CN117084324A - 居冰菌在大西洋鲑养殖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种居冰菌在大西洋鲑养殖中的应用，涉及微生物技术领域。本发明还公开了居冰菌在动物饲料或饲料添加剂中的应用。本发明通过在大西洋鲑饲料中添加居冰菌，产生大量木聚糖酶，显著增强了大西洋鲑对于碳水化合物的利用效率，从而促进大西洋鲑的生长和饲料转化率，提高鱼肉的品质。本发明通过添加居冰菌，还使得大西洋鲑的死亡率降低。本发明提供了一种居冰菌新的用途，并且使用方法简便，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种居冰菌在大西洋鲑养殖中的应用。
背景技术
居冰菌（Glaciecola）是一种革兰氏阴性、严格需氧化学异养细菌。现有技术中公开了一株革兰氏阴性、需氧、不运动的卵圆形或杆状的细菌菌株GGW-M5(T)。基于16S rRNA基因序列显示，菌株GGW-M5(T)属于Glaciecola属，加入包括琼脂糖凝胶、北极糖凝胶、查塔姆糖凝胶、嗜温糖凝胶、北极星凝胶和嗜冷糖凝胶的模式菌株的聚类，其16S rRNA基因序列相似性为95.9-96.7%。菌株GGW-M5(T)与其他冰川菌属物种的模式菌株显示出93.2-94.8%的序列相似性值。
另一现有研究从中国天津近海表层海水中分离到一株革兰氏阴性、不产芽孢的杆状细菌，具有鞭毛，能运动。采用表型、化学分类学和系统发育学方法对该菌株进行分类研究。该菌株在2216琼脂上形成无色素菌落，具有丁酰粘液稠度，在30℃，2.0% (w/v) NaCl和pH7.6时生长最佳。该菌株E3T对过氧化氢酶和氧化酶以及脂质水解呈阳性，并将硝酸盐还原为N2气体。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，该菌株属于γ-原肠杆菌属，并被归为Glaciecola属。
居冰菌能够产生多种木聚糖酶，木聚糖是一种最主要的半纤维素，是地球上仅次于纤维素的第二大碳源物质，也是海洋环境中有机碳的重要组成部分。与纤维素相比，木聚糖结构更为复杂，木聚糖的完全降解需要多种酶类协同作用。木聚糖酶饲料利用率的提高与营养物质利用率的提高有紧密联系。研究发现，木聚糖酶可以极显著或者显著提高肝胰脏和肠道消化酶（胰蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，糜蛋白酶）和肠道各段刷状缘酶活力（肌酸激酶，γ-谷氨酰转移酶，Na+，K+-ATP酶和碱性磷酸酶）。同时，木聚糖酶可以显著提高有益菌乳酸杆菌的数量和降低肠道有害菌大肠杆菌和嗜水气单胞菌的数量，优化肠道菌群。此外，木聚糖酶能显著提高攻毒后存活率，对血液红白细胞数量，免疫器官重量以及肠道、血清、脾脏和头肾四个器官的补体C3含量，溶菌酶活力和IgM含量也有显著影响。木聚糖酶可以提高鱼类的生长性能，降低肠道内容物的黏度，发挥促生长和提高饲料转化率的功效。
大西洋鲑（Salmon salar）隶属于鲑科鲑属，属于冷水性鱼类，生长水温较低，其分布范围主要集中于大西洋北部温寒带水域，根据大西洋鲑生活习性不同可将其分为陆封型及洄游型两种不同的类型。大西洋鲑个体大、肉质非常鲜嫩、不饱和脂肪酸含量高，营养价值较高，能够降低心血管疾病的风险。传统养殖模式导致大西洋鲑产量较低，寻找其更优的养殖方式是目前需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种居冰菌在大西洋鲑养殖中的应用，本发明通过在饲料中加入居冰菌，使得饲料的转化率升高，促进大西洋鲑的生长，进而提高大西洋鲑的产量。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了居冰菌在大西洋鲑养殖中的应用。
优选地，所述的居冰菌选自居冰菌菌株、居冰菌裂解物、居冰菌培养物、居冰菌株的提取物、居冰菌裂解物的提取物、居冰菌培养物的提取物中的一种或多种。
优选地，所述的培养物通过在培养基中培养获得。
进一步地，所述的培养基包括以下组分：蛋白胨、乳糖、胆盐和溴甲酚紫。
再进一步地，所述的培养基按照重量份数计包括以下组分：蛋白胨10-30份、乳糖5-20份、胆盐0.1-5份和溴甲酚紫0.1-5份。
更进一步地，所述的培养基按照重量份数计包括以下组分：蛋白胨20份、乳糖10份、胆盐1.5份和溴甲酚紫1.01份。
可选地，所述的培养基中可包括NaCl，所述的NaCl按照重量份数计包括1-10份；
优选地，所述的培养基中NaCl按照重量份数计包括5份。
可选地，所述的培养基包括以下组分：蛋白胨、乳糖、胆盐和中性红。
优选地，所述的培养基按照重量份数计包括以下组分：蛋白胨10-30份、乳糖5-20份、胆盐0.1-5份和中性红0.01-1份。
进一步地，所述的培养基按照重量份数计包括以下组分：蛋白胨20份、乳糖10份、胆盐1.5份和中性红0.03份。
优选地，所述的培养基中pH为7-8。
进一步地，所述的培养基的pH为7.4。
具体地，所述的蛋白胨的CAS号为73049-73-7。
具体地，所述的乳糖的CAS号为63-42-3。
具体地，所述的胆盐的CAS号为8008-63-7。
具体地，所述的溴甲酚紫的CAS号为115-40-2。
具体地，所述的中性红的CAS号为553-24-2。
在本发明的一些实施方式中，所述的培养基包括：蛋白胨20 g，乳糖10 g，胆盐1.5g，NaCl 5g，溴甲酚紫1.01 g，水1000mL。
在本发明的一些实施方式中，所述的培养基包括：蛋白胨20 g，乳糖10 g，胆盐1.5g，溴甲酚紫1.01 g，水1000mL。
在本发明的一些实施方式中，所述的培养基包括：蛋白胨20 g，乳糖10 g，胆盐1.5g，NaCl 5g，中性红0.03 g，水1000mL。
在本发明的一些实施方式中，所述的培养基包括：蛋白胨20 g，乳糖10 g，胆盐1.5g，中性红0.03 g，水1000mL。
优选地，所述的培养条件为20-30℃，培养时间为3-7天。
进一步地，所述的培养条件为25℃，培养时间为4天。
在本发明的一些实施方式中，在上述培养基中25℃培养4天，菌落呈圆形，乳白色，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，凸起，直径2mm。
在本发明的一些实施方式中，在上述培养基中培养7天，蛋白酶、淀粉酶、脂酶（三丁酸甘油酯）、木聚糖酶阴性。
具体地，上述培养基中的乳糖起选择作用，大多数细菌不能发酵乳糖，若细菌发酵乳糖，含有溴甲酚紫指示剂的培养基会由紫色变为红色。
又一方面，本发明提供了居冰菌在制备动物饲料、饲料添加剂或药物中的应用。
优选地，所述的居冰菌选自居冰菌菌株、居冰菌裂解物、居冰菌培养物、居冰菌株的提取物、居冰菌裂解物的提取物、居冰菌培养物的提取物中的一种或多种。
优选地，所述的动物为水产动物。
进一步地，所述的水产动物为大西洋鲑。
优选地，所述的饲料中还包括营养物质，所述的营养物质包括但不限于大豆、鱼油、鱼粉、面粉。
又一方面，本发明提供了一种大西洋鲑饲料添加剂，所述的饲料添加剂中包含居冰菌。
优选地，所述的饲料添加剂中还包括辅料。
进一步地，所述的辅料选自防腐剂、粘合剂、赋性剂、稀释剂、湿润剂、崩解剂中的一种或多种。
再进一步地，所述的防腐剂选自羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、三氯叔丁醇、硫柳汞、氧氰化汞、苯氧乙醇、氯己定、苯甲酸、苯甲酸钠、氯甲酚、苯扎溴铵、苯扎氯铵、羟苯乙酯中的至少一种。
再进一步地，所述的粘合剂选自乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
再进一步地，所述的赋性剂选自微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、环糊精、羧甲基纤维素、甘露醇中的至少一种。
再进一步地，所述的稀释剂选自赤藓糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、乳糖、蔗糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙、结晶纤维素中的至少一种。
再进一步地，所述的湿润剂选自十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的至少一种。
再进一步地，所述的崩解剂选自硫酸铵、氯化铝、尿酸、氯化镁、葡萄糖中的至少一种。
优选地，所述的居冰菌选自居冰菌菌株、居冰菌裂解物、居冰菌培养物、居冰菌株的提取物、居冰菌裂解物的提取物、居冰菌培养物的提取物中的一种或多种。
优选地，所述的饲料添加剂中居冰菌的活菌数为（1-2）×109CFU/g或（1-2）×109CFU/mL。
又一方面，本发明提供了上述饲料添加剂具有下述至少一项的应用：
（1）制备水产动物促生长产品中的应用；
（2）制备增加水产动物产量的产品中的应用。
在本发明的一些实施例中，本发明提供了大西洋鲑的养殖方法，所述的养殖方法包括向饲料中添加居冰菌、或向循环水中添加居冰菌。
又一方面，本发明提供了一种大西洋鲑养殖水体添加剂，所述的大西洋鲑养殖水体添加剂中包含居冰菌。
本发明的有益效果为：
（1）本发明将居冰菌加入到大西洋鲑饲料中，产生大量木聚糖酶，从而促进大西洋鲑的生长和饲料转化率，提高鱼肉的品质。
（2）本发明将居冰菌加入到大西洋鲑的饲料中，并检测了大西洋鲑的死亡率，居冰菌能够显著提高大西洋鲑的产量。
（3）本发明提供了居冰菌的一种新用途，将其应用于大西洋鲑养殖中，操作简便，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
下述实施例中的居冰菌（西藏居冰菌）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其编号为CGMCC No.1.12484。
普通饲料购自于广州多恺菲宠物用品有限公司，货号为AL668875157202。
实施例1 居冰菌对大西洋鲑的影响
普通饲料的组分包括：鱼粉45%，肉骨粉13%，血粉3%，小麦粉22%，饲料酵母15%，葵花籽油2%。
将居冰菌进行活化，扩大培养，经发酵、干燥制成菌粉。
含居冰菌饲料组中在上述普通饲料的基础上加入居冰菌，居冰菌的有效菌数为1×109CFU/g。
实验分组：
实验大西洋鲑来源于国信东方循环水养殖科技有限公司，体重为394g-535g；共20尾，分为4组，每组5尾。
普通饲料组：投喂普通饲料，投喂的频率为1次/2d，投喂的量为2.4g/L，养殖池的容积为90L，投喂的时间为48周。
含居冰菌饲料组：投喂含居冰菌的饲料，居冰菌的有效活菌数分别为0.8×109CFU/g、1×109CFU/g、1.7×109CFU/g，投喂的频率为1次/2d，投喂的量为2.4g/L，养殖池的容积为90L，投喂的时间为48周。
实验样本的制备包括以下步骤：
将容器密封并存放在-4℃条件下，实验开始后，使用干净的刀具将鱼肉切成1cm×1cm×1cm的块，并将其放入容器中。
检测方法：
含水量的检测方法包括以下步骤：
1. 取一定重量的样品，称量并记录样品质量。
2. 将样品放入预先烘干至恒定质量的烘箱中（在105℃下烘干24小时），以去除样品中所有水分。
3. 从烘箱中取出样品，放置冷却器中，保持室温。
4. 称取样品质量，并记录称重值，再将其放回烘箱中烘干。
5. 待样品重量不再改变时（通常需要1-2小时），取出样品，记录称重值。
6. 根据样品的初始质量和最终质量计算出样品失去的重量（即水分量）。
7. 计算鱼肉的含水量百分比，含水量=（失去的重量÷初始样品重量）×100%。
硬度及弹性的检测方法使用苏州保曼TA.GEL质构仪：
1. 鱼肉样品准备
在大西洋鲑中，取长*宽*厚为1cm*1cm*1cm的鱼肉块，置于沸水浴上蒸5min，取出后，室温下自然冷却15min，用包装袋密封包装，备用。
2. 仪器及配件
仪器：苏州保曼TA.GEL质构仪，质构仪的型号为TA/GEL。
探头：6mm柱形探头。
3. 测试方法
将煮熟好的鱼肉样品放于装有柱形探头质构仪的正下方，在软件中设置以下测试条件：
测试模式：TPA模式；
测试前速度：0.5mm/s；
测试速度：0.5mm/s；
测试后速度：0.5mm/s；
触发力：6g；
目标模式：距离4mm；
两次压缩间隔时间：2s。
4. 测试结果
可以获得鱼肉的硬度、弹性等指标，可以客观评价鱼肉的品质。
死亡率的计算方式：
死亡率=（死亡鱼数/总鱼数）×100%。
统计分析：
数据均以均数±标准差表示。采用单因素方差分析确定统计学显著性，p＜0.05结果具有统计学差异（SPSS软件）。
实验结果：
表1.
注：上表中a代表无显著性差异；b代表有显著性差异。
实验结果如上表1所示，从表1中可以看出，与普通饲料组相比，含居冰菌饲料组的含水量、硬度、弹性较高于普通饲料组，含居冰菌饲料喂养的大西洋鲑鱼肉具有更好的品质并且含居冰菌饲料组的死亡率低于普通饲料组。
与饲料中居冰菌的有效活菌数为0.8×109CFU/g相比，饲料中含有居冰菌有效活菌数为1×109CFU/g的含水量、硬度、弹性较高死亡率较低。与饲料中居冰菌的有效活菌数为1.0×109CFU/g相比，饲料中含有居冰菌有效活菌数为1.7×109CFU/g的含水量、硬度、弹性较高，死亡率较低。上述结果说明，居冰菌能够提高鱼肉的品质并降低大西洋鲑的死亡率。
实施例2 居冰菌对饲料转化率的影响
实验步骤：
1. 样品准备：在2216E液体培养基中接种新鲜的培养物于30℃培养48h后加入无菌生理盐水中稀释成1mL菌液浓度不大于100cfu的菌悬液。收集居冰菌的培养物作为检测样品。确保样品的来源和质量符合要求。
2. 酶提取：将上述培养物于4000 r/min离心15 min后收集上清液。分别取50mL上清液，在20℃加入固体(NH)2SO4至相对饱和度分别为20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%，充分混合均匀。4℃放置12 h，4000 r/min离心15 min，分别吸取上清液测定其残留木聚糖酶酶活。盐析得到粗酶沉淀，然后将粗酶于45-50℃干燥约10h，得到干燥粗酶粉。取上述干燥粗酶粉适量溶于100mL的蒸留水中，透析24 h除盐，将得到的粗酶透析液用于酶学性质研究。
3. 酶活性测定：
标准木聚糖酶曲线的制作
1）吸取pH5.5的0.1M乙酸乙酸钠+缓冲溶液4.0mL，加入DNS试剂5.0mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白。
2）分别吸取木糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL，分别用pH5.5 0.1M柠檬酸盐缓冲液定容至100mL，配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液。
3）分别取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到试管中，再分别加入2.0mL缓冲液和5.0mL DNS试剂。电磁振荡3s-5s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，用水定溶液至25mL。以标准空白为对照调零，在540min处测定吸光度A值。
酶样测定：
1）吸取2中的粗酶透析液10mL，37℃平衡10min。
2）吸取2.00mL已经过37℃平衡的粗酶透析液，加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂，电磁振荡3s-5s。然后加入100mg/mL木聚糖溶液2.0mL，37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s-5s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。
用于酶解反应的稀释酶液中木聚糖酶的活力计算：
XD=((AE- AB)*K+CO]/(M*t)*1000；
式中：
XD-稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；
AE-酶反应液的吸光度；
AB-酶空白样的吸光度；
K-标准曲线的斜率；
CO-标准曲线的截距；
M-木糖的摩尔质量，M(C5H10O5)=150.2g/mol；
t-酶解反应时间，min；
1000-转化因子，1mmol=1000μmol。
XD值应在0.04U/mL-0.08U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X=XD*DF；
式中：
X-试样中木聚糖酶的活力，U/g或（U/mL）；
DF-试样的稀释倍数。
酶活力的计算保留三位有效数字。
实验结果：
表2.
注：上表中b代表有显著性差异。
从上表2中可以看出，含居冰菌饲料喂养组的大西洋鲑生长环境的木聚糖酶含量较高，鱼体重量较普通饲料组较高，说明在饲料中加入居冰菌能够产生大量的木聚糖酶，从而促进大西洋鲑的生长和饲料转化率，提高鱼肉的品质。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.居冰菌在大西洋鲑养殖中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的居冰菌选自居冰菌菌株、居冰菌裂解物、居冰菌培养物、居冰菌株的提取物、居冰菌裂解物的提取物、居冰菌培养物的提取物中的一种或多种。
3.居冰菌在制备动物饲料、饲料添加剂或药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的动物为水产动物。
5.一种大西洋鲑饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂中包含居冰菌。
6.根据权利要求5所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂中还包括辅料。
7.根据权利要求6所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的辅料选自防腐剂、粘合剂、赋性剂、稀释剂、湿润剂、崩解剂中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂中居冰菌的活菌数为（1-2）×109CFU/g或（1-2）×109CFU/mL。
9.权利要求5-8任一项所述的饲料添加剂具有下述至少一项的应用：
（1）制备水产动物促生长产品中的应用；
（2）制备增加水产动物产量的产品中的应用。
10.一种大西洋鲑养殖水体添加剂，其特征在于，所述的大西洋鲑养殖水体添加剂中包含居冰菌。
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