitrión apropiado se considera dentro del alcance de los técnicos en la materia a partir de las enseñanzas de la presente.

Con referencia particular a diferentes sistemas , de cultivo celular de mamífero que se pueden emplear para expresar la proteína recombinante , los ejemplos de los sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritas en "SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants" (Gluzman, 1981) y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de réplica, un promotor y un mej orador adecuados, y también cualesquiera sitios de enlace de ribosoma necesarios, sitios de poliadenilación, sitios de donador y aceptor de empalme, secuencias de terminación de transcripción, y secuencias no transcritas de flanqueo 5'. Las secuencias de ADN derivadas a partir de sitios de, empalme SV40 y poliadenilación, se pueden utilizar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos .

En otro aspecto, se prevé que el método de la presente invención se puede emplear para generar polinucleótidos novedosos que codifican sendas bioquímicas a partir de uno o más operones o racimos genéticos o porciones de los mismos. Por ejemplo, las bacterias y muchos eucariotes tienen un mecanismo coordinado para regular los genes cuyos productos están involucrados en procesos i relacionados. Los genes se arraciman en estructuras referidas como "racimos genéticos" sobre un solo cromosoma, y se transcriben juntos bajo el control de una sola secuencia reguladora, incluyendo un solo promotor que inicia la transcripción del racimo entero. Por consiguiente, un racimo genético es un grupo de genes adyacentes que son idénticos o bien están relacionados, usualmente con respecto a su función. Un ejemplo de una senda bioquímica codificada por racimos genéticos es el de los policétidos.

El ADN del racimo genético se puede aislar a partir de diferentes organismos, y se liga en vectores, en particular en vectores que contienen secuencias reguladoras de expresión que pueden controlar y regular la producción de una proteína detectable o de una actividad de matriz relacionada con proteína a partir de los racimos genéticos ligados. El uso de vectores que tienen una capacidad excepcionalmente grande para la introducción de ADN exógeno, el particularmente apropiado para utilizarse con estos racimos genéticos, y se describe a manera de ejemplo en la presente para incluir el factor-f (o factor de fertilidad) de E. coli. Este factor-f de E. coli es un plásmido que afecta la transferencia de alta frecuencia de sí mismo durante la conjugación, y es ideal para lograr y propagar establemente fragmentos de ADN grandes, tales como los racimos genéticos a partir de muestras microbianas mixtas . Un aspecto de la invención es utilizar vectores de clonación, referidos como "fósmidos" o vectores de cromosoma artificial bacteriano (BAC) . Éstos se derivan a partir del factor-f de E. coli, que es capaz de integrar establemente segmentos grandes de ADN genómico. Cuando se integran con el ADN a partir de una muestra medio-ambiental no cultivada mixta, esto hace posible lograr grandes fragmentos genómicos en la forma de una "biblioteca de ADN medio-ambiental" estable. Otro tipo de vector para utilizarse en la presente invención es un vector de cósmido. Los vectores de cósmido se diseñaron originalmente para clonar y propagar grandes segmentos de ADN genómico. La clonación en vectores de cósmido se describe con detalle en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laborátory Press (1989) . Una vez ligados en un vector apropiado, se pueden introducir dos o más vectores que contengan diferentes racimos genéticos de sintasa de policétido en una célula hospedera adecuada. Las regiones de homología de secuencia parcial compartidas por los racimos genéticos, promoverán procesos que den como resultado la reorganización de la secuencia, dando como resultado un racimo genético híbrido. Luego se puede rastrear el racimo genético híbrido novedoso para determinar actividades mejoradas no encontradas en los racimos genéticos originales.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a un método para producir un polipéptido híbrido biológicamente activo, y rastrear este polipéptido para determinar una actividad mejorada, mediante: 1) Introducir cuando menos un primer polinucleótido en enlace operativo y un segundo polinucleótido en enlace operativo, compartiendo los cuando menos primer polinucleótido y segundo polinucleótido cuando menos una región de homología de secuencia parcial, en una célula hospedera adecuada; 2) cultivar la célula hospedera bajo condiciones que promuevan la reorganización de la secuencia, dando como resultado un polinucleótido híbrido en enlace operativo; 3) expresar un polipéptido híbrido codificado por el polinucleótido híbrido; 4) rastrear el polipéptido híbrido bajo condiciones que promuevan la identificación de una actividad biológica mejorada; y 5) aislar el polinucleótido que codifique al polipéptido híbrido.

Los métodos para rastrear diferentes actividades enzimáticas son conocidos por los técnicos en este campo, y se describen a través de toda la presente memoria descriptiva. Estos métodos se pueden emplear cuando se aislen los polipéptidos y polinucleótidos de la invención.

Metodologías de Rastreo y Dispositivos de Monitoreo "En Línea" En la práctica de los métodos de la invención, se pueden utilizar una variedad de aparatos y metodologías en conjunto con los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, para rastrear polipéptidos con el fin de determinar la actividad de xilanasa (por ejemplo, ensayos tales como hidrólisis de caseína en cimogramos, la liberación de fluorescencia a partir de gelatina, o la liberación de p-nitroanilida a partir de varios sustratos peptídicos pequeños) , con el objeto de rastrear compuestos como moduladores potenciales, por ejemplo, activadores o inhibidores, de una actividad de xilanasa, para buscar anti-cuerpos que se enlacen con un polipéptido de la invención, para buscar ácidos nucleicos que se hibriden a un ácido nucleico de la invención, para rastrear con el fin de buscar células que expresen un polipéptido de la invención, y similares. En adición a los formatos de matriz descritos con detalle más adelante para el rastreo de muestras, también se pueden utilizar formatos alternativos con el fin de practicar los métodos de la invención. Estos formatos incluyen, por ejemplo, espectrómetros de masas, cromatógrafos , por ejemplo, cromatografía de líquidos a alta presión de alto rendimiento y otras formas de cromatografía de líquidos, y formatos' más pequeños, tales como placas de 1536 pozos, placas de 384 pozos, etc. El aparato de rastreo de alta producción se puede adaptar y utilizar para practicar los métodos de la invención, ver, por ejemplo, la solicitud de patente US 20020001809.

Matrices Capilares Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención se pueden inmovilizar en, o aplicar a, una matriz. Las matrices se pueden utilizar para rastrear o monitorear bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anti-cuerpos , ácidos nucleicos, etc.), para determinar su capacidad para enlazarse a, o modular, la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la invención. Las matrices capilares, tales :como la GIGAMATRIX®, Diversa Corporation, San Diego, California, Estados Unidos; y matrices descritas, por ejemplo, en la solicitud de patente US 20020080350 Al; las publicaciones internacionales WO 02/31203 A y WO 02/44336 A, proporcionan un aparato alternativo para contener y rastrear muestras. En un aspecto, la matriz capilar incluye una pluralidad de capilares formados en una matriz de capilares adyacentes, en donde cada capilar comprende cuando menos una pared que define un lumen ,para retener una muestra. El lumen puede ser cilindrico, cuadrado, hexagonal, o de cualquier otra forma geométrica, siempre que las paredes formen un lumen para la retención de un líquido o una muestra. Los capilares de la matriz capilar se pueden mantener juntos en estrecha proximidad para formar una estructura plana. Los capilares se pueden enlazar entre sí, al fundirse (por ejemplo, cuando los capilares se hacen de vidrio) , adherirse, enlazarse, o sujetarse lado a lado. Adicionalmente , la matriz capilar puede incluir material intersticial dispuesto entre los capilares adyacentes de la matriz, formando de esta manera un dispositivo plano sólido que contiene una pluralidad de orificios atravesados .

Una matriz capilar se puede formar de cualquier número de capilares individuales, por ejemplo, un rango de 100 a 4,000,000 capilares. Además, se puede formar una matriz capilar que tenga aproximadamente 100,000 o más capilares individuales en el tamaño y forma estándares de una placa Microtiter® para ajustarse en un equipo de laboratorio convencional. Los lúmenes se rellenan de una manera manual o automática empleando ya sea acción capilar o bien micro- inyección, utilizando una aguja delgada. Las muestras de interés se pueden remover subsecuentemente de los capilares individuales para un análisis o caracterización adicional. Por ejemplo, se coloca una sond en forma de aguja delgada en comunicación de fluido con un capilar seleccionado, para agregar o retirar material del lumen.

En un ensayo de rastreo de un solo recipiente, se mezclan los componentes del ensayo, produciendo una solución de interés, antes de insertarse en la matriz capilar. El lumen se rellena mediante acción capilar cuando se sumerge cuando menos una porción de la matriz en una solución de interés. Se monitorean las reacciones químicas o biológicas y/o la actividad en cada capilar, para determinar los eventos detectables . Un evento detectable es con frecuencia referido como un "impacto", el cual usualmente se puede distinguir de los capilares; "no productores de impacto" mediante detección óptica. Por consiguiente, las matrices capilares permiten tener una detección masivamente paralela de "impactos".

En un ensayo de rastreo de múltiples recipientes, se puede introducir un polipéptido o un ácido nucleico, por ejemplo un ligando, en un primer componente, el cual se introduce en cuando menos una porción de un capilar o de una matriz capilar. Luego se puede introducir una burbuja de aire en el capilar detrás del primer componente. Entonces se puede introducir un segundo componente en el capilar, en donde el segundo componente se separa del primer componente mediante la burbuja de aire. Luego se pueden mezclar los primero y segundo componentes mediante la aplicación de presión hidrostática a ambos lados de la matriz capilar para colapsar la burbuja. Entonces se monitorea i la matriz capilar para determinar un evento detectable resultante de la reacción o falta de reacción de los dos componentes.

En el ensayo de rastreo de enlace, se puede introducir una muestra de interés como un primer líquido marcado con una partícula detectable en un capilar de una matriz capilar, ; en donde se recubre el lumen del capilar con un material de enlace, para enlazar la partícula detectable al lumen. Luego se puede remover el primer líquido del tubo capilar, en donde se mantiene la partícula detectable introducida dentro del capilar, y se puede introducir un segundo líquido en el tubo capilar. Entonces se monitorea el capilar para determinar un evento detectable resultante de la reacción o falta de reacción de la partícula con el segundo líquido.

Matrices o "Biochips" Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención se pueden inmovilizar o aplicar a una matriz. Se pueden utilizar matrices para rastrear o monitorear bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anti-cuerpos , ácidos nucleicos, etc.) para determinar su capacidad para enlazarse a, o modular, la actividad de un ácido nucleico o polipéptido de la invención. Por ejemplo, en un aspecto de la invención, se transcribe' un parámetro monitoreado para la expresión de un gen de xilanasa.

Una o más, o todas las transcripciones de una célula se pueden medir mediante la hibridación de una muestra que comprenda transcripciones de la célula, o ácidos nucleicos representativos de, o complementarios para, las transcripciones de una célula, mediante hibridación a ácidos nucleicos inmovilizados sobre una raatriz, o "biochip" . Mediante la utilización de una "matriz" de ácidos nucleicos sobre un microchip, se pueden cuantificar simultáneamente algunas o todas las transcripciones de una célula. De una manera alternativa, También se pueden utilizar matrices que comprendan el ácido nucleico genómico con el fin de determinar el genotipo de una cepa recién diseñada hecha mediante los métodos de la invención. También se pueden utilizar "matrices de polipéptidos" para cuantificar simultáneamente una pluralidad de proteínas. La presente invención se puede practicar con cualquier "matriz" conocida, también referida como una "micromatriz" o "matriz de ácido nucleico" o "matriz de polipéptido" o "matriz de anti-cuerpo" o "biochip", o una variación de los mismos . Las matrices son genéricamente una pluralidad de "puntos" o "elementos objetivos", comprendiendo cada elemento objetivo una cantidad definida de una o más moléculas biológicas, por ejemplo oligonucleótidos , inmovilizadas sobre un área definida de una superficie de sustrato para! el enlace específico a una molécula de muestra, por ejemplo, transcripciones de AR m.

En la práctica de los métodos de la invención, se puede incorporar cualquier matriz y/o método de marcado y matrices de uso conocidos, del todo o en parte, o variaciones de los mismos, como se describen, por ejemplo, en las patentes US 6,277, 628; 6,277,489; 6,261,776; 6,258,606; 6,054,270; 6,048,695; 6,045,996; 6,022,963; 6,013,440; 5,965,452; 5,959,098; 5,856,174; 5,830,645; 5,770,456; 5,632,957; 5,556,752; 5,143,854; 5,807,522; 5,800,992; 5,744,305; 5,700,637; 5,556,752; 5,434,049; ver también, por ejemplo, las publicaciones internacionales WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; ver también, por ejemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cáncer 20: 399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp . 21: 25-32. yer también las solicitudes de patente US 20010018642 ; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.

Anti-cuerpos y métodos de rastreo basados en anti-cuerpos La invención proporciona anti-cuerpos aislados o recombinantes que se enlazan específicamente a una xilanasa de la invención. Estos anti-cuerpos se pueden utilizar para aislar, identificar, o cuantificar las xilanasas de la invención o polipéptidos relacionados. Estos anti-cuerpos se pueden utilizar para aislar otros polipéptidos dentro del alcance de la invención u otras xilanasas relacionadas. Los anti-cuerpos se pueden diseñar para enlazarse a un sitio activo de una xilanasa. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para inhibir las xilanasas utilizando los anti-cuerpos de la invención (ver anteriormente con respecto a las aplicaciones para las composiciones anti-xilanasa de la invención) .

La invención proporciona fragmentos de las enzimas de la invención, incluyendo fragmentos inmunogénicos de un polipéptido de la invención. La invención proporciona composiciones que comprenden un polipéptido o péptido de la invención, y adyuvantes o portadores y similares.

Los anti-cuerpos se pueden utilizar en inmuno-precipitación, teñido, columnas de inmuno-afinidad, y similares. Si se desea, se pueden generar secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen para antígenos específicos mediante inmunización seguida por aislamiento del polipéptido o ácido nucleico, amplificación o clonación e inmovilización del polipéptido sobre una matriz de la invención. De una manera alternativa, los métodos de la invención se pueden emplear para modificar la estructura de un anti-cuerpo producido por una célula que se vaya a modificar, por ejemplo se puede incrementar o reducir la afinidad de un anti-cuerpo. Adicionalmente , la capacidad para hacer o modificar anti-cuerpos puede ser un fenotipo diseñado en una célula mediante los métodos de la invención. ¡ i Los métodos de inmunización, producción y aislamiento de anti-cuerpos (policlonales y monoclonales ) son conocidos por los técnicos en este campo, y se describen en la literatura científica y de patente, ver, por ejemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMU OLOGY, Wiley/Greene , N.Y. (1991) ; Stites (editor) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a. edición) Lange Medical Publications , Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES : PRINCIPLES AND PRACTICE (2a. edición) Academic Press, N.Y. (1986); Kohler (1975) Nature 256: 495; Harlow (1988) ANTIBODIES , A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, N.Y. También se pueden generar anti-cuerpos in vitro, por ejemplo, empleando bibliotecas de exhibición de fagos que expresen el sitio de enlace de anti-cuerpo recombinante, en adición a los métodos tradicionales in vivo utilizando animales. Ver, por ejemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol . 15: 62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys . Biomol . Struct . 26: 27-45.

Los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas o los fragmentos que comprenden cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, también se pueden utilizar para generar anti-cuerpos que! se enlacen específicamente a los polipéptidos o fragmentos. Los anti-cuerpos resultantes se pueden utilizar en procedimientos de cromatografía por inmuno-afinidad para aislar o purificar el polipéptido, o para determinar si el polipéptido está presente en una muestra biológica. En estos procedimientos, se pone1 en contacto una preparación de proteína, tal como un extracto, o ,una muestra biológica, con un anti-cuerpo capaz de enlazarse específicamente con uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprendan cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas .

En los procedimientos por inmuno-afinidad, el anti- cuerpo se une a un soporte sólido, tal como una perla u otra matriz de columna. La preparación de proteína se pone en contacto con el anti-cuerpo bajo condiciones en las que el anti-cuerpo se enlace específicamente con uno de los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos de las mismas. Después de un lavado para remover las proteínas no específicamente enlazadas, se levigan los polipéptidos específicamente enlazados.

Se puede determinar la capacidad de las proteínas en una muestra biológica para enlazarse con el anti-cuerpo empleando cualquiera de una variedad de procedimientos familiares para los técnicos en la materia. Por ejemplo, el enlace se puede determinar marcando el anti-cuerpo con una marca detectable, tal como un agente fluorescente, una marca enzimática, o un radioisótopo. De una manera alternativa, se puede detectar el enlace del anti-cuerpo a la muestra utilizando un anti-cuerpo secundario que tenga esta marca detectable en el mismo. Los ensayos particulares incluyen ensayos ELISA, ensayos de emparedado, radio- inmunoensayos , y Manchas Western. ' Los anti-cuerpos policlonales generados contra , los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprendan cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, se pueden obtener mediante la inyección directa de los polipéptidos en; un animal, o mediante la administración de los polipéptidos a un animal, por ejemplo, un no humano. El anti-cuerpo así obtenido se enlazará entonces al polipéptido mismo. De esta manera, , se puede utilizar inclusive una secuencia que codifique solamente un fragmento del polipéptido, para generar anti-cuerpos que puedan enlazarse con el polipéptido nativo entero. Estos anticuerpos se pueden utilizar entonces para aislar el polipéptido de las células que expresen ese polipéptido. i Para la preparación de anti-cuerpos monoclonales , se puede emplear cualquier técnica que proporcione anti-cuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, Nature, 256 : 495-497, 1975) , la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células-B humanas (Kozbor y colaboradores, Immunology Today 4: 72, 1983) y la técnica de hibridoma-EBV (Colé y colaboradores, 1985, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96) .

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (patente US 4,946,778) se pueden adaptar para producir anti-cuerpos de una sola cadena para los polipéptidos de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprendan cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40,; 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas. De una manera alternativa, se pueden utilizar ratones transgénicos para expresar anti-cuerpos humanizados para estos polipéptidos o fragmentos de los mismos .

Los anti-cuerpos generados contra los polipéptidos, de las secuencias de aminoácidos del Grupo B y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos que comprendan cuando menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos de las mismas, se pueden utilizar en el rastreo de polipéptidos similares a partir, de otros organismos y muestras. En estas técnicas, los polipéptidos del organismo se ponen en contacto con el anti -cuerpo, y se detectan los polipéptidos que se enlacen específicamente con el anti-cuerpo. Se puede emplear cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para detectar el enlace del anti-cuerpo.

Uno de estos ensayos de rastreo se describe en "Methods for Measuring Cellulase Activities" , Methods in Enzymology, Volumen 160, páginas 87-116.

Estuches La invención proporciona estuches que comprenden las composiciones, por ejemplo, los ácidos nucleicos, casetes de expresión, vectores, células, semillas o plantas o partes de plantas transgénicas, polipéptidos (por ejemplo, xilanasas) , y/o anti-cuerpos de la invención. Los estuches también pueden contener material de instrucción que enseñe las metodologías y usos industriales de la invención, como se describe en la presente .

Diseño de células enteras y medición de los parámetros metabólicos Los métodos de la invención proporcionan evolución de células enteras, o diseño de células enteras, para que una célula desarrolle una nueva cepa celular que tenga un nuevo fenotipo, por ejemplo, una actividad de xilanasa nueva o modificada, mediante la modificación de la composición genética de la célula. 1 La composición genética se puede modificar mediante la adición a la célula de un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una secuencia de codificación para una enzima de la invención. Ver, por ejemplo, las publicaciones internacionales WO/0229032 y WO/0196551. I Con el fin de detectar un nuevo fenotipo, se monit!orea cuando menos un parámetro metabólico de una célula modificada en la célula en un marco de "tiempo real" o de tiempo "en línea" . En un aspecto, se monitorea una pluralidad de células, tal ¡como un cultivo celular, en "tiempo real" o "en línea". En un aspecto, se monitorea una pluralidad de parámetros metabólicos en "tiempo real" o "en línea". Los parámetros metabólicos se pu'eden monitorear utilizando las xilanasas de la invención.

El análisis del flujo metabólico (MFA) se basa en una estructura bioquímica conocida. Se construye una matriz metabólica linealmente independiente basándose en la ley de conservación de la masa y en la hipótesis de estado pseudo- I continuo sobre los metabolitos intracelulares . En la práctica de los métodos de la invención, se establecen redes metabólicas, incluyendo : • La identidad de todos los sustratos de sendas, productos, y metabolitos intermediarios, • la identidad de todas las reacciones químicas que inter-convierten los metabolitos de senda, y la estequiometría de las reacciones de senda, • la identidad de todas las enzimas que catalicen las reacciones, y la cinética de la reacción enzimática, • las interacciones reguladoras entre los componentes de senda, por ejemplo, interacciones aloestéricas , interacciones de enzima-enzima, etc., • la compartimentalización intra-celular de [ las enzimas, o cualquier otra organización supra-molecular de las enzimas, y • la presencia de cualesquiera gradientes de concentración de metabolitos, enzimas, o moléculas efectoras, o barreras de difusión a su movimiento. 1 Una vez que se construye la red metabólica para una cepa dada, se puede introducir la presentación matemática mediante noción de matriz, con el fin de estimar los flujos metabólicos intra-celulares si están disponibles los datos metabólicos en línea. El fenotipo metabólico se apoya en los cambios de la red metabólica entera adentro de una célula. El fenotipo metabólico se apoya en el cambio de utilización de senda con respecto a las condiciones medio-ambientales, la regulación genética, el estado de desarrollo, y el genotipo, etc. En un aspecto de los métodos de la invención, después del cálculo del análisis de flujo metabólico en línea, se analizan el comportamiento dinámico de las células, su fenotipo, y otras propiedades, mediante la investigación de la utilización de senda. Por ejemplo, si se aumenta el suministro de glucosa, y se reduce el oxígeno durante la fermentación de la levadura, , se reducirá y/o se detendrá la utilización de las sendas respiratorias, y dominará la utilización de las sendas - de fermentación. El control del estado fisiológico de los cultivos celulares llegará a ser posible después del análisis de la senda. Los métodos de la invención pueden ayudar a determinar la manera de manipular la fermentación mediante la determinación de, la manera de cambiar el suministro de sustrato, la temperatura,, el uso de inductores, etc., para controlar el estado fisiológico de las células para moverse a lo largo de la dirección deseable.1 En la práctica de los métodos de la invención, también se pueden comparar los resultados del análisis de flujo metabólico con los datos de transcriptoma y proteoma, para diseñar experimentos y protocolos para el diseño metabólico o la mezcla de genes, etc.

En la práctica de los métodos de la invención, se puede conferir y detectar cualquier fenotipo modificado o nuevo, incluyendo las características nuevas o mejoradas en la célula.

Se puede monitorear cualquier aspecto del metabolismo o del crecimiento .

Monitoreo de la expresión de una transcripción de ARNm En un aspecto de la invención, el fenotipo diseñado comprende aumentar o reducir la expresión de una transcripción de ARNm (por ejemplo, un mensaje de xilanasa) , o generar nuevas transcripciones (por ejemplo, xilanasa) en una célula. Esta expresión aumentada o reducida se puede rastrear mediante, la prueba de la presencia de una xilanasa de la invención; o mediante ensayos de la actividad de xilanasa. Las transcripciones de ARNm, o los mensajes, también se pueden detectar y cuantificar mediante cualquier método conocido en la materia, incluyendo, por ejemplo, manchas Northern, reacciones de amplificación cuantitativa, hibridación a matrices, y similares. Las reacciones de amplificación cuantitativa incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa, o RT-PCR; reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real, o "reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cinética en tiempo real" (ver, por ejemplo, Kreuzer (2001) Br. J. Haematol . 114: 313-318; Xia (2001) Transplantation 72: 907-914). 1 En un aspecto de la invención, se genera el fenotipo diseñado mediante la expresión con eliminación genética de un gen homólogo. Se puede eliminar genéticamente la secuencia de codificación del gen, o uno o más elementos de control de transcripción, por ejemplo promotores o potenciadores . Por consiguiente, se puede cortar completamente o sólo reducir la expresión de una transcripción.

En un aspecto de la invención, el fenotipo diseñado comprende aumentar la expresión de un gen homólogo. Esto se puede efectuar mediante la eliminación genética de un elemento de control negativo, incluyendo un elemento regulador de transcripción que actúe en cis o trans, o mutando un elemento de control positivo. Se pueden medir una o más, o todas las transcripciones de una célula, mediante la hibridación de ' una muestra que comprenda transcripciones de la célula, o ácidos nucleicos representativos de, o complementarios para, las transcripciones de una célula, mediante hibridación a ácidos nucleicos inmovilizados sobre una matriz.

Monitoreo de la expresión de polipéptidos, péptidos y aminoácidos En un aspecto de la invención, el fenotipo diseñado comprende aumentar o reducir la expresión de un polipéptido (por ejemplo, una xilanasa) , o generar nuevos polipéptidos en una célula. Esta expresión aumentada o reducida se puede rastrear mediante la determinación de la cantidad de xilanasa presente, o mediante ensayos de la actividad de xilanasa. Los polipéptidos, péptidos, y aminoácidos, también se pueden detectar y cuantificar mediante cualquier método conocido en la materia, incluyendo; por ejemplo, resonancia magnética nuclear (RMN) , espectrofotometría, radiografía (radio-marcado de proteínas) , electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) , cromatografía de capa delgada (TLC) , cromatografía de hiper-difusión, diferentes métodos inmunológicos , por ejemplo inmuno-precipitación, inmuno-difusión, inmuno-electroforesis , radio- inmunoensayos (RIAs) , ensayos i inmuno- sorbentes enlazados con enzimas (ELISAs) , ensayos inmuno-fluorescentes, electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE) , teñido con anti-cuerpos , seleccionador de células activado por fluorescencia (FACS) , espectrometría de masas con pirólisis, Espectrometría Infrarroja de Transformada de Fourier, espectrometría de Raman, GC-MS, y Electro-rociado-LC y espectrometrías de masas con electro-rociado en fila de tapa-LC, y similares . Las bio-actividades novedosas también se pueden rastrear empleando los métodos, o variantes de los mismos, descritos en la patente US 6,057,103. Además, como se describe más adelante con detalle, uno o más, o todos los polipéptidos de una célula, se pueden medir utilizando una matriz de proteína.

Aplicaciones Industriales Las enzimas de xilanasa de la invención pueden ser catalizadores altamente selectivos. Pueden catalizar reacciones con estéreo-, regio-, y quimio- selectividades exquisitas que no tienen paralelo en la química sintética convencional. Más ain, las enzimas son notoriamente versátiles. Las enzimas de xilanasa de la invención se pueden hacer a la medida para funcionar en solventes orgánicos, operar en pHs extremos (por ejemplo, altos pHs y bajos pHs) , temperaturas extremas (por ejemplo, altas temperaturas y bajas temperaturas) , niveles de salinidad extremos (por ejemplo, alta salinidad y baja salinidad) , y catalizar reacciones con compuestos que estructuralmente no estén relacionados con sus sustratos fisiológicos naturales.

Composiciones Detergentes La invención proporciona composiciones detergentes que comprenden uno o más polipéptidos (por ejemplo, xilanasas) de la invención, y métodos para hacer y usar estas composiciones. La invención incorpora todos los métodos para hacer y usar composiciones detergentes, ver, por ejemplo, las patentes US 6,413,928; 6,399,561; 6,365,561; 6,380,147. Las composiciones detergentes pueden ser una composición acuosa de una y dos partes, una composición líquida no acuosa, un sólido vaciado, ¡una forma granular, una forma de partículas, una tableta comprimida, un gel, y/o una pasta y una forma de pasta acuosa. Las xilanasas de la invención también se pueden utilizar como un producto aditivo detergente en una forma sólida o líquida. Estos productos aditivos se pretenden para complementar o reforzar el desempeño de las composiciones detergentes convencionales, y se puéden agregar en cualquier etapa del proceso de limpieza. ! El contenido de enzima activa real depende del método de fabricación de una composición detergente y no es crítico, asumiendo que la solución detergente tenga la actividad enzimática deseada. En un aspecto, la cantidad de xilanasa presente en la solución final es de aproximadamente 0.001 mg a 0.5 mg por gramo de la composición detergente. La enzima particular seleccionada para utilizarse en el proceso y los productos de esta invención, depende de las condiciones de utilidad final, incluyendo la forma física del producto, el pH de uso, la temperatura de uso, y los tipos de suelos que se vayan a degradar o alterar. La enzima se puede seleccionar para proporcionar una actividad y estabilidad óptimas para cualquier conjunto dado de condiciones de servicio. En un aspecto, las xilanasas de la presente invención son activas en los intervalos de pH desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 12, y en el intervalo de temperatura de aproximadamente 20°C' a aproximadamente 95°C. Los detergentes de la invención pueden comprender tensioactivos catiónicos, semi-polares , no iónicos, o zwitteriónicos ; o mezclas de los mismos.

Las xilanasas de la invención se pueden formular en detergentes en polvo o líquidos que tengan un pH de entre 4.0 y 12.0 en niveles de aproximadamente el 0.01 a aproximadamente el 5 por ciento (de preferencia del 0.1 por ciento al 0.5 por ciento) en peso. Estas composiciones detergentes también pueden incluir otras enzimas, tales como xilanasas, celulasas, lipasas, o endoglicosidasas , endo-beta-1, -glucanasas, beta-glucanasas , endo-beta-1, 3 (4) -glucanasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas , amilasas, glucoamilasas , pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , ligninasas, pululanasas, arabinanasas , hemi-celulasas, mananasas, xiloglucanasas, xilanasas, acetil-esterasas de pectina, acetil-esterasas de ramnogalacturonano, poligalacturonasas , ramnogalacturonasas , galactanasas , liasas de pectina, metil-esterasas de pectina, celobio idrolasas , y/o transglutaminasas . Estas composiciones detergentes también pueden incluir mejoradores de detergencia y estabilizantes.

La adición de las xilanasas de la invención a composiciones limpiadoras convencionales no crea ninguna i limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuados para el detergente, también son adecuados para las composiciones de la invención, siempre que la enzima esté activa o sea tolerante al pH y/o temperatura del uso pretendido. En adición, las xilanasas de la invención se pueden utilizar en una composición limpiadora sin detergentes, nuevamente sola o en combinación con mejoradores de detergencia y estabilizantes.

La presente invención proporciona composiciones limpiadoras que incluyen composiciones detergentes para limpiar superficies duras, composiciones detergentes para limpiar telas, composiciones para lavado de trastes, composiciones para limpieza oral, composiciones limpiadoras de dentaduras, y soluciones limpiadoras de lentes de contacto. j En un aspecto, la invención proporciona un método para lavar un objeto, el cual comprende poner en contacto el objeto con un polipéptido de la invención bajo condiciones suficientes para el lavado. Una xilanasa de la invención se puede incluir como un aditivo de detergente. La composición detergente dé la invención, por ejemplo, se puede formular como una composición i detergente para lavar ropa a mano o en máquina, que comprenda un polipéptido de la invención. Un aditivo para lavado de ropa adecuado para el tratamiento previo de telas tenidas puede comprender un polipéptido de la invención. Una composi|ción suavizante de telas puede comprender una xilanasa de la invención. De una manera alternativa, una xilanasa de la i. invención se puede formular como una composición detergente ¡para utilizarse en operaciones generales de limpieza de superficies duras del hogar. En los aspectos alternativos, los aditivos de detergente y las composiciones detergentes de la invención, pueden comprender una o mas enzimas diferentes, tales como una xilanasa, una lipasa, una cutinasa, otra xilanasa, ¡ una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa,; una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, 1 por ejemplo, una lactasa y/o una peroxidasa (ver también anteriormente) . Las propiedades de las enzimas de la invención i se seleccionan para ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, compatibilidad óptima de pH con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y las enzimas están presentes en cantidades efectivas. En un aspecto,: las enzimas de xilanasa de la invención se utilizan para remover materiales de mal olor de las telas. Diferentes composiciones detergentes y métodos para fabricarlos, que se pueden utilizar en la práctica de la invención se describen, por ejemplo, en las patentes US 6,333,301; 6,329,333; 6,326,341; 6,297,038; 6,309,871; 6,204,232; 6,197,070; 5,856,164.

Cuando se formulan como composiciones adecuadas para utilizarse en un método de lavado de ropa en máquina lavadora, las xilanasas de la invención pueden comprender tanto un tensioactivo como un compuesto mej orador de detergencia. Adicionalmente pueden comprender uno o más componentes i detergentes, por ejemplo, compuestos poliméricos orgánicos, agentes blanqueadores, enzimas adicionales, supresores de espuma, dispersantes, dispersantes de cal-jabón, agentes de suspensión de suciedad y contra el re-depósito, e inhibidores de corrosión. Las composiciones para lavado de ropa de la invención también pueden contener agentes suavizantes, como componentes adicionales del detergente. Las composiciones que contienen carbohidrasa pueden proporcionar limpieza de telas, remoción de manchas, mantenimiento de blancura, suavizamiento, apariencia de colór, inhibición de transferencia de tintes, y saneamiento, cuando! se formulan como composiciones detergentes para lavado de ropa.

La densidad de las composiciones detergentes para lavado de ropa de la invención puede ser de aproximadamente 200 a 1500 g/1, o de aproximadamente 400 a 1200 g/1, o , de aproximadamente 500 a 950 g/1, o de 600 a 800 g/1, de < la composición; ésta se puede medir a aproximadamente 20°C.

La forma "compacta" de las composiciones detergentes para lavado de ropa de la invención se refleja mejor por la densidad y, en términos de la composición, por la cantidad de sal de relleno inorgánica. Las sales de relleno inorgánicas son ingredientes convencionales de las composiciones detergentes en su forma en polvo. En las composiciones detergentes convencionales, las sales de relleno están presentes en cantidades sustanciales, normalmente del 17 por ciento al 35 por ciento en peso de la composición total. En un aspecto de las composiciones compactas, la sal de relleno está presente en cantidades que no exceden al 15 por ciento de la composición total, o que no exceden al 10 por ciento, o que no exceden al 5 por ciento en peso de la composición. Las sales de relleno inorgánicas se pueden seleccionar a partir de las sales < de metales alcalinos y alcalinotérreos de sulfatos y cloruros, por ejemplo, sulfato de sodio.

Las composiciones detergentes líquidas de la invención también pueden estar en una "forma concentrada". En un aspecto, las composiciones detergentes líquidas pueden contener una cantidad más baja de agua, comparándose con los detergentes líquidos convencionales. En los aspectos alternativos, ¦ el contenido de agua del detergente líquido concentrado es menor al 40 por ciento, o menor al 30 por ciento, o menor al 20 por ciento en peso de la composición detergente. Los compuestos detergentes de la invención pueden comprender formulaciones como se describen en la publicación internacional WO 97/01629.

Las xilanasas de la invención pueden ser útiles en la formulación de diferentes composiciones limpiadoras. Un número de compuestos conocidos son tensioactivos adecuados, incluyendo ¦ i detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, o zwitteriónicos , y se pueden utilizar, por ejemplo, como se da a conocer en las patentes US 4,404,128; 4,261,868; 5,204,015. En adición, las xilanasas se pueden utilizar, por ejemplo, en las aplicaciones de jabón en barra o en líquido, en las formulaciones para el cuidado de trastes, en las soluciones o productos limpiadores de lentes de contacto, hidrólisis de péptidos, tratamiento de desechos, aplicaciones textiles, como enzimas de fusión-disociación en la producción de proteínas, y similares. ¡Las xilanasas pueden proporcionar un mejor desempeño en i una composición detergente, comparándose con otra xilanasa detergente, es decir, el grupo enzimático puede aumentar la limpieza de ciertas manchas sensibles a las enzimas, tales como de pasto o sangre, como es determinado por una evaluación usual después de un ciclo de lavado estándar. Las xilanasas se pueden formular en detergentes en polvo y líquidos conocidos que tengan un pH entre 6.5 y 12.0, en niveles de aproximadamente el 0.01 a aproximadamente el 5 por ciento (por ejemplo, de aproximadamente el 0.1 por ciento al 0.5 por ciento) en peso. Estas composiciones limpiadoras detergentes también pueden incluir otras enzimas, tales como las xilanasas conocidas, xilanasas, amilasas, celulasas, lipasas, o endoglicosidasas, así como mej oradores de detergencia y estabilizantes.

En un aspecto, la invención proporciona composiciones detergentes que tienen actividad de xilanasa (una xilanasa de la invención) para utilizarse con fruta, verduras, y/o fango y compuestos de arcilla (consultar, por ejemplo, la patente US 5, 786, 316) .

Tratamiento de fibras y textiles La invención proporciona métodos para el tratamiento de fibras y telas utilizando una o más xilanasas de la invención. Las xilanasas se pueden utilizar en cualquier método, de tratamiento de fibras o telas, los cuales son bien conocidos en la materia, ver, por ejemplo, las patentes US 6,261,828; 6,077,316; 6,024,766; 6,021,536; 6,017,751; 5,980,581; ' la publicación US 20020142438 Al. Por ejemplo, las xilanasas dé la invención se pueden utilizar en el desapresto de fibras y/o telas. En un aspecto, se mejora la sensación y apariencia de una tela mediante un método que comprende poner en contacto la tela con una xilanasa de la invención en una solución. En un aspecto, la tela se trata con la solución bajo presión. Por ejemplo, las xilanasas de la invención se pueden utilizar en la remoción de manchas .

Las xilanasas de la invención se pueden utilizar para tratar cualquier material celulósico, incluyendo fibras (por ejemplo, fibras de algodón, cáñamo, yute o lino) , telas cosidas y no cosidas, por ejemplo, tejidos, hilados, driles, hilos, y toallas, hechos de algodón, mezclas de algodón, o celulósicos naturales o hechos por el hombre (por ejemplo, originados a partir de fibras de celulosa que contienen xilano, tal como a partir de pulpa de madera) , o mezclas de los mismos. Los ejemplos de las mezclas son mezclas de algodón o rayón/viscoso con uno o más materiales acompañantes tales como lana, fibras sintéticas (por ejemplo, fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras: de poliéster, fibras de poli (alcohol vinílico) , fibras de poli (cloruro de vinilo) , fibras de poli (cloruro de vinilideno) , fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida) , y fibras que contienen celulosa (por ejemplo, rayón/viscoso, ramina, cáñamo, lino, yute, fibras de acetato de celulosa, lyocell) .

Los procesos de tratamiento textiles de la invención (utilizando las xilanasas de la invención) se pueden utilizar en conjunto con otros tratamientos textiles, por ejemplo, raspado y blanqueo. El raspado es la remoción del material no celulósico de la fibra de algodón, por ejemplo la cutícula (que consiste principalmente en ceras) y la pared celular primaria (que consiste principalmente en pectina, proteína, y xiloglucano) . , Es necesaria una remoción de cera apropiada para obtener una alta humectabilidad . Esto es necesario para el teñido. La remoción de las paredes celulares primarias mediante los procesos de la invención mejora la remoción de cera y asegura un teñido más uniforme. El tratamiento de textiles con los procesos de la invención puede mejorar la blancura en el proceso de blanqueo. El producto químico principal utilizado en el raspado es hidróxido de sodio en altas concentraciones y a altas temperaturas. El blanqueo comprende oxidar el textil. El blanqueo normalmente involucra el uso de peróxido de hidrógeno como el agente oxidante con el objeto de obtener ya sea una tela completamente blanqueada (blanca) , o bien para asegurar un matiz limpio del tinte.

La invención también proporciona xilanasas alcalinas (xilanasas activas bajo condiciones alcalinas) . Éstas tienen aplicaciones de amplio rango en el procesamiento de textiles, en el desengomado de fibras de plantas (por ejemplo, fibras de estera de plantas) , en el tratamiento de aguas residuales pécticas, fabricación de papel, y en las fermentaciones de café y té. Ver, por ejemplo, Hoondal (2002) Applied Microbiology 1 and Biotechnology 59: 409-418.

Tratamiento de alimentos y procesamiento de alimentos Las xilanasas de la invención tienen numerosas aplicaciones en la industria del procesamiento de alimentos. Por ejemplo, en un aspecto, las xilanasas de la invención se utilizan para mejorar la extracción de aceite a partir de un material de planta rico en aceite, por ejemplo, semillas ricas en aceite,, por ejemplo aceite de semilla de soya a partir de semillas de soya, aceite de olivo a partir de olivos, aceite de semilla de colza a partir de semillas de colza, y/o aceite de girasol a partir de semillas de girasol.

Las xilanasas de la invención se pueden utilizar para la separación de los componentes de los materiales celulares de las plantas. Por ejemplo, las xilanasas de la invención se pueden utilizar en la separación de material rico en xilano (por ejemplo, células de plantas) en sus componentes. En un aspecto, las xilanasas de la invención se pueden utilizar para separar los cultivos ricos en xilano o ricos en aceite, en las valiosas fracciones de proteína y aceite y cáscara. El proceso de separación se puede llevar a cabo mediante el uso de métodos conocidos en la materia.

Las xilanasas de la invención se pueden utilizar en la preparación de jugos de frutas o verduras, jarabes, extractos, y similares, para aumentar el rendimiento. Las xilanasas de¡ la invención se pueden utilizar en el tratamiento enzimático (por ejemplo, en la hidrólisis de materiales de plantas que comprendan xilano) de diferentes materiales derivados de las paredes celulares de las plantas o materiales de desecho, por ejemplo, a partir de cereales, granos, de la producción de vino o jugo, o de los residuos agrícolas tales como cáscaras de verduras, cascaras de semillas, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de olivo, pulpa de papa, y similares. Las xilanasas de la invención se pueden utilizar para modificar la consistencia y apariencia de las frutas o verduras procesadas. Las xilanasas de la invención se pueden utilizar para tratar el material de las plantas, con el fin de facilitar el procesamiento del material de las plantas, incluyendo alimentos, para facilitar la purificación o extracción de los componentes de las plantas. Las xilanasas de la invención se pueden utilizar para mejorar el valor alimenticio, para reducir la capacidad de enlace de agua, para mejorar la degradabilidad de las plantas de aguas1 de desecho, y/o para mejorar la conversión del material de las plantas para ensilaje, y similares.

En un aspecto, las xilanasas de la invención se t utilizan en aplicaciones de repostería, por ejemplo en bizcochos y galletas, para hidrolizar los arabinoxilanos y crear masas no pegajosas que no sean difíciles de maquilar y reducir a tamaño de bizcocho. El uso de las xilanasas de la invención para hidrolizar arabinoxilanos se hace para prevenir la rehidratación rápida del producto horneado que da como resultado una pérdida de consistencia tostada y una vida de anaquel reducida. En un aspecto, las xilanasas de la invención se utilizan como aditivos en el procesamiento de masa. En un aspecto, las xilanasas de la invención se utilizan en el acondicionamiento de la masa, en donde, en un aspecto, las xilanasas poseen una alta actividad sobre un intervalo de temperatura de aproximadamente 25°C a 35°C, y a un pH casi neutro (7.0 a 7.5) . En un aspecto, las enzimas de acondicionamiento de masa se pueden inactivar a las temperaturas extremas del horneado (>260°C) .

En un aspecto, las xilanasas de la invención se utilizan como aditivos en el procesamiento de masa, para que se desempeñe de manera óptima bajo las condiciones de pH y temperatura de la masa. En un aspecto, se utiliza una enzima de la invención para el acondicionamiento de la masa. En un aspecto, una xilanasa de la invención posee una alta actividad sobre , un intervalo de temperatura de 25°C a 35°C, y a un pH casi neutro (7.0 a 7.5) . En un aspecto, la enzima se inactiva a las temperaturas extremas del horneado, por ejemplo, >260°C.

Tratamiento de papel o pulpa Las xilanasas de la invención pueden estar en el tratamiento de papel o pulpa, o en el desentintado de papel. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un proceso, de tratamiento de papel utilizando una xilanasa de la invención., En un aspecto, la xilanasa de la invención es aplicable tanto en la reducción de la necesidad de un agente blanqueador químico, tal como dióxido de cloro, como en los medios ambientes altamente i alcalinos y a alta temperatura. En un aspecto, la xilanasa de la invención es una endoxilanasa alcalina termo-estable que puede efectuar una reducción mayor al 25 por ciento en el requerimiento de dióxido de cloro de la pulpa de papel de estraza, con una pérdida de rendimiento de la pulpa menor al 0.5 por ciento. En un aspecto, los parámetros limitantes son un pH de 10, una temperatura de 65°C a 85°C, y un tiempo de tratamiento menor á 60 minutos con una carga de enzima menor al 0.001 por ciento en peso. Se puede probar un grupo de xilanasas para determinar su capacidad para hidrolizar el xilano marcado con tinte, | por ejemplo, a un pH de 10, y a 60°C. Las enzimas que se prueban positivas bajo estas condiciones se pueden evaluar entonces, por ejemplo, a un pH de 10 y a 70°C. De una manera alternativa, las enzimas se pueden probar a un pH de 8 y a un pH de 10, a 70°C. En el descubrimiento de las xilanasas deseables en la industria de pulpa y papel, se dirigieron bibliotecas a partir de medios ambientes de alta temperatura o altamente alcalinos. De una manera específica, estas bibliotecas se rastrearon para determinar las enzimas que funcionaran a un pH alcalino y a una temperatura de aproximadamente 45°C. En otro aspecto, las xilanasas de la invención son útiles en la industria de pulpa y papel en la degradación de un enlace de hemi-celulosa de lignina, con el objeto de liberar la lignina. , Alimentos para animales y aditivos de alimentos La invención proporciona métodos para el tratamiento de alimentos para animales y aditivos de alimentos utilizando las xilanasas de la invención, animales incluyendo mamíferos (por ejemplo, seres humanos), aves, peces, y similares. La invención proporciona alimentos para animales, comidas, y aditivos que comprenden las xilanasas de la invención. En un aspecto;, el tratamiento de alimentos para animales, comidas, y aditivos utilizando las xilanasas de la invención, puede ayudar en la disponibilidad de los nutrientes, por ejemplo, almidón, proteíña, y similares, en el alimento para animales o en el aditivo. Mediante la descomposición de las proteínas difíciles de digerir o el desenmascarado indirecto o directo del almidón (u otros nutrientes) , la xilanasa hace que los nutrientes sean más accesibles para otras enzimas endógenas o exógenas . La xilanasa también puede provocar simplemente la liberación de los i nutrientes y azúcares fácilmente digeribles y fácilmente absorbidos .

Cuando se agregan al alimento para animales, las xilanasas de la invención mejoran la descomposición in vivo del material de la pared celular de las plantas, parcialmente debido a una reducción de la viscosidad intestinal (ver, por ejemplo, Bedford y colaboradores, Proceedings of the lst Symposiumj on Enzymes in Animal Nutrition, 1993, páginas 73-77), mediante lo cual se logra una mejor utilización de los nutrientes de las plantas por parte del animal. Por consiguiente, mediante la utilización de las xilanasas de la invención en los alimentos, se mejora el índice de crecimiento y/o la proporción de conversión del alimento (es decir, el peso del alimento ingerido en relación con la ganancia de peso) del animal. ; El aditivo de alimento para animales de la invención puede ser un producto enzimático granulado que puede mezclárse fácilmente con los componentes del alimento. De una manera alternativa, los aditivos de alimentos de la invención pueden formar un componente de una pre-mezcla. El producto enzimático granulado de la invención se puede recubrir o no recubrir. El tamaño de partículas de los granulados enzimáticos puede ser compatible con aquél del alimento y de los componentes de la pre-mezcla. Esto proporciona un medio seguro y conveniente para incorporar enzimas en los alimentos. De una manera alternativa, el aditivo de alimento para animales de la invención puede; ser una composición líquida estabilizada. Ésta puede ser una pasta acuosa o basada en aceite. Ver, por ejemplo, la patente US 6,245,546.

Las xilanasas de la presente invención, en, la modificación del alimento para animales o de una comida, pueden procesar el alimento o la comida ya sea in vitro (mediante la modificación de los componentes del alimento o de la comida) , o bien in vivo. Las xilanasas se pueden agregar al alimento o composiciones alimenticias para animales que contengan altas cantidades de xilanos, por ejemplo, al alimento o la comida que contenga material de planta; a partir de cereales, granos, y similares. Cuando se agrega al alimento o a la comida,: la xilanasa mejora de una manera significativa la descomposición in vivo del material que contiene xilano, por ejemplo, las paredes celulares de la planta, mediante lo cual se logra una mejor utilización de los nutrientes de la planta por parte del animal (por ejemplo, un ser humano) .j En un aspecto, se mejora el índice de crecimiento y/o la proporción de conversión del alimento (es I decir, el peso del alimento ingerido en relación con la ganancia de peso) del animal. Por ejemplo, una proteína que comprenda xilano parcialmente o indigerible, es completa o parcialmente I degradada por una xilanasa ,de la invención, por ejemplo en combinación con otra enzima ,j por ejemplo beta-galactosidasa, hasta péptidos y galactosa y/o galacto-oligómeros . Estos productos de la digestión enzkmática son más digeribles para el animal. Por consiguiente lasj xilanasas de la invención pueden contribuir a la energía disponible del alimento o la comida. También, al contribuir a la ! degradación de las proteínas que comprenden xilano, una xilanasa de la invención puede mejorar la I digestibilidad y recuperación del alimento o los constituyentes alimenticios de carbohidrato y que no sean de carbohidrato, tales como proteína, grasa, y minerales.

En otro aspecto, lá xilanasa de la invención se puede suministrar mediante la exprJsión de las enzimas directamente en los cultivos alimenticios jtransgénicos (como, por ejemplo, plantas, semillas, y similares transgénicas) , tales como granos, i cereales, maíz, semilla de soya, semilla de colza, lupina, y i similares. Como se describió anteriormente, la invención proporciona plantas, partes j de plantas, y células de plantas transgénicas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de lá invención. En un aspecto, el ácido nucleico se expresa de tal manera que se produzca la xilanasa de la invención en cantidades recuperables. La xilanasa se puede I recuperar a partir de cualquijer planta o parte de planta. De una manera alternativa, la planta o parte de planta que contiene al polipéptido recombinante, se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o! comida, por ejemplo mejorando su valor nutritivo, sabor, y propiedades reológicas, o para destruir un factor anti-nutritivo . 1 En un aspecto, la ¡invención proporciona métodos para remover los oligosacáridos a partir del alimento antes de su consumo por parte de un sujjto animal, utilizando una xilanasa de la invención. En este pro eso, se forma un alimento que tenga un mayor valor de energía metabolizable . En adición a las I xilanasas de la invención, se pueden utilizar galactosidasas , celulasas, y combinaciones de las mismas. En un aspecto,: la enzima se agrega en una cantidad igual a entre aproximadamente el 0.1 por ciento y el 1 | por ciento en peso del material alimenticio. En un aspecto, eí alimento es un material de ceréal, de trigo, de grano, o de semilla de soya (por ejemplo, una semilla de soya molida) . Ver, por ejemplo, la patente! US 6,399,123. ; , En otro aspecto, la' invención proporciona métodos para utilizar la xilanasa como un complemento nutritivo en las dietas de animales, mediante la preparación de un complemento nutritivo que contenga una enzima xilanasa recombinante que comprenda cuando menos treinta aminoácidos contiguos de un aminoácido de las secuencias de aminoácidos del Grupo B, y la administración ! del complemento nutritivo a un animal con el fin de aumentar la l j utilización del xilano contenido en el alimento ingerido por el animal . I i En todavía otro aspecto, la invención proporciona una matriz de suministro de enzimas granulada y comestible, y un I i método de uso para suministrar xilanasa a un animal, por ejemplo como un complemento nutritivo. La matriz de suministro de enzimas libera fácilmente una enzima xilanasa, tal como una que tenga una secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos! del i Grupo B, o cuando menos 30 am Iinoácidos contiguos de la mismai, en un medio acuoso, tal como, por ejemplo, el fluido digestivo de j un animal. La matriz de suministro de enzimas de la invención se prepara a partir de un vehículo granulado comestible seleccionado a partir de componentes tales como germen de grano que: ¡esté agotado de aceite, heno, alfalfa, fleo, cáscara de soya, harina de semilla de girasol, centro de trigo, y similares, ¡ que pero de preferencia germen de grano aprobado para utilizarse en alimento para animales, tal como el germen de maíz que se obtiene en un proceso de molienda húmeda o seca. El germen de grano de preferencia comprende germen gastado, el cual es germen de grano a partir del cual se ha extraído el aceite, tal como mediante presión o extracción con hexano u otro solvente. De una manera alternativa, elj germen de grano se extrae con el exprimidor, es decir, se remueve el aceite mediante presión.

La matriz de suministro de enzimas de la invención está en la forma de partículas, grumos, o granulos plurales separados.

"Granulos" significa las partículas que se comprimen o compactan, tal como mediante una granulación, extrusión, o compactación similar para remover el agua de la matriz. Esta compresión o compactación de las partículas también promueve la cohesión I intra-partículas . Por ejemplo, los granulos se pueden preparar mediante la granulación del j sustrato basado en granos en, un molino de gránulos . Los gránulos preparados mediante lo mismo, se muelen o se trituran hasta ^_in tamaño de gránulos adecuado para utilizarse como un adyuvante en alimento para animales. Debido a que la matriz está por sí jmisma aprobada para utilizarse; en alimento para animales, se puede utilizar como un diluyente para el suministro de enzimas en un alimento para animales.

De preferencia, la matriz de suministro de enzimas está i en la forma de gránulos que 'tienen un tamaño de gránulo en un intervalo de aproximadamente malla 4 a aproximadamente malla 400 i (USS) ; de una manera más preférible, de aproximadamente malla 8 i a aproximadamente malla 80; y muy preferiblemente de aproximadamente malla 14 a aproximadamente malla 20. Si el germen i de grano se gasta por medio de¡ extracción con solvente, puede ser necesario el uso de un agente! de lubricidad, tal como aceite1 de i maíz, en el granulador, pero este agente de lubricidad ordinariamente no es necesario si el germen se extrae con el exprimidor. En otros aspectos de la invención, la matriz se prepara mediante otros procesos de compactación o compresión, tales como, por ejemplo, mediante extrusión del sustrato basado j en granos a través de un troquel, y la molienda del extrudido I hasta un tamaño de gránulo adecuado.

La matriz de suministro de enzimas puede incluir además i ; un componente de polisacárido como un agente de cohesión para mejorar la cohesión de los gr'ánulos de la matriz. Se cree qué el agente de cohesión proporciona grupos hidroxilo adicionales, los cuales mejoran el enlace ent're las proteínas de granos adentro del gránulo de la matriz, i Además, se cree que los grupos hidroxilo adicionales funcionan así al mejorar el enlacé de hidrógeno de las proteínas con el almidón o con otras proteínas . El agente de cohesión puede estar presente en cualquier cantidad adecuada para mejorar la cohesión de los granulos de la matriz de suministro de enzimas. Los agentes de cohesión adecuados incluyen una o más de dextjrinas , maltodextrinas , almidones,, tales como almidón de maíz, harinas, celulósicos, tiemi- celulósicos, y similares. Por ejemplo, el porcentaje de germen de grano y agente de cohesión en la matriz (sin incluir la enzima) es del 78 por ciento de harina de germen de maíz y del 20 por ciento en peso de almidón de maíz.

Debido a que la matriz liberadora de enzimas de la invención se hace de materiales biodegradables , la matriz puede estar sujeta a deterioro, tal como mediante formación de moho. Con el fin de prevenir o inhibir esta formación de moho, la matriz puede incluir un inhibidor de moho, tal como una sal de propionato, que puede estár presente en cualquier cantidad i suficiente para inhibir laj formación de moho de la matriz liberadora de enzimas, proporcionando de esta manera una matriz de suministro en una formulación estable que no requiere refrigeración .

La enzima xilanasa Icontenida en la matriz de suministro i de enzimas y métodos de la invención, de preferencia es una xilanasa termo-estable, como se describe en la presente, para resistir a la inactivación dé la xilanasa durante la fabricación, ! en donde se pueden emplear temperaturas elevadas y/o vapor para preparar la matriz de suministro de enzimas granulada. Durante la digestión del alimento que contiene a la matriz de suministro de enzimas de la invención, los fluidos digestivos acuosos provocarán la liberación de lia enzima activa. También se pueden incorporar en la matriz de 'suministro, otros tipos de enzimas termo-estables y complementos nutritivos que sean termo-estables, para liberarse bajo cualquier tipo de condiciones acuosas.

Se puede aplicar un recubrimiento a las partículas de la matriz de enzimas de la invención para muchos propósitos diferentes, tales como para agregar un sabor o un complemento nutritivo al alimento para animales, con el fin de demorar la liberación de los complementos del alimento para animales y enzimas en las condicionejs gástricas, y similares. 0 el recubrimiento se puede aplicar para alcanzar una meta funcional, i por ejemplo, si es deseable hacer más lenta la liberación de la enzima desde las partículas de la matriz, o controlar | las condiciones bajo las cuales se liberará la enzima. La composición i del material de recubrimiento puede ser tal que se descomponga selectivamente mediante un ágente al cual sea susceptible (tal como calor, ácido o base, enzimas, u otros productos químicos) . De una manera alternativa, sé pueden aplicar a las partículas de la matriz, dos o más recubrimientos consecutivos susceptibles a diferentes agentes de descomposición.

La invención también se refiere a un proceso para la preparación de una matriz liberadora de enzimas. De conformidad con la invención, el procesó comprende proporcionar partículas plurales separadas de un susjtrato basado en granos en un tamaño i de partículas adecuado para utilizarse como una matriz liberadora i ! de enzimas, en donde las partículas comprenden una enzima i xilanasa codificada por una secuencia de aminoácidos de, las secuencias de aminoácidos j del Grupo B o cuando menos 30 entonces se desmoronan en un desmoronador del molino de granulación, para proporcionar partículas plurales separadas que tengan un tamaño de partícula jcapaz de pasar a través de un tamiz de malla 8, pero que se retengan sobre un tamiz de malla 20.

Las xilanasas termo-estables de la invención se pueden utilizar en los granulos de j la invención. Pueden tener al£as temperaturas óptimas y una alta resistencia al calor, de tal i manera que se puede lograr una reacción enzimática a una temperatura no llevada a cabo hasta ahora. El gen que codifica la xilanasa de acuerdo con la. presente invención (por ejemplo, I 1 j como se estipula en cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo A) se pujede utilizar en la preparación de xilanasas (por ejemplo, emplejando GSSM®, como se describe en la presente) que tengan características diferentes de aquéllas de i I las xilanasas de las secuencias de aminoácidos del Grupo B (en términos de pH óptimo, temperatura óptima, resistencia al calor, I estabilidad a los solventes, actividad específica, afinidad con el sustrato, capacidad de 'secreción, índice de traducción, control de transcripción, y similares) . Además, se puede emplear un polinucleótido de las secuencias de ácidos nucleicos del Grupo I i I A para rastrear xilanasas variantes preparadas mediante los métodos descritos en la presiente, para determinar aquéllas ¡que tengan una actividad deseada, tal como una termo-estabilidad o termo-tolerancia mejorada o modificada. Por ejemplo, la patente US 5,830,732, describe un ensayo de rastreo para determinar la termo-tolerancia de una xilaiaasa.

Tratamiento de desechos Las xilanasas de lá invención se pueden utilizar en una I I variedad de otras aplicaciones industriales, por ejemplo, en el tratamiento de desechos. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un proceso de digestión de desechos sólidos utilizando las xilanasas de la invención. Los métodos pueden i : . comprender reducir la amasa y el volumen del desecho solido sustancialmente no tratado. El desecho sólido se puede tratar! con un proceso digestivo enzimático en la presencia de una solución enzimática (incluyendo las xilanasas de la invención) a < una temperatura controlada. Esto da como resultado una reacción sin una fermentación bacteriana apreciable de los microorganismos agregados . El desecho sólido se convierte en un desecho licuado y cualquier desecho sólido residual. El desecho lic ado resultante se puede separar de cualquier desecho solidificado residual. Ver, por ejemplo, !la patente US 5,709,796. ; I ; Productos para el cuidado oral < La invención propoirciona un producto para el cuidado oral, el cual comprende las xilanasas de la invención. ! Los productos para el cuidado oral de ejemplo incluyen pastas de i ; dientes, cremas dentales, geljes o polvos para dientes, odónticos, enjuagues bucales, formuljaciones de enjuague previas o i I posteriores al cepillado, gomas de mascar, grageas, o dulces.

Ver, por ejemplo, la patente US 6,264,925 Fabricación de cerveza y fermentación La invención proporciona métodos para fabricar (por ejemplo, fermentar) cerveza, los cuales comprenden las xilanasas de la invención. En un proceso de ejemplo, la materia prima que I ¡ contiene almidón se desintegra y se procesa para formar .una malta. Se utiliza una xilanasa de la invención en cualquier punto del proceso de fermentación. Por ejemplo, las xilanasas de la invención se pueden utilizar en el procesamiento de malta de cebada. La materia prima principal de la fabricación de cerveza es la malta de cebada. Éste puede ser un proceso de tres etapas.

Primero, se puede impregnar el grano de cebada para incrementar el contenido de agua, por ejemplo, hasta alrededor de aproximadamente el 40 por ciento. Segundo, se puede germinar el grano mediante incubación dé 15°C a 25°C durante 3 a 6 días, cuando se estimule la síntesis de la enzima bajo el control de giberelinas. En un aspecto, ¡las xilanasas de la invención se agregan en esta (o cualquier otra) etapa del proceso. Las xilanasas de la invención se pueden utilizar en cualquier proceso de producción de cerveza oj de bebidas alcohólicas, como, se describe, por ejemplo, en las patentes US 5,762,991; 5,536,650; I 5,405,624; 5,021,246; 4,788,066.

En un aspecto, se utiliza una enzima de la invención para mejorar la posibilidad de filtración y la viscosidad ¡del i ; mosto, y para obtener una hidrólisis más completa de los componentes del endosperma. El uso de una enzima de la invención I , I también aumentaría el rendimiento del extracto. El proceso de la fabricación de cerveza involucra la germinación del grano de I ' ! cebada (malta) , seguida por la extracción y la descomposición de los carbohidratos almacenados, para dar azúcares simples, los cuales son utilizados por la levadura para la fermentación alcohólica. La descomposición eficiente de las reservas de carbohidratos presentes en el! endosperma de la cebada y en los auxiliares de la fabricación d¡e cerveza, requiere de la actividad de varias enzimas diferentes. j En un aspecto, una enzima de la invención tiene actividad en un pH ligeramente ácido (por ejemplo, de 5.5 a 6.0) en, por ejemplo, el intervalo! de temperatura de 40°C a 70°C;!y, en un aspecto, con inactivación a 95°C. La actividad bajo estas condiciones sería óptima, pero no son un requerimiento esencial para la eficacia. En un aspecto, una enzima de la invención tiene actividad entre 40°C y 75°C, y un pH de 5.5 a 6.0; es estable a 70°C durante cuando menos 50 minutos, y, en un aspecto, > se inactiva de 96°C a 100°C. Las j enzimas de la invención se pueden utilizar con otras enzimas, por ejemplo, beta-1, 4-endoglucanasas I , y amilasas. ! Aplicaciones médicas y de investigación Las xilanasas de laj invención se pueden utilizar como agentes anti-microbianos debido a sus propiedades ¡ bacteriolíticas . Las xilanasas1 de la invención se pueden utilizar para eliminar o proteger a los animales de las salmonelas, como i i se describe, por ejemplo, enj las publicaciones internacionales WO 00/49890 y WO 99/03497.

Otras aplicaciones industriales Las xilanasas de| la invención, incluyendo las secuencias de aminoácidos del| Grupo B, se pueden utilizar en una i amplia variedad de aplicaciones en alimentos, comida para animales, y bebidas. Las nuevas xilanasas se descubren mediante el rastreo de las bibliotecas 'existentes y las bibliotecas de ADN construidas a partir de diversas localizaciones mesófilas y moderadamente termófilas, así como a partir de las fuentes objetivas, incluyendo la florá digestiva, los microorganismos de los desechos animales, las bacterias del suelo, y los hábitats altamente alcalinos. Tambiénjson útiles las bio-trampas y las estrategias de enriquecimiento primario utilizando sustratos de arabinoxilano y/o las fracciones de polisacáridos no solubles del material alimenticio para animales. 1 En el descubrimiento de las xilanasas novedosas, se utilizan dos formatos de rastreo (basado en la actividad y basado i ; en la secuencia) . El planteamiento basado en la actividad es el rastreo directo de la actividad de xilanasa en platos de agar utilizando un sustrato tal como AZO-xilano (Megazyme) . De una manera alternativa, se puede emplear el planteamiento basado; en la secuencia, el cual se apoya en la bio- informática y en la i : biología molecular para diseñar sondas para hibridación y bio-paneo. Ver, por ejemplo, las ¡patentes US 6,054,267; 6,030,779; 6,368,798; 6,344,328. Los impjactos del rastreo se purifican, se secuencian, se caracterizan! (por ejemplo, determinación de I : especificidad, temperatura y pH óptimos) , se analizan empleando bio- informática, se sub-cl¡onan y se expresan para t la caracterización bioquímica básica. Estos métodos se pueden emplear en el rastreo de xilánasas útiles en una gran cantidad de aplicaciones, incluyendo el acondicionamiento de masa, y como i ; enzimas aditivas de alimento para animales.

En la caracterización de las enzimas obtenidas del i rastreo, se puede evaluar la utilidad de ejemplo en el procesamiento de masa y en las aplicaciones de repostería. La caracterización puede inclui , por ejemplo, la medición de la especificidad del sustrato (xilano, arabinoxilano, CMC, BBG) , la estabilidad a la temperatura y al pH, y la actividad específica. Se , puede utilizar una enzima comercial como un control. En un I ! aspecto, las enzimas de la' invención tienen una actividad significativa a un pH > 7 y á 25-35°C, son inactivas en xilano insoluble, son estables y activas en sacarosa al 50-67 por i ciento. I En otro aspecto, se puede evaluar la utilidad como j ! aditivos de alimentos a partir de la caracterización de las enzimas candidatas . La caracterización puede incluir, por ejemplo, la medición de la especificidad del sustrato (xilano, I : arabinoxilano, CMC, BBG), la 'estabilidad a la temperatura y al pH, la actividad específica, ¡y la estabilidad gástrica. En . un aspecto, el alimento se diseña para un animal monogastrico, y en i otro aspecto, el alimento se diseña para un animal rumiante. En un aspecto, las enzimas de ía invención tienen una actividad significativa a un pH de 2 a 4 , y de 35°C a 40°C, una vida media mayor a 30 minutos en el fluido gástrico, una vida media de la formulación (en regulador o en células) mayor a 5 minutos a 85°C, y se utilizan como un aditivo de alimento para animales monogástricos . En otro aspecto, las enzimas de la invención tienen una o más de las siguientes características: una actividad significativa a un pH de 6.5 a 7.0, y de 35°C a 40°C, una vida media mayor a 30 minutos en el fluido del rumen, una estabilidad de la formulación tan estable como un polvo seco, y se utilizan como un aditivo de alimento para animales rumiantes. i ¦ Las enzimas son reactivas hacia un amplio rango¦ de sustratos naturales y no naturales, haciendo posible de esta manera la modificación de virtualmente cualquier compuesto de plomo orgánico. Más aún, a ¡ diferencia de los catalizadores químicos tradicionales, las enzimas son altamente enantio- y regio-selectivas . El alto gra¡do de especificidad de los grupos funcionales exhibido por las lenzimas, hace posible mantener la ! i pista de cada reacción en una secuencia sintética que conduzca a un nuevo compuesto activo. Las enzimas también son capaces de catalizar muchas reacciones diversas no relacionadas con , su ? ! función fisiológica en la naturaleza. Por ejemplo, las peroxidasas catalizan la oxidación de los fenoles mediante peróxido de hidrógeno. Las ¡peroxidasas también catalizan las reacciones de hidroxilación que no están relacionadas con la función nativa de la enzima. Otros ejemplos son las xilanasas, las cuales catalizan la descomposición de los polipéptidos . En una solución orgánica, algunas xilanasas también pueden acilar azúcares, una función no relacionada con la función nativa de estas enzimas. j i La presente invención explota las propiedades ¡ I catalíticas únicas de las j enzimas. Aunque el uso de ¿io-catalizadores (es decir, enzjimas purificadas o crudas, células no vivas o vivas) en las transformaciones químicas normalmente requiere de la identificación de un bio-catalizador particular j que reaccione con un compuesto de partida específico, la presente invención utiliza bio-catalizadores y condiciones de reacción i seleccionados que son específicos para los grupos funcionales que están presentes en muchos compuestos de partida. Cada bio-catalizador es específico para un grupo funcional, o para varios grupos funcionales relacionados, y puede reaccionar con muchos compuestos de partida que contengan este grupo funcional. Las reacciones bio-catalíticas producen una población de derivados de un solo compuesto de partida. Estos derivados se pueden someter a otra ronda de reacciones bio-catalíticas para producir i ! una segunda población de compuestos derivados. Se pueden producir miles de variaciones del compuesto original con cada iteración i de derivación bio-catalíticai Las enzimas reaccionan en sitios específicos de: un compuesto de partida sin afectar al resto de la molécula, un í ; proceso que es muy difícil ¡ de lograr empleando los métodos químicos tradicionales. Este | alto grado de especificidad bio-catalítica proporciona el medio para identificar un solo I compuesto activo dentro de la biblioteca. La biblioteca se caracteriza por la serie de reacciones bio-catalíticas empleadas para producirla, una denominada "historia bio-sintética" .1 El rastreo de la biblioteca para determinar las actividades i biológicas y rastrear la historia bio-sintética identifica la secuencia de reacción específica que produce el compuesto activo.

I i La secuencia de reacción se repite, y se determina la estructura del compuesto sintetizado. Este modo de identificación, a diferencia de otros planteamientos de síntesis y rastreo, no requiere de tecnologías de inmovilización, y los compuestos se j pueden sintetizar y probar libres en solución empleando virtualmente cualquier tipo de ensayo de rastreo. Es importante observar que el alto grado de especificidad de las reacciones enzimáticas sobre los grupos funcionales, permite el "rastreo" i de las reacciones enzimáticas específicas que forman la biblioteca bio-catalíticamente producida.

Muchos de los pasos ¡del procedimiento se llevan a cabo empleando automatización robótica, que hace posible la ejecución ! : de muchos miles de reacciones bio-catalíticas y ensayos de rastreo al día, así como se asegura un alto nivel de precisión y reproducibilidad. Como un ; resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en materia de semanas, lo cual tomaría años para producirse empleando los métodos químicos actuales. (Para otras enseñanzas sobre la modificación de moléculas, incluyendo moléculas pequeñas, ver la publicación internacional PCT/US94/0917 ) .

La invención se ' describirá adicionalmente con referencia a los siguientesj ejemplos; sin embargo, se debe entender que la invención no está limitada a tales ejemplos., ! i EJEMPLOS I EJEMPLO 1; DESCUBRIMIENTO DE LA ENZIMA ENDOGLICOSIDASA BASADA EN PLATO: RASTREO DE EXPRESIÓN. ! 1 Determinación de titulación de la Biblioteca Lambda: i Se agrega 1.0 microlitro del suministro de la biblioteca I 1 amplificada Lambda Zap Express a 600 microlitros de células MRF1 i I de E. coli (OD600 = 1.0 ) . Se 1 diluye el suministro de MRF ' con MgS04 10 mM. Se incuba la mezcla a 37°C durante 15 minutos^ y luego se transfiere la suspensión a 5-6 mi de agar superior NZY a 50°C, y se mezcla suavemente. Inmediatamente se vierte solución de agar sobre un plato de medio NZY grande (150 mm) , y se permite que el agar superior I se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos) . j Se invierte el plato. Se incuba el plato a 39°C durante 8 a 12 choras. (Se aproxima el número de I placas. Se determina la titulación de fagos para dar 50,000 unidades formadoras de placas/plato. Se diluye una alícuota del fago de la Biblioteca con regulador SM si es necesario) .

Rastreo del sustrato: Se agrega Lambda Zap Express (50,000 unidades formadoras de placas) a partir de la biblioteca ? amplificada, a 600 microlitrds de células MRF 1 de E. coli (OD600 = 1.0) y se incuba a 37°C durante 15 minutos. Mientras se está ? incubando la suspensión de fagos/células, se agrega 1.0 mi del sustrato marcado con tinte del polisacárido deseado (usualmente del 1 al 2 por ciento en pesojvolumen) a 5.0 mi de agar superior NZY a 50°C, y se mezcla completamente. (La solución se mantiene a 50°C hasta que se necesite) . Se transfiere la suspensión i celular a la solución de sustrato/agar superior, y se mezcla suavemente. Inmediatamente sel vierte sobre un plato de medio NZY grande (150 mm) . Se permite que el agar superior se solidifique I completamente (aproximadamente 30 minutos) , luego se invierte el plato. Se incuba el plato a 39°C durante 8 a 12 horas. Se observa I el plato para determinar zonas' aclaradas (halos) alrededor de las placas . Las placas de núcleo con halos fuera del agar ¡ se transfieren a un micro- tubo estéril. (Funciona bien una punta de pipeta de 200 microlitros de agujero grande para remover el tapón de agar (núcleo) que contiene la placa deseada) . Se vuelven a suspender los fagos en 500 ! microlitros de regulador SM. ¡ Se agregan 20 microlitros de cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional,.

Aislamiento de los clones puros: Se agregan 5 micro-litros de suspensión de fagos re -suspendidos a 500 microlitros de células MRF 1 de E. 1.0). Se incuban a 37°C durante 15 minutos. Mientras ! se está incubando la suspensión de fagos/células, se agregan 600 microlitros del sustrato marcado I i con tinte del polisacárido deseado (usualmente del 1 al 2 por ciento en peso/volumen) a 3. Ó mi de agar superior NZY a 50°C, y se mezcla completamente. (La, solución se mantiene a 50°C hasta que se necesite) . Se transfiere la suspensión celular a la solución de sustrato/agar superior, y se mezcla suavemente. Inmediatamente se vierte sobre un plato de medio NZY pequeño (90 mm) , y se permite que el agar superior se solidifique completamente (aproximadamente 30 minutos) , luego se invierte el plato. Se incuba el plato a 39°C durante 8 a 12 horas. Se observa el plato para determinar una| zona aclarada (halo) alrededor de una sola placa (clon puro) . ' (Si no se puede aislar una sola placa, se ajusta la titulación y se vuelve a poner en plato la suspensión de fagos) . Se vuelven a suspender los fagos en 500 microlitros de regulador SM,: y se agregan 20 microlitros1 de j Cloroformo para inhibir cualquier crecimiento celular adicional. i í Excisión del clon puro: Se permite que se incube la í : suspensión de fagos puros a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas o durante la noche a 4 C. Se agregan 100 microlitros de la suspensión de fagos puros a 200 microlitros de células MRF' de E. coli (OD600 = 1.0) . Se agrega 1.0 microlitro del fago auxiliar ExAssist (>1 x 106 unidades formadoras de placas/ml; Stratagene) . Se incuba la suspensión a 37°C durante 15 minutos. Se agregan 3.0 ? ral de un medio 2 x YT a la suspensión celular. Se incuba a 3'7°C durante 2 a 2.5 horas con agitación. Se transfiere al tubo a 70°C í durante 20 minutos. Se transfieren de 50 a 100 microlitros de la suspensión de fagémidos a un micro-tubo que contiene 200 microlitros de células Exp 505 de E. coli (OD600 = 1.0 ) . Se incuba la suspensión a 37°C durante 45 minutos. Se ponen en el plato 100 microlitros de suspensión celular sobre un medio LBkan (medio: LB con 50 microgramos/ml de canamicina) . Se incuba el plato a 37°C durante 8 a 12 horas . Se observa el plato para determinar las colonias. Cualesquiera colonias que crezcan contienen al fagémido puro. Se recoge una colonia y se cultiva en un pequeño cultivo líquido (de 3 a 10 mi) durante 8 a 12 horas. El medio de cultivo es LBkan 50 líquido.

Verificación de la actividad: Se transfiere 1.0 mi de I cultivo líquido a un micro-tubo estéril. Se centrifuga a 13,200 revoluciones por minuto (16,00j0 g's) durante 1 minuto. Se dese ha el sobrenadante, y se agregan 200 microlitros de regulador de fosfato, pH de 6.2. Se sónica durante 5 a 10 segundos sobre hielo i i utilizando una micro-punta, j Se agregan 200 microlitros del sustrato apropiado, se mezclan suavemente, y se incuban a 37°C durante 1.5 a 2 horas. También se debe ejecutar un control negativo que contenga solamente el regulador y el sustrato. Se agrega 1.0 mi de etanol absoluto (prueba 200) a la suspensión, y se mezcla. Se centrifuga a 13,200 revoluciones por minuto durante 10 minutos. Se obserya el sobrenadante para determinar el color. La cantidad de1 coloración puede variar, pero cualesquiera tubos con másj coloración que el control se consideran positivos para la actividad. Se puede utilizar un I : espectrofotómetro para este paso si así se desea o se necesita. (Para Azo-xilano, Megazyme, l^er a 590 nanómetros) .

RFLP de clones puros de las mismas Bibliotecas: Se transfiere 1.0 mi de cultivo líquido a un micro-tubo estéril. Se centrifuga a 13,200 revoluciones por minuto (16,000 g's) durante 1 minuto. Se sigue el jprotocolo del mini-estuche de centrifugación QIAprep (Qiagen) para el aislamiento de plásmidos, y se utilizan 40 microlitros ¡de agua pura como el regulador de elución. Se transfieren 10 microlitros de ADN del plásmido a un micro-tubo estéril. Se agregan 1.5 microlitros del Regulador 3 (New England Biolabs) , 1.5 microlitros de solución 100X BSA (New i England Biolabs) y 2.0 microlijtros de agua pura. A esto se agrega 1.0 microlitro de Not 1 y 1J0 microlitro de endonucleasas.de I ¦ restricción Pst 1 (New England Biolabs). Se incuba durante 1.5 horas a 37°C. Se agregan 3.0 microlitros de regulador de Carga 6X (Invitrogen) . Se pasan 15 microlitros de la muestra digerida sobre un gel de agarosa al 1.0 por ciento durante 1 a 1.5 horas a 120 voltios. Se ve el gel con un formador de imágenes en gel. Se realiza el análisis de secuencia sobre todos los clones con un patrón de digestión diferente.

La Tabla 6 describe diferentes propiedades de las enzimas de ejemplo de la invención. i Tabla 6 SEQ ID NO: Topt* Tstab** Phopt* Actividades pl M„ Notas significativas 151, 152 50°C < 1 min a 65°C 5 .5 -9. 0 AZO-xilano 5 .7 40 .2 155, 156 50°C < 1 min a 65°C 5 .5 -8. 0 AZO-xilano 8 .8 62 .7 169, 170 50°C > 1 min a 65°C; 7 .0 AZO-xilano 8 .7 36 .7 < 1 min a 85°C ~195~~196 50°C >G mirf a "65°C< o~ m"iñ 5 G5 --~" AZO-xilano —-8" ".-5 36 .-7 < 1 min a 85°C 215, 216 85°C < 3 min a 85°C 5 .5 -8. 0 AZO-xilano 8 .6 34 .8 47,48 50°C < 0.5 min a 65°C; 7 .0 -8. 0 AZO-xilano 6 .2 40 .3 < 1 min a 85°C 191, 192 385°C > 30 seg a 85°C 5 .5 AZO-xilano 7 .8 34 .6 247, 248 50°C < 1 min a 65°C 8 .0 AZO-xilano 9 .4 43 .5 7,8 50°C >1 min 85°C<5 min 5 .5 AZO-xilano 4 .5 55 .3 221, 222 50-65°C < 1 min a 75°C 5 .5 AZO-xilano 8 .3 34 .6 163, 164 65°C < 1 min a 65°C 7 .0 AZO-xilano 6 .3 36 .0 19, 20 37°C < 5 min a 50°C 7 .0 -8. 0 AZO-xilano 9 .2 41 .5 87, 88 37-50°C < 1 min a 85°C 8 .0 AZO-xilano 5 .2 36 .7 81,82 50°C < 1 min a 65°C 7 .0 -9. 0 AZO-xilano 5 .3 _ 38 .8 91, 92 50°C < 1 min a 65°C 7 - 8 AZO-xilano, AZO- 5.4 39.0 CMC 61, 62 37°C < 5 min a 50°C 7 .0 -9. 0 AZO-xilano, AZO- 5. 4 40 CMC 159, 160 85°C 30 seg a 85°C 5 .5 AZO-xilano 8. 3 34. 5 233, 234 50°C >30 seg<l min a 65°C; 7 .0 AZO-xilano 8. 5 35. 1 < 1 min a 85°C 203 , 204 50-65°C >1 . min a 65°C<5 min, 5 .5 AZO-xilano 9. 5 21. 7 < 1 min a 85°C 181, 182 385°C > 1 min a 85°C 5 .5 -8. 0 AZO-xilano 8. 8 35. 5 227-,-228 - 65-G-- >1-min a—85°C<5-min -5-.-5 -7--0-- . AZO^xilano_ _7_. 8 25. 8 45,46 345°C 35 min a 45°C, > 5 .5 AZO-xilano 6. 7 40. 4 < 0.5 min a 55°C 231, 232 65°C > 10 min a 50°C 5 .5 -7. 0 AZO-xilano 8. 4 31. 4 129, 130 65°C < 1 min a 75°C 5 .5 AZO-xilano 5. 1 116 93, 94 50°C < 1 min a 60°C 8 .0 -9. 0 AZO-xilano 5. 3 39. 1 189, 190 65°C < 1 min a 65°C 5 .5 AZO-xilano 9. 2 20. 3 49, 50 70°C < 20 min a 70°C > 5 AZO-xilano 5. 7 38. 9 85, 86 50°C > 5 min a 85°C 5 .5 -7. 0 AZO-xilano 6. 1 48. 4 99, 100 50°C 1 min a 75°C 5 .5 -8. 0 AZO-xilano 10 > .8 36. 6 123 , 124 385°C < 30 seg a 100°C 5 .5 -7. 0 AZO-xilano 6. 1 44. 1 249, 250 45°C. >1 min 75°C<10 min 5 .5 AZO-xilano 5. 3 93 167, 168 85°C < 5 min a 85°C 5.5 AZO-xilano 9.5 21.7 207, 208 75°C < 5 min a 65°C 5 .5 AZO-xilano 9 .1 20 .4 251, 252 65-75°C < 1 min a 85°C 5 .5 AZO-xilano 8 .8 20 .4 11, 12 < 90°C < 40 min a 70°C > 6 AZO-xilano 6 .8 43 .9 177, 178 65°C < 1 min a 75°C 5 .5 AZO-xilano 8 .7 44 .6 9, 10 50°C < 1 min a 65°C 5.5 -7.0 AZO-xilano 4 .9 46 .1 43,44 37°C inestable 5.5 -7.0 AZO-xilano 4 .9 39 .1 113 , 114 65-75°C < 1 min a 75°C 5.5 -8.0 AZO-xilano 5 41 .2 -7-5 , 76 50°C < 1 min-a-85°C - _7.0 --9-..0- AZO-xilano^ ^_4_ .JZ __3_9_ ._4 111, 112 37°C > 10 min a 50°C 7 - 8 AZO-xilano 5 .6 41 .0 117, 118 37°C inestable 7 - 8 AZO-xilano 9 .1 53 .3 115, 116 - - - - - - AZO-xilano 8 .9 50 .8 125, 126 37°C - - 8 .0 AZO-xilano 5 .3 41 .1 137, 138 50°C < 30 seg a 65°C 5 .5 AZO-xilano 5 .7 38 .5 69, 70 385°C < 5 min a 85°C 5.5 -9.0 AZO-xilano 6 .4 58 .0 205,206 50°C < 1 min a 65°C 5.5 -8 AZO-xilano 4 .3 35 .1 211, 212 50°C < 1 min a 65°C 5 .5 AZO-xilano 4 .4 35 .4 197, 198 65°C < 1 min a 65°C 5 .5 AZO-xilano 8 .8 20 .1 31,32 37°C inestable 7 .0 AZO-xilano 5 .1 54 .4 13, 14 50°C < 1 min a 65°C 7 AZO-xilano 5 .5 40 .0 65, 66 50°C < 1 min a 65°C 5 .5 AZO-xilano, AZO- 4 .8 55 .5 CMC 257, 258 37°C inestable 5. 5 AZO-xilano, AZO- 5 .3 100. ; cebada ß-glucano, AZO-CMC 57, 58 50 °C < 1 min a 65°C 7. 0 AZO-xilano 4 .8 56.7 185, 186 50 -75°C < 1 min a 80°C 5. 5 AZO-xilano 8 .8 23.2 243, 244 75 °C > 0 .5 min @ 85° C 5. 5 AZO-xilano 8 .8 44.4 77, 78 50 °C < 5 min a 65°C, 5. 5 AZO-xilano 5 .3 44.5 < 1 min a 85°C -2-2-9—2-3-0 -—3-7 -°C -330 -min-a— 55°C, 5-. -5- AZO-xilano 8_ .7_ 2.0_..6- < 5. min a 75°C 109, 110 65 °C > 0 .5 min @ 75° C 5. 5 AZO-xilano 4 .9 45.2 193 , 194 65 °C < 1 min a 75°C 5. 5 AZO-xilano 5 .4 29.1 173, 174 65 °C < 1 min a 80°C 7. 0 AZO-xilano 7 .6 51.6 59,60 37 °C < 1 min a 65°C 7. 0 AZO-xilano 6 .6 42.5 101, 102 50 °C > 0 .5 min @ 65° C 7. 0 AZO-xilano 8 .7 41.1 55,56 37 °C > 5 min a 50°C; 7. 0 AZO-xilano 6 .5 41.8 < 1 min a 85°C 15, 16 50 °C < 1 min a 65°C 7. 0 AZO-xilano 6 .4 40.2 131, 132 - - - - - - AZO-xilano 5 .6 42.1 145, 146 65 -85°C < 1 min a 85°C 5. 5 AZO-xilano 5 .2 43.7 219, 220 - - - - ' 5. 5 AZO-xilano 6 .6 34.5 253,254 65°C > 0.5 min a 85°C 5.5-7 AZO-xilano 7.8 34.6 255,256 65°C >1 min 65°C<3 min 5.5-7.0 AZO-xilano 8.3 35.0 * pH o temperatura óptimas determinadas por los índices iniciales, utilizando A AZO-xilano como un sustrato.

** Estabilidad térmica, tiempo en el que la enzima retuvo una activi significativa (aproximadamente > 50 por ciento) .

*** Acondicionamiento de la masa.

**** GSSM® progenitor para la evolución de tolerancia térmica para aplicaciones alimentos para animales.

***** Mutación N35D hecha para incrementar la actividad relativa de la enzima muta con actividad a un bajo pH - basándose en el conocimiento público -, a un pH d significativamente incrementado.

****** Acondicionamiento de la masa.

EJEMPLO 2; RASTREO GSSM® PARA MUTANTES TÉRMICAMENTE TOLERANTES El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para rastrear enzimas térmicamente tolerantes.

Placas Maestras: Se preparan placas para un recogedor de colonias mediante la marca de placas de 96 pozos, y aplicando alícuotas de 200 microlitros de LB Amp 100 en cada pozo. (Se necesitan aproximadamente 20 mi por placa de 96 pozos) . Después de que se regresan las placas del recogedor, se remueve el medio de la fila 6 de la placa A. Se reemplaza con una inoculación de la SEQ ID NO: 189. Se coloca en una incubadora humidificada a 37°C durante la noche.

Placas de Ensayo : Se prenden cultivos en una placa fresca de 96 pozos (200 microlitros/pozo LB Amp 100) . Se remueve la cubierta de plástico y se reemplaza con un Sello Permeable al Gas. Se coloca en una incubadora humidificada durante la noche.

Se remueve el sello y se vuelve a colocar la tapa de plástico. Se centrifugan los cultivos en un centrífugo de mesa a 3,000 revoluciones por minuto durante 10 minutos. Se remueve el sobrenadante mediante inversión sobre una toalla de papel. Se ponen alícuotas de 45 microlitros de regulador Cit-Phos-KCl , pH de 6 , en cada pozo. Se vuelve a colocar la tapa de plástico con un sello de placa de aluminio. Se utiliza un rodillo para obtener un buen sello. Se vuelven a suspender las células en un agitador de placas en un nivel de 6 a 7 durante aproximadamente 30 segundos .

Se coloca la placa de 96 pozos en una incubadora a 80°C durante 20 minutos. No se apila. Después, se remueven inmediatamente las placas al agua helada para enfriarse durante unos cuantos minutos . Se remueve el sello de aluminio y se reemplaza con una tapa de plástico. Se agregan 30 microlitros de Azo-xilano al 2 por ciento. Se mezcla como antes sobre el agitador de placas. Se incuba a 37°C en una incubadora humidificada durante la noche.

Se agregan 200 microlitros de etanol a cada pozo, y se pasan por pipeta hacia arriba y hacia abajo un par de veces para mezclarse. Como una alternativa a cambiar las puntas cada vez, se enjuaga en un lavado de etanol, y se seca exprimiendo en; una toalla de papel. Se centrifugan las placas a 3,000 revoluciones i por minuto durante 10 minutos. Se remueven 100 microlitros del sobrenadante hacia una placa fresca de 96 pozos. Se lee la OD590.

EJEMPLO 3: ENSAYO DE GSSM® PARA LA VERIFICACIÓN DE IMPACTO DE MOTANTES TÉRMICAMENTE TOLERANTES.

El siguiente ejemplo describe un método de ejemplo para ensayar las enzimas térmicamente tolerantes.

Se prenden o se recogen clones en placas de 96 pozos duplicadas (200 microlitros/pozo LB Amp 100) . Se remueve la cubierta de plástico y se reemplaza con un Sello Permeable al Gas. Se coloca en una incubadora humidificada durante la noche. Se remueve el sello y se reemplaza con una tapa de plástico. Se prenden los clones en agar sólido. Se centrifugan los cultivos en un centrífugo de mesa a 3,000 revoluciones por minuto durante 10 minutos. Se remueve el sobrenadante mediante inversión sobre una toalla de papel. Se sacan alícuotas de 25 microlitros de solución de BPER/Lisozima/ADNsa (ver más adelante) en cada pozo. Se vuelven a suspender las células en un agitador de placas en un nivel de 6 a 7 durante aproximadamente 30 segundos.

Se incuba la placa sobre hielo durante 15 minutos. Se agregan 20 microlitros de regulador Cit-Phos-KCl , pH de 6, en cada pozo. Se vuelve a colocar la tapa de plástico con un sello de placa de aluminio. Se utiliza un rodillo para obtener un buen sello. Se mezcla sobre un agitador de placas en un nivel de' 6 a 7 durante aproximadamente 30 segundos.

Se coloca una placa de 96 pozos en una incubadora a 80°C durante 20 minutos, y la otra a 37°C. No se apilanJ Se remueven inmediatamente las placas a hielo acuoso para enfriar i durante unos cuantos minutos (se utiliza una charola de plástico grande si es necesaria) . Se remueve el sello de aluminio;. Se agregan 30 microlitros de Azo-xilano al 2 por ciento. Se sella con un sello de plástico permeable al gas. Se mezcla como antes sobre el agitador de placas. Se incuba un juego de placas a 37°C y a 80°C en una incubadora humidificada a 37°C durante 2 horas, y el otro juego durante 4 horas.

Después de la incubación, se deja asentar la placa durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente . Se agregan 200 microlitros de etanol a cada pozo, y se pasan por pipeta hacia arriba y hacia abajo un par de veces para mezclarse. En lugar de cambiar las puntas cada vez, se enjuagan en un lavado de etanol, y se secan exprimiendo en una toalla de papel. Pero se utiliza un nuevo juego de puntas para cada clon. Se centrifugan las placas a 3,000 revoluciones por minuto durante 10 minutos. Se remueven 100 microlitros del sobre-nadante hacia una placa fresca de 96 pozos. Le lee la OD590.

Solución de BPER/Lisozima/ADNsa (4.74 mi en total): 4.5 mi de BPR. , 200 microlitros a 10 mg/ml de Lisozima (se hace fresca en un regulador Cit-Phos a un pH de 6) . 40 microlitros a 5 mg/ml de ADNsa (se hace fresca en regulador Cit-phos a un pH de 6) .

EJEMPLO 4; ENSAYO DE XILANASA CON ARABINOXILANO DE TRIGO COMO EL SUSTRATO .

El siguiente ejemplo describe un ensayo de xilanasa de ejemplo que se puede emplear, por ejemplo, para determinar si una enzima está dentro del alcance de la invención.

Las SEQ ID NOS: 11, 12, 69, 70, 77, 78, 113, 114, 149, 150, 159, 160, 163, 164, 167, 168, 181, 182, 197, y 198 se sometieron a un ensayo, pH de 8 (regulador de fosfato de sodio) y a 70°C utilizando arabinoxilano de trigo como un sustrato. Las enzimas se caracterizaron como se estipula en la Tabla 7.

Tabla 7 SEQ ID Concentración Volumen de Número de Unidades/ Proteína NOS: de proteína Usado agrefrascos mi* (mg/ml) U/mg (mg/ml) gado a cada frasco 11, 12 42 0.5 10 163 22 .0 7. 113 , 114 37 0.6 10 66 22 .0 3. 163, 164 35 0.6 10 25 22 .0 1. 197, 198 23 1.0 10 31 22 .0 1. 167, 168 10 2.2 10 228 22 .0 10. 77, 78 47 0.5 10 29 22 .0 1. 69,70 18 1.3 10 36 22 .0 1. 181, 182 28 0.8 10 24 22 .0 1. 159, 160 25 0.9 10 43 22 .0 2. 149, 150 42 0.5 10 24 22 .0 1.

* Basándose en la adición de 1 mi de agua a cada muestra, Las Unidades son micromoles de xilosa liberadas por minuto basándose en un ensayo de az reductor .

EJEMPLO 5; Generación de una xilanasa de ejemplo de la invención.

El siguiente ejemplo describe la generación de una xilanasa de ejemplo de la invención empleando tecnología de mutagénesis de saturación del sitio genético (GSSM®) , designada como la variante o mutante "9x" (el ácido nucleico como se especifica en la SEQ ID NO: 377, la secuencia de polipéptido como se estipula en la SEQ ID NO: 378) .

Se empleó GSSM® para crear una biblioteca comprensiva de mutaciones puntuales en la SEQ ID NO: 190 de ejemplo, la xilanasa de "tipo silvestre" (codificada por la SEQ ID NO: 189) . El rastreo de termo-tolerancia de xilanasa descrito anteriormente identificó nueve mutantes de aminoácidos de un solo sitio (Figura 6A) (D8F, Q11H, N12L, G17I, G60H, P64V, S65V, G68A, y S79P) , que tuvieron una mejor tolerancia térmica en relación con la enzima de tipo silvestre (medida en seguida de un estímulo de calor a 80°C durante 20 minutos) . La enzima de tipo silvestre y los nueve mutantes de aminoácidos de un solo sitio se produjeron en E. poli y se purificaron utilizando una marca de hexahistidina N-terminal . No hubo una diferencia notoria en la actividad debido a la marca.

La Figura 6 ilustra los nueve mutantes de aminoácidos de un solo sitio de la "variante 9x" , o, como se estipula en la SEQ ID NO: 378 (codificada por la SEQ ID NO: 377) , como se generó mediante Mutagénesis de Saturación del Sitio Genético (GSSM®) de la enzima de "tipo silvestre" de la SEQ ID NO: 190 de ejemplo (codificada por la SEQ ID NO: 189) . La Figura 6A es un diagrama esquemático que ilustra la posición, la numeración y el cambio de aminoácidos para los mutantes puntuales térmicamente tolerantes del gen de "tipo silvestre" (SEQ ID NO: 190, codificada por la SEQ ID NO: 189) . Se generó una biblioteca de los 64 codones por cada posición de aminoácido del gen (aproximadamente 13,000 mutantes), y se rastreó para determinar las mutaciones que aumentaran la tolerancia térmica. La variante "9X" se generó mediante la combinación de todos los 9 mutantes de un solo sitio en una enzima. A la derecha se muestran el punto medio de transición de temperatura de fusión (Tm) correspondiente, determinado mediante calorimetría de exploración diferencial para cada enzima mutante, y la variante "9X" (SEQ ID NO: 378) . La Figura 6B ilustra el despliegue de las enzimas de "tipo silvestre" (SEQ ID NO: 190) y "variante/ mutante" "9X" (SEQ ID NO: 378) , monitoreado mediante calorimetría de exploración diferencial a una velocidad de exploración de l°C/minuto. Se normalizaron los datos de la caloría de exploración diferencial sustraídos de la línea base para la concentración de la proteína. Ensayos de la actividad de xilanasa Se determinaron las actividades enzimáticas utilizando 400 microlitros de Azo-xilano al 2 por ciento como sustrato, en 550 microlitros de regulador de CP (citrato-fosfato) , pH de 6.0, a las temperaturas indicadas. Se determinaron las mediciones de actividad como una función del pH utilizando soluciones reguladoras de Britton y Robinson 50 mM (pH de 3.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, y 9.0), preparadas mediante la mezcla de soluciones de ácido fosfórico 0.1 M, ácido bórico 0.1 M, y ácido acético 0.1 M, seguido por ajuste del pH con hidróxido de sodio 1 M. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 50 microlitros a 0.1 mg/ml de la enzima purificada. Los puntos del tiempo se tomaron desde 0 hasta 15 minutos, en donde se agregaron 50 microlitros de mezcla de reacción a 200 microlitros de solución de precipitación (etanol al 100 por ciento) . Cuando se hubieron tomado todos los puntos del tiempo, las muestras se mezclaron, se incubaron durante 10 minutos, y se centrifugaron a 3,000 g durante 10 minutos a 4°C. Se sacó el sobrenadante en alícuotas (150 microlitros) en una placa fresca de 96 pozos, y se midió la absorbencia a 590 nanómetros. Los valores A590 se graficaron contra el tiempo, y la velocidad inicial se determinó a partir de la inclinación de la línea.

Calorimetría de Exploración Diferencial (DSC) . ' Se llevó a cabo la calorimetría utilizando un apa'rato de calorimetría de exploración diferencial Modelo 6100 Nano II (Calorimetry Sciences Corporation, American Fork, Utah, Estados Unidos) , utilizando el paquete de software DSCRun para la adquisición de datos, CpCalc para el análisis, CpConvert para la conversión en capacidad de calor molar a partir de microvatios, y CpDeconvolute para la desconvolución . El análisis se llevó a cabo con 1 mg/ml de proteína recombinante en fosfato de potasio 20 mM (pH de 7.0) y KCl 100 mM a una velocidad de exploración de l°C/minuto. Se mantuvo una presión constante de 5 atmósferas durante todos los experimentos de calorimetría de exploración diferencial, para prevenir una posible desgasificación de la solución sobre el calentamiento. La línea base instrumental se registró rutinariamente antes de llenar con regulador los experimentos con ambas celdas. Se probó la reversibilidad de las transiciones térmicamente inducidas mediante recalentamiento de la solución en la celda del calorímetro inmediatamente después de enfriar la primera prueba.

Determinación de tolerancia térmica.

Se analizaron todas las enzimas para determinad su tolerancia térmica a 80°C en fosfato de potasio 20 mM (pH de 7.0) y KCl 100 mM. Las enzimas se calentaron a 80°C durante 0, 5,' 10, o 30 minutos en tubos de paredes delgadas, y se enfriaron sobre hielo. Las actividades residuales se determinaron con Azo-xilano como el sustrato, utilizando el ensayo descrito anteriormente para la medición de la actividad.

Huella del Polisacárido . 1 Se determinaron las huellas del polisacárido mediante análisis de polisacáridos utilizando electroforesis en gel de carbohidrato (PACE) . El xilano de madera de haya (0.1 mg/ml, 100 microlitros, Sigma, Poole, Dorset, Reino Unido) o los xilo-oligosacáridos (1 mM, 20 microlitros, Megazyme, Wicklow, Irlanda) , se trataron con la enzima (1 a 3 microgramos) en un volumen total de 250 raicrolitros durante 16 horas. La reacción se reguló en acetato de amonio 0.1 M, pH de 5.5. Se llevaron a cabo controles sin sustratos o enzimas bajo las mismas condiciones para identificar cualesquiera compuestos no específicos en las enzimas, los polisacáridos/oligosacáridos o reactivos marcadores. Las reacciones se detuvieron mediante ebullición durante 20 minutos. Los ensayos se llevaron a cabo de una manera independiente cuando menos 2 veces para cada condición. La derivación utilizando A TS (ácido 8 -aminonaftalen-1 , 3 , 6-trisulfónico, Molecular Probes, Leiden, Los Países Bajos), la electroforesis , y la toma de imágenes, se llevaron a cabo como se describe (Goubet, F. , Jackson, P., Deery, M. y Dupree, P. (2002) Anal. Biochem. 300, 53-68).

Cálculo de Idoneidad. ¡ La idoneidad (Fn) , para una variante enzimática dada, n, se calculó ponderando igualmente el incremento en el punto medio de transición de temperatura de desnaturalización (Tm) ¡y el incremento (o la reducción) en la actividad enzimática en relación con la mayor diferencia en cada parámetro a través de todas las variantes: Fn = + FVn, en donde FTn = factor de idoneidad de Tm de la variante, y FVn = factor de idoneidad de la actividad de la variante. Los factores de idoneidad para cada una (Tm y actividad) son en relación con la mayor diferencia en la Tm o índice a través de todas las variantes. F^ = (Tm - TmIí)/(TmH -TmL) , en donde T,^ es la Tm para la variante dada, n, y TmL es la Tm más baja a través de todas las variantes, y es la Tm más alta a través de todas las variantes, y FVn = (Vn - VL) / (VH - VJ , en donde Vn es el índice relativo para la variante dada, n, y VL es el índice más bajo a través de todas las variantes, y VH es el índice más alto a través de todas las variantes.

Evolución mediante el método de GSSM® Se empleó la tecnología de GSSM® para crear j una biblioteca comprensiva de mutaciones puntuales en la xilanasa de ejemplo de la invención, SEQ ID NO: 190 (codificada por la SEQ ID NO: 189) ; incluyendo la xilanasa de ejemplo de la invención, i SEQ ID NO: 378 (codificada por la SEQ ID NO: 377) . El rastreo de termo-tolerancia de la xilanasa descrito anteriormente identificó nueve mutantes de aminoácidos de un solo sitio (Figura 6A) , D8F, Q11H, N12L, G17I, G60H, P64V, S65V, G68A, y S79P, que tuvieron una mejor tolerancia térmica en relación con la enzima de "tipo silvestre" de ejemplo, la SEQ ID NO: 190 (codificada por la SEQ ID NO: 189) , como se midió en seguida de un estímulo de calor a 80°C durante 20 minutos. Se produjeron la enzima de tipo silvestre y los nueve mutantes de aminoácidos de un solo s tio en E. coli, y se purificaron utilizando una marca¡ de hexahistidina N-terminal. No hubo una diferencia notoria en la actividad debido a la marca.

Con el fin de determinar el efecto de las mutaciones de un solo aminoácido sobre la actividad enzimática, los nueve mutantes se purificaron, y se comparó su actividad de xilanasa ( índices iniciales a la temperatura óptima del tipo silvestre, 70°C) , con aquélla de la enzima de "tipo silvestre" de la SEQ ID NO: 190 de ejemplo. Las actividades enzimáticas fueron comparables al tipo silvestre (índice inicial normalizado a 1.0) para los mutantes D8F, N12L, G17I, G60H, P64V, S65V, G68A, y S79P (en relación con los índices iniciales de 0.65, 0.68, 0.76, 1.1, 1.0, 1.2, 0.98, y 0.84, respectivamente), confirmando que estas mutaciones no alteran de una manera significativa la actividad enzimática. Los índices iniciales se midieron 3 o más veces, y la variación fue típicamente menor al 10 por ciento. En contraste con estos ocho mutantes, se observó una reducción notoria en la actividad enzimática para el mejor mutante de un solo sitio térmicamente tolerante, Q11H (en relación con el índice inicial de 0.35) .

Temperatura de fusión (Tm) de enzimas de "tipo silvestre" y mutantes de aminoácidos de un solo sitio térmicamente tolerantes .

La xilanasa de "tipo silvestre" de la SEQ ID NO:1 190 purificada y los nueve mutantes de aminoácidos de un solo sitio térmicamente tolerantes, se analizaron empleando calorimetría de exploración diferencial (DSC) . La acumulación fue aparente para la enzima de tipo silvestre, como fue evidenciado por una joroba en el trazo de la calorimetría de exploración diferencial :para su desnaturalización térmica, ver la Figura 6B. Las enzimas mutantes evolucionadas no mostraron ninguna indicación de acumulación. Para todas las enzimas, la desnaturalización térmicamente inducida fue irreversible, y no se observó ninguna transición discernible en una segunda exploración de la muestra. Debido a la irreversibilidad de la desnaturalización, solamente se pudo calcular la Tm aparente (temperatura de fusión) (como es descrito, por ejemplo, por Sánchez-Ruiz (1992) Biophys . J. .61: 921-935; Beldarrain (2000) Biotechnol . Ap l . Biochem. 31: 77-84) . La Tm de la enzima de tipo silvestre fue de 61°C, mientras que las Tm's de todos los mutantes puntuales se incrementaron y estuvieron en el intervalo de 64°C a 70°C (Figura 6A) .¦ La mutación QllH introdujo el mayor incremento (Tm = 70°C) sobre la de tipo silvestre, seguida por P64V (69°C) , G17I (67°C) , y D8F (67°C) . 1 La enzima de ejemplo de GSSM®, SEQ ID NO: 378, combinada con "9X" .

La enzima "9X" (SEQ ID NO: 378) se construyó mediante la combinación de los. cambios de un solo sitio de los nueve mutantes térmicamente tolerantes superiores, mediante mutagénesis dirigida al sitio (Figura 6A) . La enzima "9X" (SEQ ID NO: 378) se expresó en E. coli, y se purificó hasta la homogeneidad. Se i llevó a cabo la calorimetría de exploración diferencial para determinar la temperatura de fusión. La Tm de la enzima "9X"! fue 34 grados más alta que la SEQ ID NO: 190, la enzima de 'Vtipo silvestre", demostrando un cambio dramático en su estabilidad térmica (Figura 6B) .

Con el fin de evaluar el efecto de las mutaciones combinadas y la temperatura de fusión elevada sobre las propiedades bioquímicas de la enzima, se construyeron y se compararon el pH y los perfiles de temperatura con la SEQ ID NO: 190, la enzima de "tipo silvestre". La Figura 7 ilustra la caracterización bioquímica de las enzimas de "tipo silvestré" y mutantes 9X "evolucionadas" . La Figura 7A ilustra la dependencia en el pH de la actividad para las enzimas de tipo silvestre y mutante 9X evolucionada. La actividad de xilanasa se midió a 37°C en cada pH, y se gráfico la velocidad inicial contra, la absorbencia a 590 nanómetros, para determinar los índices iniciales. La Figura 7B ilustra la dependencia en la temperatura de la actividad para las enzimas de tipo silvestre y mutante 9X evolucionada. Se midieron las temperaturas, óptimas de las enzimas de tipo silvestre y mutante 9X sobre un intervalo de temperatura de 25 a 100°C a un pH de 6.0, y se basan en los índices iniciales medidos durante 5 minutos. La Figura 7C ilustra la estabilidad térmica de las enzimas de tipo silvestre y mutante 9X evolucionada. La dependencia térmica de la actividad dé' las enzimas de tipo silvestre y mutante 9X evolucionada, se midió calentando primero las enzimas en cada una de las temperaturas indicadas durante 5 minutos, seguido por enfriamiento a temperatura ambiente, y la medición de la actividad residual (índice inicial a 37°C, pH de 6.0) . Para todos los experimentos, los índices iniciales se midieron 2 o más veces, y la variación fue menor al 10 por ciento. ¡ Las enzimas de las SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 378; (la mutante " 9X") , tuvieron perfiles de pH/actividad comparables, con la actividad más alta entre un pH de 5 y 6 (Figura 7A) . Ambas enzimas tuvieron óptimas de índice inicial/temperatura similares a 70°C; sin embargo, la SEQ ID NO: 190, la enzima de "tipo silvestre", tuvo una actividad más alta a temperaturas más bajas (25°C a 50°C) , mientras que la SEQ ID NO: 378 (la mutante "9X") retuvo más del 60 por ciento de su actividad a 100°C (determinada por el índice inicial) en la presencia del sustrato (Figura 7B) . La actividad de la SEQ ID NO: 190, la enzima de "tipo silvestre", no fue detectable a temperaturas mayores a 70°C.

Con el fin de determinar el efecto de las 9 mutaciones combinadas sobre la tolerancia térmica de la enzima, se midió la actividad residual y se comparó con la SEQ ID NO: 190, la enzima de "tipo silvestre" . La actividad residual se determinó mediante un estímulo de calor durante 5 minutos a cada temperatura (37°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, y 90°C) , seguido por mediciones dé la actividad a 37°C. La SEQ ID NO: 190 se inactivo completamente arriba de 70°C, mientras que la mutante 9X evolucionada exhibió una actividad significativa después de calentarse a 70°C, a 70°C, e inclusive a 90°C (Figura 7C) . Adicionalmente, aunque se redujo la actividad de la enzima de tipo silvestre al aumentar la temperatura, la variante 9X se activó un poco por el t calentamiento a temperaturas de hasta 60°C.

Generación de variantes de GSSM® de combinación empleando la tecnología de GeneReasse bly®.

Con el fin de identificar las variantes de combinación de los 9 mutantes de aminoácidos de un solo sitio con la más alta tolerancia térmica y actividad, comparándose con la SEQ ID NO: 378 aditivamente construida (la variante "9X"), se construyó y se rastreó una biblioteca GeneReassembly® (patente US 6,537,776) de todas las posibles combinaciones de mutantes (29) . Utilizando la tolerancia térmica como el criterio de rastreo, ' se identificaron 33 combinaciones únicas de nueve mutaciones, así como lo fue la variante 9X original. Se llevó a cabo un rastreo secundario para seleccionar las variantes con una actividad/expresión más altas que la 9X evolucionada. Este rastreo produjo 10 variantes con secuencias que poseían entre 6 y 8 de las mutaciones individuales originales en diferentes combinaciones, como se ilustra en la Figura 8A. La Figura 8 ilustra las variantes de combinación identificadas empleando la tecnología GeneReasembly® . La Figura 8A ilustra la biblioteca GeneReassembly® de todas las posibles combinaciones de las 9 mutaciones puntuales de GSSM®, que se construyó y se rastreó 'para determinar las variantes con una mejor tolerancia térmica y actividad. Se obtuvieron once variantes, incluyendo la variante 9X. Como se muestra en la figura, las variantes tuvieron 6, 7, 8, o 9 de las mutaciones puntuales en diferentes combinaciones. A la derecha se muestra el punto medio de transición de temperatura de fusión correspondiente (Tj , determinado mediante calorimetría de exploración diferencial de cada variante. La Figura 8B ilustra la actividad relativa (índice inicial medido durante un periodo de tiempo de 5 minutos) de las variantes 6X-2 y 9X, comparándose con el tipo silvestre a la temperatura óptima (70°C) y a un pH de 6.0. Las barras de error muestran1 el intervalo del índice inicial para 3 mediciones . j La temperatura de fusión (Tm) de cada una de |;las variantes de combinación fue cuando menos 28 °C más alta que la i del tipo silvestre (Figura 8A) , y todas las variantes de | re-ensamble exhibieron una actividad relativa más alta que la enzima 9X. La actividad de una variante en particular, 6X-2, fue mayor I que la de la enzima de tipo silvestre, y significativamente mejor (1.7X) que la enzima 9X (Figura 8B) . La comparación de secuencias de las variantes de re-ensamble identificaron cuando menos 6 mutaciones que se requirieron para la mejor termo-estabil!idad (>20 grados) . Todas las 33 variantes únicas encontradas en el rastreo de termo-estabilidad inicial contuvieron ambas mutaciones Q11H y G17I, demostrando su importancia par ala tolerancia térmica. i Análisis de huellas del producto del polisacárido de \tipo silvestre y variant . I Los productos generados por el "tipo silvestre", y las i variantes 6X-2 y 9X, se compararon mediante análisis de polisacáridos , utilizando electroforesis en gel de carbohidratos i (PACE) . Se probaron diferentes sustratos (oligosacáridós y polisacáridos) , para la hidrólisis por parte de las xilanasas. Los productos de digestión de las 3 xilanasas probadas fueron muy similares, como se ilustra en la Figura 9. Las tres enzimas se hidrolizaron (Xyl)6 y (Xyl)5, principalmente tanto en (Xyl)3 como en (Xyl)2, y se hidrolizó (Xyl)4 hasta (Xyl)2 (Figura 9A) . Solamente se observó una pequeña cantidad de hidrólisis de (Xyl)3 en (Xyl) 2, y se observó Xyl, indicando que (Xyl)3 es un sustrato relativamente pobre para la enzima. No se detectó actividad alguna sobre (Xyl)2. El xilano de madera de haya, que contiene residuos de glucuronosilo, fue hidrolizado por las tres enzimas, principalmente en (Xyl)2 y (Xyl)3, pero se detectaron otras bandas que migraron entre las bandas de oligoxilano (Figura 9B) . En el análisis PACE, cada oligosacárido tiene una migración específica, dependiendo de la composición de azúcar y del grado de polimerización (Goubet, F. , Jackson, P. , Deery, M., y Dupree, P. (2002) Anal. Bioche . 300, 53-68), y por lo tanto, estas bandas posiblemente corresponden a oligoglucuronoxilanos . Por consiguiente, las enzimas evolucionadas retuvieron la especificidad del sustrato de la enzima de "tipo silvestre".

Como se observó anteriormente, la Figura 9 ilustrá las huellas del producto de las variantes enzimáticas de "tipo silvestre", la SEQ ID NO: 190 (codificada por la SEQ ID NO: 189) , 6X-2 (SEQ ID NO: 380, codificada por la SEQ ID NO: 379) , y la SEQ ID NO: 378 (la mutante "9X"), como se determina mediante electroforesis en gel de carbohidratos. La Figura 9A ilustra huellas obtenidas después de la hidrólisis de oligoxilanos (Xyl)3, (Xyl)4, (Xyl)5, y (Xyl)6, por parte de las enzimas de "tipo silvestre" y variantes. Las pistas de control contienen el oligosacárido incubado bajo las condiciones del ensayo en ausencia de enzimas. La Figura 9B ilustra las huellas obtenidas después de la hidrólisis de xilano de madera de haya mediante las i enzimas de tipo silvestre y variantes. Los estándares contenían (Xyl)2/ (Xyl)3, (Xyl)4. Todos los ensayos se llevaron a cabo a 37°C y a un pH de 5.5. : Se empleó una combinación de estrategias de evolución genética de laboratorio para generar rápidamente una xilahasa termo-estable altamente activa, optimizada para la compatibilidad del proceso en un número de aplicaciones del mercado industrial. Se empleó la metodología de GSSM® para explorar toda la secuencia de la xilanasa de "tipo silvestre" de ejemplo, SEQ ID NO: 190 (codificada por la SEQ ID NO: 189) , y para identificar 9 mutaciones puntuales que mejoren su tolerancia térmica. Aunque no hubo un efecto discernible sobre el perfil del producto de hidrólisis de la enzima, como se ilustra en la Figura 9, la adición de las 9 mutaciones a la secuencia de proteína dio como resultado una reducción moderada en la actividad enzimática específica a la temperatura óptima de 70°C de la SEQ ID NO: 190 (el "tipo silvestre"), ver la Figura 9B. Empleando el método de GeneReassembly® para generar una biblioteca de combinación de los 9 mutantes de aminoácidos de un solo sitio, se superó esta reducción en la actividad. Se obtuvieron diez variantes termo-estables (Tm entre 89°C y 94°C) con una actividad mejor que las de la variante "9X" a partir del rastreo de la biblioteca GeneReassembly® . Con una Tm de 90°C, es particularmente notoria la actividad enzimática específica que sobrepasa a la del tipo silvestre, y una huella del producto no alterada y comparable( con la SEQ ID NO: 190 (el "tipo silvestre"), la variante 6X-2 (SEQ ID NO: 380, codificada por la SEQ ID NO: 379) . Para nuestro conocimiento, el cambio en la Tm obtenido para estas variantes es el incremento más alto reportado desde la aplicación de las tecnologías de evolución dirigida.

La SEQ ID NO: 380 (la variante 6X-2) incluye ' los siguientes cambios, comparándose con la SEQ ID NO: 190 (el "tipo silvestre") : D8F, Q11H, G17I, G60H, S65V, y G68A. La SEQ ID, NO: i 379 incluye los siguientes cambios de nucleótidos, comparándose con la SEQ ID NO: 189 de "tipo silvestre": los nucleótidos en las posiciones 22 a 24 son TTC, los nucleótidos en las posiciones 31 a 33 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 49 a 51 son ATA, los nucleótidos en las posiciones 178 a 180 son CAC, '< los nucleótidos en las posiciones 193 a 195 son GTG, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCT.

Con el objeto de calibrar la efectividad de la mezcla de combinación contra la adición de los mutantes puntuales al fenotipo deseado, se calculó un parámetro de idoneidad' que combina las contribuciones tanto de los cambios en la actividad I enzimática, como de la termo-estabilidad, para cada mutante. El término "idoneidad", como se describe en la presente, no es una medida objetiva que se pueda comparar con otras enzimas, sino que más bien es un término que permite hacer la medición del éxito de la evolución dirigida de esta xilanasa en particular. Debido a que la idoneidad enzimática, F, se calcula ponderando igualmente los cambios en la Tm y en la actividad enzimática para este juego de variantes, el máximo valor de idoneidad permisible es de 2 (FT < 1 y Fv < 1, ver anteriormente) . En otras palabras, si la variante con la mejor actividad también tuviera la más alta Tm, su valor de idoneidad seria de 2. Con un valor de idoneidad cercano a 2 (ver la Figura 10B) , la variante 6X-2 (SEQ ID NO: 380, codificada por la SEQ ID NO: 379) es la más cercana a poseer la mejor combinación posible de estabilidad térmica y actividad enzimática. La mutación de un solo sitio que confiere el valor más alto de idoneidad es la S65V. Aunque la Tm de la mutante S65V es más baja que aquélla de la mutante Q11H 66°C contra 7Ó°C, respectivamente) , tiene un valor de idoneidad más alto, debido a que no se reduce su actividad específica en relación con el tipo silvestre. 1 La Figura 10A es un diagrama esquemático que ilustra el nivel de mejora en la estabilidad térmica (representada por Tm) sobre el "tipo silvestre" obtenido mediante evolución ¡con GSSM® . Se muestran el mutante de aminoácidos de un solo sitio y la variante de combinación con la estabilidad térmica más alta (Q11H y "9X" (SEQ ID NO: 378), respectivamente), en comparación con el tipo silvestre. La Figura 10B ilustra un "diagrama de idoneidad" de la mejora enzimática obtenida mediante la combinación de las tecnologías GSSM® y GeneReassembly® . Se determinó la idoneidad empleando la fórmula F = FT + FV, en donde la idoneidad (F) se calcula ponderando igualmente la idoneidad de tolerancia térmica (FT) y la idoneidad de actividad relativa (FV) , como se describen anteriormente. Se muestra la mutación puntual que confiere la mayor idoneidad (S65V) . La combinación de todas las 9 mutaciones puntuales también mejoró la idoneidad (SEQ ID NO: 378, la variante "9X"). Sin embargo, se obtuvo la mayor mejora en la idoneidad mediante la combinación de los métodos GSSM® y GeneReassembly® para obtener la mejor variante, 6X-2 (SEQ ID NO: 380) .

El método de GeneReassembly® también permitió hacer la identificación de los residuos importantes que parecen |Ser absolutamente necesarios para una mejor estabilidad térmica. Estuvieron presentes dos residuos claves, Q11H y G17I, en cada variante de GeneReassembly® identificada, basándose en la tolerancia térmica (ver la Figura 6A) . Se han estudiado 'las determinantes estructurales para la estabilidad térmica de las proteínas, y varias teorías han sido documentadas, por ejemplo, por Kinjo (2001) Eur. Biophys . J. 30: 378-384; Britton (1999), J. Mol. Biol. 293: 1121-1132; Ladenstein (1998) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 61: 37-85; Britton (1995) Eur. J. Biochem. 229: 688-695; Tanner (1996) Biochemistry 35: 2597-2609; Vetriani (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95: 2300-2305. Los patrones de enlace de hidrógeno, las interacciones iónicas, el empaque hidrófobo, y la longitud reducida de los ciclos superficiales, están entre los factores claves, inclusive cuando no se entienda completamente la contribución de cada uno para la estabilidad de la proteína. Dado que la mayoría de las sustituciones puntuales benéficas identificadas a partir de la prueba de todas las posibles sustituciones de aminoácidos individuales involucradas en el reemplazo de residuos relativamente polares, cargados, o pequeños (glicina) por residuos hidrófobos mucho más grandes, se t puede conjeturar que las interacciones hidrófobas tienen el papel más significativo en la mejora de la termo-estabilidad de esta proteína. Inclusive con un buen entendimiento de las interacciones óptimas para mejorar la tolerancia térmica, no es directa la predicción de en dónde hacer mutaciones ,que introduzcan estas interacciones. Sin embargo, un planteamiento no racional que utilice el método de GSSM®, permite hacer un muestreo rápido de todas las cadenas laterales en todas las posiciones dentro de una estructura de proteína. Este planteamiento conduce al descubrimiento de sustituciones' de aminoácidos que introducen interacciones funcionales que no podrían haberse previsto. | EJEMPLO 6: Pre-tratamiento de pulpa de papel con las xilanaaas de la invención En un aspecto, las xilanasas de la invención se pueden utilizar para tratar previamente la pulpa de papel. Este ejemplo describe un protocolo de rastreo rutinario de ejemplo para determinar si una xilanasa es útil en el tratamiento previo de la pulpa de papel; por ejemplo, en la reducción del uso de productos químicos blanqueadores (por ejemplo, dióxido de cloro, C102) , cuando se utilizan para tratar previamente la pulpa1 de papel de estraza. ! El protocolo de rastreo tiene dos parámetros de prueba alternativos: impacto del tratamiento con xilanasa después de un paso de deslignificación con oxígeno (pulpa posterior al 02) ; e Impacto de la xilanasa en un proceso que no incluye deslignificación con oxígeno (suministro café antes del 02) .

Para el tratamiento de pulpa, las condiciones que simulan las condiciones de proceso en situaciones industriales, por ejemplo, fábricas, son: pH de 8.0; 70°C; duración de i 60 minutos .

El proceso se ilustra esquemáticamente en el Diagrama I de Flujo de la Figura 11.

Se identificaron veinte xilanasas mediante pruebas bioquímicas que eran activas bajo estas condiciones. De lasi20 xilanasas, 6 pudieron reducir de una manera significativa , la demanda de C102 cuando se utilizaron para tratar previamente la pulpa de estraza antes de blanquearse químicamente. Las seis son: SEQ ID NO: 182 (codificada por la SEQ ID NO: 181) ; SEQ ID NO: 160 I (codificada por la SEQ ID NO: 159); SEQ ID NO: 198 (codificada por la SEQ ID NO: 197) ; SEQ ID NO: 168 (codificada por la SEQ ID NO: 167); SEQ ID NO: 216 (codificada por la SEQ ID NO: 215); SEQ ID NO: 260 (codificada por la SEQ ID NO: 259) . Otras mostraron alguna actividad, pero no fueron tan buenas. Las xilanasas de las SEQ ID NO: 182 (codificada por la SEQ ID NO: 181) y SEQ ID NO: 160 (codificada por la SEQ ID NO: 159) son modulares y contienen un módulo de enlace de carbohidrato en adición al dominio catalítico de la xilanasa. Se demostró que los derivados truncados de estas 2 xilanasas que contienen justamente ^ el dominio catalítico, son más efectivas en esta aplicación. La mejor xilanasa, la SEQ ID NO: 160 (codificada por la SEQ ID NO: 159) se estudió de una manera más comprensiva. Los resultados se pueden resumir como sigue: -El tratamiento previo de pulpa de picea/pino/ abeto (SPF) posterior al 02, con 2 unidades/g de la SEQ ID NO: ¡160 (codificada por la SEQ ID NO: 159) reduce el uso subsecuente de C102 por el 22 por ciento, para alcanzar el 65 por ciento; de brillantez GE; -el tratamiento previo de SPF del suministro café previo al 02, con 0.5 unidades/g de la SEQ ID NO: 160 (codificada por la SEQ ID NO: 159) reduce el uso subsecuente de C102 pori el 13 por ciento, para alcanzar el 65 por ciento de brillantez ¡GE; -el tratamiento previo de pulpa de álamo previa al 02, con 0.5 unidades/g de la SEQ ID NO: 160 (codificada por la SEQ ID NO: 159) reduces el uso de C102 por cuando menos el 22 por ciento; -el tratamiento previo de pulpa de Abeto Douglas/ Pinabete previa al 02, con 0.5 unidades/g de la SEQ ID NO: 160 (codificada por la SEQ ID NO: 159) reduce el uso de C102 por cuando menos el 22 por ciento; bajo las condiciones de tratamiento empleadas,; la reducción en el rendimiento a partir del tratamiento con xilanasa, no excedió del 0.5 por ciento, al compararse con! la pulpa que se había blanqueado hasta el mismo factor kappa, pero sin tratarse con la xilanasa; las condiciones óptimas para el tratamiento de pulpa SPF posterior al 02, con las SEQ ID NOS : 159, 160 fueron: pH de 6 a 7; dosis de enzima de 0.3 unidades/g; tiempo : de tratamiento de 20 a 25 minutos. Bajo estas condiciones, fue posible la reducción en el uso de C102 del 28 por ciento, para alcanzar el 69 por ciento de brillantez GE.

En otros experimentos : SEQ ID NO: 160 (XYLA) , codificada por la SEQ ID NO: 159 = xilanasa de tipo silvestre de longitud completa: • XYLA (E.c) = variante truncada de las SEQ ID NOS: 159, 160, que contienen solamente el dominio catalítico de xilanasa expresado en E. coli; • XYLA (P.f) = lo mismo, pero expresada en P. fluorescens; , SEQ ID NO: 182 (codificada por la SEQ ID NO: 181) = segunda xilanasa de tipo silvestre de longitud completa: • XYLB (E.c) = variante truncada etc., etc., expresada en E. coli; · XYLB (P.f) = lo mismo, pero expresada en P. fl orescens; Datos de Respuesta a la Dosis para las Xilanasas Delanteras en un Suministro Café Previo al O, Condiciones para la etapa de xilanasa (etapa-X) como siguen: pH de 8; Temperatura de 70°C; Tiempo de 60 minutos; Factor kappa de 0.24; Para el control sin enzima alguna, el factor kappa fue de 0.30.

Los resultados mostraron un aumento dependiente de la dosis en la brillantez para las muestras tratadas con xilanasa, con una carga más baja de dióxido de cloro (C102) (Kf 0.24 contra Kf 0.30) .

En cada caso, el derivado truncado pareció ser imás efectivo que la xilanasa de longitud completa. La dosis ¡ de xilanasa óptima pareció estar alrededor de 0.6 a 0.7 Unidades/ g de pulpa . , Tratamiento Previo del Suministro Café Previo al Q? Intercontinental, con las 4 mejores Xilanasas Determinación de Respuesta a la Dosis de C102 en D0. Lineamiento experimental .

• Suministro café previo al 02.

• Kappa inicial de 31.5.

• Condiciones de la etapa-X.

• Carga de xilanasa de 0.7 Unidades/g.

• Temperatura de 70°C. i • pH de 8.

• Tiempo de tratamiento de 1 hora .

• Consistencia de la pulpa del 10 por ciento.

• Secuencia de blanqueo XDEp.

• Factor kappa de 0.22, 0.26, y 0.30 (porcentaje de D sobre la pulpa: 2.63, 3.12, y 3.60).

Brillantez final después de la secuencia de blanqueo de 3 etapas contra el factor Kappa (carga de C107) .· • XYLB - Con una brillantez final de 61.5, la etapa-X hace posible la reducción en el uso de C102 de 3.89 kg/tonelada de pulpa.

• XYLB (E.c) - Con una brillantez final de 61.5, la etapa-X hace posible la reducción en la carga de C102 de 4.07 kg/tonelada de pulpa.

• XYLA - Con una brillantez de 61.5, la etapa-X hace posible una reducción en el uso de C102 de 4.07 kg/toneladá de pulp .

• XYLA (E.c) - Con una brillantez final de 61.5, la etapa-X hace posible la reducción en el uso de C102 de 4.90 kg/tonelada de pulpa.

Determinación de la Respuesta a la Dosis de CIO-, en D„ : Enzima Ahorros de C102 en D0 Reducción de Kf (kg/ton OD) en D0 XYLB 3. .89 11. .7% XYLB (E. ,c) 5. .08 15 , .8% XYLA 4. .07 12. .2% 1 XYLA (E. • c) 4 , .90 14 , .7% Xilanasa, 0.7 Unidades/g; pH de 8.0; 70°C; 1 hora.

Pulpa: Suministro café previo al 02; kappa inicial de 31.5.

El porcentaje de ahorro de C102 es de poco significado para la industria. Su preocupación primordial son los kilogramos de C102 requeridos por tonelada de pulpa OD. Esto tiene sentido cuando se considera que un porcentaje más bajo de ahorro como el i que se vé con un suministro café de alto kappa inicial puede ser más valioso en términos de kilogramos de C102 ahorrados, que un i porcentaje más alto de reducción para una pulpa de kappa inicial bajo que requerirá de una carga total más baja de C102 para alcanzar la brillantez objetiva.

Relación entre Brillantez, Rendimiento, y Factor Kappa, para la Pulpa de Control Blanqueada: Los resultados mostraron que el blanqueo con dosis crecientes de C102 para alcanzar la brillantez objetiva más alta, da como resultado una mayor pérdida de rendimiento de pulpa. Ésta es una cuestión debido a que la pulpa en esta etapa del proceso tiene un valor de casi US$400 por tonelada, y la pérdida de celulosa cuesta dinero.

Un beneficio de la xilanasa (por ejemplo, una xilanasa de la invención) es que el uso de una dosis más baja de C102 puede reducir las pérdidas de rendimiento, siempre que la acción de la xilanasa misma no cancele la ganancia.

Datos de Respuesta a la Dosis para el Tratamiento Previo del Suministro Café Previo al 0? con la Xilanasa XYLB (P.f) : Lineamiento experimental .

• Suministro café de madera del Norte previo aí 02.

Kappa inicial de 28.0. <¾. - Consistencia inicial del 32.46 por ciento. 1 Brillantez inicial de 28.37. ' • Condiciones de la etapa-X. < Carga de xilanasa de 0 a 2.70 Unidades/g. 1 Temperatura de 58°C a 61°C. < pH de 8.2 a 8.5. i Tiempo de tratamiento de 1 hora.

• Secuencia de blanqueo XDEP.

Factor Kappa de 0.24.

• Ahorro de C102 calculado para factores Kappa de entre 0.24 y 0.30.

El propósito de este experimento fue evaluar la mejor de las 4 xilanasas sobre un suministro café de SPF no lavado. Los resultados mostraron los incrementos dependientes de la dosis en la brillantez final para la pulpa tratada con XYLB (E.c), aproximándose la brillantez alcanzada en la presencia de xilanasa en el Kf más bajo de 0.24, a la brillantez alcanzada con el Kf más alto de 0.30 de una manera asintótica.

Relación entre la Dosis de Xilanasa XYLB (E.c) y el Ahorro de Dióxido de Cloro (Suministro Café Previo al 07) : Ahorro de C102 en % Ahorro de C102 en Dosis de Xilanasa de Pulpa OD kg/ton de Pulpa en U/gm 0 , .299% 2. , 99 0. 31 ? 0 , .363% 3. , 63 0. 51 0. .406% 4. 06 0. 71 1 0. .439% 4. 39 0. 91 0. .483% 4. 83 1. 26 0 , .523% 5. 32 1. 80 0. .487% 5. 87 2. 70 La Dosis Óptima de Xilanasa es de entre 0.5 y 0.9 Unidades/g .

La dosis óptima está en el intervalo de 0.5 a 0.9 Unidades/g. Arriba de esta dosis, hay un retorno en disminución por unidad de incremento de xilanasa. Las reducciones en la dosis de dióxido de cloro por tonelada de pulpa tratada de esta magnitud, son comercialmente significativas.

Procedimiento de bio-blanqueo en tres etapas .

Se desarrolló un procedimiento de bio-blanqueo en tres etapas que simularía estrechamente las operaciones de blanqueo reales en una planta de blanqueo de molino de pulpa (Figura11) . Esta secuencia de blanqueo se designa por (X)DoEp, en donde X representa la etapa de tratamiento con xilanasa, D para la etapa de blanqueo con dióxido de cloro, y Ejo para la etapa de extracción con peróxido alcalino. El suministro de alimentación primario utilizado en nuestras pruebas de aplicación fue el Suministro Café de Estraza de Madera Suave del Sur (sin deslignificación con oxígeno) . Los candidatos de xilanasa más efectivos que mostraron un alto potencial de reducción química de blanqueo en los ensayos de bio-blanqueo, también se probaron en dos especies de pulpa de estraza de madera dura (maple y i álamo) . Al terminar cada ronda de bio-blanqueo, se utilizó la siguiente pulpa para producir hojas estándares de TAPPI (Technical Association of Pulp and Paper Industries -Asociación Técnica de las Industrias de Pulpa y Papel) . Se midió el porcentaje de brillantez GE de cada hoja, y se utilizaron los valores de brillantez como la indicación de la manera en que se desempeñó cada enzima sobre la pulpa durante la etapa de 'pre- tratamiento enzimático (X) .

Resultados : De aproximadamente 110 xilanasas que se rastrearon utilizando la secuencia de bio-blanqueo (X)DoEp, 4 enzimas, es decir, XYLA (P.f); XYLB (P.f); SEQ ID NO: 216 (codificada por la SEQ ID NO: 215) ; SEQ ID NO: 176 (codificada por la SEQ ID NO: 175) , mostraron el mayor potencial para reducir el usoi de productos blanqueadores químicos. Mientras que las XYLA (P.f) y XYLB (P.f) exhibieron un desempeño igualmente alto (el mejor entre las cuatro buenas desempeñadoras) , la XYLA (P.f) mostró una í mejor tolerancia al pH que la XYLB (P.f). Los resultados se pueden resumir como sigue: • Es posible lograr una brillantez de la hoja de 60 (%GE) utilizando una secuencia de blanqueo de tres etapas [(X)DoEp] que involucra el tratamiento previo del Suministro Café de Estraza de Madera Suave del Sur, con las siguientes cuatro enzimas, en los niveles de carga enlistados en seguida (pH = 8, 65°C, y 1 hora) : ! • XYLA (P.f) a 0.55 Unidades/g de pulpa. , · XYLB (P.f) a 0.75 Unidades/g de pulpa.

• SEQ ID NOS : 215, 216 a 1.80 Unidades/g de pulpa.

• SEQ ID NOS: 175, 176 a 1.98 Unidades/g de pulpa .

· El pre-tratamiento de Suministro Café de Estraza de Madera Suave del Sur con 2 Unidades/g de pulpa de XYLA (P.f) , reduce el uso de C102 por el 18.7 por ciento, para alcanzar un porcentaje de brillantez GE final de 61.

• XYLA (P. f) exhibe una buena tolerancia a un pH más alto, y proporciona más del 14 por ciento de ahorros en productos químicos cuando la etapa de pre-tratamiento enzimático se ejecuta a un pH = 10.

• El pre-tratamiento de Suministro Café de Estraza de Madera Suave del Sur con 2 Unidades/g de pulpa de XYLB (P.f) reduce el uso de C102 por el 16.3 por ciento, para alcanzar un porcentaje de brillantez GE final de 60.5.

• El pre-tratamiento de pulpa de estraza de álamo con 2 Unidades/g de pulpa de XYLA (P.f) y XYLB (P.f), reduce el uso de C102 por aproximadamente el 35 por ciento, para alcanzar un porcentaje de brillantez GE final de 77.

• El pre-tratamiento de pulpa de estraza de maple con 2 Unidades/g de pulpa de XYLA (P.f) y XYLB (P.f), reduce el uso de C102 por aproximadamente el 38 por ciento, para alcanzar un porcentaje de brillantez GE final de 79.

• Las dos xilanasas de mejor desempeño, es decir, XYLA (P.f) y XYLB (P.f), son enzimas truncadas, que contienen justamente el dominio catalítico, y se produjeron en Pseudo onas fluorescens .

Aunque la invención se ha descrito con detalle con referencia a ciertos aspectos preferidos de la misma, se entenderá que las modificaciones y variaciones están dentro; del espíritu y alcance de lo que se describe y se reivindica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico aislado o recombinante, que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, ^EQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, : SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID ¡NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:, 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: ni, SEQ ID NO: 113,' SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129/ SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145,¡ SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153/ SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161,; SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, 3EQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, 3EQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, 3EQ NO 213 , SEQ ID NO 215 , SEQ ID NO 217 , SEQ ID NO 219 , SEQ ID NO 221 , SEQ ID NO 223 , SEQ ID NO 225 , SEQ ID NO 227 , SEQ ID NO 229 , SEQ ID NO 231 , SEQ ID NO 233 , SEQ ID NO 235 , SEQ ID NO 237 , SEQ ID NO 239 , SEQ ID NO 241 , SEQ ID NO 243 , SEQ ID NO 245 , SEQ ID NO 247 , SEQ ID NO 249 , SEQ ID NO 251 , SEQ ID NO 253 , SEQ ID NO 255 , SEQ ID NO 257 , SEQ ID NO 259 , SEQ ID NO 261 , SEQ ID NO 263 , SEQ ID NO 265 , SEQ ID NO 267 , SEQ ID NO 269 , SEQ ID NO 271 , SEQ ID NO 273 , SEQ ID NO 275 , SEQ ID NO 277 , SEQ ID NO 279 , SEQ ID NO 281 , SEQ ID NO 283 , SEQ ID NO 285 , SEQ ID NO 287 , SEQ ID NO 289 , SEQ ID NO 291 , SEQ ID NO 293 , SEQ ID NO 295 , SEQ ID NO 297 , SEQ ID NO 299 , SEQ ID NO 301 , SEQ ID NO 303 , SEQ ID NO 305 , SEQ ID NO 307 , SEQ ID NO 309 , SEQ ID NO: 311 , SEQ ID NO 313 , SEQ ID NO 315 , SEQ ID NO 317 , SEQ ID NO 319 , SEQ ID NO 321 , SEQ ID NO 323 , SEQ ID NO 325 , SEQ ID NO 327 , SEQ ID NO 329 , SEQ ID NO: 331 , SEQ ID NO 333 , SEQ ID NO 335 , SEQ ID NO 337 , SEQ ID NO 339 , SEQ ID NO 341 , SEQ ID NO 343 , SEQ ID NO 345 , SEQ ID NO 347 , SEQ ID NO 349 , SEQ ID NO 351 , SEQ ID NO 353 , SEQ ID NO 355 , SEQ ID NO 357 , SEQ ID NO 359 , SEQ ID NO 361 , SEQ ID NO 363 , SEQ ID NO 365 , SEQ ID NO 367 , SEQ ID NO 369 , SEQ ID NO. 371 , SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 O SEQ ID NO: 379, sobre una región de al menos alrededor de 100 residuos, donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, y las identidades de secuencia son determinadas por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual.

2. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la identidad de secuencia es al menos de alrededor de 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63% o 64%.

3. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la identidad de secuencia es de al menos alrededor de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77% , 78% , 79%, 80% , 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% , 91%,r 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o. mas de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO:; 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ i ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, J SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: : 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: : 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: : 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, ,SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: : 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: : 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ NO : 213, SEQ ! ID NO : 215, SEQ ! ID NO : 217, SEQ ID NO: : 219, SEQ ID NO : 221, SEQ ID NO: : 223, SEQ ID NO: : 225 , SEQ ID NO: : 227 , SEQ ID NO : 229, SEQ ! ID NO : 231, SEQ ID NO : 233 , SEQ ID NO: : 235, SEQ ID NO : 237, SEQ ID NO: : 239, SEQ ID NO: : 241, SEQ ID NO: : 243, SEQ ID NO : 245, SEQ ! ID NO : 247, SEQ ID NO : 249, SEQ ID NO: : 251 ·, SEQ ID NO : 253, SEQ ID NO : 255, SEQ ID NO : 257 ', SEQ ID NO: : 259 ', SEQ ID NO : 261, SEQ ID NO : 263, SEQ ID NO: : 265, SEQ ID NO: : 267, SEQ ID NO : 269, SEQ ID NO : 271, SEQ ID NO : 273, SEQ ID NO: : 275, SEQ ID NO : 277, SEQ ID NO : 279, SEQ ID NO: : 281 ,, SEQ ID NO: : 283, SEQ ID NO : 285, SEQ ID NO : 287, SEQ ID NO : 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379.

4. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la identidad de secuencia es sobre una región de al menos alrededor de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 o mas residuos, o la longitud completa de un gen o una transcripción. i

5. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO:' 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103 , SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: ni, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: !153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: ¡177, I SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183 , SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO : 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: ¡209, SEQ ID NO: 211, SEQ NO: 213, SEQ ID NO: 215, , SEQ ID NO: 217, , SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223 , SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273, ;SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, ' SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, , SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 o; SEQ ID NO: 379. :

6. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se señala en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ IQ NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:| 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID; NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO : 94 , ¡ SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO : 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO 104 , SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO 112 , SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO 120 , SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124 , SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO 128 , SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO 136 , SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO 144 , SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO 152 , SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO 160 , SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO 168 , SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174 , SEQ ID NO 176 , SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182 , SEQ ID NO 184 , SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO 192 , SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO 200 , SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204 , SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO 208 , SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO 216 , SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO 224 , SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 , SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO 232 , SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 262, SEO ID NO: 264, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284 , SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378 o SEQ ID NO : 380

7. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2, donde se establece' una lectura de filtro en blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las demás opciones son establecidas por defecto u omisión.

8. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de eslabones ß-1, 4 -xilosídicos internos.

9. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de xilanasa comprénde actividad de una endo-1, 4-beta-xilanasa .

10. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de xilanasa comprende hidrolizar un xilano para producir una xilosa de menor peso molecular y un oligómero xilo.

11. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 10, donde el xilano comprende un arabinoxilano.

12. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 11, donde el arabinoxilano comprende un arabinoxilano soluble en agua.

13. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 12, donde el arabinoxilano soluble en agua comprende un producto de masa o de pan. 1

14. El ácido nucleico aislado o recombinante dé la reivindicación 1, donde la actividad' de xilanasa comprende hidrolizar polisacáridos que comprenden D-xilopiranosas enlazadas por 1, 4^-glicósido. :

15. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de xilanasa comprende hidrolizar hemi-celulosas .

16. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de xilanasa comprende hidrolizar hemi-celulosas en una pulpa de madera o papel o un producto de papel.

17. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 8, donde la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de xilanos en un alimento o un producto alimenticio. !

18. El ácido nucleico aislado o recombinante dé la reivindicación 17, donde el alimento o producto alimenticio comprende un alimento animal a base de cereales, un mosto de cereza o una cerveza, leche o un producto de leche, una fruta o una verdura.

19. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de xilanos en una célula microbiana q una célula de planta.

20. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de xilanasa es termo-estable .

21. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 20, donde el polipéptido conserva una actividad de xilanasa bajo condiciones que comprende un rango de temperaturas de entre alrededor de 37 y alrededor de 95 °C, o entre alrededor de 55 y alrededor de 85 °C, o entre alrededor de 70 y alrededor de 75 °C, o entre alrededor de 70 y alrededor de 95 °C, o entre alrededor de 90 y alrededor de 95 °C. :

22. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de xilanasa es termo-tolerante .

23. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 22, donde el polipéptido conserva una actividad de xilanasa después de exposición a una temperatura en el rango de mas de 37 a alrededor de 95 °C, de mas de 55 a alrededor de 85 °C, o entre alrededor de 70 y alrededor de 75 °C, o de mas de 90 a alrededor de 95°C. ;

24. Un ácido nucleico aislado o recombinante, donde el ácido nucleico comprende una secuencia que híbrida bajo condiciones de astringencia en un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33/ SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID, NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67,: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID, NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, ' SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, ; SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205,' SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ NO: : 213, SEQ ID NO: : 215, SEQ ID NO: : 217, SEQ ID NO : 219, SEQ ID NO: : 221, SEQ ID NO: : 223 , SEQ ID NO: : 225, SEQ ID NO: : 227, SEQ ID NO: : 229, SEQ ID NO: : 231, SEQ ID NO: : 233, SEQ ID NO : 235, SEQ ID NO: : 237, SEQ ID NO: : 239, SEQ ID NO: : 241, SEQ ID NO: : 243, SEQ ID NO; : 245, SEQ ID NO: : 247, SEQ ID NO : 249, SEQ ID NO : 251, SEQ ID NO : 253, SEQ ID NO: : 255, SEQ ID NO: : 257, SEQ ID NO: : 259, SEQ ID NO: : 261, SEQ ID NO: : 263, SEQ ID NO : 265, SEQ ID NO : 267, SEQ ID NO: : 269, SEQ ID NO: : 271, SEQ ID NO: : 273, SEQ ID NO: : 275, SEQ ID NO: : 277, SEQ ID NO: : 279, SEQ ID NO : 281, SEQ ID NO : 283, SEQ ID NO: : 285, SEQ ID NO: : 287, SEQ ID NO: : 289, SEQ ID NO: : 291, SEQ ID NO : 293, SEQ ID NO: : 295, SEQ ID NO : 297, SEQ ID NO : 299, SEQ ID NO: : 301, SEQ ID NO: : 303, SEQ ID NO: : 305, SEQ ID NO : 307, SEQ ID NO : 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa!.

25. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 24, donde el ácido nucleico es de al menos alrededor de 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, í 900, 1000 o mas residuos de longitud o la longitud completa del I gen o la transcripción.

26. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 24, donde las condiciones de astringencia incluyen un paso de lavado que comprende un lavado en 0.2X SSC a ; una temperatura de alrededor de 65 °C por alrededor de 15 minutos.

27. Una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de xilanasa, donde la sonda comprende al menos 10 bases consecutivas de una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO : ,89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, ! SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, [ SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, i SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163 , SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, ! SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185,! SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193,: SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209,, SEQ ID NO: 211, SEQ NO : 213, SEQ ID NO : 215, SEQ ID NO: : 211 \ SEQ ID NO: : 219, SEQ ID NO : 221, SEQ ID NO : 223, SEQ ID NO : 225, SEQ ID NO: 227 SEQ ID NO: 229 SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235 SEQ ID NO: 237 SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 24 1, SEQ ID NO: 243 SEQ ID NO: 245 SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 24 9, SEQ ID NO: 251 SEQ ID NO: 253 SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 25 7, SEQ ID NO: 259 SEQ ID NO: 261 SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 26 5, SEQ ID NO: 267 SEQ ID NO: 269 SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 27 3, SEQ ID NO: 275 SEQ ID NO: 277 SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 28 1, SEQ ID NO: 283 SEQ ID NO: 285 SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 28 9, SEQ ID NO: 291 SEQ ID NO: 293 SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 29 7, SEQ ID NO: 299 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 30 5, SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 309 SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 31 3, SEQ ID NO: 315 SEQ ID NO: 317 SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 32 1, SEQ ID NO: 323 SEQ ID NO: 325 SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 32 9, SEQ ID NO: 331 SEQ ID NO: 333 SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 33 7, SEQ ID NO: 339 SEQ ID NO: 341 SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 34 5, SEQ ID NO: 347 SEQ ID NO: 349 SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 35 3, SE ID NO: 355 SEQ ID NO: 357 SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 36 1, SEQ ID NO: 363 SEQ ID NO: 365 SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 36 9, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379, donde la sonda identifica el ácido nucleico por ligadura o hibridación.

28. La sonda de ácido nucleico de la reivindicación 27, donde la sonda comprende un oligonucleótido que comprende al menos alrededor de 10 a 50, alrededor de 20 a 60, alrededor de 30 a 70, alrededor de 40 a 80, alrededor de 60 a 100, o alrededor de 50 a 150 bases consecutivas.

29. Una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, donde la sonda comprende un ácido nucleico que comprende al menos alrededor de 10 residuos consecutivos de una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 50% de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3,¡ SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO : 29,' SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID' NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63,! SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID, NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97,, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121,j SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137,1 SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153,, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, , SEQ ? ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, 3EQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ NO 213 , SEQ ID NO 215, SEQ ID NO 217 , SEQ ID NO 219, SEQ ID NO 221 , SEQ ID NO 223 , SEQ ID NO 225 , SEQ ID NO 227, SEQ ID NO 229 , SEQ ID NO 231, SEQ ID NO 233 , SEQ ID NO 235, SEQ ID NO 237 , SEQ ID NO 239, SEQ ID NO 241 , SEQ ID NO 243, SEQ ID NO 245 , SEQ ID NO 247, SEQ ID NO 249 , SEQ ID NO 251, SEQ ID NO 253 , SEQ ID NO 255, SEQ ID NO 257 , SEQ ID NO 259, SEQ ID NO 261 , SEQ ID NO 263, SEQ ID NO 265 , SEQ ID NO 267, SEQ ID NO 269 , SEQ ID NO 271, SEQ ID NO 273 , SEQ ID O 275, SEQ ID NO 277 , SEQ ID NO 279, SEQ ID NO 281 , SEQ ID NO 283, SEQ ID NO 285 , SEQ ID NO 287, SEQ ID NO 289 , SEQ ID NO 291, SEQ ID NO 293 , SEQ ID NO 295, SEQ ID NO 297 , SEQ ID O 299, SEQ ID NO 301 , SEQ ID NO 303, SEQ ID NO 305 , SEQ ID O 307, SEQ ID NO 309 , SEQ ID NO 311, SEQ ID NO 313 , SEQ ID O 315, SEQ ID NO 317 , SEQ ID NO 319, SEQ ID NO 321 , SEQ ID O 323, SEQ ID NO 325 , SEQ ID NO 327, SEQ ID NO 329 , SEQ ID O 331, SEQ ID NO333 , SEQ ID NO 335, SEQ ID NO 337 , SEQ ID O 339, SEQ ID NO 341 , SEQ ID NO 343 , SEQ ID NO 345 , SEQ ID O: 347, SEQ ID NO: 349 , SEQ ID NO 351, SEQ ID NO 353 , SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379, donde las identidades de secuencia son determinadas por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o . por inspección visual .

30. La sonda de ácido nucleico de la reivindicación 29, donde la sonda comprende un oligonucleótido que comprendé al menos alrededor de 10 a 50, alrededor de 20 a 60, alrededor de 30 a 70, alrededor de 40 a 80, alrededor de 60 a 100, o alrededor de 50 a 150 bases consecutivas.

31. Una par de cebadores de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, donde el par de cebadores es capaz de amplificar un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24, o una sub-secuencia de éstas. 1

32. El par de cebadores de amplificación dé la reivindicación 31, donde un miembro del par de secuencias de cebadores de amplificación comprende un oligonucleótido - que comprende al menos alrededor de 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia, o alrededor de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o mas bases consecutivas de la secuencia.

33. Un par de cebadores de amplificación, donde el par de cebadores comprende un primer miembro que tiene una secuencia como se señala por alrededor de los primeros (el 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o mas residuos de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO : ¡ 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID ??.:| 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO : 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO : 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: ,123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: il39, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: ¡155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ NO 213, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217 , SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223 , SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, 1 SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, ; SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273 , SEQ ID NO: 275, 1 SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, ! SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293 , SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, ' SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, ; SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323 ; SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343 , SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, ¡ SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373 , SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 O SEQ ID NO: 379, y ? un segundo miembro que tiene una secuencia como se señala por alrededor de los primeros (el 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,! 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o mas residuos del filamento complementario del primer miembro.

34. Un ácido nucleico que codifica una xilanása, generado por amplificación de un polinucleótido usando un par de cebadores de amplificación como se señala en la reivindicación 33.

35. El ácido nucleico que codifica una xilanasa de la reivindicación 34, donde la amplificación es por medio de la reacción de cadena de polimerasa (PCR) .

36. El ácido nucleico que codifica una xilanasa de la reivindicación 34, donde el ácido nucleico es generado por amplificación de una biblioteca de genes.

37. El ácido nucleico que codifica una xilanasa de la reivindicación 34, donde la biblioteca de enes es una bibli teca ambiental .

38. Una xilanasa aislada o recombinante , codificada por un ácido nucleico que codifica una xilanasa, como se señala en la reivindicación 34.

39. Un método de amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa,: que comprende amplificación de un ácido nucleico de plantilla con un i par de secuencias de cebador de amplificación capaces de amplificar una secuencia de ácido nucleico como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24, o una sub-secuencia de las mismas.

40. Un cásete de expresión, que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24.

41. Un vector, que comprende un ácido nucleico 'que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación : 1 o la reivindicación 24.

42. Un vehículo de clonación, que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24, donde el vehículo de clonación comprende un vector viral, un plásmido, un fago, un fagémido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago, o un cromosoma artificial .

43. El vehículo de clonación de la reivindicación 42, donde el vector viral comprende un vector de adenovirus un vector retroviral, o un vector viral adeno-asociado .

44. El vehículo de clonación de la reivindicación 42, que comprende un cromosoma bacteriano artificial (BAC) ,! un plásmido, un vector derivado de bacteriófago Pl (PAC) ,' un cromosoma de levadura artificial (YAC) , o un cromosoma de mamífero artificial (MAC) .

45. Una célula transformada, que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24.

46. Una célula transformada, que comprende un cásete de expresión como se señala en la reivindicación 40.

47. La célula transformada de la reivindicación 40, donde la célula es una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fungal, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de planta.

48. Un animal transgénico no humano, que comprende; una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o ) la reivindicación 24.

49. El animal transgénico no humano de' la reivindicación 48, donde el animal es un ratón.

50. Una planta transgénica que comprende una secuencia i como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24.

51. La planta transgénica de la reivindicación 50, donde la planta es una planta de maíz, una planta de sorgo, una planta de papa, una planta de jitomate, una planta de trigo, | una planta de semilla de aceite, una planta de semilla de colza,, una planta de frijol de soja, una planta de arroz, una planta de cebada, un pasto, o una planta de tabaco.

52. Una semilla transgénica, que comprende I una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o' la reivindicación 24.

53. La semilla transgénica de la reivindicación 52, donde la semilla es una semilla de maíz, un kernel de trigo, una semilla de aceite, una semilla de colza, una semilla de frijol de soja, un kernel de palma, una semilla de girasol, una semilla de ajonjolí, un arroz, una cebada, un cacahuate, o una semilla de planta de tabaco.

54. Un oligonucleótido anti-sentido, que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a o capaz de hibridar bajo condiciones de astringencia con una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24, o una sub-secuencia de las mismas.

55. El oligonucleótido anti-sentido de la reivindicación 49, donde el oligonucleótido anti-sentido es de entre alrededor de 10 a 50, alrededor de 20 a 60, alrededor de 30 a 70, alrededor de 40 a 80, o alrededor de 60 a 100 bases de longitud.

56. Un método de inhibir la traducción de un mensaje de xilanasa en una célula, que comprende administrar a la célula o expresar en la célula un oligonucleótido anti-sentido que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria cpn o capaz de hibridar bajo condiciones de astringencia co una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24. 1

57. Una molécula de ARN inhibitorio (iARN) , de doble i hélice, que comprende una sub-secuencia de una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24. '

58. Una molécula de ARN inhibitorio (iARN), de doble hélice, de la reivindicación 52, donde el iARN es de alrededor de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o mas nucleótidos dúplex de longitud.

59. Un método de inhibir la expresión de una xilanasa en una célula, que comprende administrar a la célula o expresar en la célula un ARN inhibitorio (iARN) de doble hélice, donde el ARN comprende una sub- secuencia de una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24.

60. Un polipéptido aislado o recombinante, (i) teniendo al menos 50% de identidad de secuencias con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 'SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO:, 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52,, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ??' NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86,' SEQ t ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ iq NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ iti NO: 136 SEQ ID NO 138 SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 142 SEQ ID NO; 144 SEQ ID NO 146 SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 150 SEQ ID: NO: 152 SEQ ID NO 154 SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO: 158 SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO 162 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 166 SEQ ID NO: 168 SEQ ID NO 170 SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 174 SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO 178 SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO: 182 SEQ ID, NO 184 SEQ ID NO 186 SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO: 190 SEQ ID NO 192 SEQ ID NO 194 SEQ ID NO: 196 SEQ ID NO: 198 SEQ ID NO 200 SEQ ID NO 202 SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO: 206 SEQ ID; NO: 208 SEQ ID NO 210 SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 214 SEQ ID NO: 216 SEQ ID NO 218 SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 222 SEQ ID NO 224 SEQ ID NO 226 SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO 232 SEQ ID NO 234 SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO 240 SEQ ID NO 242 SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 246 SEQ ID NO 248 SEQ ID NO 250 SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 254 SEQ ID NO 256 SEQ ID NO 258 SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 262 SEQ ID NO 264 SEQ ID NO 266 SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 270 SEQ ID NO 272 SEQ ID NO 274 SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO 280 SEQ ID NO 282 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO 288 SEQ ID NO 290 SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 294 SEQ ID NO i 296 SEQ ID NO 298 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO: 302 SEQ ID NO 304 SEQ ID NO 306 SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO: 310 SEQ ID NO t 312 SEQ ID NO 314 SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 318 SEQ ID NO 320 SEQ ID NO 322 SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO: 326 SEQ ID NO 328 SEQ ID NO 330 SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO: 334 SEQ ID NO 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 342, SEQ ID. NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO : 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID, NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO : 376, SEQ ID NO: 378 o SEQ ID NO: 380, sobre una región de al menos alrededor de 100 residuos, donde las identidades, de secuencia son determinadas por medio de análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual, o (ii) codificado por un ácido nucleico que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ?> NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163 , SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173 , SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ NO: 213 , SEQ ID; NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO 231, SEQ ID NO: 233 , SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, SEQ NO 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 261, SEQ ID, NO 263 , SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO 271, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID' NO 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO : 323, SEQ ID NO : 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: : 331, SEQ ID NO : 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO : 339, SEQ ID NO : 341, SEQ ID NO: 343 , SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: : 347, SEQ ID NO : 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO : 355, SEQ ID NO : 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: : 363, SEQ ID NO : 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO : 371, SEQ ID NO : 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379, sobre una región de al menos alrededor de 100 residuos, y las identidades de secuencia son determinadas por medio de análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual, o codificado por un ácido nucleico capaz de hibridar, bajo condiciones de astringencia, con una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID i NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID(NO: i 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 43, ; SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID, NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO:, 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103 , SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: Í91, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: : 211, SEQ NO: 213, , SEQ ID NO: 215, , SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, , SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, ' SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, , SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 255, 1 SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295/ SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, ¡ SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379.

61. El polipéptido aislado o recombinante de reivindicación 60, donde la identidad de secuencia es sobre región de al menos alrededor de 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% , 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% , 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85% , 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99%, o mas, o es 100% de identidad de secuencia.

62. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 60, donde la identidad de secuencia es sobre una región de al menos alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40,; 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o mas residuos, o toda la longitud de una enzima.

63. El polipéptido aislado o recombinante dé la reivindicación 60, donde el polipéptido tiene una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: ,58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO : 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96 , SEQ ID NO : 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO : 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO : 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118 , SEQ ID NO : 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO : 144 , SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, ; SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO : 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164,; SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172,! SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO : 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO : 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206 , SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214 , SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222 , SEQ ID NO: 224 , SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228, ; SEQ ID NO: 230 , SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238 , SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246 , SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 252, : SEQ 1 ID NO: 254 , SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 262 , SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 270 , SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274 , SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 278 , SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286 , SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294 , SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302 , SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308,i SEQ ID NO: 310 , SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318 , SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 326 , SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 332, ¡ SEQ ID NO: 334 , SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340,' SEQ ID NO: 342 , SEQ ID NO: 344 , SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350 , SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358 , SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364 SEQ ID NO: 366 , SEQ ID NO: 368 , SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374 , SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378 O SEQ ID NO : 380

64. El polipéptido aislado o recombinante dé la reivindicación 60, donde el polipéptido tiene una actividad xilanasa .

65. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 64, donde la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de eslabones ß-1 , 4 -xilosídicos internos.

66. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 65, donde la actividad de xilanasa comprende una actividad de endo-1 , 4 -beta-xilanasa .

67. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 64, donde la actividad de xilanasa comprende hidrolizar un xilano para producir una xilosa de menor peso molecular y un oligómero xilo.

68. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 67, donde el xilano comprende un arabinoxilano .

69. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 68, donde el arabinoxilano comprende un arabinoxilano soluble en agua.

70. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 69, donde el arabinoxilano soluble en agua comprende un producto de masa o de pan.

71. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 64, donde la actividad de xilanasa comprende hidrolizar polisacáridos que comprenden D-xilopiranosas enlaz.adas por 1, - -glicósido. ;

72. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 1, donde la actividad de xilanasa comprende hidrolizar hemi-celulosas .

73. El polipéptido aislado o recombinante de la t reivindicación 72, donde la actividad de xilanasa comprende hidrolizar hemi-celulosas en una pulpa de madera o papel o un producto de papel.

74. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 73, donde la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de xilanos en un alimento o un producto alimenticio .

75. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 74, donde el alimento o producto alimenticio comprende un alimento animal a base de cereales, un mosto de cereza o una cerveza, leche o un producto de leche, una fruta o una verdura. i

76. El polipéptido aislado o recombinante de la i reivindicación 64, donde la actividad de xilanasa comprende catalizar la hidrólisis de xilanos en una célula microbiana o una célula de planta.

77. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 64, donde la actividad de xilanasa es termo-estable.

78. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 77, donde el polipéptido conserva una actividad de xilanasa bajo condiciones que comprende un rango de temperaturas de entre alrededor de 37 y alrededor de 95°'C, o entre alrededor de 55 y alrededor de 85°C, o entre alrededor de 70 y alrededor de 75°C, o entre alrededor de 70 y alrededor de 95°C, o entre alrededor de 90 y alrededor de 95°C.

79. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 64, donde la actividad de xilanasa es termo-tolerante .

80. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 79, donde el polipéptido conserva una actividad de xilanasa después de exposición a una temperatura en el rango de mas de 37 a alrededor de 95 °C, de mas de 55 a alrededor de 85 °C, o entre alrededor de 70 y alrededor de 75°C, o de mas de 90 a alrededor de 95°C.

81. Un polipéptido aislado o recombinante, que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 60 y careciendo de una secuencia de señal o una secuencia prepro.

82. Un polipéptido aislado o recombinante, que i comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 60 y teniendo una secuencia de señal heteróloga o una secuencia prepro heteróloga.

83. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 64, donde la actividad de xilanasa comprende una i actividad específica a alrededor de 37 °C en el rango de alrededor de 100 a alrededor de 1,000 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 500 a alrededor de 750 unidades por miligramo de proteína, de alrededor de 500 a alrededor de 1,200 unidades por miligramo de proteína, o de alrededor de 750 a alrededor de 1,000 unidades por miligramo de proteína.

84. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 79, donde la termo-tolerancia comprende conservación de al menos la mitad de la actividad específica de la xilanasa a 37 °C después de ser calentada a una temperatura elevada.

85. El polipéptido aislado o recombinante de, la reivindicación 79, donde la termo-tolerancia comprende; la conservación de la actividad específica a 37 °C en el rango de alrededor de 500 a alrededor de 1,200 unidades por miligramo de proteína después de ser calentada a una temperatura elevada.

86. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 60, donde el polipéptido comprende al menos un sitio de glicosilación.

87. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 86, donde la glicosilación es una glicosilación N-enlazada.

88. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 87, donde el polipéptido es glicosilado después de ser expresado en P. pastoris o S. pombe.

89. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 64, donde el polipéptido conserva una actividad de xilanasa bajo condiciones que comprenden un pH de alrededor de 6.5 , un pH de 6.0 , un pH de 5.5, un pH de 4.5 , o un pH de 4.0.

90. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 64, donde el polipéptido conserva una actividad de xilanasa bajo condiciones que comprenden un pH de alrededor de 7.5, un pH de 8.0, un pH de 8.5, un pH de 9.0, un pH de 9.5, un pH de 10 o un pH de 10.5. ,

91. Una preparación de proteína, que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 60, donde la preparación de proteína comprende un líquido, un sólido o un gel.

92. Un heterodímero, que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 60 y un segundo dominio.

93. El heterodímero de la reivindicación 92, donde el segundo dominio es un polipéptido y el heterodímero es una proteína de fusión.

94. El heterodímero de la reivindicación 92, donde el segundo dominio es un epítopo o un marcador.

95. Un homodímero, que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 60.

96. Un polipéptido inmovilizado, donde el polipéptido comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 60, o una sub-secuencia de la misma. '

97. El polipéptido inmovilizado de la reivindicación 96, donde el polipéptido es inmovilizado sobre una célula, un metal, una resina, un polímero, un material cerámico, un vidrio, un micro-electrodo, una partícula de grafito, una perla, un gel, una placa, un arreglo o un tubo capilar.

98. Un arreglo, que comprende un polipéptido inmovilizado como se señala en la reivindicación 60. 1

99. Un arreglo, que comprende un ácido nucleico inmovilizado como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24.

100. Un anti-cuerpo aislado o recombinante que se liga específicamente a un polipéptido como se señala en la reivindicación 60.

101. El anti-cuerpo aislado o recombinante de la reivindicación 100, donde el anti-cuerpo es un anti-cuerpo monoclonal o policlonal. '

102. Un hibridoma, que comprende un anti-cuerpo que se liga específicamente a un polipéptido como se señala en la reivindicación 60.

103. Un método de aislar o identificar un polipéptido con una actividad de xilanasa, que comprende los pasos de: (a) proveer un anti-cuerpo como se señala en la reivindicación 100; (b) proveer una muestra que comprende polipéptidos ; y (c) poner en contacto la muestra del paso (b) con el anti-cuerpo del paso (a) bajo condiciones donde el anti-cuerpo puede ligarse específicamente al polipéptido, con ello aislando o identificando un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa. |

104. Un método de hacer un anti-cuerpo anti-xilanasa, que comprende administrar a un animal no humano un ácido nucleico como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24 o una sub-secuencia de éstos, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, con ello haciendo un anticuerpo anti-xilanasa .

105. Un método de hacer un anti-cuerpo anti-xilanasa, que comprende administrar a un animal no humano un polipép ido como se señala en la reivindicación 60, o una sub-secuencia del mismo, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, con ello haciendo un anti-cuerpo anti-xilanasa.

106. Un método de producir un polipéptido recombinante, que comprende los pasos de: (a) proporcionar un ácido nucleico enlazado operativamente a un promotor, donde el ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; y (b) expresar el ácido nucleico del paso (a) bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido, con ello produciendo un polipéptido recombinante . '

107. El método de la reivindicación 106, comprendiendo además transformar una célula hospedera con el ácido nucleico del paso (a) , seguido por expresar el ácido nucleico del paso (a) , con ello produciendo un polipéptido recombinante en una célula transformada.

108. Un método para identificar un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar un polipéptido como se señala en la -reivindicación 64; (b) proporcionar un sustrato de xilanasa; y (c) poner en contacto el polipéptido con el sustrato del paso (b) y detectar una reducción en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, dónde una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción detectan un polipéptido ¡que tiene una actividad de xilanasa.

109. Un método para identificar un sustrato de xilanasa, que comprende los pasos siguiente: (a) proporcionar un polipéptido como se señala en la reivindicación 64 ; (b) proporcionar un sustrato de prueba y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el sustrato de prueba del paso (b) y detectar una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad! del producto de reacción, donde una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción identifica el sustrato de prueba como un sustrato de xilanasa.

110. Un método de determinar si un compuesto de prueba se liga específicamente con un polipéptido, que comprende los pasos siguientes: (a) expresar un ácido nucleico o un vector ; que comprende el ácido nucleico bajo condiciones que permitan- la traducción del ácido nucleico en un polipéptido, donde el ácido nucleico tiene una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24 ; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de prueba; y (d) determinar si el compuesto de prueba del paso (b) se liga específicamente al polipéptido.

111. Un método de determinar si un compuesto de prueba se liga específicamente a un polipéptido, que comprende los pasos siguientes : (a) proporcionar un polipéptido como se señala en la reivindicación 60; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de prueba; y < (d) determinar si el compuesto de prueba del paso (b) se liga específicamente al polipéptido.

112. Un método de identificar un modulador de; una actividad de xilanasa, que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar un polipéptido como se señala en la reivindicación 64; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con el compuesto de prueba del paso (b) y medir una actividad de la xilanasa, donde un cambio en la actividad de xilanasa medida en presencia del compuesto de prueba comparada con la actividad en ausencia del compuesto de prueba proporciona una determinación de que el compuesto de prueba modula la actividad de xilanasa.

113. El método de la reivindicación 112, donde la actividad de xilanasa es medida proporcionando un sustrato de xilanasa y detectando una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, o un incremento en la cantidad del sustrato o una reducción en la cantidad de un producto de reacción.

114. El método de la reivindicación 113, donde una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba en comparación con la cantidad del sustrato o el producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica el compuesto de prueba como un activador de una actividad de xilanasa.

115. El método de la reivindicación 113, donde un incremento en la cantidad del sustrato o una reducción en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba en comparación con la cantidad del sustrato o el producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica el compuestb de prueba como un inhibidor de una actividad de xilanasa.

116. Un sistema de computador, que comprendé un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos, donde dicho dispositivo de almacenamiento de datos tiene almacenado en el mismo una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de polipéptido comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 60, un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24.

117. El sistema de computador de la reivindicación 115, comprendiendo además un algoritmo de comparación de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene al menos una secuencia de referencia almacenada en el mismo.

118. El sistema de computador de la reivindicación 117, donde el algoritmo de comparación de secuencias comprende un programa de computador que indica polimorfismos.

119. El sistema de computador de la reivindicación 117, comprendiendo además un identificador que identifica una o mas características en dicha secuencia.

120. Un medio legible por computador que tiene almacenado en él una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de polipéptido comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 60; un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24.

121. Un método para identificar una característica en una secuencia, que comprende los pasos de: (a) leer la secuencia usando un programa de computador que identifica una o mas características en una secuencia, donde la secuencia comprende una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de polipéptido comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 60; un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; y (b) identificar una o mas características en la secuencia con el programa de computador.

122. Un método para comparar una primera secuencia; con una segunda secuencia, que comprende los pasos de: (a) leer la primera secuencia y la segunda secuencia mediante el uso de un programa de computador que compara secuencias, donde la primera secuencia comprende una secuencia de polipéptido o una secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de polipéptido comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 60, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; y (b) determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa de computador. '

123. El método de la reivindicación 122, donde el paso de determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia comprende además el paso de identificar polimorfismos.

124. El método de la reivindicación 123, comprendiendo además un identificador que identifica una o mas características en una secuencia.

125. El método de la reivindicación 124, comprendiendo leer la primera secuencia usando un programa de computador e identificar una o mas características en la secuencia.

126. Un método para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de xilanasa de una muestra ambiental, que comprende los pasos de: (a) proporcionar un par de secuencia de cebador, de amplificación como se señala en la reivindicación 31 o 1 la reivindicación 33; (b) aislar un ácido nucleico de la muestra ambiental o tratar la muestra ambiental tal que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para hibridación al par de cebadores de amplificación; y (c) combinar el ácido nucleico del paso (b) con el ¡par de cebadores de amplificación del paso (a) y amplificar el ácido nucleico a partir de la muestra ambiental, con ello aislando o recuperando un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de xilanasa a partir de una muestra ambiental.

127. El método de la reivindicación 126, donde cada miembro del par de secuencias de cebador de amplificación comprende un oligonucleótido que comprende al menos alrededor de t 10 a 50 bases consecutivas de una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, ¡SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID ' NO : 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO : 99, SEQ ID NO: 101, , SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO : 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO : 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO : 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO : 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, , SEQ ID NO: 143 , SEQ ID NO : 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, ! SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO : 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, : SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO : 161, SEQ ID NO: 163 , SEQ ID NO: 165,, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO : 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173,' SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO : 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181,: SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO : 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, ; SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO : 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO : 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205,, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO : 209, SEQ ID NO: 211, SEQ NO: : 213, SEQ ID NO: ; 215i, SEQ ID NO: : 217, SEQ ID NO: : 219, SEQ ID NO: 221 ., SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233 SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241 SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 , SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257 SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265 , SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273 SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281 , SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289 SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297 , SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305 , SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313 , SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321 , SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329 , SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333 , SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337 , SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345 , SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353 , SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361 , SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369 , SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 O SEQ ID NO: 379, o una sub- secuencia de éstas.

128. Un método para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de xilanasa a partir de una muestra ambiental, que comprende los pasos de : proporcionar una sonda de polinucleótido ; que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24, o una sub-secuencia de éstas; (b) aislar un ácido nucleico a partir de la muestra ambiental o tratar la muestra ambiental tal que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para hibridación a una sonda de polinucleótido del paso (a) ; (c) combinar el ácido nucleico aislado o la muestra ambiental tratada del paso (b) con la sonda de polinucleótido del paso (a) ; y (d) aislar un ácido nucleico que híbrida de manera específica con la sonda de polinucleótido del paso (a) , con ello aislando o recuperando un ácido nucleico que codifica1 un polipéptido con una actividad de xilanasa a partir de una muestra ambiental .

129. El método de la reivindicación 127 o, la reivindicación 128, donde la muestra ambiental comprende . una muestra de agua, una muestra líquida, una muestra de tierra, luna muestra de aire, o una muestra biológica.

130. El método de la reivindicación 129, donde la muestra biológica es derivada de una célula bacteriana, ' una célula de protozoario, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, una célula fungal, o una célula de mamífero.

131. Un método de generar una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de xilanasa, que comprende los pasos de: ¡ (a) proporcionar un ácido nucleico de plantilla que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; y (b) modificar, eliminar o añadir uno o mas nucleótidos en la secuencia de plantilla, o una combinación de estas acciones, para generar una variante del ácido nucleico de plantilla .

132. El método de la reivindicación 131, comprendiendo además expresar el ácido nucleico variante para generar un polipéptido de xilanasa variante.

133. El método de la reivindicación 131, donde las i modificaciones, adiciones o eliminaciones son introducidas por medio de un método que comprende PCR susceptible a error, revoltura, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, PCR de ensamble, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recurs'iva, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica al sitio, re-ensamble de genes, mutagénesis saturada en sitio de gen (GSSM®) , re-ensamble de ligadura sintética (SLR) , y una combinación de estas técnicas.

134. El método de la reivindicación 131, donde las modificaciones, adiciones o eliminaciones son introducidas por medio de un método que comprende recombinación, recombinación recursiva de secuencias, mutagénesis de ADN modificada; por fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, rautagénesis dúplex con espacios, mutagénesis de reparación de falta de correspondencia de puntos, mutagénesis de cepas hospederas deficientes en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de eliminación, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y una combinación de estas técnicas.

135. El método de la reivindicación 131, donde el método es repetido de manera iterativa hasta que se produce una í xilanasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente respecto de las de un polipéptido codificado por el ácido nucleico de plantilla.

136. El método de la reivindicación 135, donde el polipéptido de xilanasa variante es termo-tolerante, y conserva cierta actividad después de ser expuesto a una temperatura elevada.

137. El método de la reivindicación 135, donde el polipéptido de xilanasa variante tiene glicosilacion incrementada en comparación con la xilanasa codificada por un ácido nucleico de plantilla. ;

138. El método de la reivindicación 135, donde el polipéptido de xilanasa variante tiene una actividad de xilanasa bajo una temperatura elevada, donde la xilanasa codificada por el ácido nucleico de plantilla no es activa bajo la temperatura elevada.

139. El método de la reivindicación 131, donde el método es repetido de manera iterativa hasta que se produce una secuencia de codificación de xilanasa que tiene un uso de códón alterado respecto de aquél del ácido nucleico de plantilla.

140. El método de la reivindicación 131, donde el método es repetido de manera iterativa hasta que se produce un gen de xilanasa que tiene un nivel mayor o menor de expresión de mensaje o estabilidad respecto de las del ácido nucleico de plantilla .

141. Un método para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de xilanasa para incrementar su expresión en una célula hospedera, i el método comprendiendo los pasos siguientes: (a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de xilanasa que comprende ; una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24 ; y (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazarlo con un codón preferido o usado de manera neutral que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, donde un codón preferido es un codón sobre-representado en secuencias de codificación en genes en la célula hospedera y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en las secuencias de codificación en genes en la célula hospedera, con ello modificando el ácido nucleico para incrementar su expresión en una célula hospedera.

142. Un método para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido de xilanasa, el método comprendiendo los pasos siguientes: (a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de xilanasa que comprende , una secuencia como se señala en la reivindicación o la reivindicación 24; y : (b) identificar un codón en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazarlo con un codón diferente que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, con ello modificando codones en un ácido nucleico que codifica una xilanasa.

143. Un método para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido de xilanasa para incrementar su expresión en una célula hospedera, el método comprendiendo los pasos siguientes : i (a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de xilanasa comprendiendo una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; y (b) identificar un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazarlo con un codón preferido o usado de manera neutral que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, donde un codón preferido es un codón sobre-representado en las secuencias de codificación en genes en la célula hospedera y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en secuencias' de codificación en genes en la célula hospedera, con ello modificando el ácido nucleico para incrementar su expresión en una célula hospedera.

144. Un método para modificar un codón en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa para reducir su expresión en una célula hospedera, el 1 método comprendiendo los pasos siguientes: (a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de xilanasa que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; y (b) identificar al menos un codón preferido en el ácido nucleico del paso (a) y reemplazarlo con un codón no preferido o menos preferido que codifica el mismo aminoácido que el codón reemplazado, donde un codón preferido es un codón sobre-representado en secuencias de codificación en genes en una célula hospedera y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en secuencias de codificación en genes en la célula hospedera, con ello modificando el ácido nucleico para reducir su expresión en una célula hospedera. ¡

145. El método de la reivindicación 144, donde la célula hospedera es una célula bacteriana, una célula fungal> una I célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, o una célula de mamífero.

146. Un método para producir una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos, de xilanasa modificada o sitios de ligadura de sustrato, donde . los sitios activos modificados o los sitios de ligadura de sustrato son derivados de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de ligadura de sustrato, el método comprendiendo los pasos siguientes: (a) proporcionar un primer ácido nucleico que codifica un' primer sitio activo o un primer sitio de ligadura, donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que híbrida, bajo condiciones de astringencia, a una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:, 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO : 22 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95 , SEQ ID NC): 97, SEQ ID' NO : 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO : 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO : 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO : 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO : 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO : 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO : 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO : 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO : 199, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO : 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO : 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO : 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO : 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO : 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ NO: 213, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID| NO 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ in NO 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO 253 , SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ id NO 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID¡ NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313 , SEQ ID NO: 315, SEQ ID; NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID; NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363 , SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377 o SEQ ID NO: 379, o una sub-secuencia de las mismas, y el ácido nucleico codifica un sitio activo de xilanasa o un sitio de ligadura de sustrato de xilanasa; (b) proporcionar un conjunto de oligonucleótidos mutagénicos que codifican variantes de aminoácidos que ocurren de manera natural en una pluralidad de codones objetivados en el primer ácido nucleico; y (c) usar el conjunto de oligonucleótidos mutagénicos para generar un conjunto de ácidos nucleicos variantes! que codifican sitios activos o codifican sitios de ligadura de sustrato, que codifican una gama de variaciones de aminoácidos en cada codón de aminoácido que fue mutagenizado, con ello produciendo una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de xilanasa modificados o sitios de ligadura de sustrato.

147. El método de la reivindicación 145, comprendiendo mutagenizar el primer ácido nucleico del paso (a) por medio de un método que comprende un sistema de evolución dirigida optimizado, mutagénesis por saturación de sitios de genes I (GSSM®) , o un re-ensamble de ligadura sintética (SLR) .

148. El método de la reivindicación 145, que comprende mutagenizar el primer ácido nucleico del paso (a) o variantes por medio de un método que comprende PCR PCR susceptible a error, revoltura, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, PCR de ensamble, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de cásete, mutagénesis de ensamble recursiva, mutagénesis de ensamble exponencial, mutagénesis específica al sitio, re-ensamble de genes, mutagénesis saturada en sitio de gen (GSSM®) , re-ensamble de ligadura sintética (SLR) , y i una combinación de estas técnicas .

149. El método de la reivindicación 145, que comprende mutagenizar el primer ácido nucleico del paso (a) variantes por í medio de un método que comprende recombinación, recombmacion recursiva de secuencias, mutagénesis de ADN modificada por fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con espacios, mutagénesis de reparación de falta de correspondencia de puntos, mutagénesis de cepas hospederas deficientes en reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de eliminación, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesisi de ensamble, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y una combinación de estas técnicas. i

150. Un método para hacer una molécula pequeña, ¡que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar una pluralidad de enzimas bio-sintéticas capaces de sintetizar o modificar una molécula pequeña, donde una de las enzimas comprende una enzima xilanasa codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; (b) proporcionar un sustrato para al menos una de las enzimas del paso (a) ; y (c) hacer reaccionar el sustrato del paso (b) con¡ las enzimas bajo condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones bio-catalíticas para generar una pequeña molécula mediante una serie de reacciones bio-catalíticas. i

151. Un método para modificar una pequeña molécula, que comprende los pasos siguientes : (a) proporcionar una enzima xilanasa, donde la enzima comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 64, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; (b) proporcionar una pequeña molécula; y (c) hacer reaccionar la enzima del paso (a) con la pequeña molécula del paso (b) bajo condiciones que facilitan una reacción enzimática catalizada por la enzima xilanasa, con eíllo modificando una molécula pequeña por medio de una reacción enzimática de xilanasa. ,

152. El método de la reivindicación 151, que comprende una pluralidad de sustratos de molécula pequeña para la enzima del paso (a) , con ello generando una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas por al menos una reacción enzimática catalizada por la enzima xilanasa.

153. El método de la reivindicación 151, comprendiendo i además una pluralidad de enzimas adicionales bajo condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones bio-catalíticas por parte de las enzimas para formar una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producidas por la pluralidad de reacciones enzimáticas. !

154. El método de la reivindicación 153, comprendiendo además el paso de probar la biblioteca para determinar si' una molécula pequeña modificada, particular, que exhibe una actividad deseada, está presente dentro de la biblioteca.

155. El método de la reivindicación 154, donde el paso de probar la biblioteca comprende además los pasos de eliminar de manera sistemática todas salvo una de las reacciones bio-catalíticas usadas para producir una porción de la pluralidad de moléculas pequeñas modificadas dentro de la biblioteca probando la porción de la molécula pequeña modificada en cuanto a la presencia o ausencia de la molécula pequeña modificada, particular, con una actividad deseada, e identificar al menos una reacción bio-catalítica específica que produce la molécula pequeña modificada, particular, de actividad deseada.

156. Un método para determinar un fragmento funcional de una enzima xilanasa, que comprende los pasos de: (a) proporcionar una enzima xilanasa, donde la enzima comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 64, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico, como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; y (b) eliminar una pluralidad de residuos de aminoácidos de la secuencia del paso (a) y probar la sub-secuencia remanente en cuanto a actividad de xilanasa, con ello determinando un fragmento funcional de una enzima xilanasa.

157. El método de la reivindicación 156, donde la actividad de xilanasa es medida proporcionando un sustrato de xilanasa y eliminando una reducción en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción.

158. Un método para ingeniería de células completas de fenotipos nuevos o modificados, usando análisis de flujo metabólico en tiempo real, el método comprendiendo los siguientes pasos: ! (a) hacer una célula modificada modificando la composición genética de una célula, donde la composición genética es modificada por adición a la célula de un ácido nucleico 'que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; (b) cultivar la célula modificada para generar 'una pluralidad de células modificadas; (c) medir al menos un parámetro metabólico de la célula monitoreando el cultivo celular del paso (b) en tiempo real; y (d) analizar los datos del paso (c) para determinar si el parámetro medido difiere de una medición comparable en una célula no modificada bajo condiciones similares, con ello identificando un fenotipo de ingeniería en la célula usando análisis de flujo metabólico en tiempo real.

159. El método de la reivindicación 158, donde la composición genética de la célula es modificada por medio de un método que comprende la eliminación de una secuencia o la modificación de una secuencia en la célula, o la supresión de la expresión de un gen.

160. El método de la reivindicación 158, comprendiendo además seleccionar una célula que comprende un fenotipo recién creado por ingeniería.

161. El método de la reivindicación 160, comprendiendo además cultivar la célula seleccionada, con ello generando una nueva cepa celular que comprende un fenotipo recién creadp por ingeniería.

162. Una secuencia de señal aislada o recombinante, que consiste en una secuencia como se señala en los residuos 1 a 14, l a 15, 1 a 16, 1 a 17, l a 18, 1 a 19, 1 a 20, l a 21, 1 a 22, 1 a 23, l a 24, 1 a 25, 1 a 26, l a 27, 1 a 28, l a 2?, 1 a 30, l a 31, 1 a 32, 1 a 33, l a 34, 1 a 35, 1 a 36, l a 3 , 1 a 38, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, o l a 44, de la SEQ ID, NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO : 82, SEQ ID NO: : 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, ! 3EQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: : 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID, NO: 104, SEQ ID NO: : 106, SEQ ID NO : 108, SEQ ID NO: 110, SEQ NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: : 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: : 122, SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128 , SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: : 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: : 138, SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: : 154 , SEQ ID NO : 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO : 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: I SEQ ID NO: 170 SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 174 SEQ ID NO SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO: 182 SEQ ID NO SEQ ID NO: 186 SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO: 190 SEQ ID| NO SEQ ID NO: 194 SEQ ID NO: 196 SEQ ID NO: 198 SEQ ID NO SEQ ID NO: 202 SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO: 206 SEQ ID! NO SEQ ID NO: 210 SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 214 SEQ ID NO SEQ ID NO: 218 SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 222 SEQ ID NO SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 246 SEQ ID' NO SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 254 SEQ ID NO SEQ ID NO: 258 SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 262 SEQ ID NO SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 270 SEQ ID NO SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO SEQ ID NO: 282 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO SEQ ID NO: 290 SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 294 SEQ ID NO SEQ ID NO: 298 SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO: 302 SEQ ID NO SEQ ID NO: 306 SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO: 310 SEQ ID NO i SEQ ID NO: 314 SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 318 SEQ ID NO SEQ ID NO: 322 SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO: 326 SEQ ID NO SEQ ID NO: 330 SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO: 334 SEQ ID NO SEQ ID NO: 338 SEQ ID NO: 340 SEQ ID NO: 342 SEQ ID NO SEQ ID NO: 346 SEQ ID NO: 348 SEQ ID NO: 350 SEQ ID NO SEQ ID NO: 354 SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO: 358 SEQ ID NO SEQ ID NO: 362 SEQ ID NO: 364 SEQ ID NO: 366 SEQ ID NO 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378 o SEQ ID NO: 380; o que consiste en una secuencia como se señala en la Tabla 4.

163. Un polipéptido quimérico, que comprende al menos un primer dominio que comprende un péptido de señal (SP) que tiene una secuencia como se señala en la reivindicación 162, y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, donde el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado de manera natural con el péptido de señal (SP) .

164. El polipéptido quimérico de la reivindicación 163, donde el polipéptido o péptido heterólogo no es una xilanasa .

165. El polipéptido quimérico de la reivindicación 163, donde el polipéptido o péptido heterólogo es amino terminal a, carboxi terminal a, o en ambos extremos del péptido de señal (SP) o un dominio catalítico (CD) de xilanasa. ,

166. Un ácido nucleico aislado o recombinante, : que codifica un polipéptido quimérico, donde el polipéptido quimérico comprende al menos un primer dominio que comprende un péptido de señal (SP) que tiene una secuencia como se señala en la reivindicación 162 y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, donde el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado de manera natural con el péptido de señal (SP) .

167. Un método de incrementar la termo-tolerancia o la termo-estabilidad de un polipéptido de xilanasa, el método comprendiendo glicosilar una xilanasa, donde el polipéptido comprende al menos treinta aminoácidos contiguos de 1 un polipéptido como se señala en la reivindicación 60, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24, con ello incrementando la termo-tolerancia o la termo-estabilidad de la xilanasa .

168. Un método para sobre-expresar una xilanasa recombinante en una célula, que comprende expresar un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se señala eri la reivindicación 1 o la reivindicación 24, donde la sobre-expresión es efectuada mediante el uso de un promotor de alta actividad, un vector dicistrónico o por amplificación de genes del vector.

169. Un método de hacer una planta transgénica, que comprende los pasos siguientes: (a) introducir una secuencia de ácido nucleico heterólogo en la célula, donde la secuencia de ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia como se señala en[ la reivindicación 1 o la reivindicación 24, con ello produciendo una t célula de planta transformada; (b) producir una planta transgénica a partir de la célula transformada.

170. El método como se define en la reivindicación 169, donde el paso (a) comprende además introducir la secuencia de ácido nucleico heterólogo por electroporación o micro-inyección de protoplastos de célula de planta.

171. El método como se define en la reivindicación 169, donde el paso (a) comprende introducir la secuencia de ácido nucleico heterólogo directamente al tejido de planta ,por bombardeo de partículas de ADN o usando un anfitrión, de Agrobacterium turnefaciens.

172. Un método de expresar una secuencia de ácido nucleico heterólogo en una célula de planta, que comprende los pasos siguientes: (a) transformar la célula de planta con una secuencia de ácido nucleico heterólogo enlazada operativamente a un promotor, donde la secuencia de ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; (b) cultivar la planta bajo condiciones donde la secuencia de ácido nucleico heterólogo es expresada en la célula de planta.

173. Un método para hidrolizar, desintegrar o romper una composición que comprende xilano, que comprende los pasos siguientes: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa como se señala en la reivindicación 64, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico como se señala en la reivindicación 1 o la reivindicación 24; (b) proporcionar una composición que comprende un xilano; y (c) poner en contacto el polipéptido del paso (a) con la composición del paso (b) bajo condiciones en las cuales^ la xilanasa hidroliza, desintegra o rompe la composición que contiene xilano.

174. El método como se define en la reivindicación 173, donde la composición comprende una célula de planta, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula animal.

175. Un producto de masa o de pan, que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 64. ,

176. Un método de acondicionamiento de masa, que comprende poner en contacto una masa o un producto de pan con al menos un polipéptido como se señala en la reivindicación 64, bajo condiciones suficientes para acondicionar la masa. '

177. Una bebida, que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 64. 1

178. Un método de producción de bebidas, que comprende la administración de al menos un polipéptido como se señala en la reivindicación 64 a una bebida o un precursor de bebida bajo condiciones suficientes para reducir la viscosidad de la bebida.

179. El método de la reivindicación 178, donde la bebida o precursor de bebida es un mosto de cerveza o una cerveza. i

180. Un alimento, una producto para alimentar o un complemento nutricional, que comprende un polipéptido como, se señala en la reivindicación 64.

181. Un método para utilizar una xilanasa como un complemento nutricional en una dieta animal, el método comprendiendo : ' preparar un complemento nutricional que contiene una enzima xilanasa comprendiendo al menos treinta aminoácidos contiguos de un polipéptido como se señala en la reivindicación 64; y administrar el complemento nutricional a un animal para incrementar la utilización de un xilano contenido en un alimento o un producto alimenticio ingerido por el animal.

182. El método de la reivindicación 181, donde el animal es un ser humano.

183. El método de la reivindicación 181, donde el animal no es un ser humano . 1

184. El método de la reivindicación 181, donde el animal es un rumiante o un animal monogástrico .

185. El método de la reivindicación 181, donde la enzima xilanasa es preparada por expresión de un polinucleótido que codifica la xilanasa en un organismo seleccionado del grupo que consiste en una bacteria, una levadura, una planta, un insecto, un hongo, y un animal.

186. El método de la reivindicación 185, donde el i organismo es seleccionado del grupo que consiste en S. pombe¿ S. cerevisiae, Pichia pastoris, Pseudomonas esp., E. coli, Streptomyces esp., Bacillus esp., y Lactobacillus esp.

187. Una matriz de entrega de enzima comestible, que comprende una enzima xilanasa recombinante, termo-estable.

188. La matriz de entrega de enzima comestible de la reivindicación 187, que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 64.

189. Un método para entregar un complemento de xilanasa a un animal, el método comprendiendo: preparar una matriz de entrega de enzima comestible en la forma de perlas que comprenden un portador comestible granulado y una enzima xilanasa recombinante termo-estable, donde las perlas dispersan fácilmente la enzima xilanasa contenida en ellas en un medio acuoso, y administrar la matriz de entrega de enzima comestible al animal . !

190. El método de la reivindicación 189, donde la enzima xilanasa recombinante comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 64.

191. El método de la reivindicación 189, donde el portador comestible granulado comprende un portador seleccionado del grupo que consiste en un germen de grano, un germen de grano que está desprovisto de aceite, una paja, una alfalfa, un fleo, una cáscara de soja, una harina de semilla de girasol, y un producto intermedio de trigo. i

192. El método de la reivindicación 189, donde el portador comestible comprende germen de grano que está desprovisto de aceite. ;

193. El método de la reivindicación 189, donde la enzima xilanasa es glicosilada para aportar termo-estabilidad en condiciones de formación de perlas.

194. El método de la reivindicación 189, donde la matriz de entrega es formada mediante formar en perlas una mezcla que comprende un germen de grano y una xilanasa.

195. El método de la reivindicación 189, donde 1 las condiciones de formación de perlas incluyen la aplicación de vapor de agua.

196. El método de la reivindicación 189, donde las condiciones de formación de perlas comprenden la aplicación de i una temperatura en exceso de alrededor de 80 °C por alrededor de 5 minutos y la enzima conserva una actividad específica dé al menos 350 a alrededor de 900 unidades por miligramo de enzima.

197. Un ácido nucleico aislado o recombinante, que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa y una secuencia de señal, donde el ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1.

198. El ácido nucleico aislado o recombinante de la reivindicación 197, donde la secuencia de señal es derivada de otra xilanasa o una enzima no xilanasa.

199. Un ácido nucleico aislado o recombinante , que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una actividad de xilanasa, donde la secuencia no contiene una señal de secuencia y el ácido nucleico comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 1. ¡

200. Un ácido nucleico aislado o recombinante, 'que comprende una secuencia como se señala en la SEQ ID NO: 189, donde la SEQ ID NO: 189 contiene una o mas de las siguientes mutaciones: los nucleótidos en las posiciones 22 a 24 son TTC, los nucleótidos en las posiciones 31 a 33 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son TTG, los nucleótidos en las posiciones 49 a 51 son ATA, los nucleótidos en ; las posiciones 31 a 33 son CAT, los nucleótidos en las posiciones 67 a 69 son ACG, los nucleótidos en las posiciones 178 a 180 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son TGT, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son GTA, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son GTT, los nucleótidos en las posiciones 193 a 195 son GTG, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCT, los nucleótidos en las posiciones 235 a 237 son CCA, o los nucleótidos en las posiciones 235 a 237 son ,CCC.

201. Un método para hacer un ácido nucleico,, que comprende una secuencia como se señala en la reivindicación 200, donde las mutaciones en la SEQ ID NO: 189 son obtenidas' por mutagénesis saturada en sitio de genes (GSSM®) .

202. Un polipéptido aislado o recombinante , que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 190, donde la SEQ ID NO: 190 contiene una o mas de Jas siguientes mutaciones: el ácido aspártico en la posición; de aminoácido 8 es fenilalanina, la glutamina en la posición de aminoácido 11 es histidina, la asparagina en la posición de aminoácido 12 es leucina, la glicina en la posición de aminoácido 17 es isoleucina, la treonina en la posición de aminoácido 23 es treonina codificada por un codón distinto del codón tipo silvestre, la glicina en la posición de aminoácido 60 es histidina, la prolina en la posición de aminoácido 641 es cisteína, la prolina en la posición de aminoácido 64 es valina, la serina en la posición de aminoácido 65 es valina, la glicina en la posición de aminoácido 68 es isoleucina, la glicina en la posición de aminoácido 68 es alanina, o la valina en la posición de aminoácido 79 es prolina.

203. Un método para reducir lignina en una madera o un producto de madera, que comprende poner en contacto la madera o el producto de madera con un polipéptido como se señala en la reivindicación 64. :

204. Una composición detergente, que comprendé un polipéptido como se señala en la reivindicación 64.

205. Una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido como se señala en la reivindicación 64.

206. Un método para eliminar o proteger animales de un microorganismo que comprende un xilano, que comprende administrar un polipéptido como se señala en la reivindicación 64.

207. El método de la reivindicación 206, donde el microorganismo es una bacteria.

208. El método de la reivindicación 205, donde la bacteria es una salmonela.

209. Un ácido nucleico aislado o recombinante que t comprende la SEQ ID NO: 189, donde la SEQ ID NO: 189 comprende una o mas o todas las siguientes variaciones de secuencia: , los nucleótidos en las posiciones 22 a 24 son TTC, los nucleótidos en las posiciones 22 a 24 son TTT, los nucleótidos en 1 las posiciones 31 a 33 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 31 a 33 son CAT, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son ÍTG, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son TTA, | los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son CTC, los nucleótidos en las posiciones 34 a 36 son CTT, los nucleótidos en : las posiciones 34 a 36 son CTA, los nucleótidos en las posiciones 49 a 51 son ATT, los nucleótidos en las posiciones 49 a 51 son TC, los nucleótidos en las posiciones 178 a 180 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 178 a 180 son CAT, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son TGT, los nucleótidos en, las posiciones 190 a 192 son TGC, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son GTA, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son GTT, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son GTC, los nucleótidos en las posiciones 190 a 192 son GTG, los nucleótidos en las posiciones 193 a 195 son GTG, los nucleótidos en las posiciones 193 a 195 son GTC, los nucleótidos en las posiciones 193 a 195 son GTA, los nucleótidos en las posiciones 193 a 195 son GTT, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son ATA, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son ATT, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son ATC, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCT, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCG, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCC, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCA, los nucleótidos en las posiciones 235 a 237 son CCA, los nucleótidos en las posiciones 235 a 237 son CCC, o los nucleótidos en las ' I posiciones 235 a 237 son CCG.

210. Un polipéptido aislado o recombinante , que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 190, donde la SEQ ID NO: 190 comprende una o mas o todas de las siguientes variaciones de secuencia: el ácido aspártico en la posición de aminoácido 8 es fenilalanina, la glutamina en la posición de aminoácido 11 es histidina, la asparagina en la posición de aminoácido 12 es leucina, la glicina en la posición de aminoácido 17 es isoleucina, la treonina en la posición de aminoácido 23 es treonina codificada por un codón distinto del codón tipo silvestre, la glicina en la posición de aminoácido 60 es histidina, la prolina en la posición de aminoácido 64 es cisteína, la prolina en la posición de aminoácido 64 es vaíina, la serina en la posición de aminoácido 65 es valina, la glicina en la posición de aminoácido 68 es isoleucina, la glicina en la posición de aminoácido 68 es alanina, o la valina en la posición de aminoácido 79 es prolina.

211. Un ácido nucleico aislado o recombinante, que comprende la SEQ ID NO: 189, donde la SEQ ID NO: 189 comprende una o mas o todas las variaciones de secuencia señaladas en la Tabla 1 o la Tabla 2.

212. Un polipéptido aislado o recombinante, codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 211.

213. Un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende la SEQ ID NO: 379, donde la SEQ ID NO: 379 comprende una o mas o todas de las siguientes variaciones de secuencia: los nucleótidos en las posiciones 22 a 24 son TTC, los nucleótidos en las posiciones 31 a 33 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 49 a 51 son ATA, los nucleótidos en las posiciones 178 a 180 son CAC, los nucleótidos en las posiciones 193 a 195 son GTG, los nucleótidos en las posiciones 202 a 204 son GCT. i

214. Un polipéptido aislado o recombinante, que comprende la SEQ ID NO: 380, donde la SEQ ID NO: 380 comprende una o mas o todas de las siguientes variaciones de secuencia: D8F, Q11H, G17I, G60H, S65V, y/o G68A.

215. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 210 o la reivindicación 214, donde el polipéptido tiene una actividad de xilanasa termo-estable.