CN113604404A

CN113604404A - 一种凝结芽孢杆菌ysf17及其用途

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Publication number: CN113604404A
Application number: CN202111012439.2A
Authority: CN
Inventors: 刘超; 杨丹露; 彭楠; 田建平; 梁运祥
Original assignee: Sichuan Runge Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Runge Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2041-08-31
Also published as: CN113604404B

Abstract

本发明公开了一种凝结芽孢杆菌YSF17及其用途，属于微生物技术领域，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021965，保藏地点为中国武汉武汉大学，保藏时间为2021年8月2日；本发明的凝结芽孢杆菌YSF17具有分泌淀粉酶和纤维素酶的能力，能够利用11种单糖或者寡糖产酸，能够耐高温，菌可以在60℃生长，芽孢能够在90℃高温处理30min后存活率达到80％；能够耐香兰素、丁香醛、苯甲醛、棉酚等多种酚醛类物质，用于棉籽粕和豆粕的发酵，能有效降低棉酚、水苏糖、棉籽糖等抗营养因子含量，缩短发酵周期，实现降本增效，在蛋白饲料的开发及应用方面具有非常好的应用前景。

Description

一种凝结芽孢杆菌YSF17及其用途

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种凝结芽孢杆菌YSF17及其用途。

背景技术

乳酸菌是人体和动物倡导正常菌群的优势菌，能够发酵糖产生大量乳酸，具有调节倡导菌群平衡、提高免疫力等优点。传统的乳酸菌虽具有很强的产乳酸的特点，但是在耐热、耐胆盐、耐胃酸这方面的能力却很差，凝结芽孢杆菌是目前发现的唯一一种孢子型乳酸菌，其具有良好抗逆性，通过产生的乳酸来抑制肠道病原菌的繁殖，进而维持肠道的健康，因此凝结芽孢杆菌既有芽孢又产乳酸的特点极大的弥补了这一缺点。凝结芽孢杆菌作为饲料添加剂应用于动物养殖中在动物肠道产生的一系列的生物正效应是通过在动物肠道中生长时分泌多种有益的代谢产物，并且与肠道中的其他益生菌相互作用，从而起到提高动物的生长效率的作用。

凝结芽孢杆菌经生物发酵制成高菌数高芽孢数的凝结菌粉后，当其进入动物胃里，在胃液强酸的环境下开始萌发，并且芽孢在这个过程中顺利通过胃液后到达动物的小肠部位，且大部分已经萌发成为营养细胞，到达小肠后，凝结芽孢杆菌在肠道中开始生长繁殖，利用其兼性厌氧的特性从而消耗肠道中的游离氧，为其他有益菌(乳杆菌)提供一个无氧的环境，从而促进肠道中其他严格厌氧的益生菌的生长繁殖，稳固微生态平衡，减少动物的患病几率。

研究表明，凝结芽孢杆菌因其具备强大的产酶系统，可以产生诸多的酶类，当凝结芽孢杆菌在动物肠道中定植后，在其生长繁殖过程中会分泌淀粉酶和蛋白酶，可以帮助动物机体对营养物质的吸收，从而提高动物的生长速率，并且提高营养物质的利用率。凝结芽孢杆菌在动物肠道中进行生长繁殖会代谢出多种小分子的营养物质，比如维生素、氨基酸，从而与肠道中的其他益生菌产生协同作用，促进肠道的蠕动，提高动物肠道的消化功能，促进动物对饲料的利用率从而提高动物的机体性能。

随着畜牧业的飞速发展，蛋白质饲料原料紧缺已经成为阻碍饲料行业发展的一个突出问题，寻求方法开发新型蛋白质资源，改进工艺充分利用已有蛋白质资源，这已经成为备受饲料工业和养殖业关注的热点。

棉籽粕，是棉籽经脱壳、加热、压扁成薄片用溶剂己烷浸出油后，所剩余的副产品。棉籽粕中含蛋白质40％以上，赖氨酸1.59％，蛋氨酸0.52％，其蛋白含量丰富，比大米和小麦的蛋白含量高出5-8倍，是一种十分优质的植物源蛋白，是畜禽饲料非常有价值的一种原料。但是，棉籽粕中还存在多种抗营养因子(ANFs)，即棉籽粕中所含有的一类对营养成分的消化、吸收、代谢以及对动物的健康和生产性能产生不良影响的物质。由于这些抗营养因子的存在，大大制约了棉籽粕在畜禽饲料和水产饲料上的应用。因而如何降解棉粕中的抗营养因子是一个急需解决的问题。

豆粕是大豆油加工过程中产生的副产品，粗蛋白含量为40％-45％，氨基酸组成比例合理，是养殖业主要蛋白来源。但豆粕中同样存在一些抗营养因子(ANFs)，能影响机体对大豆蛋白的的消化吸收。仔猪、犊牛等幼畜对大豆抗营养因子耐受性较弱，日粮中添加比例有限。通过物理或化学方法能够分离或钝化大豆中的抗营养因子，提高原料品质，如通过膨化方法生产膨化大豆，膨化豆粕；通过乙醇分离方法生产大豆浓缩蛋白以及通过沉淀法生产大豆分离蛋白等。通过这些方法的加工后，豆粕产品中的抗营养因子大量降低，动物饲喂效果显著上升。

出现于上世纪末的微生物发酵法是更有前景的解决豆粕应用限制的方法。微生物发酵可以降解豆粕中的ANFs，还能分解豆粕中的蛋白质，生成小肽和一些游离的氨基酸，发酵中富集的有益微生物及其代谢产物能够促进动物肠道健康，此外，发酵可以使豆粕产生香气，吸引动物进食，改善适口性。

然而，凝结芽孢杆菌在食品和饲料领域实际复杂环境中的有效存活问题一直没有得到解决，在实际生产应用中，生产加工环境带来的高温、人和动物消化道中胃酸的低pH和胆汁中的胆酸盐均会极大影响凝结芽孢杆菌的有效存活。

发明内容

本发明的目的是提供一种凝结芽孢杆菌YSF17及其用途，以解决上述现有技术存在的问题，该凝结芽孢杆菌具有良好的抗逆性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)YSF17，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021965，保藏地点为中国武汉武汉大学，保藏时间为2021年8月2日。

本发明还提供一种如上述的凝结芽孢杆菌YSF17在制备动物食品或饲料中的用途。

进一步地，所述凝结芽孢杆菌YSF17用于发酵棉籽粕和豆粕，发酵产物用于制备动物食品或饲料。

本发明还提供一种应用上述的凝结芽孢杆菌YSF17降解棉酚的棉籽粕发酵方法。

进一步地，该棉籽粕发酵方法，包括以下步骤：

在棉籽粕中加入1-5wt％的膨化玉米粉和0.1-1wt％的硫酸亚铁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化所述凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，50℃静置培养24h后的培养液作为固态发酵的种子液，以接种量2-20wt％和料液质量比＝1:0.6-1.4将种子液和水接入所述基础固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为5-9，发酵温度为30-55℃，发酵时间为12-60h，进行微生物固态发酵，将所得发酵后的棉籽粕烘干，即得到棉酚含量低，蛋白含量高的棉籽粕，将其用密封袋密封包装，置于干燥条件储藏。

本发明还提供一种应用上述的凝结芽孢杆菌YSF17高温发酵豆粕的方法。

进一步地，该方法，包括以下步骤：

在豆粕中加入1-5wt％的麸皮和0.2-1wt％的硫酸镁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化所述凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，50℃静置培养24h后的培养液作为固态发酵的种子液，以接种量2-20wt％和料液质量比1:0.6-1.4将种子液和水接入所述基础固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为5-9，发酵温度为45-55℃，发酵时间为12-36h，进行微生物固态发酵，发酵过程不用翻料，将所得发酵后的豆粕烘干，即得到抗营养因子含量低，蛋白含量高的豆粕，将其用密封袋密封包装，置于干燥条件储藏。

本发明公开了以下技术效果：

本发明的凝结芽孢杆菌YSF17具有分泌淀粉酶和纤维素酶的能力，能够利用葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、蔗糖、α-半乳糖、乳糖、山梨醇、阿拉伯糖、水苏糖和棉子糖等11种单糖或者寡糖产酸，能够耐高温，菌可以在60℃生长，芽孢能够在90℃高温处理30min后存活率达到80％；能够耐香兰素、丁香醛、苯甲醛、棉酚等多种酚醛类物质。

用本发明中的凝结芽孢杆菌发酵的棉籽粕有效的降低了抗营养因子的含量，并且提高了蛋白和乳酸的含量，为更好的利用棉籽粕提供了一定的技术支撑。本发明发酵过程采用固态发酵，使凝结芽孢杆菌固态发酵棉籽粕降解其抗营养因子生产实现大规模放大生产。本发明涉及的凝结芽孢杆菌YSF17发酵棉籽粕，解决了以棉籽粕为主要原料发酵中目前大都采用酵母菌、霉菌等真菌发酵，产热量大且比较集中，生产过程不易控制的问题；另外，霉菌产生的孢子易污染环境且可能产生毒素，对动物体和人体都有不利影响，已报道的研究中都是将棉籽粕灭菌后再进行发酵处理，尽管得到了良好的脱毒率，但也导致了蛋白的变性及营养成分的丧失，且灭菌过程中能源消耗量大，成本较高，在实际生产中可行性不高。本发明的发酵方法将棉籽粕中的棉酚由1173mg/kg降到111.3mg/kg，脱毒率达90.5％，粗蛋白含量达到53.25％，较发酵前提高了5.1％，酸溶性蛋白含量从2.44％提高到5.78％，乳酸的含量由0.02％提高到1.6％。

用本发明中的凝结芽孢杆菌YSF17高温发酵豆粕有效的降低了抗营养因子水苏糖和棉子糖的含量，并且提高了蛋白和乳酸的含量，为更好的利用豆粕提供了一定的技术支撑。本发明发酵过程采用固态发酵用凝结芽孢杆菌高温发酵豆粕的方法，使凝结芽孢杆菌固态发酵豆粕生产实现大规模放大生产。本发明涉及的凝结芽孢杆菌YSF17高温发酵豆粕，由于凝结芽孢杆菌发酵温度高，又兼性厌氧的特点，解决了以豆粕为主要原料发酵中目前大都采用酵母菌、霉菌等真菌发酵，产热量大且比较集中，生产过程不易控制的问题；另外，霉菌产生的孢子易污染环境且可能产生毒素，对动物体和人体都有不利影响，已报道的研究中很多都是将豆粕灭菌后再进行发酵处理，尽管得到了良好的发酵，但也导致了蛋白的变性及营养成分的丧失，且灭菌过程中能源消耗量大，成本较高，在实际生产中可行性不高。高温发酵也极大的缩短了发酵时间，文献报道中的发酵时间大都为48-72h，本发明将发酵时间降低到了24h，将豆粕中粗蛋白含量从46.1％提升到了50.8％，较发酵前提高了4.7％，酸溶性蛋白含量从1.3％提高到9.8％，乳酸的含量由0.03％提高到1.8％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为凝结芽孢杆菌YSF17的芽孢热耐受存活率；

图2为凝结芽孢杆菌YSF17的菌落形态；

图3为凝结芽孢杆菌YSF17的营养体形态；

图4为凝结芽孢杆菌YSF17的芽孢形态；

图5为基于16S rDNA序列构建的凝结芽孢杆菌YSF17系统进化树；

图6为凝结芽孢杆菌YSF17利用单糖或寡糖产酸情况。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

在本发明中，粗蛋白含量测定方法：采用凯氏定氮法，具体方法参见GB/T 6432-2018；酸溶蛋白含量测定方法：采用凯氏定氮法，具体方法参见GB/T 22492-2008；游离棉酚含量的测定方法：按照国标GB 13086-91“饲料中游离棉酚的测定方法”。

在本发明中，所采用的棉籽粕来源于阿克苏新粮油脂有限公司，其中粗蛋白含量≥46％，游离棉酚含量≤1200mg/kg；豆粕来源于绿科生物科技有限公司，其中粗蛋白含量≥46％。

实施例1

1.凝结芽孢杆菌的筛选和分离纯化

采集河北省保定市健康农场羊。以无菌棉签和镊子采集新鲜动物粪便于无菌离心管中，每种动物样品取三份。称取采集的新鲜粪便样品10g，用90mL无菌水稀释并于室温下震荡30min。准备无菌纱布将上述震荡处理的粪便样品过滤取滤液，重复过滤三次。将得到的滤液置于80℃水浴锅中热处理15min除去非芽孢菌体。将上述热处理后的粪便过滤液梯度稀释适当梯度后，涂布于含有溴甲酚紫的YPD和MRS固体平板上各一份，并于50℃培养箱中培养24h。挑取YPD和MRS固体平板上周围有黄色变色圈的菌落分别于YPD和MRS液体培养基中，50℃静止培养24h。将上述菌液分别以稀释涂布法用含溴甲酚紫指示剂的YPD和MRS培养基进行产酸筛选，挑取产黄色变色圈较大的单菌落进行多次分离纯化，得到单菌落，具体情况见表1。

表1本发明筛选到的凝结芽孢杆菌

2.分泌淀粉酶和纤维素酶的实验

取新鲜活化的待测菌液2.5μL点状结种于淀粉平板培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉2g/L，牛肉膏5g/L，琼脂20g/L，121℃灭菌30min)和羧甲基纤维素钠平板培养基(羧甲基纤维素钠10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾1g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌30min。)上，平板置于50℃培养箱静置培养24h。取出淀粉平板后，向平板内加入适量的碘液，慢慢旋转使碘液刚好覆盖固体培养基为佳，静置30s，以阳性对照和阴性对照为参考，观察实验菌菌落周围是否出现无色透明圈。若出现无色透明圈，则该菌具有淀粉水解能力，取出羧甲基纤维素钠平板，以1mg/mL的刚果红染色液覆盖平板表面，静止染色10min-15min，然后倒出染液，用1mol/L浓度的NaCl覆盖平板表面，轻轻晃动洗去未染色部分，15min后倒去洗脱液。观察菌落周围是否有变色圈出现，以阳性对照菌落周围出现的无色圈为参考，如若有，则该菌有降解纤维素的能力，将菌落的直径定为d，无色透明圈的直径为D，则当D/d＞2.5，水解能力为++++；当2＜D/d≤2.5，水解能力为+++；当1.5＜D/d≤2，水解能力为++；当1＜D/d≤1.5，水解能力为+；D/d≤1，水解能力为-；无透明圈，该菌不具有水解能力。结果见表2。

表2凝结芽孢杆菌分泌淀粉酶和纤维素酶的能力

3.利用单糖和寡糖产酸

产酸基础培养基(g/L)：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L；固体培养基额外添加1.5％的琼脂粉。分别向基础培养基中添加1％葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、蔗糖、α-半乳糖、乳糖、山梨醇、阿拉伯糖、水苏糖或棉子糖制成不同碳源的固体培养基。另添加0.05％溴钾酚紫作为酸碱指示剂。

步骤：新鲜活化的待测菌液，取2.5μL点状接种于上述固体平板上，于50℃培养箱培养24h，观察菌株的生长状态以及菌落周围是否出现变色圈，若菌落生长状况良好并且周围有黄色变色圈，即该待测菌可以发酵相对应的糖产酸；将菌落的直径定为d，变色圈的直径为D，则当D/d＞3，产酸能力为+++；当2＜D/d≤3，产酸能力为++；当1＜D/d≤2，产酸能力为+；当D/d≤1，产酸能力为-；无变色圈，即没有产酸。结果见表3及图6。

表3凝结芽孢杆菌利用单糖和寡糖产酸能力

4.酚醛耐受性实验

分别向YPD液体培养基中添加0.1％的香兰素、苯甲醛或丁香醛制成不同酚醛液体培养基。以YPD液体培养基活化待测凝结芽孢杆菌，重复转接两次以提高其菌株活性，然后按照1％接种量接种于不同酚醛液体培养基中，于50℃摇床220r/min震荡培养48h，分别测其OD600，用每个菌在每种酚醛液体培养基中生长的OD600与每个菌在YPD中生长的OD600的比值来判断每个菌对某种酚醛的耐受性。比值≤0.1，则酚醛耐受性为-；0.1＜比值≤0.5，则酚醛耐受性为+；0.5＜比值≤0.9，则酚醛耐受性为++；比值＞0.9，则酚醛耐受性为+++。结果见表4。

表4凝结芽孢杆菌酚醛耐受能力

5.芽孢热耐受性

选择以上实验中各方面性能都好的菌株，即凝结芽孢杆菌YSF17，将活化好的待测菌接种于基础产孢培养基(蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，牛肉膏2g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄·7H₂O0.005g/L，MnSO₄·H₂O 0.02g/L；121℃灭菌30min。)中，50℃摇床250r/min培养48h制成菌悬液。分别将上述菌悬液分别置于80、90、100℃中处理10、20、30min后稀释平板计数，以未经处理的菌悬液中芽孢数为对照，计算其在不同温度下处理不同时间后的芽孢存活率。结果见图1。

通过上述试验说明，本发明的凝结芽孢杆菌YSF17具有下述性质：

(1)具有分泌淀粉酶和纤维素酶的能力；

(2)能够利用葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、蔗糖、α-半乳糖、乳糖、山梨醇、阿拉伯糖、水苏糖和棉子糖等11种单糖或者寡糖产酸；

(3)能够耐高温，菌可以在60℃生长，芽孢能够在90℃高温处理30min后存活率达到80％；

(4)能够耐香兰素、丁香醛、苯甲醛、棉酚等多种酚醛类物质。

实施例2

该凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)YSF17，经16S rDNA序列鉴定为芽孢杆菌属，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021965，保藏地点为中国武汉武汉大学，保藏时间为2021年8月2日。

凝结芽孢杆菌YSF17的菌种培养方法如下：

YPD平板纯化分离：无菌条件下用接种环挑取凝结芽孢杆菌YSF17，在YPD平板上划线，平板置于50℃培养箱中倒置培养24h，挑取单菌落到液体YPD中进行下一步活化，活化过后进行实验。

YPD培养基组成(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，水1000；115℃灭菌20min。固体培养基额外添加1.5％的琼脂粉。

菌数量的检测方法：准确称取10g样品加入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，震荡30min使其完全溶解制成待测液悬液。准确吸取1.0mL上述待测液，加入到9mL无菌水中，充分震荡，以此梯度稀释，分别得到10^-2、10^-3、10^-4、……的稀释液，稀释到适当梯度后，使用移液器准确吸取100μL用于平板涂布。芽孢计数在稀释之前将待测液悬液放于80℃水浴锅热处理15min，然后再进行之后步骤。菌落计数标准参考GB4789-2-2010《食品安全国家标准》。

对凝结芽孢杆菌YSF17进行形态学以及生长特性分析，如图2-4所示，凝结芽孢杆菌YSF17的生物学特性如下：

1.菌落形态呈圆形，直径约为2-3mm，不透明，呈乳白色，整体微微隆起，中心微微凸起，表面粗糙有光泽，边缘呈轻微的发散锯齿状。

2.菌体形态呈短杆状，两端钝圆，单个、成对或链状排列生长，形成芽孢，芽孢端生，革兰氏染色阳性。

3.能专性分解糖，主要代谢产物为乳酸。

本发明的凝结芽孢杆菌YSF17的16S rDNA碱基序列，如SEQ ID No.1所示，其16SrDNA序列的系统进化树如图5所示。

SEQ ID No.1：

GCGGCTGGCTCCGTAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGGGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGAATGGTTTTCTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTCTCGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGTCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAGGCCCTGTCTCCAGGGAGGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGCCTCCCAGTTTCCAATGACCGCTTGCGGTTGAGCCGCAAGATTTCACATCAGACTTAAGAAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGCCGGGTACCGTCAAGGCGCCGCCCTGTTCGAACGGCACTTGTTCTTCCCCGGCAACAGAGTTTTACGACCCGAAGGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAGCCGTCTTTCCTTTTTCCTCCATGCGGAGGAAAAAACTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGCGTTATCCCGATCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTT。

实施例3利用凝结芽孢杆菌YSF17发酵棉籽粕降解棉酚

棉籽粕中加入2％的膨化玉米粉和0.6％的硫酸亚铁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，50℃静置培养24h后的培养液为固态发酵的种子液，以接种量15％和料液比1:1种子液和水接入固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为6，发酵温度为50℃，发酵时间为48h为培养条件进行微生物固态发酵，将所得发酵后的棉籽粕烘干，将其用密封袋密封包装，置于干燥条件储藏。

上述实施例中，将棉籽粕中的棉酚由1173mg/kg降到111.3mg/kg，脱毒率达90.5％。粗蛋白含量达到53.25％，较发酵前提高了5.1％，酸溶性蛋白含量从2.44％提高到5.78％；乳酸的含量由0.02％提高到1.6％。

实施例4利用凝结芽孢杆菌YSF17发酵棉籽粕降解棉酚

棉籽粕中加入1％的膨化玉米粉和0.8％的硫酸亚铁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，50℃静置培养24h后的培养液为固态发酵的种子液，以接种量5％和料液比＝1:0.8种子液和水接入固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为7，发酵温度为45℃，发酵时间为60h为培养条件进行微生物固态发酵，将所得发酵后的棉籽粕烘干，将其用密封袋密封包装，置于干燥条件储藏。

上述实施例中，将棉籽粕中的棉酚由1173mg/kg降到211.3mg/kg，脱毒率达82.0％。粗蛋白含量达到52.25％，较发酵前提高了4.1％，酸溶性蛋白含量从2.44％提高到4.78％；乳酸的含量由0.02％提高到0.9％。

实施例5利用凝结芽孢杆菌YSF17发酵棉籽粕降解棉酚

棉籽粕中加入5％的膨化玉米粉和0.1％的硫酸亚铁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，50℃静置培养24h后的培养液为固态发酵的种子液，以接种量2％和料液比1:1.2种子液和水接入固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为8，发酵温度为55℃，发酵时间为24h为培养条件进行微生物固态发酵，将所得发酵后的棉籽粕烘干，将其用密封袋密封包装，置于干燥条件储藏。

上述实施例中，将棉籽粕中的棉酚由1173mg/kg降到197mg/kg，脱毒率达83.2％。粗蛋白含量达到51.25％，较发酵前提高了3.1％，酸溶性蛋白含量从2.44％提高到5.08％；乳酸的含量由0.02％提高到1.3％。

实施例6利用凝结芽孢杆菌YSF17高温发酵豆粕

豆粕中加入2％的麸皮和0.5％的硫酸镁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，50℃静置培养24h后的培养液为固态发酵的种子液，以接种量15％和料液比1:1将种子液和水接入固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为6，发酵温度为50℃，发酵时间为24h为培养条件进行微生物固态发酵，发酵过程不用翻料，将所得发酵后的豆粕烘干将其用密封袋密封包装，置于干燥条件储藏。

上述实施例中，将豆粕中粗蛋白含量从46.1％提升到了50.8％，较发酵前提高了4.7％，酸溶性蛋白含量从1.3％提高到9.8％；乳酸的含量由0.03％提高到1.8％。

实施例7利用凝结芽孢杆菌YSF17高温发酵豆粕

豆粕中加入1％的麸皮和1％的硫酸镁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，50℃静置培养24h后的培养液为固态发酵的种子液，以接种量5％和料液比1:0.8将种子液和水接入固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为7，发酵温度为45℃，发酵时间为36h为培养条件进行微生物固态发酵，发酵过程不用翻料，将所得发酵后的豆粕烘干将其用密封袋密封包装，置于干燥条件储藏。

上述实施例中，将豆粕中粗蛋白含量从46.1％提升到了51.5％，较发酵前提高了5.4％，酸溶性蛋白含量从1.2％提高到8.6％；乳酸的含量由0.03％提高到1.3％。

实施例8利用凝结芽孢杆菌YSF17高温发酵豆粕

豆粕中加入5％的麸皮和0.3％的硫酸镁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，50℃静置培养24h后的培养液为固态发酵的种子液，以接种量20％和料液比1:1.2将种子液和水接入固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为8，发酵温度为55℃，发酵时间为18h为培养条件进行微生物固态发酵，发酵过程不用翻料，将所得发酵后的豆粕烘干将其用密封袋密封包装，置于干燥条件储藏。

上述实施例中，将豆粕中粗蛋白含量从46.1％提升到了50.9％，较发酵前提高了4.8％，酸溶性蛋白含量从1.2％提高到8.9％；乳酸的含量由0.03％提高到1.4％。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 四川润格生物科技有限公司

<120> 一种凝结芽孢杆菌YSF17及其用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcggctggct ccgtaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120

agcgattccg gcttcatgca ggcgggttgc agcctgcaat ccgaactggg aatggttttc 180

tgggattggc ttaacctcgc ggtctcgcag ccctttgtac catccattgt agcacgtgtg 240

tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300

accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaaggtcaa gggttgcgct 360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420

tcactctgtc ccccgaaggg gaaggccctg tctccaggga ggtcagagga tgtcaagacc 480

tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600

gttagctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720

acagaccaga gagccgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc 780

tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagcct cccagtttcc aatgaccgct 840

tgcggttgag ccgcaagatt tcacatcaga cttaagaagc cgcctgcgcg cgctttacgc 900

ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960

gccgtggctt tctggccggg taccgtcaag gcgccgccct gttcgaacgg cacttgttct 1020

tccccggcaa cagagtttta cgacccgaag gccttcttca ctcacgcggc gttgctccgt 1080

cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt 1140

gtctcagtcc caatgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt tgccttggtg 1200

agccgttacc ccaccaacta gctaatgcgc cgcgggccca tctgtaagtg acagccgaag 1260

ccgtctttcc tttttcctcc atgcggagga aaaaactatc cggtattagc cccggtttcc 1320

cggcgttatc ccgatcttac aggcaggttg cccacgtgtt 1360

Claims

1.一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)YSF17，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021965，保藏地点为中国武汉武汉大学，保藏时间为2021年8月2日。

2.一种如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌YSF17在制备动物食品或饲料中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌YSF17用于发酵棉籽粕和豆粕，发酵产物用于制备动物食品或饲料。

4.一种应用权利要求1所述的凝结芽孢杆菌YSF17降解棉酚的棉籽粕发酵方法。

5.根据权利要求4所述的棉籽粕发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

在棉籽粕中加入1-5wt％的膨化玉米粉和0.1-1wt％的硫酸亚铁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化所述凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，静置培养后的培养液作为固态发酵的种子液，以接种量2-20wt％和料液质量比＝1:0.6-1.4将种子液和水接入所述基础固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为5-9，发酵温度为30-55℃，发酵时间为12-60h，进行微生物固态发酵。

6.一种应用权利要求1所述的凝结芽孢杆菌YSF17高温发酵豆粕的方法。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

在豆粕中加入1-5wt％的麸皮和0.2-1wt％的硫酸镁做为基础固态发酵培养基，以YPD固态培养基活化所述凝结芽孢杆菌YSF17，挑单菌落到YPD液体培养基中，静置培养后的培养液作为固态发酵的种子液，以接种量2-20wt％和料液质量比1:0.6-1.4将种子液和水接入所述基础固态发酵培养基，混拌均匀，调整初始pH为5-9，发酵温度为45-55℃，发酵时间为12-36h，进行微生物固态发酵。