CN1981036A

CN1981036A - 微生物表达的木聚糖酶及其作为饲料添加剂的用途和其他用途

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Publication number: CN1981036A
Application number: CNA2004800379262A
Authority: CN
Inventors: M·S·鲍尔; M·R·贝德福德; D·A·普利亚姆
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-20
Publication date: 2007-06-13
Also published as: US7662415B2; US7291493B2; WO2006083240A2; AU2004324514A1; MXPA06006670A; WO2006083240A3; BRPI0417821A; EP1771554A2; US20050208178A1; AR047157A1; CA2548723A1; EP1771554A4; TW200530262A; AU2004324514A8; US20080187627A1

Abstract

本发明涉及密码子最优化的木聚糖酶编码序列和木聚糖酶在微生物和酵母中的表达。本发明还涉及使用多拷贝木聚糖酶表达构建体进行高水平的蛋白表达。本发明也涉及木聚糖酶作为饲料或食物添加剂的用途。本发明也涉及这样的酶的表达方法，即通过在对蛋白进行糖基化的生物体中表达酶，和不对相同酶进行糖基化的表达相比，增加了所述酶的耐热性。此外，本发明涉及制备饲料、酶饲料添加剂的方法，和减少饲料转化率或增加动物的体重增量的方法。

Description

微生物表达的木聚糖酶及其作为饲料添加剂的用途和其他用途

交叉引用相关申请

本申请要求2003年12月19日提交的美国临时专利申请号60/531,404的利益。

发明领域

本发明涉及密码子最优化的木聚糖酶编码序列和木聚糖酶在微生物和酵母中的表达。本发明还涉及使用多拷贝木聚糖酶表达构建体进行高水平的蛋白表达。本发明也涉及木聚糖酶作为饲料和食物的添加剂的用途。本发明也涉及这样的酶的表达方法，即通过在对蛋白进行糖基化的生物体中表达酶，和不对相同酶进行糖基化的表达相比，增加了所述酶的耐热性。此外，本发明涉及制备饲料、酶饲料添加剂的方法，和减少饲料转化率或增加动物的体重增量的方法。

发明背景

非淀粉多糖(NSP)涉及鸡的谷类饲料的营养品质的易变性，其和消化物的粘性变化关联(Bedford，M.R.&H.L.Classen(1993)″An in vitro Assay for Prediction of Broiler IntestinalViscosity and Growth When Fed Rye-Based Diets in the Presenceof Exogeneous Enzymes″Poult.Sci.72，137-143)。阿拉伯木聚糖是小麦的主要NSP，几种从木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)和曲霉属(Aspergillus)产生的商购可获得的木聚糖酶产物已显示降低消化物的粘性并通常提高饲料的营养价值(xylo-oligomer)。

木聚糖是通过β-1，4连接的D-吡喃木糖形成的线性多糖。在谷物中，木聚糖通常含有α-1，2、α-1，3或α-1，2和α-1，3连接的L-阿拉伯糖呋喃糖苷的侧链。这些取代木聚糖通常称作阿拉伯木聚糖。木聚糖酶(例如，内-1，4-β-木聚糖酶，EC3.2.2.8)水解木聚糖中的内β-1，4-木糖苷键，从而产生更小分子量的木糖寡聚体。

可在例如富含阿拉伯木聚糖和葡糖木聚糖(glucoxylan)的动物饲料组合物中、焙烤中、酿造中和在纸浆和纸的应用(例如提高纸浆的漂白率)中使用木聚糖酶。当加入至含有谷物(例如大麦、小麦、玉米、黑麦、黑小麦(triticale)或燕麦)或谷物副产品的饲料(例如给单胃动物包括家禽或猪食用的)时，半纤维素溶解酶(hemicellulolytic enzyme)提高了植物细胞壁的分解，导致动物更好地利用植物营养物。这导致了提高的生长速率和饲料转化率。同样，也可减少含有木聚糖的饲料的粘性。

在许多实际应用中，物理条件(例如，温度和pH)阻碍了木聚糖酶的使用；木聚糖酶必需在其被使用的过程中的温度和pH条件下是活性的。使用粒化(pelleting)、挤压挤出(extrusion)或膨胀(expanding)配制商品化饲料包括涉及高温(70-180℃)的步骤。配制过程中加入的酶应当经受住这些条件。在另一方面，在动物的肠中相应的温度是大约40℃。因此，用于饲料组合物的理想的木聚糖酶应当经受住上述极端温度。在漂白应用中，木聚糖酶的应用并非如加入木聚糖酶处理步骤那样简单。因为漂白过程，和甚至在漂白过程中使用的步骤的顺序在不同的制浆中都会不同，因此仍然需要发现在不同的温度和pH条件下具有活性的新的木聚糖。

大多数商购获得的设计用于饲料用途的木聚糖酶并不非常耐热，特别是当使用中性或碱性pH条件时。实际上，在高于60℃的温度下木聚糖酶通常是失效或失活的，并且这些酶通常在酸性条件下起作用。一般地，真菌和细菌的木聚糖酶的物理学特性存在差异(综述参见Wong等人，Microbiol.Rev.52：305-317(1988))。通常，真菌的木聚糖酶具有大约50℃的最适温度和具有比细菌来源的木聚糖酶更低的最适pH。细菌来源的木聚糖酶通常具有50至70℃的范围内最适温度。许多来自真菌和细菌微生物的木聚糖酶已被鉴定和表征。(参见，例如，美国专利号5,437,992；Coughlin，M.P.；Biely，P.等人，“Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichodermareesei Cellulases and Other Hydrolases，”Espoo 1993，P.Souminen和T.Reinikainen(编著)，Foundation for Biotechnicaland Industrial Fermentation Research 8：125-135(1993) 和WO03/16654)。特别地，在里氏木霉(T.reesei)中已鉴定了三种特异性的木聚糖酶(XYL-I，XYL-I I和XYL-III)(Tenkanen等人，EnzymeMicrob.Technol.14：566(1992)；Torronen等人，Bio/Technology10：1461(1992)；和Xu等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：718(1998))。尽管在文献中已描述了大量的木聚糖酶，但仍存在对鉴定新的木聚糖酶的需要，所述新的木聚糖酶在应用例如涉及动物饲料和谷物加工、生物燃料、清洁处理、织物维护(fabriccare)、化学药品、植物加工和纸浆和纸的脱木质素(delignifying)和增亮的应用中是有效的。

发明简述

本发明提供了具有SEQ ID NOS：1、3、5或7的序列的分离的核酸分子和包含这些序列的表达盒、载体和重组宿主细胞。本发明也提供了制备耐热性木聚糖酶的方法，其包括以下步骤在微生物宿主细胞中表达含有启动子有效地连接至编码木聚糖酶的核酸分子的表达盒，所述木聚糖酶在60℃30分钟后保持至少40％的活性并在低于pH5.0和高于pH1.5的pH下具有大于400U/mg的比活性。本发明还提供了制备耐热性木聚糖酶的方法，其中所述木聚糖酶被糖基化。本发明也提供了由这些方法产生的分离的耐热性木聚糖酶。本发明也提供了包含耐热性木聚糖酶的酶饲料添加剂和动物饲料。本发明还提供了制备包含耐热性木聚糖酶的经粒化的动物饲料的方法以及通过这些方法生产的粒化动物饲料。本发明也提供了降低饲料转化率和增加动物体重增量的方法，其包括用含有降低动物中饲料转化率有效量的耐热性木聚糖酶的动物饲料喂养动物的步骤。其也提供了提高动物饲料的表观代谢能(apparent metabolizable energy)的方法，其包括用以提高饲料的表观代射能有效量的一种或多种耐热性木聚糖酶配制动物饲料的步骤。本发明也提供了提高动物饲料或人食品的营养价值的方法，其包括在制备动物饲料或人食品的过程中加入耐热性木聚糖酶的步骤。

附图概述

图1是质粒pBCS12771的载体图谱。

图2是质粒pBCS12772的载体图谱。

图3是质粒pSYN12773的载体图谱。

图4是经选择的木聚糖酶经过18小时发酵的气体产生率的图表。各点代表6个观察的平均值。

图5是毕赤氏酵母表达的木聚糖酶PP6002的酶活性对pH的图表。

表6是PP6002 Quantum zylanase的热耐受性的图表。

图7是比较各种木聚糖酶的热稳定性和耐热性的图表。

序列表简述

SEQ ID NO：1是PP6002的木聚糖酶编码区的核苷酸序列(无kex2蛋白酶切割位点或AvaI限制性位点)。经最优化以在毕赤氏酵母中表达的密码子。

SEQ ID NO：2是PP6002的木聚糖酶编码区的氨基酸序列(也和无分泌信号的BD6002相同)。

SEQ ID NO：3是PP6016的木聚糖酶编码区的核苷酸序列(无kex2蛋白酶切割位点或AvaI限制性位点)。经最优化以在毕赤氏酵母中表达的密码子。

SEQ ID NO：4是PP6016的木聚糖酶编码区的氨基酸序列(也和无分泌信号的BD6016的氨基酸序列相同)。

SEQ ID NO：5是PP6407的木聚糖酶编码区的核苷酸序列(无kex2蛋白酶切割位点或AvaI限制性位点)。经最优化以在毕赤酵母中表达的密码子。

SEQ ID NO：6是PP6407的木聚糖酶编码区的氨基酸序列(也和无分泌信号的BD6407的氨基酸序列相同)。

SEQ ID NO：7是PP7436的木聚糖酶编码区的核苷酸序列(不具有kex2蛋白酶切割位点或AvaI限制性位点)。经最优化以在毕赤氏酵母中表达的密码子。

SEQ ID NO：8是PP7436的木聚糖酶编码区的氨基酸序列(也和无分泌信号的BD 7436的氨基酸序列相同)。

SEQ ID NO：9是包含AvaI限制性位点、kex2蛋白酶切割位点和毕赤氏酵母密码子最优化性木聚糖酶的PP6002的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10是包含AvaI限制性位点、kex2蛋白酶切割位点和毕赤氏酵母密码子最优化性木聚糖酶的PP6016的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11是包含AvaI限制性位点、kex2蛋白酶切割位点和毕赤氏酵母密码子最优化性木聚糖酶的PP6407的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是包含AvaI限制性位点、kex2蛋白酶切割位点和毕赤氏酵母密码子最优化性木聚糖酶的PP7436的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13是木聚糖酶Xy1A1A的核苷酸序列(也称作无分泌信号的BD6002)。

SEQ ID NO：14是无原始分泌信号序列的木聚糖酶Xy1A1A的氨基酸酸序列(也称作BD6002)。

SEQ ID NO：15是缺少分泌信号编码区的木聚糖酶Xy1A1B的核苷酸序列(全长序列也称为BD7436)。

SEQ ID NO：16是缺少原始分泌信号区的木聚糖酶Xy1A1B的氨基酸序列(BD7436)。

SEQ ID NO：17是缺少分泌信号序列编码区的木聚糖酶Xy1A1C的核苷酸序列(全长序列也称作BD2230)。

SEQ ID NO：18是缺少分泌信号序列区的木聚糖酶Xy1A1C的氨基酸序列(BD2230)。

SEQ ID NO：19是缺少分泌信号序列编码区的木聚糖酶Xy1A1D的核苷酸序列(全长序列也称作BD6016)。

SEQ ID NO：20是缺少分泌信号序列区的木聚糖酶Xy1A1D的氨基酸序列(BD6016)。

SEQ ID NO：21是缺少分泌信号序列编码区的木聚糖酶Xy1A1E的核苷酸序列(全长序列也称作BD6407)。

SEQ ID NO：22是缺少分泌信号序列区的木聚糖酶Xy1A1E的氨基酸序列(BD6407)。

SEQ ID NO：23是引物1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24是引物2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25是引物3的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26是引物4的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27是引物5的核苷酸序列。

SEQ ID NO：28是引物6的核苷酸序列。

SEQ ID NO：29是引物7的核苷酸序列。

SEQ ID NO：30是引物8的核苷酸序列。

SEQ ID NO：31是引物9的核苷酸序列。

SEQ ID NO：32是引物10的核苷酸序列。

SEQ ID NO：33是质粒pBCS12771的核苷酸序列。

SEQ ID NO：34是质粒pBCS12772的核苷酸序列。

SEQ ID NO：35是质粒pSYN12773的核苷酸序列。

SEQ ID NO：36编码kex2蛋白酶切割位点的核苷酸序列。

SEQ ID NO：37是kex2蛋白酶切割位点的氨基酸序列。

SEQ ID NO：38是编码啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)α交配因子前原肽分泌信号肽(pre-pro-peptide secretion signalpeptide)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：39是啤酒糖酵母α交配因子前原肽分泌信号肽的氨基酸序列。

发明详述

本发明涉及木聚糖酶和其突变体及变体作为动物饲料添加剂的用途，和涉及含有木聚糖酶的饲料。

本发明也涉及使用木聚糖酶提高饲料转化率和/或饲料的表观代射能的方法。

本发明提供了提高动物饲料营养价值的方法。在该方法中，为了提高饲料营养利用度，使用一种或多种木聚糖酶例如Xy1A1A、Xy1A1B、Xy1A1C、Xy1A1D和Xy1A1E(序列分别为SEQ ID NOS：13-22)来配制饲料。所述饲料包括任何谷物，因为所有谷物但特别是小麦、黑麦、黑小麦、稻或玉米都以低于是1.0％、更特别地以低于0.1％w/w的包含率包含木聚糖。使用1至10000U/kg的包含率(inclusion rate)将酶加入饲料。可在饲料加工之前或之后将酶加入饲料或简单地加入至未经加工的(捣碎的)饲料中，饲料加工包括粒化、膨胀和挤压挤出，但存在其他的方法。与未添加补充物的饲料相比，这些酶的一种或更多种的加入导致表观代射能(AME)的增加和/或饲料转化率(FCR)的降低。

本发明也提供了制备和使用编码木聚糖酶的核酸分子(即多核苷酸)的方法。所述木聚糖酶可以是耐热性的，但其不是必需是耐热性的。因此，本发明也涉及制备和使用编码耐热性木聚糖酶的核酸分子的方法。耐热性木聚糖酶包括在大约60℃30分钟后仍保留至少40％活性和具有高比活性(即，在37℃下和例如pH5.3的酸性pH下至少大约200U/mg)的木聚糖酶。在另一个实施方案中，木聚糖酶在70℃30分钟后保持至少40％的活性，或在80℃30分钟后保持至少40％的活性，或在85℃30分钟后保持至少40％的活性。所述方法表达缺少糖基化的耐热性木聚糖酶。或者，所述方法包括表达被宿主糖基化的耐热性木聚糖酶。

本发明也提供制备木聚糖酶包括耐热性木聚糖酶的方法。所述方法包括在微生物宿主细胞中表达包含有效地连接至编码木聚糖酶的核酸分子的启动子的表达盒。所述微生物宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞(例如，埃希氏杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳芽孢杆菌属(Lactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母(例如，糖酵母属(saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)或汉逊氏酵母属(Hansenula)或真菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))细胞。特别地，所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母。用于制备重组木聚糖酶的微生物细胞可产生糖基化形式的重组木聚糖酶。

本发明也提供了制备耐热性木聚糖酶的方法，其中所述木聚糖酶由SEQ ID NOS：1、3、5或7的核苷酸序列编码。此外，该核酸分子编码包含木聚糖酶的融合多肽。所述融合蛋白可进一步包含有效地连接至木聚糖酶的分泌信号肽。

本发明还包含有效地连接至少一个调控序列和任选地连接编码信号序列的第二多核苷酸的编码木聚糖酶的多核苷酸，所述调控序列是例如启动子、增强子、内含子、终止序列或其任何组合，所述信号序列指导由第一多核苷酸编码的酶至特定的细胞区域例如，细胞外区域。启动子可以是组成型启动子或诱导型(条件性)启动子。如此处所描述的，将编码木聚糖酶的亲本多核苷酸的诱变用于制备编码具有提高的特性(相对于由亲本多核苷酸编码的木聚糖酶)的木聚糖酶的变体(合成的)DNA。在一个实施方案中，就提高的在酸性或碱性pH下的活性、提高的肠稳定性或提高的在宿主生物体中的表达水平对木聚糖酶进行筛选。在另外的实施方案中，组合许多变体DNA上的突变以制备编码具有增强的耐热性和胃稳定性和具有相似或更高的比活性(相对于由亲本多核苷酸编码的木聚糖酶)的合成的多核苷酸。可从任何来源包括植物、细菌或真菌的核酸获得亲本多核苷酸，和可用任何方法例如组合诱变、递归诱变(recursive mutagenesis)和/或DNA改组来制备来自选择的亲本多核苷酸的本发明的合成的多核苷酸。

因此，在本发明的一个实施方案中，相对于对应的木聚糖酶，耐热性木聚糖酶具有一个或多个氨基酸替换，所述替换与在等于或大于60℃的温度下的活性保持相关。

在另外的实施方案中，耐热性木聚糖酶在大约60℃30分钟后具有至少40％的活性，或在大约65℃30分钟后具有至少40％的活性，或在大约70℃30分钟后具有至少35％的活性，和在37℃和在例如低于pH6.0或在低于pH4.0而高于pH1.5的酸性pH下具有至少400U/mg、更优选地至少600U/mg、和/或至少800U/mg的比活性。一个木聚糖酶单位(XU)是指在标准条件下，在37℃、pH5.3下每分钟从WAXY(小麦阿拉伯木聚糖)释放1μmol的还原性末端(木糖等同物)的酶量。

在另外的实施方案中，本发明提供了因糖基化而使酶耐热的方法，其包括在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中表达酶的步骤。在特定的实施方案中，所述酶是木聚糖酶。

在本发明的实施方案中，分离的核酸分子具有SEQ ID NOS：1、3、5或7的序列。本发明也提供了包含含有SEQ ID NOS：1、3、5或7的核苷酸序列的核酸分子的表达盒。所述表达盒还可包含蛋白水解切割位点例如KEX2蛋白酶切割位点。在更特别的实施方案中，所述表达盒由SEQ ID NOS：9、10、11或12的核酸序列编码。所述表达盒还可包含编码分泌信号肽例如啤酒糖酵母α交配因子前原肽分泌信号的分离核苷酸序列。表达盒还可包含至少一个有效地连接至启动子的编码本发明的木聚糖酶的核酸分子。

本发明也提供包含至少一个SEQ ID NOS：1、3、5或7的核酸分子的重组宿主细胞。所述重组细胞可以是细菌、酵母或真菌细胞。优选地所述宿主细胞是埃希氏杆菌属、假单胞菌属、乳芽孢菌属、芽孢杆菌属、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属、曲霉属或木霉属细胞。优选地，所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母。在更优选的实施方案中，宿主细胞包含载体pBCS12771、pBCS12772或pSYN12773。优选地宿主细胞是包含载体pSYN12773的巴斯德毕赤氏酵母。

本发明还提供包含本发明的表达盒或多核苷酸的载体和包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的经转化的微生物细胞。本发明的载体可编码超过一个多肽，包括超过一个木聚糖酶，或可编码包含本发明的木聚糖酶的融合多肽，经转化的微生物细胞可包含本发明的一个或多个载体。本发明的经转化的细胞用于制备本发明的重组木聚糖酶。因此，本发明提供从本发明的经转化的微生物细胞中分离的木聚糖酶和通过合成制备的酶。特别地，所述载体包含称为pBCS12771(SEQ IDNO：33)、pBCS12772(SEQ ID NO：34)或pSYN12773(SEQ ID NO：35)的质粒。

本发明也提供了由本发明的方法制备的分离的耐热性木聚糖酶。此外，分离的耐热性木聚糖酶被糖基化。

本发明还提供了用于木聚糖酶、木聚糖酶制剂或经配制的酶混合物的配制的方法。包含耐热性木聚糖酶的饲料添加剂包含本发明的耐热性木聚糖酶。饲料添加剂制剂还包含稳定化化合物，例如但不限于山梨糖醇(sorbital)。在食物或饲料加工之前、期间或之后，可将重组木聚糖酶或其制剂作为补充物加入至食物或动物饲料中或加入至食物和饲料的成分中。优选地，在制粒机(pelletmill)中加热(例如，蒸汽)处理之前和/或期间将本发明的重组木聚糖酶加入至饲料成分的混合物中。因此，本发明包括制备和使用木聚糖酶的方法。

此外，因为本发明的木聚糖酶能够经受住在饲料配制过程中在商购获得的制粒机中遇到的加热处理步骤，所以本发明提供了制备动物饲料例如包含木聚糖酶的坚硬的颗粒状饲料颗粒的方法。为制备饲料，可将配制的木聚糖酶和饲料成分混合，在制粒机中调节混合蒸气以使至少50％的经预热处理的酶活性得以保持，通过制粒模具(pellet dye)挤压出饲料。在另外的实施方案中，在85℃下粒化后恢复了超过70％的酶活性，或更优选地，在85℃下粒化后恢复了超过90％的酶活性。在优选的实施方案中，在90℃下粒化后恢复了至少80％的预处理酶促活性。

因此除了和维生素、矿质、其他饲料酶、农业副产品(例如，小麦麦敷(wheat middlings)或玉米面筋粉(corn gluten meal)一起或在其组合物外，木聚糖酶自身可用作动物饲料中的补充物。所述酶也可加入捣碎的饲料，即饲料还未通过制粒机。

在饲料生产过程中，例如在加热处理期间，此时温度，如在常规的粒化中，在75至95℃范围内(膨胀是在105-125℃)变化，产生了在饲料中使用木聚糖酶的一些有益方面。这些处理可降低动物的消化道中的饲料的粘性。参见Silversides和Bedford，Poultry Sci.78：1184-1190(1999)。

非耐热性的木聚糖酶通常在粒化后使用，通常通过将酶溶液喷洒在经粒化的饲料上进行使用。与喷洒方法关联的一些问题是只有较低百分比的小球与酶接触，酶只存在于被包被的小球表面，而且需要为饲料粉碎机(feed mills)投资和操作复杂的喷雾机。相反地，本发明的耐热性木聚糖酶，可在粒化前加入，从而有利于生产具有提高的酶分布的饲料。此外，包含本发明的耐热性木聚糖酶的饲料可具有比用木聚糖酶喷洒的饲料更长的货架期，因为喷洒过程引入了在贮存期间可支持真菌和细菌生长的水分。目前可通过用石蜡层包被以将湿汽排除在外来制备不耐热的木聚糖酶，以使其经受住较高的加工温度。但是该方法较昂贵并且降低了在经较低温度粒化的饲料或捣碎的饲料中产物的功效，因为在导入动物的消化道后，石蜡包衣缓慢地释放酶。

因此本发明提供了制备动物饲料的方法，其包括提供包含一种或多种饲料成分和包含本发明的木聚糖酶例如耐热性木聚糖酶的制剂的混合物，和在合适的温度和湿度条件下处理所述混合物以使存在于所述混合物中的木聚糖水解。还提供了通过该方法制备的动物饲料。所述动物饲料包括但不限于家禽饲料、猪饲料或反刍动物饲料。

还提供了制备用于饲料制剂的包含木聚糖酶的组合物的方法，其包括将含有本发明的耐热性木聚糖酶液体溶液和粉例如大豆粉混合以产生混合物；和干燥所述混合物以产生干燥的组合物。可通过本领域内常规使用的技术(包括但不限于冻干和/或加热)实现干燥所述混合物。

本发明还提供了方法，在所述方法中加热处理包含动物饲料成分和含有本发明的木聚糖酶的制剂的混合物，从而产生经热处理的动物饲料混合物。也提供了通过所述方法制备的经热处理的动物饲料。木聚糖酶制剂可以是液体或固体制剂。在一个实施方案中，将包含本发明的液体溶液和大豆粉组合以产生混合物，然后冻干所述混合物。混合物也可包含至少一种维生素、矿质、非木聚糖酶的酶、有机酸、益生菌产物、精油(essential oil)或谷物加工的副产品。可通过例如将经热处理的饲料通过制粒机挤压产生粒化的动物饲料来进一步加工经热处理的饲料。也提供了包含本发明的木聚糖酶的动物饲料组合物，和包含该酶的酶饲料添加剂或食品添加剂。

本发明还提供了经粒化的动物饲料。在一个实施方案中，在制粒机中，在大约85℃下用蒸汽处理经粒化的动物饲料，这样超过70％的经预热处理的酶促活性得到保持，并通过pellet dye挤压饲料。在另外的实施方案中，经粒化的动物饲料在制粒机中在大约90℃下经蒸汽处理，这样至少80％的经预热的酶促活性得到保持，并通过pellet dye挤压出饲料。

还提供了降低饲料转化率和增加动物的体重增量的方法，其包括以降低动物中饲料转化率和增加动物的体重增加的有效量给动物喂食包含本发明的耐热性木聚糖酶的饲料。

本发明提供了提高动物饲料或人食品的营养价值的方法。所述方法包括在动物饲料或人食品制备过程中加入本发明的木聚糖酶的步骤。也提供了制备人食品的方法，其包括提供食品成分和包含本发明的木聚糖酶的制剂的混合物；和在有利于木聚糖水解的合适的温度和湿度条件下处理所述混合物。

本发明也提供了提高动物饲料的表观代谢能(AME)的方法，其包括这样的步骤，即以提高饲料的表观代谢能的有效量的本发明的一种或多种的耐热性木聚糖酶和动物饲料一起配制动物饲料的步骤。

在本发明的范围内的动物包括多胃动物例如小牛(calf)和单胃动物包括但不限于猪、家禽(例如，鸡、火鸡、鹅、鸭、野鸡、松鸡(grouse)、鹌鹑(quail)和驼鸟)、马、绵羊(ovine)、公山羊(caprine)、犬科动物(canine)和猫科动物(feline)以及鱼和甲壳类动物(crustaceans)。此外，反刍动物例如母牛也包括在本发明的范围之内。以大约1至10000U/kg，更优选地50至5000U/kg或200至3,200U/kg的包含率将木聚糖加入饲料或食品。

木聚糖酶和上述的酶混合物基本上可加入至所有的饲料中。合适的和优选的例子是遵守饲料立法条款的饲料，例如完全饲料、补充物饲料和矿质饲料。

本发明是提高动物饲料营养价值的方法。在该方法中，为了提高饲料营养利用度，用一种或多种酶例如Xy1A1A、Xy1A1B、Xy1A1C、Xy1A1D和Xy1A1E配制饲料。所述饲料可由任何谷物组成，因为所有谷物特别是小麦、黑麦、黑小麦、稻或玉米以低于1.0％、更特别地低于0.1％w/w的包含率包含木聚糖。使用1至10000U/kg的包含率将酶加入该饲料。可在饲料加工前或期间将酶加入饲料或简单地加入至未经加工的(捣碎的)的饲料中，所述饲料加工包括粒化、膨胀和挤压，当然也存在其他方法。与未经补充的饲料相比，也和用目前商购可获得的标准木聚糖酶补充的饲料相比，这些酶中的一种或多种的添加导致饲料表观代谢能(AME)的增加和/或饲料转化率(FCR)的降低。

施用的酶在0.01至10,000ppm的范围内，或可选择地在20至1000ppm的范围之内。木聚糖酶产物的活性通常以单位(U)表示。

按重量计算以合适的比例通过分批方式将单独的或混合物中的酶产物与饲料混合。在该上下文中，在饲料中均匀地分配活性物质是非常重要的。

含有木聚糖酶的饲料可用于喂养所有家畜，但对喂养用于食品生产的农业家畜特别是broiler、火鸡、猪和牛尤其有利。

饲料中酶产物或混合物的加入在其利用度上产生相当大的提高并且与之关联的是家畜生长的提高。与具有抗生素活性的添加剂相比，其作为饲料添加剂的用途具有巨大的有利方面，即在长期使用后没有抗性发生的风险。

其他用途

本发明的木聚糖酶可用于其他木聚糖被使用的任何用途，例如但不限于谷物加工、生物燃料、清洁处理、织物维护(fabric care)、化学药品、植物加工和纸浆和纸的脱木素(delignifying)和增亮。

本发明的构建体和宿主细胞

本发明优选地提供这样的表达盒，即其包含能够指导编码木聚糖酶的多核酸在体外或体内表达的核酸序列(启动子)。用于制备和/或鉴定木聚糖酶的方法包括诱变例如recursive诱变、和/或选择或筛选，例如，选择或筛选在高于60℃的温度下具有活性的木聚糖酶。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域是熟知的。参见，例如，Kunkel，1985；Kunkel等人，1987；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra，1983和其中引用的参考文献；和Arnold等人，1996。

A.用于转化的DNA和宿主细胞

用于转化细胞的载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)和分离的核酸分子通常包含木聚糖酶编码核酸分子和其他核酸分子，例如想要导入细胞的cDNA、基因。这些核酸构建体还可包含这样的核酸分子例如想要的启动子、增强子、多接头或甚至调控基因。经选择用于细胞导入的核酸分子或基因中的一个通常编码在所得的转化(重组的)细胞中表达的蛋白，这将产生可筛选或可选择的性状和/或其将给所述转化细胞提供提高的表型。然而，情况可能并不总是这样，因而本发明也包含整合了非表达的转基因的转化细胞。

用于导入细胞的分离核酸分子包含来自于任何来源或从任何来源分离的核酸，然后就结构、大小和/或功能对所述核酸进行表征，对其进行化学改变，然后导入细胞。“来自”于某一来源的分离核酸分子的例子是这样的核酸序列，即其在给定的生物中被鉴定为有用的片段，然后以基本纯的形式经化学合成。这种从某一来源“分离”的核酸分子的例子是通过化学方法，例如通过使用限制性内切酶从所述来源切割或移取的有用的核酸序列，这样通过基因工程，可进一步对其进行操作例如扩增，以用于本发明。这样的核酸分子通常称作“重组体”。因此有用的核酸分子包含完全合成的核酸分子、半合成的核酸分子、从生物学来源分离的核酸分子和来源于经导入的RNA的核酸分子。一般地，导入的核酸分子不是原来就存在于作为所述核酸分子的受体的基因型中，但从给定的基因型中分离基因，然后将该基因的多拷贝导入相同的基因型例如以增加给定的基因产物的产量在本发明的范围之内。

导入的核酸分子包括但不限于从基因例如来自细菌、酵母、真菌或病毒的基因分离的核酸分子。导入的核酸分子包括经修饰或合成的基因、基因的部分或嵌合基因，包括来自相同或不同基因型的基因。术语“嵌合基因”或“嵌合核酸分子”定义为包含至少两个核酸序列或片段的基因或核酸分子序列或片段，所述的至少两个核酸序列或片段来自在天然状况下不组合核酸的物种，或所述核酸序列或片段以一般在未转化的细胞的天然基因组中不发生的方式被定位和连接。

用于此处转化的被导入的核酸分子是环形的或线性的、双链的或单链的。一般地，分离的核酸分子以嵌合DNA例如质粒DNA的形式存在，所述嵌合DNA也可包含侧翼连接有调控序列的编码区，所述调控序列提高存于转化细胞中的重组DNA的表达。例如，核酸分子包含或由在细胞中有活性的启动子构成，其来源于并非该细胞的某一来源，或可利用已存在于作为转化靶的细胞中的启动子。

一般地，导入的核酸分子相对较小，即小于大约30kb，从而使对物理、化学或酶促降解的任何易感性降至最低，已知该降解随着核酸分子的大小增加而增加。通常预先选择和确定被导入细胞的蛋白质、RNA转录物或其混合物的数目，例如可形成从1至大约5-10个这样的导入的DNA的产物。

合适的表达载体的选择依赖于宿主细胞。一般地，表达载体包含(1)编码细菌复制起始位点的原核核酸分子元件和抗生素抗性基因以进行表达载体在细菌宿主中的扩增和选择；(2)控制转录起始的核酸分子例如启动子；(3)控制转录物加工的核酸分子例如内含子、转录终止/聚腺苷酰化序列；和(4)有效地连接至控制转录起始的核酸分子的目的核酸分子或基因。在特定的实施方案中，木聚糖酶基因和可操作元件不会在宿主细胞中自主地复制。使用的表达载体可以是能够在上述宿主中自主复制或能够整合入染色体中的载体，可以是原先在能够使连接的木聚糖酶基因转录的位点上就含有启动子的载体。

如果原核生物例如细菌被用作宿主，用于木聚糖酶的表达载体优选地是能够在微生物中自主自制和包含启动子、核糖体结合序列、新的木聚糖基因和转录终止序列的载体。所述载体也可以含有调节启动子的基因。

酵母或真菌表达载体可包含复制起始位点、合适的启动子和增强子，还有任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酰化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼连接的非转录序列。

合适的载体包括例子：对于细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBluescript II(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；对于真核细胞：pXT1、pSG5(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。这些商购可获得的载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEMI(Promega Biotec，Madison，Wis.，USA)。然而，可使用任何其他的质粒或载体，只要其可在宿主中复制和存活。

可能提到的合适的宿主的代表性例子：细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；和埃希氏菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的不同种，尽管也可将其他细菌用作选择的宿主；属于曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、木霉属(Trichoderma)、链孢霉属(Neurospora)、毛霉菌属(Mucor)、青霉属(Penicillium)等属的真菌细胞，例如属于克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、毕赤氏酵母属等的酵母。

根据现有内容(参见，例如，Sambrook等人， Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press，1989；Gelvin等人， Plant Molecular Biology Manual，1990)，可于本发明使用的载体的构建对本领域技术人员来说是已知的。本发明的表达盒可包含一个或多个这样的限制性位点，即其可使编码木聚糖酶的多核苷酸置于调控序列的调控之下。表达盒也可包含有效地连接至多核苷酸的终止信号和所述多核苷酸的正确转录所需要的调控序列。含有本发明的多核苷酸的表达盒可以是嵌合型的，即其组分中的至少一个对于其他组分中的至少一个是异源的。表达盒中多核苷酸的表达可在组成型启动子、诱导型启动子、受调控的启动子、病毒启动子或合成的启动子的控制之下。

表达盒可在转录的5’-3’方向上包含转录和翻译起始区、本发明的多核苷酸和在体内和/或体外起作用的转录和翻译终止区。终止区对于录起始区可以是天然的，对于多核苷酸可以是天然的，或可来源于另外的来源。调控序列可位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部(内含子)、或下游(3’非编码序列)，并影响转录、RNA加工或稳定性，和/或相关编码序列的翻译。调控序列可包括但不限于增强子、启动子、阻抑物结合位点、翻译前导序列、内含子和聚腺苷化信号序列。其可包括天然和合成的序列以及可作为合成的和天然的序列的组合的序列。

用于本发明的载体也可包括用于扩增表达的合适的序列。

B.调控序列

启动子是通过为RNA聚合酶和其他正确转录所需要的因子提供识别来控制编码序列表达的核苷酸序列。启动子包括最小启动子和/或起始区，所述最小启动子仅由转录起始所需要的所有基本元件例如TATA盒构成，所述起始区是包含TATA盒和用作确定转录起始位点的其他序列的短DNA序列，其是加入了调控元件以控制表达的区域。启动子可完全来源于天然的基因，或由来源于天然发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至由合成的DNA片段组成。启动子可含有参与蛋白因子的结合的DNA序列，所述蛋白因子控制响应生理学或发育状况的转录起始的效率。启动子也可包含最小启动子加能够控制编码序列或功能性RNA表达的元件。该类型的启动子序列包含邻近的和更远的元件，后一种元件通常称作增强子。

启动子的代表性例子包括但不限于已知的在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的启动子。特定的细菌启动子包括大肠杆菌的lac或trp、噬功体λP_L、lacI、lacZ、T3、T7、gpt和λP_R启动子。

任何能够在酵母宿主中表达的启动子可用作启动子。其例子包括糖酵解途径中的己糖激酶等基因的启动子，和启动子例如gal 1启动子、gal 10启动子、热激蛋白启动子、MFa-1启动子和CUP1启动子。

可使用任何能够在丝状真菌中表达的启动子。例子是由淀粉或纤维素强烈诱导的启动子，例如葡糖淀粉酶或来自曲霉属的淀粉酶或来自木霉属的纤维素酶(cellobiohydrase)的启动子、糖酵解途径中的酶例如磷酸甘油酸激酶(pgk)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)等的启动子。

用于表达的控制的两个主要方法是已知的，即：过量表达和下调表达(under-expression)。通过一个或超过一个额外拷贝的经选择的基因可实现过量表达。对于下调表达，存在两个主要的方法，其在本领域通常被称为“反义下调”和“有意下调”。通常这些方法被称为“基因沉默”。这两种方法都导致靶基因表达的抑制。

几种诱导型启动子在本领域是已知的。许多启动子描述于Gatz的综述中，(Curent Opinion in Biotech.7(2)：168-172(1996)(也参见Gatz，Annual Rev.Plant.Physiol.and Plant Mol.Biol.48：89-108，1997)。例子包括四环素阻抑物系统、Lac阻抑物系统、铜诱导的系统、水杨酸诱导的系统(例如PRla系统)、糖皮质激素诱导的(Aoyama T.等人，Plant Journal 11(3)：605-612，1997)和蜕皮素诱导的系统。还包括苯磺胺诱导的系统(美国专利号5,364,780)、乙醇诱导的(WO 97/06269和WO 97/06268)诱导系统和谷胱苷肽S-转移酶启动子。

嵌合型反式作用病毒复制蛋白的受控表达可进一步由其他的基因策略调控。例如，如Odell等人，(Molecular and General Genetics223：369-3781990)描述的Cre介导的基因激活。因此，含有由启动子和复制蛋白编码序列之间的lox位点结合的3’调控序列的DNA片段可由Cre介导的切割除去并导至反式作用复制基因的表达，所述DNA片段阻止嵌合型复制基因从启动子的表达。在该情况下，嵌合型Cre基因，嵌合型反式作用复制基因或两者都可在发育特异性或诱导型启动子的控制之下。可选择的基因策略是使用tRNA抑制子基因。例如，tRNA阻抑物基因的受控表达可条件性地控制反式作用复制蛋白编码序列的表达，所述编码序列含有合适的终止密码子，如Ulmasov等人，PlantMol.Biol.35(4)：417-424，1997所描述的。此外，嵌合型tRNA阻抑物基因、嵌合型反式作用复制基因或两者都可在发育特异性或诱导型启动子的控制之下。

除了使用特定的启动子以外，其他类型的元件也可影响转基因的表达。特别地，已证明内含子具有增强转基因表达的潜能。

其他元件包括可被内源或外源性因子例如被锌指蛋白(包括天然发生的锌指蛋白或嵌合的锌指蛋白)调控的元件。参见，例如美国专利号5,789,538、WO 99/48909；WO 99/45132；W0 98/53060；WO98/53057；WO 98/53058；WO 00/23464；WO 95/19431和WO 98/54311。

增强子是能够刺激启动子活性的DNA序列，其可以是启动子的固有元件或是经插入以增强特定启动子的水平或组织特异性的异源性元件。增强子能够从两个方向(相对于目的基因编码序列5′至3′和3′至5′)起作用，并且即使在被移至所述启动子的上游或下游时仍能发挥功能。增强子和其他上游启动子元件都结合介导其功能的序列特异性DNA结合蛋白。

可构建用于本发明的载体使其包含增强子元件。本发明的构建体也包含目的基因和3’末端DNA序列，所述3′末端DNA序列用作终止转录和使所得的mRNA腺苷酰化的信号。

因为转录起始位点和编码序列的起始位点之间的DNA序列即非翻译前导序列可影响基因的表达，所以也可希望使用特定的前导序列。优选的前导序列预期包含这样的序列，即其包含经预测指导被连接的基因最优化表达的序列，即包含可增加或保持mRNA稳定性和阻止不恰当的翻译起始的优选的一致性前导序列。根据本公开内容，这些序列的选择对本领域技术人员来说是已知的。

C.标记基因

为了提高鉴定转化子的能力，除了可表达的目的基因外，人们可能希望使用可选择的或可筛选的标记基因或使用其作为目的基因。“标记基因”是给表达所述标记基因的细胞提供不同表型从而使该经转化的细胞区别于不具有该标记的细胞的基因。这些基因可编码可选择的或可筛选的标记物，依赖于所述标记物是否可提供可通过化学方法即通过使用选择性试剂(例如，抗生素等)进行选择的性状，或其是否仅是个可通过观察或检测例如通过‘筛选’来鉴定的性状。当然，许多合适的标记基因的例子在本领域是已知的并且可用于本发明的实践。

术语可选择或可筛选的标记基因还包括编码“可分泌的标记物”的基因，可检测所述标记物的分泌，作为鉴定或选择转化细胞的手段。例子包括这样的标记，即其编码分泌性抗原或甚至分泌性酶，所述抗原可通过抗体相互作用被鉴定，所述分泌性酶可通过其催化活性被检测。分泌蛋白分成许多种类，包括可通过例如ELISA检测的小的、可扩散的蛋白和可在细胞外溶液中被检测的小的活性酶。

用于原核生物的选择标记包括四环素抗性或氨苄青霉素抗性基因。可使用的筛选标记包括但不限于编码酶的b-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，所述酶的各种产色底物是已知的；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75(8)：3737-3741，1978)，其编码各种产色底物(例如，PADAC，产色的头孢菌素)是已知的酶；xy1E基因(Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：1101，1983)，其编码可转化产色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta等人，Bio-technology 8(3)：241-242，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等人，J.General Microbiol.129(Pt.9)：2703-14，1983)，其编码能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的酶，多巴醌最终缩合(condenses)形成容易检测的化合物黑色素；β-半乳糖苷酶基因，其编码酶，对于所述酶存在其产色底物；萤光素酶(lux)基因(Ow等人，Scienoe 234：856-859，1986)，其使得能够进行生物发光检测(bioluminescenoe detection)；或甚至水母发光蛋白基因(Prasher等人，Biochem Biophys Res Commun.126(3)：1259-68，1985)，其可用于钙敏感性生物发光检测，或绿色荧光蛋白(Niedz等人，Plant Cell Reports 14(7)：403-406，1995)。选择标记也可以是负选择标记例如但不限于，将基因转入基因型为ura3-的生物体中并在培养基中使用ura3系统+/-5FOA，+/-尿嘧啶。

转化

可将表达盒或含有所述表达盒的载体构建体导入细胞。可以游离的方式携带表达盒或表达载体或将其整合入细胞的基因组中，例如，SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒、酵母质粒；来源于质粒和噬菌体DNA的载体、病毒(例如牛痘病毒(vaccinia)、腺病毒(adenovirus)、禽痘病毒(fowl pox virus)和伪狂犬病病毒(pseudorabies))DNA。然而，可使用任何载体，只要其在宿主中可复制和可存活。

用于将构建体导入细胞宿主的许多技术是可获得的并且对本领域技术人员来说是已知。可通过使用聚乙二醇、氯化钙、病毒感染、DEAE葡聚糖、噬菌体感染、电穿孔和本领域已知的其他方法实现微生物细胞的转化。真菌的转化，特别是毕赤氏酵母属的转化，可按照Methods Mol.Biol.，Higgins，David R.and Cregg，James M.；Eds.(Humana，Totowa，N.J.)(1998)中的“毕赤氏酵母方案”来进行。将重组载体导入酵母可通过包括电穿孔、使用原生质球、醋酸锂等方法实现。可使用任何能够将DNA导入动物细胞的方法：例如，电穿孔、磷酸钙、脂转染法(lipofection)等。

重组酶

为了重组木聚糖酶的制备，在转化合适的宿主(例如细菌或酵母宿主)菌株并将宿主菌株培养至合适的细胞密度后，可通过合适的方法(例如温度转换或化学药品诱导)诱导经选择的启动并将细胞再培养一段时间以产生重组酶。然后通常通过离心收集细胞，通过物理或化学的方法破坏细胞，并保留所得的粗提取物以进一步纯化。或者，可将重组蛋白作为融合物(融合至有利于重组蛋白从宿主细胞外运信号肽)生产。在该情况下，通过离心收集细胞并保留上清液。然后从上清液中纯化重组蛋白。

可通过任何方便的方法破坏用于蛋白表达的微生物细胞，其包括冻-融循环、超声、机械破坏或使用细胞裂解剂，这些方法对本领域技术人员来说是熟知的。

可通过这些方法从重组细胞培养物中回收和纯化酶，所述方法括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水性相互作用层析法、亲和层析法、羟基磷灰石层析法和外源凝集素层析法。在完成成熟蛋白的构型中，如果需要，可使用蛋白重折叠方法。最后，可使用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。

本发明的酶可以是化学合成方法的产物，或可通过重组技术从微生物(例如通过培养中的细菌、酵母和真菌细胞)宿主中产生。依赖于重组体生产过程中使用的宿主，本发明的酶可以是或不是通过糖基化共价修饰的。在真核生物细胞中，分泌蛋白的糖基化起着调节蛋白折叠、构象和热稳定稳定性以及对蛋白质水解的抗性的作用。给定木聚糖酶的用途的特定用途，酶的糖基化形式可优于非糖基化的形式。例如，在动物饲料中使用糖基化的木聚糖酶可在饲料的粒化期间帮助保护酶免受热变性和当其通过动物的胃时保护其免受蛋白水解失活，帮助将有活性的酶递送至肠道和作用位点。对于在只在加工过程中而不是在最后的产物中想要酶的活性的食品加工应用中，非糖基化、不耐热的和易受蛋白水解的木聚糖酶是优选的。通过在各种微生物宿主中产生本发明的木聚糖酶，耐热性和对蛋白水解降解的易感性都被改变了。

本发明的酶可用于任何目的，在所述目的中这样的酶的活性是必需的或想要的。在优选的实施方案中，所述酶用于在动物饲料中催化木聚糖的水解。在另外的优选的实施方案中，所述酶用于在食品中催化木聚糖的水解。

木聚糖酶组合物

一般地，木聚糖酶组合物是液体或干燥的。液体组合物不必含有木聚糖酶以外的任何物质，优选地其以高度纯化的形式存在以外的任何物质。尽管这样，还可加入稳定剂例如甘油、山梨糖醇或单丙二醇。液体组合物也可包含其他添加剂，例如盐、糖类、防腐剂、pH调节剂和蛋白。典型的液体组合物是含水的或基于油的浆液。可任选地在食品或饲料粒化之前或之后，将液体组合物加入其中。

干燥组合物可以是冻干的或喷雾干燥的组合物，在该情况下组合物不必包含以干燥形式存在的酶以外的任何物质。干燥组合物可以是可容易地与例如食品或饲料成分混合或更优选形成预混合物的成分的颗粒。酶颗粒的颗粒大小优选地与混合物的其他组分的大小相容。这提供了安全和便利的将酶整合入例如被加工的食品或动物饲料中的手段。

例如，可通过冰冻具有膨胀剂(bulking agent)例如粉碎的大豆粉(ground soybean meal)的液体酶溶液的混合物，然后冻干所述混合物来制备稳定的木聚糖酶制剂。湿度的降低和木聚糖酶和膨胀剂的结合相互作用保护酶免受外部环境因子例如在混合饲料生产期间经历的极端温度的破坏。通过将潜在的蛋白水解酶的活性降到最低，干燥制剂可进一步增强稳定性，所述蛋白水解酶可在用于生产靶酶的液体发酵混合物中作为副产品存在。所得的本发明的干燥的酶-大豆粉混合物可经受住极高的温度。该配制的酶混合物可用作用于家禽和猪生产的饲料补充物。

当获得干燥的酶制剂后，在高剪切力混合器中使用团聚技术制备团聚颗粒，在该过程中填充材料和酶共团聚形成颗粒。通过使载体材料的核心吸附酶/被酶包被来制备吸附性颗粒。典型的填充材料是盐例如硫酸二钠。其他填充物包括高岭土、滑石粉、铝镁硅酸盐和纤维素纤维。任选地，粘合剂例如糊精也包含在团聚体颗粒中。

典型的载体材料包括淀粉，例如以木薯、玉米、马铃薯、稻和小麦形式的淀粉。也可使用盐。

任选地，用包衣混合物包被颗粒。这些混合物包含包衣剂、优选地疏水性包衣剂例如氢化棕榈油和牛脂，如果想要，可用其他添加剂例如碳酸钙或高岭土。

此外，木聚糖酶组合物可含有其他组分(substituents)例如生色剂、芳香化合物、稳定剂、维生素、矿质、其他饲料和食品增强酶等。这对所谓的预混合物尤其如此。

“食品或饲料添加剂”是意欲或适合于被加入食品或饲料中的基本纯的化合物或多组分组合物。特别地其是这样的物质，即其旨欲用途是成为食品或饲料产品中的成分或影响食品或饲料产品的任何特性。因此，木聚糖酶添加剂理解为作为主要的饲料或食品物质的非天然成分或不以其天然浓度存在于其中的木聚糖酶，即，将与饲料物质分开的木聚糖酶单独地或和其他饲料添加剂一起加入饲料中。典型的添加剂一般包含一种或多种化合物例如维生素、矿质或饲料增强性酶和合适的载体和/或赋形剂。

“可立即使用”的木聚糖酶添加剂此处定义为这样的添加剂，即其不是在动物饲料或经加工的食品中原位产生的。可将可立即使用的木聚糖添加剂直接地或优选地在与其他饲料或食品成分混合后直接给人或动物食用。例如，将根据本发明的该方面的饲料添加剂和其他饲料成分组合以生产饲料。这样的其他饲料成分包括一种或多种其他(优选地热稳定性的)酶补充物、维生素饲料添加剂、矿质饲料添加剂和氨基酸饲料添加剂。然后可将可能包含几种不同类型的化合物的所得的(组合的)饲料添加剂以合适的量与其他饲料成分例如谷物和蛋白补充物混合，从而形成动物饲料。可使用目前所使用的加工装置例如双制粒机器、蒸汽制粒机、膨胀机或挤压机将这些成分加工入动物饲料中。

类似地，可将本发明的该方面的食品添加剂与其他食品成分组合以产生经加工的食物产品。这些其他食品成分包括一种或多种其他(特别是热稳定性的)酶补充物、维生素食品添加剂和矿质食品添加剂。然后可将可能包含几种不同类型的化合物的所得的(组合的)食品添加剂以合适的量与其他食品成分例如谷物和植物蛋白混合，从而形成经加工的食物产品。可使用目前所使用的加工装置将这些成分加工入经加工的食物产品中。

在另外的实施方案中，本发明的木聚糖酶组合物额外地包含有效量的一种或多种饲料或食品增强性酶，特别是选自下列酶的饲料或食品增强性酶：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶特别是乳糖酶、其他木聚糖酶、β-葡聚糖酶，特别是内-β-1，4-葡聚糖酶和内β-1，3(4)-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，特别是阿拉伯半乳聚糖内-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内-1，3-β-半乳糖苷酶、内-葡聚糖酶，特别是内-1，2-β-葡聚糖酶，内-1，3-α-葡聚糖酶，和内-1，3-β-葡聚糖酶、果胶降解性酶，特别是果胶酶、果胶脂酶、果胶裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、阿拉伯聚糖酶(arabinanases)、鼠李糖聚半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonases)、鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸聚-α-鼠李糖苷酶(rhamnogalacturonan-α-rhamnosidase)、pectate lyases，和α-半乳糖醛酸苷酶(α-galacturonisidases)、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯糖木聚糖酶和酯肪分解酶例如酯酶、磷酯酶、肌醇六磷酸酶和cutinases

在饮食前或与饮食同时将本发明的动物饲料添加剂补充给动物。优选地与饮食一起将本发明的动物添加剂补充给动物。

食品或饲料中的木聚糖酶的有效量是大约1至10,000U/kg；更优选地是大约50至5,000U/kg，更优选地大约500至4,000U/kg或250至3200U/kg。

木聚糖酶在加工和生产人食品和动物饲料中的用途也在本发明的范围内。可用木聚糖酶酶促处理确定为人食物的谷物和面粉以减少材料中木聚糖的含量。减少的木聚糖水平通过增加必需矿质例如铁、钙和锌的营养利用度提高了食品的品质。除了增加食品的营养品质外，在食品加工过程中使用的木聚糖酶可提高食品生产方法的总体效率。在食品生产过程中，木聚糖酶只在生产和加工期间具有活性而在最终的食物产品中没有活性。该方面与例如生面团的制备和烘烤有关。类似地，在混合饲料生产前，可用木聚糖酶预处理动物饲料谷物例如经烘烤的大豆粉或canola粉。在混合饲料生产之前除去动物饲料成分中的抗营养因子(anti-nutritive)产生营养品质更高和更有价值的动物饲料成分。在该加工方法中，在饲料生产期间木聚糖酶是有活性的，在摄入经处理的饲料后，在动物的消化道中其可以是有活性的或无活性的。

除了使用木聚糖酶作为食品加工辅助物外，本发明的范围包括木聚糖酶作为人补充性消化辅助物的用途。在进食时间可摄入片剂形式的木聚糖酶以将有活性的酶递送至受者的胃肠道中。对于取食者，营养的获得要经历体内过程并且可以从在食品加工期间不能用木聚糖酶处理的食品中获得。

本发明的木聚糖酶在制备食品或饲料制剂或添加剂的过程中的用途也在本发明的范围之内，即木聚糖酶只在生产期间具有活性而在最终的食物或饲料产品中无活性。该方面特别地与例如生面团的制备和烘烤以及其他即食的基于谷物的产品的生产相关。

木聚糖酶也可有利地用于单胃和多胃动物，特别是小牛。也可用木聚糖酶补充鱼和甲壳类动物的饮食以进一步改善饲料转化率。也可向动物例如家禽例如火鸡、鹅、鸭和猪、马、牛、绵羊、公山羊、犬科动物和猫科动物以及鱼和甲壳类动物提供本发明的饲料。然而，特别优选的是给猪或家禽(包括但不限于broiler、母鸡特别是蛋鸡、火鸡和鸭)提供所述饲料。

饲料组合物和使用方法

如上所述配制的本发明的木聚糖酶可和其他成分一起产生具有特定优点的新的饲料组合物。

本发明的木聚糖酶的活性非常高，以至其可用于产生新的动物饲料制剂，相对于一般食物，该饲料制剂使得能够产生更优的饲料转化效率和提高的体重增量。

明确地，本发明的动物饲料包含本发明的木聚糖酶和动物饲料成分的组合，从而形成具有显著较低的完整木聚糖的含量的饲料。在优选的实施方案中，本发明的饲料组合物包含一般的饲料成分、微量营养素(micronutrients)、维生素等和有效量的热稳定性木聚糖酶，其中木聚糖酶的量在每kg饲料1至10,000个单位的木聚糖酶的水平；更优选地在每kg饲料50至5,000个单位的木聚糖酶的水平。

提高体重增量和与畜养动物的产量相关的饲料转换率(FCR)的方法也在本发明的范围之内。本发明的木聚糖酶使得能够产生提高的体重增量和FCR。特别地，本发明的方法通过给动物喂食包含本发明的木聚糖酶的饮食来改善FCR或体重增量。

本发明的动物饲料可用于单胃或多胃动物。可用本发明的动物饲料饲养家禽，或猪，或小牛，或伴侣动物例如狗、猫或马。所述动物饲料也可用于反刍动物例如牛。

本发明通过下列实施例进一步说明，所述实施例绝不以任何方式限定本发明的范围。

实施例1

Xy1A1A表达构建体

pBSC12771(包含合成的Xy1A1A木聚糖酶基因的pPIC9)。在Entelechon(Regensburg，Germany)使用巴斯德毕赤氏酵母偏爱密码子构建编码Xy1A1A木聚糖酶氨基酸序列的合成基因并称为PP6002(Xy1A1A的针对巴斯德氏毕赤氏酵母优化的密码子形式)(SEQ IDNO：1)。设计合成基因的序列以使其在成熟的肽编码序列之前包含KEX2蛋白酶切割信号(Glu-Lys-Arg)(SEQ ID NO：37和核苷酸序列SEQ ID NO：36)。在pPIC9载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中提供合成的基因，该基因被Syngenta Quality Control称为pBSC12771(图1和SEQ ID NO：33)。该克隆策略产生了这样的融合蛋白，即在所述融合蛋白中啤酒糖酵母α交配因子前原肽分泌信号(核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NOS：38和39)符合阅框地融合至PP6002基因序列的N末端。由该基因编码的融合肽在产生后从细胞中分泌出来。在分泌过程中，融合蛋白的α因子肽部分被Kex2蛋白酶切割，从而将Xy1A1A木聚糖酶释放至细胞外环境。

这有助于Xy1A1A酶的分离和纯化。该构建体中的PP6002基因在巴斯德毕赤氏酵母乙醇氧化酶-1(AOX1)的启动子控制之下，所述启动子用甲醇进行诱导。通过使用由厂商(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的特异性的5AOX和3AOX测序引物确定合成的基因。在序列确定后，如前面所描述的，将pBSC12771质粒重新转化入化学感受态大肠肝菌TOP10细胞并使用由Sambrook J，Russel D W.2001.″MolecularCloning：A Laboratory Manual，″第3版(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)所描述的方法制备甘油贮存物。

pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT中间体的构建。使用酵母多拷贝表达载体pAO815(Invitrogen，Carlsbad，CA)制备PP6002表达盒的多聚体。为了制备pAO815多聚化表达载体，构建系列中间载体。通过BamHI消化使亲本载体pBSC12771线性化。然后使用T4聚合酶(NEB，Beverly，MA)回填BamHI限制性位点。接着使用T4快速连接酶(NEB，Beverly MA)将其自身经回填的BamHI位点连接。通过第二次BamHI消化除去任何剩下的、未经修饰的亲本载体。将BamHI消化的、回填的和重新连接的DNA转化入化学感受态大肠杆菌TOP10细胞并在37℃下在LB_amp100上进行过夜选择。将单个分离的菌落培养在选择培养基上并通过Qiagen(Qiagen mini-prep purification kit，Valencia，CA)描述的方法纯化DNA。通过用BamHI限制性消化确定BamHI位点的消除。经修饰的载体称为pPIC9mod-PP6002并被用作PCR的模板。使用下列的寡核苷酸和热循环参数，用GeneAmp^PCR System 9700热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)和Advantage cDNA聚合酶(Clontech，Palo Alto，CA)扩增靶DNA：

引物1：5′-AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAAC-3′

(SEQ ID NO：23)

引物2：5′-CATTAGGATCCGCACAAACGAACGTCTCACTTAATC-3′

(SEQ ID NO：24)

表1：热循环仪参数

步骤	温度(℃)	时间	循环
步骤	温度(℃)	时间	循环	1	94	5分钟	1
2	94	30秒	25	1	94	5分钟	1
2	94	30秒		3	65	30秒
4	72	30秒		3	65	30秒
4	72	30秒		5	72	5分钟	1
6	4	5分钟至大约24小时		5	72	5分钟	1

引物1和2设计用来扩增从AOX1启动子的5′末端至AOX1转录终止子的3′末端，包括α-分泌因子-木聚糖酶ORF。同样，这些引物也通过设计将BglII位点整合在产物的5′末端和将BamHI位点整合在产物的3′末端以进行随后的表达盒的多聚化。通过Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)描述的方法将得到的PCR产物直接克隆入拓扑异构酶-I激活的载体pCR4Blunt-TOPO。该载体称为pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT。SP6、T7和基因特异性测序列引物确定了扩增和克隆的保真度。

pBSC12772(pAO815_1×PP6002)表达载体的构建。

设计寡核苷酸(参见下面的引物3和4)用来通过PCR扩增含有来自pBSC12771的啤酒糖酵母α-交配因子和PP6002的ORF。使用GeneAmpPCR System 9700热循环仪(Applied Biosystems，FosterCity，CA)和PfuUltra Hotstart聚合酶(Statagene，La Jolla，CA)扩增靶DNA。

引物3：5′-GGGGCCGGGAATTCCGATGAGATTTCCTTCAATTTTT-3′(SEQID NO：25)

引物4：5′-GCCGGGGAATTCCGCGGCCGCCTATTACCAGACAGTAACATTTGA-3′(SEQ ID NO：26)

引物将EcoRI位点整合至PCR产物的末端以允许产物随后插入pAO815受体载体。使用下列参数进行通过热循环反应的扩增：

表2.热循环参数

步骤	温度(℃)	时间	循环
步骤	温度(℃)	时间	循环	1	94	5分钟	1
2	94	30秒	25	1	94	5分钟	1
2	94	30秒		3	65	30秒
4	72	1分钟		3	65	30秒
4	72	1分钟		5	72	7分钟	1
6	4	5分钟至24小时		5	72	7分钟	1

用EcoRI消化PCR产物。通过在0.8％TAE凝胶上电泳分离限制性酶切反应物并通过Qiagen(Qiaquick Gel extraction Kit；Qiagen，Valencia，CA)描述的方法对0.8kb片段进行凝胶纯化。在平行的限制性消化反应中，使用EcoRI消化7.7kb的巴斯德毕赤氏酵母多拷贝表达载体pAO815(Invitrogen；Carlsbad，CA)并通过牛小肠磷酸酶(New England Biolabs，Berverly，MA)对其粘性末端去磷酸化。如上所述通过在0.8％TAE的凝胶上电泳分离载体片段和进行凝胶纯化。使用T4 DNA连接酶(Quick Ligation Kit，New England Biolabs；Beverly，MA)直接将EcoRI消化的和凝胶纯化的PCR片段连接入线性化的、去磷酸化的pAO815。将连接反应物转化入化学感受态大肠杆菌TOP10细胞中并在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB板上涂板。将单个分离的菌落培养在选择培养基上并通过Qiagen(Qiagen mini-preppurification kit，Valencia，CA)描述的方法纯化DNA。使用由厂商(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的质粒特异性5AOX和3AOX测序列引物确定基因的方向和序列。在确定序列后，将pAO815_1x PP6002质粒重转化入化学感受态大肠杆菌TOP10细胞中，使用Sambrook，等人2001描述的方法制备甘油贮存物。将pAO815_1x PP6002构建体提交给Syngenta Biotechnology，Inc.Quality Control并称其为pBSC12772(参见表2和SEQ ID NO：34)。

PP6002表达盒的多聚化。通过用BglII和BamHI(New EnglandBiolabs；Beverly，MA)进行双消化从pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT移去表达盒(5AOX-PP6002-3AOXTT)并对2.1kb片段进行凝胶纯化。在分开的反应中，如前面所述用BamHI消化pBSC12772并通过CIP处理对其粘性末端去磷酸化。通过0.8％TAE的凝胶对经BamHI消化的、经CIP处理的pBSC12772进行电泳并进行凝胶纯化。使用T4 DNA连接酶(Quick Ligation Kit，New EnglandBiolabs；Beverly，MA)将经凝胶纯化的BamHI-BglII表达片段连接入经BamHI线性化的、经CIP处理的pBSC12772载体并将其转化入化学感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen；Carlsbad，CA)。将转化细胞在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB板上涂板并在37℃下将板温育过液。将单个分离的菌落培养在选择性培养基上并通过Qiagen(Valencia，CA)描述的方法制备DNA。通过限制性酶切分析和在连接处使用载体特异性引物进行DNA序列分析来确定两拷贝的木聚糖酶构建体。所得的含有两个PP6002拷贝的pAO815载称为pAO815_2xPP6002。

pSYN12773(pAO815_3xPP6002)的构建。通过使用BamHI消化pAO815_2xPP6002和CIP处理粘性末端构建含有三个合成的Xy1A1A表达盒拷贝的构建体。使用T4 DNA连接酶(Quick Ligation Kit，NewEngland Biolabs；Beverly，MA)将来自BamHI-BglII双消化反应物pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT的经纯化的表达盒片段连接入经BamHI消化的、CIP处理的pAO815_2xPP6002载体，然后如前面所描述的，将其转化入化学感受态大肠杆菌TOP10细胞。将所述转化细胞涂板在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB板上并在37℃下将板温育过夜。将单个分离的菌落培养在选择性培养基上并通过Qiagen(Valencia，CA)描述的方法制备DNA。通过限制性片段分析来确定3拷贝表达构建体。此外，由Syngenta Biotechnology Inc.QualityControl确定pAO815_3xPP6002的完全核苷酸序列。pAO815_3xPP6002构建体被Syngenta QC命名为pSYN12773(参见图3和SEQ IDNO：35)。

实施例子2

用于巴斯德毕赤氏酵母的转化的pSYN12773 DNA的制备。将50mL补充有氨苄青霉素(100μ/mL)的TB培养液和含有pSYN12773的大肠杆菌TOP10细胞的甘油贮存物一起温育，在37℃下培养过液。通过Qiagen(Qiaprep Midiprep protocol，Qiagen，Valencia，CA)描述的方法从培养物中纯化DNA。用BglII内切核酸酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)消化分离的质粒DNA过液。通过在0.8％Tris-醋酸EDTA(TAE)琼脂糖凝胶上对消化混合物进行电泳，并通过Qiagen(QiaQuick gel purification protocol，Valencia，CA)描述的方法从凝胶上纯化对应于Xy1A1A整合表达盒的10.4kb的片段。通过在0.8％TAE凝胶上对部分纯化的片段进行电泳以确定完全消化和其相对浓度。此外，将经纯化的片段的部分转化入化学感受态大肠杆菌DH5α细胞以确定样品中没有残留的环化的含有氨苄青霉素标记的质粒污染。将整个转化混合物在的LB_Amp100平板上涂板并在37℃下将板温育16小时。板上没有菌落生长。

实施例3

巴斯德毕赤氏酵母Xy1A1A表达宿主的构建

用于转化的巴斯德毕赤氏酵母GS115细胞的制备。使用无菌技术在层流罩超静台中进行所有微生物操作。通过将巴斯德毕赤氏酵母GS115酵母细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)在YPD琼脂糖板上划线培养来制备所述细胞。然后在30℃下培养过夜，将来自YPD琼脂板的单个酵母集落转移至5ml YPD培养液中并在30℃下培养过夜。该“种子培养物”的部分用于接种无菌的、装有500ml YPD培养液的带挡板的2升培养瓶。在30℃下通过强烈的摇动培养该培养物过夜直至光学密度OD₆₀₀＝1.5。通过在4000Xg、4℃下离心5分钟收集细胞，并重悬浮于80mL无菌双蒸(sdd)水中。将10毫升10X TE缓冲液(10mMTris-HCl、0.1mM EDTA)，pH7.5加入至悬浮液中，然后加入10mL1M醋酸锂(LiAc)。通过轻柔的涡旋在30℃下温育细胞悬浮液。温育45分钟后，加入2.5mL 1M的二硫苏糖醇(DTT)并将细胞悬浮液重新在30℃下再温育15分钟。然后用系列的水洗涤细胞，最后重悬浮于5mL冰冷的1M山梨糖醇中。

pSYN12773 DNA至巴斯德毕赤氏酵母GS115的转化。将经纯化的来自BglII消化的pSYN12773质粒的Xy1A1A表达盒的DNA(100ng)与80μL经LiAc/山梨糖醇处理的巴斯德毕赤氏酵母GS115细胞在0.2cm电穿孔小杯(Gene Pulser Cuvettes，BioRad，Hercules，CA)中混合并在冰上孵育5分钟。将电穿孔小杯放入BioRad Gene Pulser II仪器中并用1.5kV、2 5μF和200Ω的设置进行脉冲，向电穿孔混合物中加入冰冷的山梨糖醇(0.5mL)，然后将所述混合物在不含组氨酸的、基本葡萄糖培养基(minimal media-dextrose)(MD)琼脂板上涂板。巴斯德毕赤氏酵母株系GS115是组氨酸营养缺陷体，从而不能在缺少组氨酸的情况下生长，但在Xy1A1A表达盒上含有his4基因的稳定转化子恢复成组氨酸原养型并且能够在无组氨酸的培养基上生长。在30℃下培养3天，产生大量的组氨酸原养型转化子。将在缺少转化DNA的情况下经电穿孔的经LiAc/山梨糖醇清洗的GS115细胞在MD和MD/组氨酸琼脂板上涂板作为对照。在电穿孔期间无转化DNA的GS115细胞没有产生能够在缺少组氨酸的MD板上生长的集落。

产生木聚糖酶的巴斯德毕赤氏酵母转化子的鉴定。从MD板上的原代转化子中挑出256个单个的his⁺原养型分离集落并在MD主平板上进行复制涂板。然后将这些集落复制涂板至缺少组氨酸、含有1.0％甲醇的基本培养基(MM)琼脂板，该琼脂板含有0.1％Azo-小麦阿拉伯木聚糖(缩写：AzoWAXY；Megazyme，County Wicklow，Ireland)。在30℃下温育16小时后，围绕在MM AzoWAXY板上的集落的清澈区带鉴定了92个产生木聚糖酶活性的转化子。将92个木聚糖酶表达性克隆中的24个接种至24个位点的深孔板中的3mL BMMY诱导培养液，并让克隆表达5天。诱导后，通过木聚糖酶测定法和ELISA法对上清液进行分析。8个转化子以推定高于对照的产量的水平产生木聚糖酶。在50mL摇动培养瓶中进一步检查这8个转化子的表达水平。在5天的诱导后，事件5501、5517和5520在产量和产率上表现统计学上显著的提高。

用于含有pSYN12273的巴斯德毕赤氏酵母转化子的长期贮存的甘油贮存物的制备。通过用来自MD主培养板的8个推定的高度表达木聚糖酶的阳性克隆接种带帽的16×150mm玻璃管中的7mL无菌液体MD培养基来制备甘油冷冻贮存物。将其在30℃下在旋转培养wheel上培养过夜。将1毫升(1mL)无菌甘油与各培养物混合，产生15％(v/v)的甘油对培养物的混合物。将各培养物等分分装入无菌冷冻小瓶并在-80℃下贮存。

Xy1A1A巴斯德毕赤氏酵母表达宿主的表征

筛选MutS表型。为了鉴定MutS克隆，将木聚糖酶阳性克隆在缺少组氨酸的、含有1.0％甲醇的基本培养基(MM)的琼脂板上划线，其旁边是MutS阳性对照(含有pPIC9-secHSA的GS115；Invitrogen，Carlsbad，CA)和Mut+对照(含有pPIC3-βGal的GS115；Invitrogen，Carlsbad，CA)。在30℃下温育板4天并记录在MM上的生长状况。和对照相比，前面鉴定的原始的92个his⁺xyn⁺事件中的39个在MM培养基上表现出较慢的生长。在这39个事件中，有8个之前已通过活性和ELISA测定法被鉴定为高表达者。

对Xy1A1A表达盒的初步杂交筛选。进行系列杂交实验。在初步的杂交筛选中，使用标准技术(Miles JD，Busser K，Stalder C，和Higgins DR(1998)Isolation of nucleic acids，in PichiaProtocols，第103卷(Higgins DR&Cregg JM，eds.)，Humana Press，Totowa，NJ，pp.73-80)制备8个推定的高表达性事件的基因组DNA。使用BglII限制性内切核酸酶消化2微克的基因组DNA。通过0.8％的琼脂糖凝胶对消化物进行电泳，然后双向转移至两张硝酸纤维素膜上，产生双份印迹。制备对于PP6002 CDS PP6002和氨苄青霉素基因(cAmp-04)特异性的DNA杂交探针。使用基因特异性引物(参见针对PP6002的引物5和6以及针对amp的引物7和8)通过聚合酶链式反应产生木聚糖酶和amp的探针。

引物5：5′-GCATCTACTGACTACTGGCAG-3′(SEQ ID NO：27)

引物6：5′-CCAGACAGTAACATTTGAATAACC-3′(SEQ ID NO：28)

引物7：5′-GGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCAT-3′(SEQ ID NO：29)

引物8：5′-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACC-3′(SEQ ID NO：30)

对产物进行凝胶纯化并使用Rediprime-II标记系统(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)用[³²P]-dCTP标记经纯化的产物。在用[³²P]-dCTP-amp探针在65℃在杂交缓冲液中进行严紧杂交后，除了阳性对照(经BglII消化的pSYN12773)，第一印迹没有显示任何杂交条带。该实验表明氨苄青霉素基因在这些事件中的任一事件中没有整合入巴斯德毕赤氏酵母的基因组中。使用前面描述的高严紧度方法用[³²P]dCTP-PP6002探测双份印迹，在事件5517和5520中产生大约10.4kb的单一条带，表明木聚糖酶基因的三个拷贝已成功地整合入这些事件中。

对事件5520详细的杂交筛选。为支持初步的杂交筛选，进行事件5520基因组DNA的另外的限制性消化。用BamHI、BgllI、EcoRIxNotIPssI、PvuII，和XhoIxNotI消化2微克的事件5520基因组DNA。在0.8％的琼脂糖凝胶上对消化物进行电泳，然后双向转移至两张硝酸纤维素膜上，产生双份印迹。制备对于cXy14-01 CDSαss-PP6002和载体主链基因(cAmp-04和oCOLE-10)特异性的DNA杂交探针。使用基因特异性引物(对于cXy14-01的引物3和6以及对于主链的下面的引物9和10)通过聚合酶链式反应产生木聚糖酶和主链的探针。

引物9：5′-GCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGA-3′(SEQ ID NO：31)

引物10：5′-GGGAACACTGAAAAATAACAGTTAT-3′(SEQ ID NO：32)

对产物进行凝胶纯化并使用Rediprime-II标记系统(AmershamBioscienoes，Piscataway，NJ)用[³²P]-dCTP标记纯化的产物。在用[³²P]-dCTP-主链探针在65℃在PerfectHyb^TM Plus杂交缓冲液(SigmaChemical Co.，St.Louis Mo)中进行严紧杂交后，除了阳性对照(经BglII消化的pSYN12773)外，第一印迹没有显示任何杂交条带。该实验表明载体主链在事件5520中没有整合入巴斯德毕赤氏酵母的基因组中。使用前面描述的高严紧度方法用[³²P]dCTP-cXy14-01探测双份印迹，在经Bgl11消化的样品中产生大约10.4kb的单个条带，表明木聚糖酶基因的三个拷贝已成功地整合入事件5520中。经BamHI、EcoRIxNotI、PstI、PvuII和XhoIxNotI消化的产物产生具有预期的针对在巴斯德毕赤氏酵母的AOX1基因座上整合的迁移特征谱的条带。总而言之，由Southern印变法测定的巴斯德毕赤氏酵母PP6002表达事件5520的所有特征和在含有甲醇的基本培养基上的生长特征表明所述事件具有His⁺、Mut^s表型，包含插入至AOX1基因座上的PP6002表达盒的三个拷贝，不包含氨苄青霉素抗性基因或载体主链的其他成分。

实施例4

PP6002巴斯德毕赤氏酵母主细胞文库的制备

从事件5520的MD甘油冷冻贮存物制备主细胞文库；此处称为SYN12773。在无菌条件下，通过在MD板上划线和在30℃下温育直至集落出现来复苏(revive)来自SYN12773甘油冷冻贮存物样品。从MD板中挑出单个集落并接种至装有5mL MD液体培养基的培养管中。将管在旋转wheel上在30℃下温育过夜。第二天，将SYN12773起始培养物接种至2.8L、含有350mL的YPD培养基的带挡板的培养瓶中。将培养物在30℃下在250rpm的摇床上培养直至OD₆₀₀＝2.0-3.0，达到3.0x10⁷个细胞。在无菌条件下，将150mL无菌甘油加入至350mL YPD培养物，导致30％(v/v)的甘油对YPD的比例。将培养物的等分部分(1.0mL)转移至243个无菌的2.0mL的带有螺帽和O-环形密封附件的聚丙烯冷冻管(Fisher Science，Cat No.056698)中。将243个冷冻小瓶子放入3个冷冻盒中并于-80℃下贮存。

巴斯德毕赤氏酵母木聚糖酶主细胞库的纯化。将来自主细胞库中的其中一个小瓶的1微升样品在YPD琼脂板上划线。将板在30℃下温育过夜以产生单个的集落。目视检测这些集落，发现其具有均一的与亲本株系巴斯德毕赤氏酵母GS115的表型一致的集落表型。将来自YPD板的单个集落在MD和MM AzoWAXY琼脂板上划线并在30℃下培养直至单个集落的出现。所得的集落在MD和缺少组氨酸的MM琼脂上都能生长，表明与事件SYN12773相似，但与亲本株系GS115不同，它们都具有His⁺表型。此外，所有集落在含有甲醇作为碳源的MM琼脂上生长缓慢，表明与事件SYN12773相似，但和株系GS115不同，它们具有预期的AOX1突变体的Mut^s表型。此外，所有在MM AzoWAXY板上的集落都产生清澈的区带，表明有活性的木聚糖酶的表达。这些分析的结果表明此处描述的MCB是纯的并且没有其他微生物的污染。

巴斯德毕赤氏酵母木聚糖酶克隆的遗传稳定性。通过在MD琼脂上进行20次连续的涂板实验检测事件SYN12773中多拷贝PP6002表达盒的遗传稳定性。通过在MD琼脂板上划线和在30℃下培养长达48小时来复苏来自MCB低温冷冻小瓶中的一瓶的细胞(板1)。从板1中挑出单个菌落并重新在第二块MD板上划线。连续20次进行挑出单个菌落并重涂板的该循环。纯化来自板1和20的单个菌落的基因组DNA，并用于Southern分析。比较第1代和第20代之间的杂交特征谱。如前面所述进行Southern分析，在第1和20代之间未观察到差异。从板1和板20的单个菌落制备液体培养物用于蛋白表达分析。使用来自这些板中的每一个板上的3个单独的菌落接种50mL BMGY培养基。在30℃下将细胞培养过夜，离心并重新悬浮于50mL BMMY中。在30℃下温育培养物5天，每天加入甲醇，使终浓度达到1.0％(v/v)。在发酵期的末期，分析澄清的(clarified)上清液的木聚糖酶活性。

来自两个板的克隆都以这样的水平产生有活性的木聚糖酶，即在来自相同板的培养物之间和来自板1和20的培养物之间没有统计学上显著不同的水平(p＜0.05)。通过Southern分析和通过蛋白表达对来自板1和20的细胞的基因组的分析证实了整合在巴斯德毕赤氏酵母GS 115的基因组中的PP6002表达盒的稳定性和其中的木聚糖酶基因的表达稳定性。

实施例5

木聚糖酶活性的确定

使用小麦的阿拉伯木聚糖作为底物并测量通过还原性末端和3，5-二硝基水杨酸(DNS)或2，2′-bicinchoninic acid(BCA)的反应释放的还原性末端来确定酶促活性。将底物配制为100mM醋酸钠缓冲液pH5.30(含有0.02％叠氮化钠)中的1.4％w/w的小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme P-WAXYM)溶液。DNS试剂由0.5％w/w、15％酒石酸钾钠和1.6％w/w氢氧化钠组成。该溶液是稳定的并在室温下贮存长达3个月。通过将50份试剂A和1份试剂B(试剂A和B来自Pierce，产品编号分别为23223和23224)混合制备BCA试剂。在使用前不超过4小时混合这些试剂。

在DNS测定法中，将500微升的底物和200微升酶样品混合。在想要的温度下温育想要的时间后，加入700微升的DNS试剂。混合内容物并在100℃下放置10分钟。将内容物冷却，然后转移至小杯中，相对于已知浓度的木糖，在540nm处测量吸光度。酶的稀释度、温育时间和温育温度的选择视本领域技术人员的不同而变化。

在BCA测定法中，将200微升的底物与80微升的酶样品混合。在想要的温度下温育想要的时间后，加入2.80毫升的BCA试剂。混合内容物并在80℃下放置35分钟。将内容物冷却，然后转移至小杯中，相对于已知浓度的木糖，在560nm处测量吸光度。酶的稀释度、温育时间和温育温度的选择视本领域技术人员的不同而变化。根据MillerG.L.(1959)Anal.Chem.31 426-428的方法确定酶促活性。

实施例6

使用鸡的试验

使用含有小麦、黑麦和大豆粉作为主要成分的标准家禽食物。示例性食物列于表3。使用产生于重组巴斯德毕赤氏酵母的Xy1A1A木聚糖酶。针对每种食物，将6个重复栏的鸡，每栏6只鸡，养至21天龄，并通过减去一天龄的鸡的重量确定最终的重量。持续记录每栏鸡消费的饲料量，确定平均饲料消费。通过冻干有活性的酶制剂然后在试验地点用水恢复来配制Xy1A1A木聚糖酶。直接将该制剂加入食物中。按照商业标准，以与Xy1A1A木聚糖酶相似的剂量使用Avizyme 1300。

表3.3.2食物配方

成分起始(Starter)

黑麦 20.00％

小麦-饲料 37.49％

大豆粉48 33.65％

大豆油 5.31％

盐 0.39％

DL甲硫氨酸 0.22％

赖氨酸HCl 0.04％

石灰岩 1.13％

磷酸二钙 1.28％

VIT/MIN 0.49％

粗蛋白％ 22.88

Poult ME kcal/kg 3,000.00

猪DE Kcal 3,487.48

钙％ 0.85

Phos％ 0.67

Avail Phos％ 0.40

脂肪％ 6.46

纤维％ 2.52

Met％ 0.56

Cys％ 0.39

Me+Cys％ 0.95

Lys％ 1.25

His％ 0.56

Tryp％ 0.28

Thr％ 0.84

Arg％ 1.52

Iso％ 0.95

Leu％ 1.69

Phe％ 1.07

Tyr％ 0.75

Val％ 1.05

Gly％ 0.93

Ser％ 1.07

Phe+Tyr％ 1.82

Na％ 0.18

Cl％ 0.29

K％ 0.96

亚油酸％ 2.54

Na+K-Cl 241.72

DUA 396.57

Sulphur％ 0.22

镁 0.16

甜菜碱 0.47

胆碱 1,378.97

Poult ME MJ/kg 12.55

完整大豆 0.34

表4举例子说明了含有Xy1A1A木聚糖酶的规定食物对家禽生长表现的影响，其以饲料转化率(FCR)来表示。饲料转化率(FCR)是指消耗的饲料量除以鸡的净体重增量。较低的比例表示鸡消耗每单位饲料获得更大的重量。较低的比例表示鸡更有效地利用被消耗的饲料。

对照食物(无酶补充物)明显地显示比加入了即使是最低量的任一种酶的饲料更差的效果。对照的FCR随着酶每次增加的剂量而得到不断的改善(从1.671至最适宜的1,449，此时XylA1A木聚糖酶的包含率为400个单位)。同时，随着剂量的增加两种木聚糖酶都提高表现，如通过有效的酶统计学项所显示的，XylA1A木聚糖酶明显地优于Avizyme 1300的表现。因此，和不含补充物的食物和含有商业标准品的食物相比，使用该本发明的XylA1A木聚糖酶补充这些饲料减少了每生产一个单位肉鸡(broiler chicken)重量所需要的饲料量。

表4.鸡的饲养研究数据

酶	剂量	摄入	增加	FCR	FCRc	死亡率
酶	剂量	摄入	增加	FCR	FCRc	死亡率	None	0	1088	653	1.671	1.648	4.46
Az 1310	50	1125	716	1.571	1.541	2.38	None	0	1088	653	1.671	1.648	4.46
Az 1310	50	1125	716	1.571	1.541	2.38	Az 1310	100	1079	710	1.521	1.521	0.00
Az 1310	200	1068	682	1.570	1.570	0.00	Az 1310	100	1079	710	1.521	1.521	0.00
Az 1310	200	1068	682	1.570	1.570	0.00	Az 1310	400	1079	699	1.544	1.544	0.00
Az 1310	800	1069	690	1.552	1.552	0.00	Az 1310	400	1079	699	1.544	1.544	0.00
Az 1310	800	1069	690	1.552	1.552	0.00	Az 1310	1600	1104	709	1.558	1.535	2.38
6002	50	1063	712	1.493	1.493	0.00	Az 1310	1600	1104	709	1.558	1.535	2.38
6002	50	1063	712	1.493	1.493	0.00	6002	100	1097	733	1.497	1.497	0.00
6002	200	1097	707	1.554	1.545	2.38	6002	100	1097	733	1.497	1.497	0.00
6002	200	1097	707	1.554	1.545	2.38	6002	400	1074	741	1.449	1.449	0.00
6002	800	1072	730	1.469	1.469	0.00	6002	400	1074	741	1.449	1.449	0.00
6002	800	1072	730	1.469	1.469	0.00	6002	1600	1097	753	1.457	1.457	0.00
							6002	1600	1097	753	1.457	1.457	0.00
								0	1088	653	1.671	1.648	4.46
	50	1094	714	1.532	1.517	1.19		0	1088	653	1.671	1.648	4.46
	50	1094	714	1.532	1.517	1.19		100	1088	722	1.509	1.509	0.00
	200	1083	694	1.562	1.558	1.19		100	1088	722	1.509	1.509	0.00
	200	1083	694	1.562	1.558	1.19		400	1077	720	1.497	1.497	0.00
	800	1070	710	1.510	1.510	0.00		400	1077	720	1.497	1.497	0.00
	800	1070	710	1.510	1.510	0.00		1600	1101	731	1.508	1.496	1.19
								1600	1101	731	1.508	1.496	1.19
							Az 1310		1087	694	1.569	1.559	1.32
6002		1084	718	1.513	1.508	0.98	Az 1310		1087	694	1.569	1.559	1.32
6002		1084	718	1.513	1.508	0.98	统计学p值
酶		0.7119	0.0001	0.0001	0.0001	0.6801	统计学p值
酶		0.7119	0.0001	0.0001	0.0001	0.6801	剂量		0.6719	0.0000	0.0000	0.0000	0.0627
Enz^*剂量		0.2444	0.1804	0.2595	0.3358	0.7516	剂量		0.6719	0.0000	0.0000	0.0000	0.0627
Enz^*剂量		0.2444	0.1804	0.2595	0.3358	0.7516
R-平方		0.1495	0.5615	0.5702	0.5577	0.1886
R-平方		0.1495	0.5615	0.5702	0.5577	0.1886	RMSE		42.99	27.86	0.06277	0.05728	3.73

实施例7

产生于不同宿主的木聚糖酶的热稳定性

木聚糖酶蛋白，BD6002(也称为XylA1A，SEQ ID NO：14)表达于宿主大肠杆菌、巴斯德毕赤氏酵母、啤酒糖酵母和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。获得纯化的酶并在85℃下测量残留活性以确定是否由于在不同的宿主中表达而导致木聚糖酶的热稳定性不同。这些宿主在对表达蛋白进行糖基化上的能力上是有差异的。

残留的木聚糖酶测定法

该测定方法对内-1，4-β-D-木聚糖酶的活性是特异性的。当Azo-小麦阿拉伯木聚糖和内切-木聚糖酶一起温育时，底物通过内切机制(endo-mechanism)被解聚，在向反应混合物中加入工业甲基化酒精(spirits)(IMS)或95％乙醇后，产生保留在溶液中的低分子量的被染色的(dyed)片段。通过离心除去高分子量的物质，测量上清液的颜色。通过参考标准曲线确定测定溶液中的内木聚糖酶。每一种酶都有其自己的标准曲线。在不同的宿主中产生的相同的酶可具有不同的标准曲线。

溶液

A.0.1M柠檬酸。将21.02g柠檬酸一水合物(EM SciencesCX1725-1)通过搅拌溶解在玻璃烧杯中的900mL去矿质(demineralized)水中。将溶液转至1L的容量瓶中并用去矿质水配成1L。过滤灭菌并在室温下贮存。

B.0.2M磷酸钠，二碱

将53.6g磷酸氢二钠7水合物(sodium phosphate dibasicheptahydrate)(Sigma S9390)通过搅拌溶解在玻璃烧杯中的900mL去矿质(demineralized)水中。将溶液转至1L的容量瓶中并用去矿质水配成1L。过滤灭菌并在室温下贮存。

C.50mM磷酸柠檬酸盐(citrate hosphate)缓冲液pH5.4(缩写50CPB54)

将22.2mL 0.1M柠檬酸(ξ3.A.)和27.8mL0.2M磷酸钠在100mL容量瓶中混合。用去矿质水将体积调至100mL。

D.50mM柠檬酸磷酸盐缓冲液pH5.4中的1％w/v小麦阿拉伯木聚糖

用搅拌棒将90ml 50CPB54加入至200ml烧杯中。用铝箔盖住烧杯。将烧杯和内容物放在热平板搅拌器上，将水加热至沸腾并伴随强烈的搅拌。小心地取走铝箔，加入粉沫状底物(1.000g)，再放回铝箔。搅拌溶液10分钟，同时烧沸，然后关掉加热。搅拌溶液直至其冷却至室温，不应该看到成团块的底物。将溶液转入100mL带塞子的容量瓶中。向容量瓶中加入叠氮化钠(2％w/v，1ml)。用少量(3-4ml)50CPB54洗涤烧杯的侧壁两次以除去残留的底物。将洗出物与容量瓶中的内容物混合。用50CPB54将体积调整至100ml并插上塞子。剧烈摇动容量瓶。使用间期应当将该底物溶液在4℃下贮存。在这些条件下和排除污染的情况下，该底物在至少数月内是稳定的。

测定

A.将16×100mm玻璃试管放在架子上于37℃进行水浴。

B.向各管中加入500μL 1％w/v WAXY并平衡至37℃至少5分钟。

C.以合适的稀释度将600μL+样品放入1.5mL eppendorf管中并置于37℃中水浴至少5分钟。

·一般地，对于该测定，靶向大约0.1U/mL下列稀释物以在线性范围内产生信号是想要的。

D.向玻璃试管中加入500μL样品启动反应。立即涡旋并开始起动定时器。

E.在37℃温育正好10分钟。

F.用重复移液器加入2.5mL 95％乙醇并立即涡旋。将管转移至在室温下的架子上。

G.在室温下放置10分钟，然后再涡旋。

H.以最大的速度加速和制动，在1,000g，22℃下在离心10分钟。

I.将上清液转移至1.5mL聚苯乙烯小杯中。

J.在590nm测量吸光度。

对木聚糖酶BD6002的残留活性测定的结果列于表5中。结果显示在巴斯德毕赤氏酵母中表达的木聚糖酶BD6002在85℃30分钟后具有最大的残留活性。耐热性上的差异预计是由于在不同宿主生物体中表达蛋白的糖基化上的差异造成的。已知原核宿主例如大肠菌属和假单孢杆菌株系不糖基化蛋白。

表5.产生于不同宿主的BD6002在85℃下的残留活性。

时间	大肠杆菌	巴斯德毕赤氏酵母	啤酒糖酵母	荧光甲单孢菌
时间	大肠杆菌	巴斯德毕赤氏酵母	啤酒糖酵母	荧光甲单孢菌	0	100.0	100.0	100.0	100.0
5	9.1	70.9	43.8	6.5	0	100.0	100.0	100.0	100.0
5	9.1	70.9	43.8	6.5	10	2.4	59.3	26.3	4.3
15	0.8	43.0	14.4	1.9	10	2.4	59.3	26.3	4.3
15	0.8	43.0	14.4	1.9	20	0.1	36.6	7.3	1.4
25	0.5	30.7	5.7	1.4	20	0.1	36.6	7.3	1.4
25	0.5	30.7	5.7	1.4	30	0.3	26.7	4.0	1.0

实施例8

木聚糖酶酶的加入对瘤胃液(Ruminal fluid)中的累积气体产量的影响

该实施例举例说明了额外的加入至反刍动物饲料的木聚糖酶的差异，通过木聚糖酶与瘤胃液一起温育时气体产量上的差异来测量。

该实验的目的是估计木聚糖酶补充物对苜蓿属干草瘤胃降解的影响。根据内切葡聚糖酶(endoglucanase)活性的结果和厂商的推荐，对酶选择剂量水平2和3。在另一方面，以1.0mg/g DM苜蓿属干草的比例使用四种商购获得的产品。使用Knifetec 1095样品粉碎机(Foss Tecator，Hgans，Sweden)研磨1克DM的苜蓿属干草10秒钟并称重装入发酵瓶(125ml容量)中。通过加入10ml H₂O重悬所有的酶，以6个重复将合适体积的各酶加入到对应的瓶中。在用瘤胃液接种前20小时使用酶。3小时后，加入40ml厌氧性缓冲培养基，其是按照Goering和Van Soest(1970)提出的方法制备的，并使用1M反乌头酸(Sigma Chemicals)将pH调整至pH6.0，并将瓶在20℃下贮存过夜。在喂养(1100h)后4小时从喂食TMR食物的哺乳期奶牛获取瘤胃液，所述TMR饲料是由大麦青贮饲料、剁碎的苜蓿属干草、轧制的玉米粒组成，并经压缩供早哺乳期使用。将经粗滤的瘤胃液装入密闭的、预热的容器中运至实验室并保持在39℃的水浴中。将接种体分配(每瓶10ml)至已在温箱中加温至39℃的培养瓶中并充入不含氧气的CO₂。在加入后立即用带有铝crimp帽的14mm的丁基合成橡胶塞封闭瓶子并温育18小时。也温育阴性对照(瘤胃液加单独的缓冲液以及瘤胃液加缓冲液和酶产物)。这些对照用于修正直接由接种体产生的气体释放和发酵残留物。6个重复中都包含了这些处理和对照。通过插入23号(0.6mm)针头在接种后2、6、12和18小时测量由于底物发醇产生的顶部空间气体，所述23号(0.6mm)针头连接在和可视显示器(Data Track，Christchurch，UK)连接的压力传感器(T443A型，Bailey and Mackey，Birmingham，UK)上。然后取下传感器，将针留在原位以使得可以排气。使用由Mauricio等人，Anim.Feed Sci.Technol.79：321-330(1999)报道的二次方程(气体体积＝0.18+3.697x气压+0.0824x气压²)将气压值(通过被温育的底物OM的量和从阴性对照释放的气体量修正的)用于产生体积估计值。当取出时，将瓶子放入4℃的冰箱以停止发酵，并用真空通过商购获得的咖啡滤纸进行过滤。通过在100℃下干燥残留物24小时来确定表观DM降解率(DMD)和通过在500℃下过夜灰化干燥的残留物后的差来确定OM降解率(OMD)。

测定结果列于下面的表6和7中。这些结果表明木聚糖酶在瘤胃液中，其活性不同。

表6.木聚糖酶添加对于和瘤胃液一起温育18小时的苜蓿属干草的累积气体产量(mL/g OM)的影响。

		温育时间，h
		温育时间，h				处理	2	6	12	18	排序¹
对照	7.19	42.0	105.1	166.4	14	处理	2	6	12	18	排序¹
对照	7.19	42.0	105.1	166.4	14	BD2230	11.2^c	56.5^a	124.0^a	189.8^a	4
BD2236	14.8^a	64.3^a	133.9^a	199.5^a	2	BD2230	11.2^c	56.5^a	124.0^a	189.8^a	4
BD2236	14.8^a	64.3^a	133.9^a	199.5^a	2	BD2248	12.0^b	53.9^a	117.5^c	179.3	9
BD6002	11.4^b	54.5^a	119.1^b	183.3^b	7	BD2248	12.0^b	53.9^a	117.5^c	179.3	9
BD6002	11.4^b	54.5^a	119.1^b	183.3^b	7	BD6004	13.9^a	57.7^a	122.5^a	188.2^a	6
BD6405	15.4^a	60.2^a	122.6^a	183.2^b	8	BD6004	13.9^a	57.7^a	122.5^a	188.2^a	6
BD6405	15.4^a	60.2^a	122.6^a	183.2^b	8	BD6407	12.5^a	52.4^b	112.4	170.7	12
BD6890	10.0	45.9	101.4	157.0	15	BD6407	12.5^a	52.4^b	112.4	170.7	12
BD6890	10.0	45.9	101.4	157.0	15	BD7150	13.6^a	52.9^b	109.9	167.8	13
BD7182	13.9^a	55.1^a	114.0	173.8	11	BD7150	13.6^a	52.9^b	109.9	167.8	13
BD7182	13.9^a	55.1^a	114.0	173.8	11	A	16.1^a	59.6^a	119.5^b	179.1	10
B	22.7^a	73.1^a	136.4^a	197.7^a	3	A	16.1^a	59.6^a	119.5^b	179.1	10
B	22.7^a	73.1^a	136.4^a	197.7^a	3	C	20.5^a	69.1^a	130.9^a	189.0^a	5
D	24.5^a	79.3^a	148.5^a	210.8^a	1	C	20.5^a	69.1^a	130.9^a	189.0^a	5
D	24.5^a	79.3^a	148.5^a	210.8^a	1	SEM	0.8	1.9	2.7	3.5

¹根据在18小时温育测量的累积气体产量的相对排序

^a，b，c分别表示在P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05时在列内与对照的不同。

表7.木聚糖酶添加对于和瘤胃液一起温育18小时的苜蓿属干草的DM(DMD)、OM(OMD)的表观降解力和发酵分配因子(partitioningfactor)(PF)的影响。

处理	加入的木聚糖酶活性¹	DMD，％	排序²	OMD，％	排序²	PF³	排序²
处理	加入的木聚糖酶活性¹	DMD，％	排序²	OMD，％	排序²	PF³	排序²	对照BD2230BD2236BD2248BD6002BD6004BD6405BD6407BD6890BD7150BD7182ABCDSEM	-8746667551695787582643105098859654.5-21315.1	41.144.2^b45.9^a43.7^b42.143.4^c40.841.547.5^a41.741.542.343.4^c44.6^a46.3^a0.6	145361071512111129742	39.342.5^a44.3^a42.3^a40.641.238.939.845.7^a39.840.141.5^c41.5^c42.9^a44.4^a0.5	145361091512112117742	2.362.242.222.362.222.19^c2.12^b2.332.99^a2.382.312.322.10^a2.272.410.04	410114111314613871592

¹木聚糖酶活性表示为每分钟释放的葡萄糖的纳摩尔数。

²根据DMD、OMD和FE的相对排序。

³分配因子＝降解的OM的mg/mL产生的气体

实施例9.酶的表征

从受试物品材料(test article material)(TAM)的纯化(无同种型的区分)

木聚糖酶亲和柱的制备：

将冻干的木聚糖酶，大约10mg巴斯德毕赤氏酵母产生的BD6002(rXy1PP6002，lot Xv1-BD6002-PB206)重悬于1.25ml双蒸水中并用0.1M NaHCO₃ pH8.3配至5ml。将该溶液在4℃下对4 L 0.1M NaHCO₃透析5.5小时，然后按照厂商说明书加入至经双蒸水洗涤的affigel-10(Bio-Rad)。将结合木聚糖酶的affigel-10倒入2ml柱中。

山羊抗血清：

用纯化的木聚糖酶蛋白BD7346来产生抗木聚糖酶的抗体并在山羊(American Alpine)中制备抗体。用500μg完全弗氏佐剂中的木聚糖酶注射山羊，让山羊休息3周，然后用500μg不完全弗氏佐剂中的木聚糖酶注射山羊。每次注射后10天对山羊取血。

木聚糖酶抗体的免疫亲和纯化：

用1ml0.1M甘氨酸-HCl pH2.5预洗脱木聚糖酶亲和柱，接着在磷酸缓冲盐溶液，pH7.3(PBS)中进行平衡。通过重力将5ml山羊抗木聚糖酶血清加入柱子。然后用PBS洗涤柱子直至达到基线。使用1ml的0.1M甘氨酸-HCl pH2.5接着用PBS洗脱结合的木聚糖酶抗体。收集2ml的级分。对每个级分记录280nm处的吸光度。将回收的抗体对0.1M NaHCO₃pH8.3进行透析。

山羊抗木聚糖酶亲和柱的制备：

按照厂商说明书，将山羊抗木聚糖酶(大约13mg)加入至经双蒸水洗涤的affigel-10(Bio-Rad)。将木聚糖酶抗体结合的affigel-10倒入2ml柱中。

木聚糖酶的免疫亲和纯化：

用1ml 0.1M甘氨酸-HCl pH2.5预洗脱木聚糖酶抗体亲和柱，接着在磷酸缓冲盐溶液，pH7.3(PBS)中进行平衡。将1克冻干的毕赤酶母木聚糖酶(XYL-PP6002-PD064)悬浮于5ml dH₂O和5ml PBS中并在4℃下混合30分钟。通过重力将全部悬浮液加到柱上并收集未结合的溶液(流过)。然后用PBS洗涤柱子直至达到基线。使用1ml 0.1M甘氨酸-HCl pH2.5接着用PBS洗脱结合的木聚糖酶。收集2ml级分。记录每个级分在280nm的吸光度。将含有蛋白(A280＞0.09)的级分混合。将流过液反复过柱直至无木聚糖酶可被回收。

实施例10

经纯化的酶的蛋白浓度

使用2种不同的方法测量经纯化的毕赤氏酵母木聚糖酶(XYL-PP6002-PD064)的浓度。第一种方法BCA蛋白测定法(PierceChemicals)使用牛血清白蛋白(BSA)作为参照蛋白。两个不同的条件(37℃下进行30分钟，室温下进行2小时)获得非常相似的结果。

所述蛋白浓度估计为0.403 mg/mL(参见表8和9)。

表8

37℃，30分钟

样品	微克/mL	Abs	Abs	平均	调整	斜率 981.9888
样品	微克/mL	Abs	Abs	平均	调整	斜率 981.9888			562nm	562nm	Abs	abs	R² 0.995803
									562nm	562nm	Abs	abs	R² 0.995803
							BSA	0	0.0695	0.0755	0.0725	0.0000
BSA	5	0.0849	0.0743	0.0796	0.0071		BSA	0	0.0695	0.0755	0.0725	0.0000
BSA	5	0.0849	0.0743	0.0796	0.0071		BSA	25	0.0936	0.0914	0.0925	0.0200
BSA	125	0.2334	0.2361	0.2348	0.1623		BSA	25	0.0936	0.0914	0.0925	0.0200
BSA	125	0.2334	0.2361	0.2348	0.1623		BSA	250	0.4012	0.393	0.3971	0.3246
BSA	500	0.6718	0.6784	0.6751	0.6026		BSA	250	0.4012	0.393	0.3971	0.3246
BSA	500	0.6718	0.6784	0.6751	0.6026		BSA	750	0.9008	0.9212	0.911	0.8385
BSA	1000	1.1868	1.206	1.1964	1.1239		BSA	750	0.9008	0.9212	0.911	0.8385
BSA	1000	1.1868	1.206	1.1964	1.1239		BSA	1500	1.5761	1.6613	1.6187	1.5462
BSA	2000	2.0807	2.0882	2.08445	2.0120		BSA	1500	1.5761	1.6613	1.6187	1.5462

xyn	407.1653	0.4818	0.487133	0.414633333
xyn	407.1653	0.4818	0.487133	0.414633333	xyn	0.4791
xyn		0.5005			xyn	0.4791

表9

室温下，2小时

样品	微克/mL	Abs	Abs	平均	调整	斜率 932.3376R² 0.99865
样品	微克/mL	Abs	Abs	平均	调整				562nm	562nm	Abs	abs
									562nm	562nm	Abs	abs
						BSA	0	0.0596	0.0601	0.0599	0.0000
BSA	5	0.071	0.062	0.0665	0.0067	BSA	0	0.0596	0.0601	0.0599	0.0000
BSA	5	0.071	0.062	0.0665	0.0067	BSA	25	0.0788	0.0759	0.0774	0.0175
BSA	125	0.2271	0.2211	0.2241	0.1643	BSA	25	0.0788	0.0759	0.0774	0.0175
BSA	125	0.2271	0.2211	0.2241	0.1643	BSA	250	0.3771	0.3577	0.3674	0.3076
BSA	500	0.6796	0.6417	0.6607	0.6008	BSA	250	0.3771	0.3577	0.3674	0.3076
BSA	500	0.6796	0.6417	0.6607	0.6008	BSA	750	0.928	0.8889	0.90845	0.8486
BSA	1000	1.1788	1.1864	1.1826	1.1228	BSA	750	0.928	0.8889	0.90845	0.8486
BSA	1000	1.1788	1.1864	1.1826	1.1228	BSA	1500	1.6548	1.6566	1.6557	1.5959
BSA	2000	2.271	2.1562	2.2136	2.1538	BSA	1500	1.6548	1.6566	1.6557	1.5959
BSA	2000	2.271	2.1562	2.2136	2.1538	xyn	398.3723	0.4818		0.487133	0.4273
xyn		0.4791				xyn	398.3723	0.4818		0.487133	0.4273
xyn		0.4791				xyn		0.5005

第二种方法由测量蛋白质的象素密度组成，所述蛋白在SDS-PAGE上电泳并用蛋白特异性染料SYPRO Tangerine(Invitrogen)进行染色。因为毕赤氏酵母产生的木聚糖酶除了20kD的天外然蛋白外，还含有多种同种型，选择所有条带进行象素定量。将酶的浓度和标准的碳酸酐酶进行比较，该酶迁移至大约33kDa。在纯化的木聚糖酶样品中浓度大约为0.125mg/mL。

表10

碳酸酐酶微克/mL
碳酸酐酶微克/mL			micro g/	Pixel	调整的
mL	强度		micro g/	Pixel	调整的
mL	强度			(平均)
1000	167.5	43.5		(平均)
1000	167.5	43.5	500	164.5	40.5
250	155	31	500	164.5	40.5
250	155	31	125	144.23	20.23
背景	124		125	144.23	20.23

木聚糖酶PP6002 PD064

所有条带 Pixel选择的泳道强度调整的平均浓度(平均)1 136.7 18.7 20.55 125微克/mL2 140.4 22.4背景 118

实施例11.纯化的酶的比活性

测量抗体纯化的样品对小麦阿拉伯木聚糖的比活性。将等分样品稀释至大约1000倍并用DNS方案进行测定。

该方案描述了测量在糖类特别是木聚糖和葡聚糖水解过程中产生的还原性末端的方法。所述测定法基于还原性末端和二硝基水杨酸(DNS)的反应。DNS测定法具有几个优于其他还原性糖测定法例如Somogyi-Nelson法的有利方面，包括更低的检测限、稍快的分析时间和使用较少的有毒试剂(即在Somogyi-Nelson方案中使用的砷酸钠)。此处提供的方法基于Miller G.L.(1959)Anal.Chem.31 426-428中的方案。

试剂

使用18mΩ的水制备所有试剂和检测溶液

0.4M氢氧化钠。将16.0g无水氢氧化钠(Fisher S318)通过搅拌溶解在1L烧杯中的900mL水中。转移至1L的容量瓶中，并用水将体积调整为1L。标好标签并在4℃下贮存，不超过90天。

DNS试剂。将5.0g3，5-二硝基水杨酸(Sigma D0550)和150.g酒石酸钾钠四水合物(Fisher S387)溶解在900ml 0.4M氢氧化钠。转移至1L容量瓶中并用0.4M氢氧化钠将体积调整至1L。通过0.2μm过滤器器过滤。在室温下贮存。注意：该试剂是橙黄色颜色。

200mM醋酸钠缓冲液，pH5.30(2xSAB)。将27.2g醋酸钠三水合物(Fisher S209-3)通过搅拌溶解在1L烧杯中的900mL水中。用冰醋酸(Fisher A38)将pH调整至5.304±0.05并转至1L容量瓶中。加入20.mL 2％w/v水中的叠氮化钠并将体积调整至1L。通过0.2μm过滤器过滤。标上标签并在4℃下贮存。溶液在数月内是稳定的。

2％w/v水中的叠氮化钠。将2.00g叠氮化钠(Sigma S8032)通过搅拌溶解在玻璃烧杯中的90mL水中。转至100mL容量瓶中。用水洗涤烧杯并混合入容量瓶。用水将体积调整至100mL。

100mM醋酸钠缓冲液，pH 5.30(1xSAB)。将500mL 2xSAB加入至1L容量瓶中。用水将体积调整至1L。标上标签并在4℃下贮存。溶液在数月内是稳定的。

底物溶液：1xSAB中的1.40％w/v小麦阿拉伯木聚糖。精确地称取1.40g小麦阿拉木聚糖(Megazyme P-WAXYM)装入120ml干燥耐热烧杯(pyrex beaker)。用8mL 95％乙醇湿润样品。加入磁力搅拌棒，然后加入50mL 2xSAB和30mL水。盖上盖并立即将浆放在磁力搅拌器平板上，剧烈搅拌过夜或直至溶解。转至100mL容量瓶中。用约0mL水洗涤烧杯与容量瓶中的内容物混合。用水将体积调整至100mL。标上标签并在4℃下贮存。溶液在数月内是稳定的。

木糖浓缩贮存液，1xSAB中的10.0mg/mL D(+)木糖。

将250.0mg D(+)木糖(Sigma X1500)通过搅拌溶解在50mL玻璃烧杯中的20mL 1xSAB中。将溶液转至25mL容量瓶中。用4mL 1xSAB洗涤烧杯并混合入容量瓶。用1xSAB将体积调整至25mL。

木糖工作贮存液，1xSAB中的1.00mg/mL D(+)木糖

将10.0mL木糖浓缩贮存液加入至100mL容量瓶中。加入1xSAB至100mL。

木糖标准液

使用下面的表在15mL锥形瓶中为木糖标准液制备合适的稀释度，其中溶液A＝木糖工作贮存液而溶液B＝1xSAB。应用使用positive移液器转移溶液A和B。使用间期，木糖标准液应当在4℃下贮存。

表11.

木糖	体积A	体积B	总体积
木糖	体积A	体积B	总体积	(μmol)	(μL)	(μL)	(μL)
00.200.400 600.801.001.201.33	075150225300375450500	500425350275200125500	500500500500500500500500	(μmol)	(μL)	(μL)	(μL)

可制备更大等分的木糖标准液并在4℃下贮存长达90天。

样品制剂

对于用于木聚糖酶活性测量的DNS测定法的新手，如下所述制备单瓶对照木聚糖酶。为了多个实验室间的交叉(cross-over)研究，如下制备5瓶对照木聚糖酶。

注意：应当只使用玻璃器皿制备木聚糖酶溶液，因为已显示塑料器皿结合木聚糖酶从而降低活性。

对照木聚糖酶(包括用于交叉研究的)

记录瓶中所装固体的重量(根据标签)。向一个对照木聚糖酶(lotXYL-PP6002-PDO14R)的瓶中加入10.0g±0.100g水并记录重量。对照木聚糖酶的各个瓶含有100.mg±1.0mg固体。轻微地涡旋直至完全溶解。

工作对照木聚糖酶溶液

由于在该测定法中遇到非常高的稀释率，详述样品的制备非常重要。使用1xSAB制备所有稀释度。为确定比活性，如下所述制备每个小瓶的对照木聚糖酶的稀释度。

对于起始稀释度，称取大约0.100g对照木聚糖酶放入经称重的16×100mm玻璃试管中并记录重量。加入大约10mL 1xSAB并记录重量，产生1∶100的稀释度(参见下表中的稀释度)。

通过称取大约0.100g 1∶100稀释物放入经称重的16×100mm玻璃试管中来制备第二稀释度，并记录重量。加入大约10mL 1xSAB并记录重量，产生1∶10,000稀释度(参见下表中的稀释度)。

表12.

对照木聚糖酶的系列稀释
对照木聚糖酶的系列稀释					起始稀释	酶样品	1xSAB	最终体积(mL)	最终稀释度
木聚糖酶标准贮存液	0.100g	～10mL	～10.0	～1∶100	起始稀释	酶样品	1xSAB	最终体积(mL)	最终稀释度
木聚糖酶标准贮存液	0.100g	～10mL	～10.0	～1∶100	1∶100	0.100g	～10mL	～10.0	～1∶10,000

液体木聚糖酶样品的制备

将液体木聚糖酶样品不加修饰地用作制备如下所述的工作木聚糖酶溶液的贮存液。

固体(例如，冻干的)木聚糖酶样品的制备

向100mg木聚糖酶样品中加入1.00mL水。轻轻地涡旋直至完全溶解。

液体或固体木聚糖酶样品的工作木聚糖酶溶液

由于非标准样品中的可变的预期表达水平，样品之间的合适的稀释度可发生变化。如上所述为工作对照木聚糖酶溶液制备起始稀释度(1∶100)。

如果想要的稀释度在1∶100和1∶10,000之间，那么，制备最终的工作稀释度并记录样品的重量，将1xSAB用于稀释。如果想要的稀释度高于1∶10,000，那么如上所述为工作木聚糖酶溶液首先制备1∶10,000的稀释度。通过如上所述的重量法为对照木聚糖酶制备最终的工作稀释度。

比活性确定方法概述

为精确地确定比活性，使用用于DNS测定法测量木聚糖酶活性，要求对各工作木聚糖酶溶液进行三次重复测试。为进行该测定方案在第0和15分钟采集数据。注意，当处理许多样品时，只要单个0时间重复就足够了。在该情况下，各工作木聚糖酶溶液产生4个数据点。同样，推荐木糖标准液至少要包含两份重复。

注意：0μg/mL木糖标准液也被认为是试剂空白，即，该样品代表单独由底物溶液产生的背景。

下表旨在显示样品、标准和对照反应是如何得来的：

表13.

对照、样品和标准的设置
对照、样品和标准的设置						底物溶液	1x	工作木聚糖酶溶液	木糖标准物
反应		SAB				底物溶液	1x	工作木聚糖酶溶液	木糖标准物
反应		SAB			酶+底物	500μL	----	200μL	----
底物对照	500μL	200μL	----	----	酶+底物	500μL	----	200μL	----
底物对照	500μL	200μL	----	----	标准	500μL	----	----	200μL

移液器校准

使用P-1000测量和记录5个1xSAB的0.2mL等分试样的质量，所述SAB被递送至经分析天平称重的烧杯中。电子表格计算1xSAB的0.2mL等分试样的平均质量。使用该经较准的P-1000移液管进行该方案。

比活性的确定方法

·使用positive移液分配器，用5mL重复移液头将底物溶液的500μL等分试样分配至13×100mm玻璃管中

记住：对于各时间点对各酶进行三次重复检测(第0和15分钟；因此，对于每一个工作木聚糖酶溶液需要6个底物等分试样)。

·将装有底物溶液的试管放37℃水浴中进行至少5分钟。

·将5mL待检测的各工作木聚糖酶溶液等分至16×100mm玻璃试管中并在37℃水浴中平衡至少5分钟。

·将500μL的各木糖标准液等分至1.5mL eppendorf管中并在37℃水浴中平衡至少5分钟。

·对于0时间点的样品，使用positive移液器，用5mL移液头向这些管中加入700μL DNS试剂。

·使用5mL重复移液头向底物溶液的等分试样中加入200μL工作木聚糖酶溶液启动反应。通过涡旋混合溶液并放回至37℃水浴中。

·在所有的酶反应启动后，向恰当标记的含有底物溶液的管中加入200μL木糖标准液。

·15分钟后，使用positive移液器，用5mL移液头向恰当标记的管中加入700μL DNS试剂并从水浴中取出。强烈涡旋。

·在所有酶反应终止后，向各底物溶液中的木糖标准液的各等分试样加入700μL DNS试剂并将样品从水浴中取出，强烈涡旋。

·将管放入强烈沸腾的水浴中或油浴中进行正好10分钟。

注意：在正好100℃下水浴是必需的并且温育时间正好是10分钟。

·将管从沸腾的水浴中取出并放在室温下的水浴锅中。让温度冷却至室温至少5分钟。

·转移至少1mL内容物至1.5mL聚苯乙烯杯中并测量在540nm处的吸光度。

比活性的计算

在内嵌式(embedded)工作表格的恰当单元格中输入标准和样品的吸光度。工作表格通过以吸光度读数(OD₅₄₀)对木糖浓度(μmol/测定物)作图自动地产生木糖标准曲线。然后使用下面的方程用该标准曲线将样品的吸光度转化成比活性。

[＝]μmoles木糖等同物/分钟/g原始酶

[＝]单位/g原始未稀释的酶样品

其中DF＝稀释因子(根据第一、第二和另外的稀释度计算的)

t₂＝第二时间点(例如，15分钟)

t₁＝第一时间点(例如，0分钟)

V_s＝样品重量(例如，0.2g)

在不同的三天进行的三个独立实验的结果显示于表14。也显示了TAM材料PD064的活性以比较两个部分。

表14

PP6002 PDO64 lot	未纯化的10mg/mLexp1 exp2 exp3			纯化的抗体exp1 exp2 exp3
PP6002 PDO64 lot	未纯化的10mg/mLexp1 exp2 exp3			纯化的抗体exp1 exp2 exp3			稀释因子	10100	10317	10018	994	955	1001
时间(min)	15	15	15	15	15	15	稀释因子	10100	10317	10018	994	955	1001
时间(min)	15	15	15	15	15	15	吸光度：OD_15min-OD_0min	0.957	1.003	1.035	0.697	0.731	0.683
在原始贮存液中酶的重量	0.2	0.207	0.2	0.201	0.207	0.2	吸光度：OD_15min-OD_0min	0.957	1.003	1.035	0.697	0.731	0.683
在原始贮存液中酶的重量	0.2	0.207	0.2	0.201	0.207	0.2	斜率(木糖校准曲线)	0.86	0.893	0.869	0.882	0.893	0.869
							斜率(木糖校准曲线)	0.86	0.893	0.869	0.882	0.893	0.869
							活性(单位/克)	3746	3731	3975	262	252	262

所用的公式是：

活性(单位/g)＝(稀释因子/时间×样品重量)×(OD_15分钟-OD_0分钟/斜率)

纯化的酶的平均活性是每克酶溶液259个单位，各实验之间存在很小的变化。未纯化的类型显示超过10倍的更高的活性，这是因为其浓度要高得多(如通过BCA方法测量的，10mg/mL对纯化的样品中的0.400mg/mL)。当修正酶的浓度后，每克干物质的活性在纯化的部分中现在为每mg固体650U，对比在TAM样品中每mg固体373U。

实施例12.最适反应条件

在很广的pH值范围内测量Quantum木聚糖酶的活性以确定最适pH，还确定酶在pH2至3的酸性条件下是否显示明显的活性，该酸性条件是模拟单胃动物消化道中的条件。

以1∶9187稀释PP6002类型(lot)PD064Quantum^木聚糖酶(10mg/mL)并经受从1.5至9的pH条件范围。在下面表15中指定的缓冲液中准备反应条件和小麦阿拉伯木聚糖底物。

表15.

反应pH	缓冲液组成和浓度
反应pH	缓冲液组成和浓度
1.5	0.031 mHCl+0.05M KCl
1.5	0.031 mHCl+0.05M KCl	2.0	0.01M HCl+0.05M KCl
2.5	0.1M甘氨酸+0.1M HCl	2.0	0.01M HCl+0.05M KCl
2.5	0.1M甘氨酸+0.1M HCl	3.0	0.1M甘氨酸+0.1M HCl
3.5	0.1M甘氨酸+0.1M HCl	3.0	0.1M甘氨酸+0.1M HCl
3.5	0.1M甘氨酸+0.1M HCl	4.0	0.1M乙酸钠
4.5	0.1M乙酸钠	4.0	0.1M乙酸钠
4.5	0.1M乙酸钠	5.0	0.1M乙酸钠
5.5	0.1M乙酸钠	5.0	0.1M乙酸钠
5.5	0.1M乙酸钠	6.0	0.1M Tris-HCl
6.5	0.1M Tris-HCl	6.0	0.1M Tris-HCl
6.5	0.1M Tris-HCl	7.0	0.1M Tris-HCl
8.0	0.1M Tris-HCl	7.0	0.1M Tris-HCl
8.0	0.1M Tris-HCl	9.0	0.1M Tris-HCl

在pH缓冲溶液中稀释酶贮存液(10mg/mL)并将其加至也用相同缓冲液配制的底物中。使用DNS方案在37℃进行所有反应15分钟。建立木糖(在0.1M Na Ac中，pH5.3)的校准曲线，斜率为0.8582，也修正该曲线以获得0值截距。(R²＝0.9982)。结果来自两个实验并且代表3个吸光度读数的平均值，将其修正至t＝0分钟的吸光度(即反应前加入的DNS)。

然后以对应于最大活性值(此处在pH＝5.5时观察到的)的百分比记录Quantum木聚糖酶的活性。在更高的pH下，活性下降，在pH9.0时变成极限值(大约为在pH6.0时的活性的5％)。在酸性pH下具有残留的活性，但在pH＝3.0时只具有11％)，在低于pH(1.5；2；2.5)则无活性。结果显示于图5中。

实施例13.热耐受性

通过ELISA和活性测定法确定酶的热耐受性

在以5℃的增量从37至99℃进行热处理后，测量Quantum木聚糖酶的活性。在0.1M NaOAc pH5.3中制备10mg/mL的酶溶液并稀释至1∶100。将1mL经1∶100稀释的酶样品加热，然后进一步稀释至1∶10,000并使用DNS方案测定活性。

确定木糖的校准曲线。结果以37℃时的活性的百分比显示于图6中。其是两个在不同的两天进行的实验的平均值。结果显示于图6。

PP6002在到达55℃之前显示100％的活性，此时其开始下降。然后直到65℃其活性保持在80％以上，这时其进一步下降，到80℃时下降至大约45％。高于该温度活性维持在相同的水平。这清楚地表明PP6002在即使更高的温度上仍显示特异性活性。

纯蛋白和其他木聚糖酶通过活性进行的热耐受性的比较

将Quantum木聚糖酶的活性和Thermomyces lanuginosus(Megazyme)以及大肠杆菌产生的BD6002木聚糖酶的活性进行比较。在0.1M NaOAc pH.5.3中配制10mg/mL的酶溶液并稀释至各种水平，以使在对照温度37℃下吸光度值在相似的范围内。

测定的温度在37℃至95℃范围内。确定针对木糖的较正曲线。结果以在37℃时的活性的百分比显示于图7中。如上面所看到的PP6002即使在高温下仍显示较强的特异性活性，其在95℃显示超过40％的活性。

BD6002大肠杆菌在达到55℃之前显示100％的活性。高于该温度其急剧下降直至在或高于75℃时检测不到活性。

来自长枝木霉(Trichoderma Longibrachiatum)(MegazymeInternational)的商购可获得的酶也未显示耐热性。其活性在高于55℃时急剧下降，直至高于65℃时失去活性。这些结果证实了Quantume木聚糖酶(当在巴斯德毕赤氏酵母中产生时)的耐热特性，并且一个可能的原因是耐热性与其同种型有关，其中之一些是糖基化修饰的。结果参见图7。

尽管本发明已通过其特定的实施例进行描述，但要理解大量的变化、修饰和其他实施方案也是可能的，因此所有这些变化、修饰和实施方案被认为在本发明的范围之内。

在本说明书中讨论或引用了大量专利、申请和参考文献，所有资料其全文在此引用作为参考。

序列表

<110>Syngenta Participations AG

Bauer，Michael

Bedford，Michael

Pulliam，Derrick

<120>微生物表达的木聚糖酶及其作为饲料添加剂的用途和其他用途

<130>70357WOPCT

<150>60/531,404

<151>2003-12-19

<160>39

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>555

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pp6002的木聚糖酶编码区

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(555)

<220>

<221>msic_特征

<222>(1)..(555)

<400>1

gca tct act gac tac tgg cag aac tgg act gac ggt ggt ggt acc gtg 48

Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val

1 5 10 15

aac gct act aat ggt agt gat ggt aat tac tca gtt tct tgg tca aac 96

Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ser Trp Ser Asn

20 25 30

tgt gga aac ttc gtc gtt ggt aag gga tgg aca acc gga tct gct act 144

Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ala Thr

35 40 45

aga gta atc aac tac aat gcc gga gct ttt tct cct tct ggt aat ggt 192

Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Ala Phe Ser Pro Ser Gly Asn Gly

50 55 60

tac ttg gcc ttg tat gga tgg aca aga aac tct ttg att gaa tat tac 240

Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr

65 70 75 80

gtt gtg gat tcc tgg ggt act tat cgt cca act gga aca tat aaa ggt 288

Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly

85 90 95

act gta act tct gac gga ggt acc tat gat att tac aca act aca aga 336

Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg

100 105 110

act aat gct cca tct atc gac gga aat aac act aca ttt acc cag ttt 384

Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr Phe Thr Gln Phe

115 120 125

tgg tct gtc aga caa tct aaa aga cct att gga act aat aat acc ata 432

Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr Asn Asn Thr Ile

130 135 140

act ttc agt aat cat gtt aac get tgg aag tca aaa ggt atg aac ttg 480

Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Gly Met Asn Leu

145 150 155 160

ggt tcc tcc tgg tee tac caa gtt ttg gca act gag ggt tac caa tct 528

Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser

165 170 175

agt ggt tat tca aat gtt act gtc tgg 555

Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp

180 185

<210>2

<211>185

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>pp6002的木聚糖酶编码区

<400>2

Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val

1 5 10 15

Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ser Trp Ser Asn

20 25 30

Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ala Thr

35 40 45

Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Ala Phe Ser Pro Ser Gly Asn Gly

50 55 60

Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr

65 70 75 80

Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly

85 90 95

Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg

100 105 110

Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr Phe Thr Gln Phe

115 120 125

Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr Asn Asn Thr Ile

130 135 140

Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Gly Met Asn Leu

145 150 155 160

Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp

180 185

<210>3

<211>591

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pp6016的木聚糖酶编码区

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(591)

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(591)

<400>3

gct cag act atc tgt tct aac cag act ggt act aat aac gga tat ttt 48

Ala Gln Thr Ile Cys Ser Asn Gln Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Phe

l 5 10 15

tac tca ttt tgg aag gac act ggt tct gca tgc atg acc ctt ggt tcc 96

Tyr Ser Phe Trp Lys Asp Thr Gly Ser Ala Cys Met Thr Leu Gly Ser

20 25 30

gga gga aac tat tct gtt aat tgg aac ttg ggt tct ggt aat atg gtc 144

Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Asn Leu Gly Ser Gly Asn Met Val

35 40 45

tgt ggt aag gga tgg tct acc gga tct tca tca aga aga atc ggt tac 192

Cys Gly Lys Gly Trp Ser Thr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ile Gly Tyr

50 55 60

aac gca gga gtt tgg gcc cca aac ggt aac gct tac ttg aca ttg tat 240

Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr

65 70 75 80

ggt tgg act agg aac cct ttg ata gaa tac tac gtc gta gat agt tgg 288

Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp

85 90 95

gga tca tgg cgt cct cca ggt gga act tca gct ggt acc gta aat tcc 336

Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Gly Thr Ser Ala Gly Thr Val Asn Ser

100 105 110

gat gga ggt act tat aat tta tac aga act caa agg gtg aac gct cca 384

Asp Gly Gly Thr Tyr Asn Leu Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Ala Pro

115 120 125

tct att gat ggt acc aga act ttt tac caa tat tgg tcc gtt aga aca 432

Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr

130 135 140

agt aaa cgt cct act gga tct aat cag aca att aca ttc gca aat cat 480

Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Gln Thr Ile Thr Phe Ala Asn His

145 150 155 160

gtt aat gct tgg aga tcc aaa ggt tgg aat ctg ggt tct cac gtg tac 528

Val Asn Ala Trp Arg Ser Lys Gly Trp Asn Leu Gly Ser His Val Tyr

165 170 175

caa att atg gcc act gag ggt tat caa tct agt gga aat tct aat ttg 576

Gln Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Asn Ser Asn Leu

180 185 190

aca gtt tgg gct caa 591

Thr Val Trp Ala Gln

195

<210>4

<211>197

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>pp6016的木聚糖酶编码区

<400>4

Ala Gln Thr Ile Cys Ser Asn Gln Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Phe

1 5 10 15

Tyr Ser Phe Trp Lys Asp Thr Gly Ser Ala Cys Met Thr Leu Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Asn Leu Gly Ser Gly Asn Met Val

35 40 45

Cys Gly Lys Gly Trp Ser Thr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ile Gly Tyr

50 55 60

Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp

85 90 95

Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Gly Thr Ser Ala Gly Thr Val Asn Ser

100 105 110

Asp Gly Gly Thr Tyr Asn Leu Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Ala Pro

115 120 125

Ser Ile Asp Gly Thr Arg Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr

130 135 140

Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Gln Thr Ile Thr Phe Ala Asn His

145 150 155 160

Val Asn Ala Trp Arg Ser Lys Gly Trp Asn Leu Gly Ser His Val Tyr

165 170 175

Gln Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Asn Ser Asn Leu

180 185 190

Thr Val Trp Ala Gln

195

<210>5

<211>972

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PP6407的木聚糖酶编码区

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(972)

<220>

<221>msic_特征

<222>(1)..(972)

<400>5

gca caa act ttg aac aac aac tcc act gga act cac gac ggt ttt tat 48

Ala Gln Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Gly Thr His Asp Gly Phe Tyr

1 5 10 15

tac aca ttt tgg aaa gac tct ggt tct gct tcc atg acc ctt cac cct 96

Tyr Thr Phe Trp Lys Asp Ser Gly Ser Ala Ser Met Thr Leu His Pro

20 25 30

ggt gga aga tat tca tca cag tgg aca tct aac act aac aat tgg gtt 144

Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Gln Trp Thr Ser Asn Thr Asn Asn Trp Val

35 40 45

ggt ggt aag ggt tgg aac cct gga ggt cct aga gta gtt aac tac agt 192

Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Gly Pro Arg Val Val Asn Tyr Ser

50 55 60

gga tat tac ggt gtt aat aac tcc caa aac tcc tac ctt gcc ttg tac 240

Gly Tyr Tyr Gly Val Asn Asn Ser Gln Asn Ser Tyr Leu Ala Leu Tyr

65 70 75 80

ggt tgg act cgt aat cct ttg gtg gaa tac tac gtt att gag agt tac 288

Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr

85 90 95

ggt tct tac aat cca gca tcc tgt gct gga gga gtt gat tat ggt tcc 336

Gly Ser Tyr Asn Pro Ala Ser Cys Ala Gly Gly Val Asp Tyr Gly Ser

100 105 110

ttc caa tct gac ggt gct acc tat aac gta aga agg tgc ttg aga caa 384

Phe Gln Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Asn Val Arg Arg Cys Leu Arg Gln

115 120 125

aat gct cca agt atc gaa ggt aat aac tct aca ttt tac cag tac ttt 432

Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Asn Asn Ser Thr Phe Tyr Gln Tyr Phe

130 135 140

tca gtt cgt aat cca aag aag ggt ttc ggt aat att tct ggt act att 480

Ser Val Arg Asn Pro Lys Lys Gly Phe Gly Asn Ile Ser Gly Thr Ile

145 150 155 160

acc gtc gct aat cat ttt aat tat tgg gca tcc aga ggt ctg aac tta 528

Thr Val Ala Asn His Phe Asn Tyr Trp Ala Ser Arg Gly Leu Asn Leu

165 170 175

gga aac cat gat tat atg gtt ttc gcc act gaa ggt tat caa tct caa 576

Gly Asn His Asp Tyr Met Val Phe Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Gln

180 185 190

ggt tct agt gat att act gtg tca agt ggt act gga ggt ggt gga gga 624

Gly Ser Ser Asp Ile Thr Val Ser Ser Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly

195 200 205

gga gga aat acc gga tct aaa aca ata gtc gtc aga gcc aga ggt acc 672

Gly Gly Asn Thr Gly Ser Lys Thr Ile Val Val Arg Ala Arg Gly Thr

210 215 220

gca ggt gga gag aat ata tcc ttg aag gta aat aat gcc act atc gct 720

Ala Gly Gly Glu Asn Ile Ser Leu Lys Val Asn Asn Ala Thr Ile Ala

225 230 235 240

tca tgg acc ttg aca act tca atg gct aac tac aca gct act aca tct 768

Ser Trp Thr Leu Thr Thr Ser Met Ala Asn Tyr Thr Ala Thr Thr Ser

245 250 255

gct tct ggt gga tct ctg gtt gag ttc act aac gat gga ggt aat aga 816

Ala Ser Gly Gly Ser Leu Val Glu Phe Thr Asn Asp Gly Gly Asn Arg

260 265 270

gat gtt caa gtg gac tat tta rca gtc aat ggt gct gtc aga caa gca 864

Asp Val Gln Val Asp Tyr Leu Ser Val Asn Gly Ala Val Arg Gln Ala

275 280 285

gaa gat cag act tat aat act ggt gtg tat cag aac gga cag tgc gga 912

Glu Asp Gln Thr Tyr Asn Thr Gly Val Tyr Gln Asn Gly Gln Cys Gly

290 295 300

ggt gga aac gga agg tct gag tgg ttg cat tgt aac ggt gcc att gga 960

Gly Gly Asn Gly Arg Ser Glu Trp Leu His Cys Asn Gly Ala Ile Gly

305 310 315 320

ttt ggt aat ttg 972

Phe Gly Asn Leu

<210>6

<211>324

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PP6407的木聚糖酶编码区

<400>6

Ala Gln Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Gly Thr His Asp Gly Phe Tyr

1 5 10 15

Tyr Thr Phe Trp Lys Asp Ser Gly Ser Ala Ser Met Thr Leu His Pro

20 25 30

Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Gln Trp Thr Ser Asn Thr Asn Asn Trp Val

35 40 45

Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Gly Pro Arg Val Val Asn Tyr Ser

50 55 60

Gly Tyr Tyr Gly Val Asn Asn Ser Gln Asn Ser Tyr Leu Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Val Ile Glu Ser Tyr

85 90 95

Gly Ser Tyr Asn Pro Ala Ser Cys Ala Gly Gly Val Asp Tyr Gly Ser

100 105 110

Phe Gln Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Asn Val Arg Arg Cys Leu Arg Gln

115 120 125

Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Asn Asn Ser Thr Phe Tyr Gln Tyr Phe

130 135 140

Ser Val Arg Asn Pro Lys Lys Gly Phe Gly Asn Ile Ser Gly Thr Ile

145 150 155 160

Thr Val Ala Asn His Phe Asn Tyr Trp Ala Ser Arg Gly Leu Asn Leu

165 170 175

Gly Asn His Asp Tyr Met Val Phe Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Gln

180 185 190

Gly Ser Ser Asp Ile Thr Val Ser Ser Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly

195 200 205

Gly Gly Asn Thr Gly Ser Lys Thr Ile Val Val Arg Ala Arg Gly Thr

210 215 220

Ala Gly Gly Glu Asn Ile Ser Leu Lys Val Asn Asn Ala Thr Ile Ala

225 230 235 240

Ser Trp Thr Leu Thr Thr Ser Met Ala Asn Tyr Thr Ala Thr Thr Ser

245 250 255

Ala Ser Gly Gly Ser Leu Val Glu Phe Thr Asn Asp Gly Gly Asn Arg

260 265 270

Asp Val Gln Val Asp Tyr Leu Ser Val Asn Gly Ala Val Arg Gln Ala

275 280 285

Glu Asp Gln Thr Tyr Asn Thr Gly Val Tyr Gln Asn Gly Gln Cys Gly

290 295 300

Gly Gly Asn Gly Arg Ser Glu Trp Leu His Cys Ash Gly Ala Ile Gly

305 310 315 320

Phe Gly Asn Leu

<210>7

<211>579

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pp7436的木聚糖酶编码区

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(579)

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(579)

<400>7

gag gct gaa gct gct ctg atg gct tcc act ttc tac tgg cat ctt tgg 48

Glu Ala Glu Ala Ala Leu Met Ala Ser Thr Phe Tyr Trp His Leu Trp

1 5 10 15

act gat gga atc ggt aca gtt aac gcc acc aac ggt tcc gat gga aac 96

Thr Asp Gly Ile Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn

20 25 30

tac tcc gtt tct tgg agt aac tgt gga aac ttt gtc gta ggc aag gga 144

Tyr Ser Val Ser Trp Ser Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly

35 40 45

tgg acc act ggc agt gca acc aga gtc att aac tac aat gcc cat gcc 192

Trp Thr Thr Gly Ser Ala Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala His Ala

50 55 60

ttt tct gtg gtt ggt aat gct tat tta gct ctc tat gga tgg aca aga 240

Phe Ser Val Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg

65 70 75 80

aat tca cta atc gaa tac tat gtg gtt gat tct tgg ggt act tat aga 288

Asn Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg

85 90 95

cca act ggt act tac aaa ggt act gtt acc tcc gac ggt ggc act tac 336

Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr

100 105 110

gac att tac aca aca aca cgt act aac gct cct agt atc gac gga aat 384

Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn

115 120 125

aat aca acc ttt act cag ttc tgg tca gtt cga cag agt aag agg cca 432

Asn Thr Thr Phe Thr Gln Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro

130 135 140

att ggt acc aac aat act att acc ttc tct aat cac gta aat gca tgg 480

Ile Gly Thr Asn Asn Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp

145 150 155 160

aaa tct aag ggt atg aac ttg gga tct tca tgg agt tac caa gtc ttg 528

Lys Ser Lys Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu

165 170 l75

gct act gag ggt tat caa rca tct ggt tat tct aat gta aca gtg tgg 576

Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp

180 185 190

taa 579

<210>8

<211>192

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>pp7436的木聚糖酶编码区

<400>8

Glu Ala Glu Ala Ala Leu Met Ala Ser Thr Phe Tyr Trp His Leu Trp

1 5 10 15

Thr Asp Gly Ile Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn

20 25 30

Tyr Ser Val Ser Trp Ser Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly

35 40 45

Trp Thr Thr Gly Ser Ala Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala His Ala

50 55 60

Phe Ser Val Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg

65 70 75 80

Asn Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg

85 90 95

Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr

100 105 110

Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn

115 120 125

Asn Thr Thr Phe Thr Gln Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro

130 135 140

Ile Gly Thr Asn Asn Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp

145 150 155 160

Lys Ser Lys Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu

165 170 175

Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp

180 185 190

<210>9

<211>598

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PP6002盒

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(598)

<400>9

tttccctctc gagaagaggg catctactga ctactggcag aactggactg acggtggtgg 60

taccgtgaac gctactaatg gtagtgatgg taattactca gtttcttggt caaactgtgg 120

aaacttcgtc gttggtaagg gatggacaac cggatctget actagagtaa tcaactacaa 180

tgccggagct ttttctcctt ctggtaatgg ttacttggec ttgtatggat ggacaagaaa 240

ctctttgatt gaatattacg ttgtggattc ctggggtact tatcgtccaa ctggaacata 300

taaaggtact gtaacttctg acggaggtac ctatgatatt tacacaacta caagaactaa 360

tgctccatct atcgacggaa ataacactac atttacccag ttttggtctg tcagacaatc 420

taaaagacct attggaacta ataataccat aactttcagt aatcatgtta acgcttggaa 480

gtcaaaaggt atgaacttgg gttcctcctg gtcctaccaa gttttggcaa ctgagggtta 540

ccaatctagt ggttattcaa atgttactgt ctggtaatag gcggccgcaa aaggaaaa 598

<210>10

<211>628

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PP6016表达盒

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(628)

<400>10

tttccctctc gagaagagag ctcagactat ctgttctaac cagactggta ctaataacgg 60

atatttttac tcattttgga aggacactgg ttctgcatgc atgacccttg gttccggagg 120

aaactattct gttaattgga acttgggttc tggtaatatg gtctgtggta agggatggtc 180

taccggatct tcatcaagaa gaatcggtta caacgcagga gtttgggccc caaacggtaa 240

cgcttacttg acattgtatg gttggactag gaaccctttg atagaatact acgtcgtaga 300

tagttgggga tcatggcgtc ctccaggtgg aacttcagct ggtaccgtaa attccgatgg 360

aggtacttat aatttataca gaactcaaag ggtgaacgct ccatctattg atggtaccag 420

aactttttac caatattggt ccgttagaac aagtaaacgt cctactggat ctaatcagac 480

aattacattc gcaaatcatg ttaatgcttg gagatccaaa ggttggaatc tgggttctca 540

cgtgtaccaa attatggcca ctgagggtta tcaatctagt ggaaattcta atttgacagt 600

ttgggctcaa tagtaagcgg ccgcaaaa 628

<210>11

<211>1009

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PP6407表达盒

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(1009)

<400>11

tttccctctc gagaaaagag cacaaacttt gaacaacaac tccactggaa ctcacgacgg 60

tttttattac acattttgga aagactctgg ttctgcttcc atgacccttc accctggtgg 120

aagatattca tcacagtgga catctaacac taacaattgg gttggtggta agggttggaa 180

ccctggaggt cctagagtag ttaactacag tggatattac ggtgttaata actcccaaaa 240

ctcctacctt gccttgtacg gttggactcg taatcctttg gtggaatact acgttattga 300

gagttacggt tcttacaatc cagcatcctg tgctggagga gttgattatg gttccttcca 360

atctgacggt gctacctata acgtaagaag gtgcttgaga caaaatgctc caagtatcga 420

aggtaataac tctacatttt accagtactt ttcagttcgt aatccaaaga agggtttcgg 480

taatatttct ggtactatta ccgtcgctaa tcattttaat tattgggcat ccagaggtct 540

gaacttagga aaccatgatt atatggtttt cgccactgaa ggttatcaat ctcaaggttc 600

tagtgatatt actgtgtcaa gtggtactgg aggtggtgga ggaggaggaa ataccggatc 660

taaaacaata gtcgtcagag ccagaggtac cgcaggtgga gagaatatat ccttgaaggt 720

aaataatgcc actatcgctt catggacctt gacaacttca atggctaact acacagctac 780

tacatctgct tctggtggat ctctggttga gttcactaac gatggaggta atagagatgt 840

tcaagtggac tatttatcag tcaatggtgc tgtcagacaa gcagaagatc agacttataa 900

tactggtgtg tatcagaacg gacagtgcgg aggtggaaac ggaaggtctg agtggttgca 960

ttgtaacggt gccattggat ttggtaattt gtaataggcg gccgcaaaa 1009

<210>12

<211>619

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PP7436表达盒

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(619)

<400>12

tttccctctc gagaaaagag aggctgaagc tgctctgatg gcttccactt tctactggca 60

tctttggact gatggaatcg gtacagttaa cgccaccaac ggttccgatg gaaactactc 120

cgtttcttgg agtaactgtg gaaactttgt cgtaggcaag ggatggacca ctggcagtgc 180

aaccagagtc attaactaca atgcccatgc cttttctgtg gttggtaatg cttatttagc 240

tctctatgga tggacaagaa attcactaat cgaatactat gtggttgatt cttggggtac 300

ttatagacca actggtactt acaaaggtac tgttacctcc gacggtggca cttacgacat 360

ttacacaaca acacgtacta acgctcctag tatcgacgga aataatacaa cctttactca 420

gttctggtca gttcgacaga gtaagaggcc aattggtacc aacaatacta ttaccttctc 480

taatcacgta aatgcatgga aatctaaggg tatgaacttg ggatcttcat ggagttacca 540

agtcttggct actgagggtt atcaatcatc tggttattct aatgtaacag tgtggtaata 600

ggcggccgca aaaggaaaa 619

<210>13

<211>561

<212>DNA

<213>人工核苷酸序列

<220>

<223>XYLA1A(BD6002)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(561)

<400>13

atg gct tcg aca gac tac tgg caa aat tgg act gat ggt ggt ggg aca 48

Met Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr

1 5 10 15

gta aat gct acc aat gga tct gat ggc aat tac agc gtt tca tgg tca 96

Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ser Trp Ser

20 25 30

aat tgc ggg aat ttt gtt gtt ggt aaa ggc tgg act acc gga tca gca 144

Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ala

35 40 45

act agg gta ata aac tat aat gcc gga gcc ttt tcg ccg tcc ggt aat 192

Thr Arg Val Ile Ash Tyr Asn Ala Gly Ala Phe Ser Pro Ser Gly Asn

50 55 60

gga tat ttg gct ctt tat ggg tgg acg aga aat tca ctc ata gaa tat 240

Gly Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr

65 70 75 80

tac gtc gtt gat agc tgg ggg act tat aga cct act gga act tat aaa 288

Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys

85 90 95

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Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr

100 105 110

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Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr Phe Thr Gln

115 120 125

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Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr Asn Asn Thr

130 135 140

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145 150 155 160

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Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln

165 170 175

agt agt ggg tac tct aac gta acg gtc tgg taa 561

Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp

180 185

<210>14

<211>186

<212>PRT

<213>人工核苷酸序列

<220>

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<400>14

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Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ser Trp Ser

20 25 30

Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ala

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50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr

65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr Asn Asn Thr

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Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln

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<220>

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35 40 45

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85 90 95

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100 105 110

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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Ser Ser Gly Tyr Ser Ash Val Thr Val Trp

180 185

<210>16

<211>186

<212>PRT

<213>人工核苷酸

<220>

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<400>16

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100 105 110

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115 120 125

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Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp

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<211>594

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

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<220>

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<400>17

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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195

<210>18

<211>198

<212>PRT

<213>人工核苷酸

<220>

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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195

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<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

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<220>

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<400>19

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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145 150 155 160

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<212>PRT

<213>人工核苷酸

<220>

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<400>20

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Gly Ser Ser Asp Ile Thr Val Ser Ser Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly

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Gly Gly Asn Thr Gly Ser Lys Thr Ile Val Val Arg Ala Arg Gly Thr

210 215 220

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275 280 285

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<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

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<220>

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<400>21

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Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asp Ile Thr Val

180 185 190

acc gaa ggt ggc ggc agc tcc tcg tcg tcc tcg ggc ggc ggc agc acc 624

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agc agc agt ggt ggc ggc ggc aac aag agc ttc acg gtg cgt gcg cgc 672

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245 250 255

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Thr Ser Leu Ser Gly Gly Ile Thr Val Leu Tyr Thr Asn Asp Gly Gly

260 265 270

agc cgc gac gtg cag gtg gac tac atc atc gtg aac ggc cag acc cgc 864

Ser Arg Asp Val Gln Val Asp Tyr Ile Ile Val Asn Gly Gln Thr Arg

275 280 285

cag tcc gaa gcg cag agc tac aac acc ggg ttg tat gcg aat gga cgc 912

Gln Ser Glu Ala Gln Ser Tyr Asn Thr Gly Leu Tyr Ala Asn Gly Arg

290 295 300

tgc ggc ggt ggc tcg aac agc gag tgg atg cat tgc aac ggc gcg atc 960

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325

<210>22

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<400>22

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165 170 175

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180 185 190

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Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Asn Lys Ser Phe Thr Val Arg Ala Arg

210 215 220

Gly Thr Ala Gly Gly Glu Asn Ile Gln Leu Gln Val Asn Asn Gln Thr

225 230 235 240

Val Ala Ser Trp Asn Leu Thr Thr Ser Met Gln Asn Tyr Thr Ala Ser

245 250 255

Thr Ser Leu Ser Gly Gly Ile Thr Val Leu Tyr Thr Asn Asp Gly Gly

260 265 270

Ser Arg Asp Val Gln Val Asp Tyr Ile Ile Val Asn Gly Gln Thr Arg

275 280 285

Gln Ser Glu Ala Gln Ser Tyr Asn Thr Gly Leu Tyr Ala Asn Gly Arg

290 295 300

Cys Gly Gly Gly Ser Asn Ser Glu Trp Met His Cys Asn Gly Ala Ile

305 310 315 320

Gly Tyr Gly Asn Thr Pro

325

<210>23

<211>36

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

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<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(36)

<400>23

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<210>24

<211>36

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>引物2

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(36)

<400>24

cattaggatc cgcacaaacg aacgtctcac ttaatc 36

<210>25

<211>37

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>引物3

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(37)

<400>25

ggggccggga attccgatga gatttccttc aattttt 37

<210>26

<211>45

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>引物4

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(45)

<400>26

gccggggaat tccgcggccg cctattacca gacagtaaca tttga 45

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>引物5

<220>

<221>misc特征

<222>(1)..(21)

<400>27

gcatctactg actactggca g 21

<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>引物6

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(24)

<400>28

ccagacagta acatttgaat aacc 24

<210>29

<211>28

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>引物7

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(28)

<400>29

gggcgacacg gaaatgttga atactcat 28

<210>30

<211>27

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>引物8

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(27)

<400>30

ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacc 27

<210>31

<211>25

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>引物9

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(25)

<400>31

gctgcctcgc gcgtttcggt gatga 25

<210>32

<211>25

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>引物10

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(25)

<400>32

gggaacactg aaaaataaca gttat 25

<210>33

<211>8546

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>质粒pBCS12771

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(8546)

<400>33

aaacgctgtc ttggaaccta atatgacaaa agcgtgatct catccaagat gaactaagtt 60

tggttcgttg aaatgctaac ggccagttgg tcaaaaagaa acttccaaaa gtcgccatac 120

cgtttgtctt gtttggtatt gattgacgaa tgctcaaaaa taatctcatt aatgcttagc 180

gcagtctctc tatcgcttct gaaccccggt gcacctgtgc cgaaacgcaa atggggaaac 240

acccgctttt tggatgatta tgcattgtct ccacattgta tgcttccaag attctggtgg 300

gaatactgct gatagcctaa cgttcatgat caaaatttaa ctgttctaac ccctacttga 360

cagcaatata taaacagaag gaagctgccc tgtcttaaac cttttttttt atcatcatta 420

ttagcttact ttcataattg cgactggttc caattgacaa gcttttgatt ttaacgactt 480

ttaacgacaa cttgagaaga tcaaaaaaca actaattatt cgaaggatcc aaacgatgag 540

atttccttca atttttactg cagttttatt cgcagcatcc tccgcattag ctgctccagt 600

caacactaca acagaagatg aaacggcaca aattccggct gaagctgtca tcggttactc 660

agatttagaa ggggatttcg atgttgctgt tttgccattt tccaacagca caaataacgg 720

gttattgttt ataaatacta ctattgccag cattgctgct aaagaagaag gggtatctct 780

cgagaagagg gcatctactg actactggca gaactggact gacggtggtg gtaccgtgaa 840

cgctactaat ggtagtgatg gtaattactc agtttcttgg tcaaactgtg gaaacttcgt 900

cgttggtaag ggatggacaa ccggatctgc tactagagta atcaactaca atgccggagc 960

tttttctcct tctggtaatg gttacttggc cttgtatgga tggacaagaa actctttgat 1020

tgaatattac gttgtggatt cctggggtac ttatcgtcca actggaacat ataaaggtac 1080

tgtaacttct gacggaggta cctatgatat ttacacaact acaagaacta atgctccatc 1140

tatcgacgga aataacacta catttaccca gttttggtct gtcagacaat ctaaaagacc 1200

tattggaact aataatacca taactttcag taatcatgtt aacgcttgga agtcaaaagg 1260

tatgaacttg ggttcctcct ggtcctacca agttttggca actgagggtt accaatctag 1320

tggttattca aatgttactg tctggtaata ggcggccgcg aattaattcg ccttagacat 1380

gactgttcct cagttcaagt tgggcactta cgagaagacc ggtcttgcta gattctaatc 1440

aagaggatgt cagaatgcca tttgcctgag agatgcaggc ttcatttttg atactttttt 1500

atttgtaacc tatatagtat aggatttttt ttgtcatttt gtttcttctc gtacgagctt 1560

gctcctgatc agcctatctc gcagctgatg aatatcttgt ggtaggggtt tgggaaaatc 1620

attcgagttt gatgtttttc ttggtatttc ccactcctct tcagagtaca gaagattaag 1680

tgagaagttc gtttgtgcaa gcttatcgat aagctttaat gcggtagttt atcacagtta 1740

aattgctaac gcagtcaggc accgtgtatg aaatctaaca atgcgctcat cgtcatcctc 1800

ggcaccgtca ccctggatgc tgtaggcata ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc 1860

ttgcgggata tcgtccattc cgacagcatc gccagtcact atggcgtgct gctagcgcta 1920

tatgcgttga tgcaatttct atgcgcaccc gttctcggag cactgtccga ccgctttggc 1980

cgccgcccag tcctgctcgc ttcgctactt ggagccacta tcgactacgc gatcatggcg 2040

accacacccg tcctgtggat ctatcgaatc taaatgtaag ttaaaatctc taaataatta 2100

aataagtccc agtttctcca tacgaacctt aacagcattg cggtgagcat ctagaccttc 2160

aacagcagcc agatccatca ctgcttggcc aatatgtttc agtccctcag gagttacgtc 2220

ttgtgaagtg atgaacttct ggaaggttgc agtgttaact ccgctgtatt gacgggcata 2280

tccgtacgtt ggcaaagtgt ggttggtacc ggaggagtaa tctccacaac tctctggaga 2340

gtaggcacca acaaacacag atccagcgtg ttgtacttga tcaacataag aagaagcatt 2400

ctcgatttgc aggatcaagt gttcaggagc gtactgattg gacatttcca aagcctgctc 2460

gtaggttgca accgataggg ttgtagagtg tgcaatacac ttgcgtacaa tttcaaccct 2520

tggcaactgc acagcttggt tgtgaacagc atcttcaatt ctggcaagct ccttgtctgt 2580

catatcgaca gccaacagaa tcacctggga atcaatacca tgttcagctt gagacagaag 2640

gtctgaggca acgaaatctg gatcagcgta tttatcagca ataactagaa cttcagaagg 2700

cccagcaggc atgtcaatac tacacagggc tgatgtgtca ttttgaacca tcatcttggc 2760

agcagtaacg aactggtttc ctggaccaaa tattttgtca cacttaggaa cagtttctgt 2820

tccgtaagcc atagcagcta ctgcctgggc gcctcctgct agcacgatac acttagcacc 2880

aaccttgtgg gcaacgtaga tgacttctgg ggtaagggta ccatccttct taggtggaga 2940

tgcaaaaaca atttctttgc aaccagcaac tttggcagga acacccagca tcagggaagt 3000

ggaaggcaga attgcggttc caccaggaat atagaggcca actttctcaa taggtcttgc 3060

aaaacgagag cagactacac cagggcaagt ctcaacttgc aacgtctccg ttagttgagc 3120

ttcatggaat ttcctgacgt tatctataga gagatcaatg gctctcttaa cgttatctgg 3180

caattgcata agttcctctg ggaaaggagc ttctaacaca ggtgtcttca aagcgactcc 3240

atcaaacttg gcagttagtt ctaaaagggc tttgtcacca ttttgacgaa cattgtcgac 3300

aattggtttg actaattcca taatctgttc cgttttctgg ataggacgac gaagggcatc 3360

ttcaatttct tgtgaggagg ccttagaaac gtcaattttg cacaattcaa tacgaccttc 3420

agaagggact tctttaggtt tggattcttc tttaggttgt tccttggtgt atcctggctt 3480

ggcatctcct ttccttctag tgacctttag ggacttcata tccaggtttc tctccacctc 3540

gtccaacgtc acaccgtact tggcacatct aactaatgca aaataaaata agtcagcaca 3600

ttcccaggct atatcttcct tggatttagc ttctgcaagt tcatcagctt cctccctaat 3660

tttagcgttc aacaaaactt cgtcgtcaaa taaccgtttg gtataagaac cttctggagc 3720

attgctctta cgatcccaca aggtggcttc catggctcta agaccctttg attggccaaa 3780

acaggaagtg cgttccaagt gacagaaacc aacacctgtt tgttcaacca caaatttcaa 3840

gcagtctcca tcacaatcca attcgatacc cagcaacttt tgagttgctc cagatgtagc 3900

acctttatac cacaaaccgt gacgacgaga ttggtagact ccagtttgtg tccttatagc 3960

ctccggaata gactttttgg acgagtacac caggcccaac gagtaattag aagagtcagc 4020

caccaaagta gtgaatagac catcggggcg gtcagtagtc aaagacgcca acaaaatttc 4080

actgacaggg aactttttga catcttcaga aagttcgtat tcagtagtca attgccgagc 4140

atcaataatg gggattatac cagaagcaac agtggaagtc acatctacca actttgcggt 4200

ctcagaaaaa gcataaacag ttctactacc gccattagtg aaacttttca aatcgcccag 4260

tggagaagaa aaaggcacag cgatactagc attagcgggc aaggatgcaa ctttatcaac 4320

cagggtccta tagataaccc tagcgcctgg gatcatcctt tggacaactc tttctgccaa 4380

atctaggtcc aaaatcactt cattgatacc attattgtac aacttgagca agttgtcgat 4440

cagctcctca aattggtcct ctgtaacgga tgactcaact tgcacattaa cttgaagctc 4500

agtcgattga gtgaacttga tcaggttgtg cagctggtca gcagcatagg gaaacacggc 4560

ttttcctacc aaactcaagg aattatcaaa ctctgcaaca cttgcgtatg caggtagcaa 4620

gggaaatgtc atacttgaag tcggacagtg agtgtagtct tgagaaattc tgaagccgta 4680

tttttattat cagtgagtca gtcatcagga gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg 4740

catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga 4800

agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg 4860

ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc 4920

ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg 4980

agagcgtcga gtatctatga ttggaagtat gggaatggtg atacccgcat tcttcagtgt 5040

cttgaggtct cctatcagat tatgcccaac taaagcaacc ggaggaggag atttcatggt 5100

aaatttctct gacttttggt catcagtaga ctcgaactgt gagactatct cggttatgac 5160

agcagaaatg tccttcttgg agacagtaaa tgaagtccca ccaataaaga aatccttgtt 5220

atcaggaaca aacttcttgt ttcgaacttt ttcggtgcct tgaactataa aatgtagagt 5280

ggatatgtcg ggtaggaatg gagcgggcaa atgcttacct tctggacctt caagaggtat 5340

gtagggtttg tagatactga tgccaacttc agtgacaacg ttgctatttc gttcaaacca 5400

ttccgaatcc agagaaatca aagttgtttg tctactattg atccaagcca gtgcggtctt 5460

gaaactgaca atagtgtgct cgtgttttga ggtcatcttt gtatgaataa atctagtctt 5520

tgatctaaat aatcttgacg agccagacga taataccaat ctaaactctt taaacgttaa 5580

aggacaagta tgtctgcctg tattaaaccc caaatcagct cgtagtctga tcctcatcaa 5640

cttgaggggc actatcttgt tttagagaaa tttgcggaga tgcgatatcg agaaaaaggt 5700

acgctgattt taaacgtgaa atttatctca agatctctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga 5760

cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga 5820

tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc 5880

agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca 5940

gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 6000

agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 6060

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 6120

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 6180

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 6240

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 6300

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 6360

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 6420

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 6480

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 6540

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 6600

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 6660

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 6720

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 6780

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 6840

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 6900

ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 6960

agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 7020

atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 7080

cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 7140

aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 7200

cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 7260

aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 7320

ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 7380

gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 7440

ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 7500

tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 7560

tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 7620

ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 7680

tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 7740

agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 7800

acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 7860

ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 7920

gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 7980

acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attaattctc 8040

atgtttgaca gcttatcatc gataagctga ctcatgttgg tattgtgaaa tagacgcaga 8100

tcgggaacac tgaaaaataa cagttattat tcgagatcta acatccaaag acgaaaggtt 8160

gaatgaaacc tttttgccat ccgacatcca caggtccatt ctcacacata agtgccaaac 8220

gcaacaggag gggatacact agcagcagac cgttgcaaac gcaggacctc cactcctctt 8280

ctcctcaaca cccacttttg ccatcgaaaa accagcccag ttattgggct tgattggagc 8340

tcgctcattc caattccttc tattaggcta ctaacaccat gactttatta gcctgtctat 8400

cctggccccc ctggcgaggt tcatgtttgt ttatttccga atgcaacaag ctccgcatta 8460

cacccgaaca tcactccaga tgagggcttt ctgagtgtgg ggtcaaatag tttcatgttc 8520

cccaaatggc ccaaaactga cagttt 8546

<210>34

<211>8537

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>质粒pBCS12772

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(8537)

<400>34

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 60

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 120

cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 180

ctttcgtctt caagaattaa ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctgactcat 240

gttggtattg tgaaatagac gcagatcggg aacactgaaa aataacagtt attattcgag 300

atctaacatc caaagacgaa aggttgaatg aaaccttttt gccatccgac atccacaggt 360

ccattctcac acataagtgc caaacgcaac aggaggggat acactagcag cagaccgttg 420

caaacgcagg acctccactc ctcttctcct caacacccac ttttgccatc gaaaaaccag 480

cccagttatt gggcttgatt ggagctcgct cattccaatt ccttctatta ggctactaac 540

accatgactt tattagcctg tctatcctgg cccccctggc gaggttcatg tttgtttatt 600

tccgaatgca acaagctccg cattacaccc gaacatcact ccagatgagg gctttctgag 660

tgtggggtca aatagtttca tgttccccaa atggcccaaa actgacagtt taaacgctgt 720

cttggaacct aatatgacaa aagcgtgatc tcatccaaga tgaactaagt ttggttcgtt 780

gaaatgctaa cggccagttg gtcaaaaaga aacttccaaa agtcggcata ccgtttgtct 840

tgtttggtat tgattgacga atgctcaaaa ataatctcat taatgcttag cgcagtctct 900

ctatcgcttc tgaaccccgg tgcacctgtg ccgaaacgca aatggggaaa cacccgcttt 960

ttggatgatt atgcattgtc tccacattgt atgcttccaa gattctggtg ggaatactgc 1020

tgatagccta acgttcatga tcaaaattta actgttctaa cccctacttg acagcaatat 1080

ataaacagaa ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt attagcttac 1140

tttcataatt gcgactggtt ccaattgaca agcttttgat tttaacgact tttaacgaca 1200

acttgagaag atcaaaaaac aactaattat tcgaaacgag gaattcaaac gatgagattt 1260

ccttcaattt ttactgcagt tttattcgca gcatcctccg cattagctgc tccagtcaac 1320

actacaacag aagatgaaac ggcacaaatt ccggctgaag ctgtcatcgg ttactcagat 1380

ttagaagggg atttcgatgt tgctgttttg ccattttcca acagcacaaa taacgggtta 1440

ttgtttataa atactactat tgccagcatt gctgctaaag aagaaggggt atctctcgag 1500

aagagggcat ctactgacta ctggcagaac tggactgacg gtggtggtac cgtgaacgct 1560

actaatggta gtgatggtaa ttactcagtt tcttggtcaa actgtggaaa cttcgtcgtt 1620

ggtaagggat ggacaaccgg atctgctact agagtaatca actacaatgc cggagctttt 1680

tctccttctg gtaatggtta cttggccttg tatggatgga caagaaactc tttgattgaa 1740

tattacgttg tggattcctg gggtacttat cgtccaactg gaacatataa aggtactgta 1800

acttctgacg gaggtaccta tgatatttac acaactacaa gaactaatgc tccatctatc 1860

gacggaaata acactacatt tacccagttt tggtctgtca gacaatctaa aagacctatt 1920

ggaactaata ataccataac tttcagtaat catgttaacg cttggaagtc aaaaggtatg 1980

aacttgggtt cctcctggtc ctaccaagtt ttggcaactg agggttacca atctagtggt 2040

tattcaaatg ttactgtctg gtaataggcg gccgcggaat tcgccttaga catgactgtt 2100

cctcagttca agttgggcac ttacgagaag accggtcttg ctagattcta atcaagagga 2160

tgtcagaatg ccatttgcct gagagatgca ggcttcattt ttgatacttt tttatttgta 2220

acctatatag tataggattt tttttgtcat tttgtttctt ctcgtacgag cttgctcctg 2280

atcagcctat ctcgcagctg atgaatatct tgtggtaggg gtttgggaaa atcattcgag 2340

tttgatgttt ttcttggtat ttcccactcc tcttcagagt acagaagatt aagtgagacg 2400

ttcgtttgtg cggatcctaa tgcggtagtt tatcacagtt aaattgctaa cgcagtcagg 2460

caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct cggcaccgtc accctggatg 2520

ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct cttgcgggat atcgtccatt 2580

ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct atatgcgttg atgcaatttc 2640

tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg ccgccgccca gtcctgctcg 2700

cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc gaccacaccc gtcctgtgga 2760

tctatcgaat ctaaatgtaa gttaaaatct ctaaataatt aaataagtcc cagtttctcc 2820

atacgaacct taacagcatt gcggtgagca tctagacctt caacagcagc cagatccatc 2880

actgcttggc caatatgttt cagtccctca ggagttacgt cttgtgaagt gatgaacttc 2940

tggaaggttg cagtgttaac tccgctgtat tgacgggcat atccgtacgt tggcaaagtg 3000

tggttggtac cggaggagta atctccacaa ctctctggag agtaggcacc aacaaacaca 3060

gatccagcgt gttgtacttg atcaacataa gaagaagcat tctcgatttg caggatcaag 3120

tgttcaggag cgtactgatt ggacatttcc aaagcctgct cgtaggttgc aaccgatagg 3180

gttgtagagt gtgcaataca cttgcgtaca atttcaaccc ttggcaactg cacagcttgg 3240

ttgtgaacag catcttcaat tctggcaagc tccttgtctg tcatatcgac agccaacaga 3300

atcacctggg aatcaatacc atgttcagct tgagacagaa ggtctgaggc aacgaaatct 3360

ggatcagcgt atttatcagc aataactaga acttcagaag gcccagcagg catgtcaata 3420

ctacacaggg ctgatgtgtc attttgaacc atcatcttgg cagcagtaac gaactggttt 3480

cctggaccaa atattttgtc acacttagga acagtttctg ttccgtaagc catagcagct 3540

actgcctggg cgcctcctgc tagcacgata cacttagcac caaccttgtg ggcaacgtag 3600

atgacttctg gggtaagggt accatccttc ttaggtggag atgcaaaaac aatttctttg 3660

caaccagcaa ctttggcagg aacacccagc atcagggaag tggaaggcag aattgcggtt 3720

ccaccaggaa tatagaggcc aactttctca ataggtcttg caaaacgaga gcagactaca 3780

ccagggcaag tctcaacttg caacgtctcc gttagttgag cttcatggaa tttcctgacg 3840

ttatctatag agagatcaat ggctctctta acgttatctg gcaattgcat aagttcctct 3900

gggaaaggag cttctaacac aggtgtcttc aaagcgactc catcaaactt ggcagttagt 3960

tctaaaaggg ctttgtcacc attttgacga acattgtcga caattggttt gactaattcc 4020

ataatctgtt ccgttttctg gataggacga cgaagggcat cttcaatttc ttgtgaggag 4080

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<222>(1)..(12763)

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tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc 9600

gtcgagtatc tatgattgga agtatgggaa tggtgatacc cgcattcttc agtgtcttga 9660

ggtctcctat cagattatgc ccaactaaag caaccggagg aggagatttc atggtaaatt 9720

tctctgactt ttggtcatca gtagactcga actgtgagac tatctcggtt atgacagcag 9780

aaatgtcctt cttggagaca gtaaatgaag tcccaccaat aaagaaatcc ttgttatcag 9840

gaacaaactt cttgtttcga actttttcgg tgccttgaac tataaaatgt agagtggata 9900

tgtcgggtag gaatggagcg ggcaaatgct taccttctgg accttcaaga ggtatgtagg 9960

gtttgtagat actgatgcca acttcagtga caacgttgct atttcgttca aaccattccg 10020

aatccagaga aatcaaagtt gtttgtctac tattgatcca agccagtgcg gtcttgaaac 10080

tgacaatagt gtgctcgtgt tttgaggtca tctttgtatg aataaatcta gtctttgatc 10140

taaataatct tgacgagcca gacgataata ccaatctaaa ctctttaaac gttaaaggac 10200

aagtatgtct gcctgtatta aaccccaaat cagctcgtag tctgatcctc atcaacttga 10260

ggggcactat cttgttttag agaaatttgc ggagatgcga tatcgagaaa aaggtacgct 10320

gattttaaac gtgaaattta tctcaagatc tgctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt 10380

gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc 10440

gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc 10500

atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc 10560

agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 10620

aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 10680

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 10740

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 10800

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 10860

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 10920

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 10980

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 11040

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 11100

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 11160

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 11220

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 11280

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 11340

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 11400

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 11460

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 11520

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 11580

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 11640

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 11700

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 11760

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 11820

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 11880

ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 11940

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 12000

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 12060

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 12120

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 12180

cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 12240

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 12300

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 12360

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 12420

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 12480

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 12540

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 12600

taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct tcaagaatta attctcatgt 12660

ttgacagctt atcatcgata agctgactca tgttggtatt gtgaaataga cgcagatcgg 12720

gaacactgaa aaataacagt tattattcga gatctaacat cca 12763

<210>36

<211>9

<212>DNA

<213>人工核苷酸

<220>

<223>kex2

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(9)

<400>36

ctcgagaag 9

<210>37

<211>3

<212>PRT

<213>人工核苷酸

<220>

<223>kex2肽

<220>

<221>misc_特征

<222>(1)..(3)

<400>37

Gly Leu Arg

1

<210>38

<211>243

<212>DNA

<213>啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(243)

<400>38

atg aga ttt cct tca att ttt act gca gtt tta ttc gca gca tcc tcc 48

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

gca tta gct gct cca gtc aac act aca aca gaa gat gaa acg gca caa 96

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

att ccg gct gaa gct gtc atc ggt tac tca gat tta gaa ggg gat ttc 144

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

gat gtt gct gtt ttg cca ttt tcc aac agc aca aat aac ggg tta ttg 192

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

ttt ata aat act act att gcc agc att gct gct aaa gaa gaa ggg gta 240

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

tct 243

Ser

<210>39

<211>81

<212>PRT

<213>啤酒糖酵母

<400>39

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser

Claims

1.具有SEQ ID NOS：1、3、5或7的序列的分离的核酸分子。

2.包含权利要求1的核酸序列的表达盒。

3.权利要求2的表达盒，其进一步包含蛋白酶切割位点。

4.权利要求3的表达盒，其中所述蛋白酶切割位点是KEX2蛋白酶切割位点。

5.权利要求4的表达盒，其由SEQ ID NOS：9、10、11或12的核酸序列编码。

6.权利要求2的表达盒，其进一步包含编码分泌性信号肽的分离的核苷酸序列。

7.包含至少一个有效地连接至启动子的权利要求1的核酸分子的表达盒。

8.包含至少一个权利要求2的表达盒的载体。

9.权利要求8的载体，其包括称为pBCS12771(SEQ ID NO：33)、pBCS12772(SEQ ID NO：34)或pSYN12773(SEQ ID NO：35)的质粒。

10.包含至少一个权利要求1的核酸分子的重组宿主细胞。

11.权利要求10的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌、酵母或真菌细胞。

12.权利要求11的重组宿主细胞，其中所述细菌、酵母或真菌细胞是克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、糖酵母属(saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Shizosaccharomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansuela)、埃希氏杆菌属(Eschericia)、假单孢菌属(Psudomonas)、乳芽孢杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、木霉属(Trichoderma)、链孢霉属(Neurospora)、毛霉属(Mucor)或青霉属(Penicillium)细胞。

13.权利要求11的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)。

14.权利要求13的重组宿主细胞，其包含权利要求9的载体。

15.制备耐热性木聚糖酶的方法，其包括步骤：

a)在微生物宿主细胞中表达含有有效地连接至编码木聚糖酶的核酸分子的启动子的表达盒，所述木聚糖酶在60℃30分钟后保持至少40％的活性并在低于pH5.0并高于pH1.5的pH下具有大于400U/mg的比活性。

16.权利要求15的方法，其中所述木聚糖酶在70℃下30分钟后仍保持至少40％的活性。

17.权利要求15的方法，其中所述木聚糖酶在80℃下30分钟后仍保持至少40％的活性。

18.权利要求15的方法，其中所述木聚糖酶在85℃下30分钟后仍保持至少40％的活性。

19.权利要求15的方法，其中所述木聚糖酶在缺少糖基化的情况下是耐热性木聚糖酶。

20.权利要求15的方法，其中所述木聚糖酶当被宿主细胞糖基化时是耐热性的。

21.权利要求15的方法，其进一步包含分离耐热性木聚糖酶的步骤。

22.权利要求15的方法，其中所述宿主细胞是细菌、酵母或真菌细胞。

23.权利要求22的方法，其中所述宿主细胞是克鲁维氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属、丝孢酵母属、许旺氏酵母属、毕赤氏酵母属或汉逊氏酵母属细胞。

24.权利要求22的方法，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha)或粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞。

25.权利要求22的方法，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母。

26.权利要求22的方法，其中所述宿主细胞是埃希氏杆菌属、假单胞菌属、乳芽孢杆菌属或芽孢杆菌属。

27.权利要求22的方法，其中所述宿主细胞是曲霉属、根霉属、木霉属、链孢霉属、毛霉属或青霉属细胞。

28.权利要求15的方法，其中所述木聚糖酶是由权利要求1的核酸编码的。

29.权利要求15的方法，其中所述核酸分子编码包含木聚糖酶的融合多肽。

30.权利要求29的方法，其中所述融合多肽包含有效地连接至木聚糖酶的分泌性信号序列。

31.由权利要求21的方法制备和分离的分离的耐热性木聚糖酶。

32.权利要求31的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶被糖基化。

33.包含权利要求31的耐热性木聚糖酶的酶饲料添加剂。

34.制备动物饲料的方法，其包括步骤：

a)提供包含动物饲料成分和包含权利要求31的耐热性木聚糖酶的制剂的混合物，和

b)在高于75-90℃的温度下加热该混合物，从而生产经加热处理的动物饲料混合物。

35.权利要求34的方法，其中所述包含木聚糖酶的制剂是液体制剂。

36.权利要求34的方法，其中所述包含木聚糖酶的制剂是固体制剂。

37.权利要求34的方法，其中a)中所述混合物还包含至少一种维生素、矿质、除耐热性木聚糖酶以外的酶、有机酸、益生菌产物、精油或谷物加工联产品。

38.由权利要求34的方法产生的经热处理的动物饲料混合物。

39.权利要求34的方法，其还包含通过制粒机将热处理的混合物挤压而产生经粒化的动物饲料的步骤。

40.由权利要求39的方法产生的经粒化的动物饲料。

41.权利要求40的经粒化的动物饲料，其中在制粒机中在大约85℃下对所述混合物进行蒸汽处理，这样超过70％的预热处理的酶促活性得到保持，并通过pellet dye挤压出所述饲料。

42.权利要求40的经粒化的动物饲料，其中在制粒机中在大约85℃下对所述混合物进行蒸汽处理，这样超过90％的预热处理的酶促活性得到保持，并通过pellet dye挤压出所述饲料。

43.权利要求40的经粒化的动物饲料，其中在制粒机中在大约90℃下对所述混合物进行蒸汽处理以使至少80％的预热处理的酶促活性得到保持，并且过pellet dye挤压出所述饲料。

44.包含权利要求31的耐热性木聚糖酶的动物饲料组合物。

45.权利要求44的饲料，其中所述谷物是小麦、黑麦、黑小麦、稻或玉米。

46.权利要求44的饲料，其中以1至10,000U/kg的包含率将一种或多种木聚糖酶加入至饲料中。

47.权利要求44的饲料，其中以50至5,000U/kg的包含率将一种或多种木聚糖酶加入至饲料中。

48.权利要求44的饲料，其中以200至3,200U/kg的包含率将一种或多种木聚糖酶加入至饲料中。

49.制备用于饲料制剂的含有耐热性木聚糖酶的组合物的方法，其包括步骤：

a)将包含权利要求31的耐热性木聚糖酶的液体溶液和大豆粗粉混合以产生混合物；和

b)冻干所述混合物以产生包含耐热性木聚糖酶的冻干组合物。

50.权利要求49的方法，其还包括将冻干的组合物和其他饲料成分混合以产生其他混合物的步骤。

51.由权利要求50的方法制备的冻干的组合物。

52.制备用于饲料制剂的含有木聚糖酶的组合物的方法，其包括步骤：

a)将包含权利要求31的耐热性木聚糖酶的液体溶液和粗粉混合，从而产生混合物；

b)和干燥所述混合物以产生经干燥的组合物。

53.降低饲料转化率和增加动物的体重增量的方法，其包括步骤：

给动物喂食以在动物中降低饲料转化率有效量的包含权利要求31的耐热性木聚糖酶的饲料。

54.提高动物饲料的表观代谢能的方法，其包括这样的步骤，即以提高饲料的表观代谢能有效量的一种或多种权利要求31的耐热性木聚糖酶配制动物饲料。

55.提高动物饲料或人食品的营养价值的方法，其包括在动物饲料或人食品制备期间加入权利要求31的耐热性木聚糖酶与步骤。

56.权利要求55的方法，其进一步包括在合适的温度和湿度条件下处理混合物从而促进木聚糖的水解的步骤。

57.制备动物饲料的方法，其包括步骤：

a)提供包含一种或多种饲料成分和包含权利要求31的耐热性木聚糖酶的制剂的混合物；和

b)在合适的温度和湿度条件下处理所述混合物，从而水解存在于所述混合物中的木聚糖。

58.由权利要求57的方法制备的动物饲料。

59.权利要求52至57中任一项的方法，其中所述饲料是家禽饲料。

60.权利要求52至57中任一项的方法，其中所述饲料是猪饲料。

61.权利要求52至57中任一项的方法，其中所述饲料是反刍动物饲料。