CN116064282B - 一种降解油茶冷榨饼粕茶皂素的发酵工艺及其专用菌 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种快速降解油茶冷榨饼粕茶皂素的发酵工艺及其专用菌。所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)N‑2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2022623。采用枯草芽孢杆菌N‑2进行单菌固态发酵，对茶皂素的降解率在发酵60h时可达到72.18％，避免了复合菌种发酵的繁琐复配工艺，条件易控制，降低了人工、时间和经济成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种快速降解油茶冷榨饼粕茶皂素的发酵工艺及其专用菌。
背景技术
油茶饼粕为油茶果实榨油后的饼粕，其中含有粗蛋白15.94％、矿物质3.37％、粗脂肪6.64％、可溶性糖4.3％、易水解多糖26.09％、难水解多糖12.44％等。经测定表明,油茶饼营养物质比较丰富,其价值可与米糠媲美,是一种值得开发利用的蛋白质饲料。但是,油茶饼中含有有毒物质皂素和影响家畜适口性物质单宁,必须加以适当的处理才能使用。
目前，关于微生物发酵油茶饼粕中茶皂素的研究已有很多相关研究，有细菌类、霉菌类，有黑曲霉、桔青霉、枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌等，其中只有黑曲霉是从自然发酵的油茶饼中分离得到，其他都是油茶土壤分离获得或者购买所得。目前已有的研究主要从枯草芽孢杆菌菌液、施氏假单胞菌以及黑曲霉等菌种进行液态发酵来降解油茶饼粕中的茶皂素，存在需要液态降解体系以及降解效果不稳定的缺点。其中，黑曲霉对茶皂素的降解效果是最高的，如公开号为CN108977367A的专利文件公开了一株黑曲霉菌株及其在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，此黑曲霉L-2对茶皂素降解率高，经固态发酵后，可达96.2％。黑曲霉L-2虽对茶皂素的降解率高，但其降解时间很长，需要103.5h或8d才能够达到96.2％的降解率。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种快速降解油茶冷榨饼粕茶皂素的发酵工艺及其专用菌。
具体是通过以下技术方案实现的：
一种快速降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌，所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)N-2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2022623，保藏日期为2022年05月13日。
枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)N-2为本发明研究人员从油茶饼粕中经分离纯化、初筛、复筛得到，菌株在37℃、pH＝7于营养琼脂培养基上活化，种子液为37℃、150r/min的摇床中培养22h。菌株经过革兰氏染色后呈蓝紫色及不规则长杆状，是革兰氏阳性菌；其菌落大，表面粗糙，边缘不规则，有隆起。菌株N-2的生理生化结果如表1所示。
表1
1、菌株筛选具体包括以下步骤：
(1)分离纯化：取自然发酵的油茶饼，加入无菌水，于37℃、150r/min振荡30min，静置，进行梯度稀释后，然后取10-2～10-4稀释度的菌悬液于LB、NA及PDA固体培养基上涂布，置37℃培养箱中培养48h；分离挑选单菌落，在平板上进行4次划线纯化，编号后存于固体斜面培养基中，倒30％甘油保存于-20℃冰箱中；
(2)初筛：从斜面上挑取一环接种于固体培养基中进行活化，重复两次后挑选单个菌落于相应液体培养基上，于37℃，150r/min震荡培养48h后作为种子液，在添加10％茶皂素的平板上稀释，并在37℃的倒置培养48小时，进行菌落计数，菌落数为108～109cfu/mL时记为”+++”，菌落数为107～108cfu/mL时记为”++”，菌落数<105cfu/mL表示为”-“，各菌株分别重复三次，取平均值。选取活菌数高于107cfu/mL的菌株进行复筛；
(3)复筛：将初筛得到的菌株培养48h得到种子液，按10％的接种量接入含水量为80％的油茶饼粕中，37℃发酵48h，结束后取出测定其茶皂素降解率，3个平行,筛选得到枯草芽孢杆菌N-2。对所得到的枯草芽孢杆菌N-2进行测序，得到序列表中所示的序列。
2、上述快速降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，包括以下步骤：
接种活化后的枯草芽孢杆菌N-2于对应的NA液体培养基中培养22个小时，将N-2种子液接种到发酵培养基中进行发酵，在发酵前让菌种与油茶饼粕进行充分混合，12h翻料，整个过程无需光照。
进一步，枯草芽孢杆菌N-2种子液的接种量为6-12％。
进一步，所述的发酵温度为31-37℃，发酵时间为48-108h。
进一步，所述的发酵培养基是由NA培养基与油茶饼粕组成，其中，油茶饼粕占比60-85％，初始含水量为80-100％。
使用Lai et al2013的方法对油茶饼粕中的茶皂素含量进行检测，此条件下茶皂素为6.24-7.95％,初始茶皂素为22.43％,降解率达到64.55-72.18％。
对茶皂素降解率有影响的初始含水量、发酵温度、发酵时间、接种量四个因素进行单因素实验，具体步骤为：
选取初始含水量、发酵温度、接种量、发酵时间进行单因素试验。初始条件确定：pH自然，发酵时间48h，发酵温度37℃，接种量10％，间隔12h翻样一次，每组重复三次。
分别设置初始含水量的梯度为70％、80％、90％、100％、110％、120％；发酵温度的梯度为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃；种子液接种量的梯度为2％、4％、6％、8％、10％、12％；发酵时间的梯度为12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h。
单因素实验结果如图1所示。在单因素的结果基础下，保持节约时间的理念，确定发酵时间60h，选用其他三个因素，将茶皂素降解率作为响应值，进一步利用三因素三水平进行常用于优化微生物发酵的工艺参数的Box-Behnken响应面设计，各因素交互作用下对茶皂素降解率影响的响应面和等高线图如图2所示。
通过Design-Expert13软件进行结果分析得到模型中最佳条件下茶皂素降解率的最佳预测值71.23％。此时按照N-2菌株固态发酵降解饼粕中茶皂素的最佳工艺条件为：含水量83.7％，温度36.3℃，接种量10.5％，发酵时间60h，得到降解率72.18％，与预测值相差不大，吻合良好，说明响应面法优化降解油茶饼中茶皂素的发酵工艺是可行的。
在本发明中，在初始含水量为80％～100％，发酵温度为31℃～37℃，接种量为6％～12％，发酵时间为48h～108h的范围之间时，菌株N-2对茶皂素的降解率均在50％以上，可有效降解油茶饼中的茶皂素。固定的参数点值，是在绝对确定工艺条件下所得，并不代表其他条件范围内茶皂素的降解率。
本发明的有益效果在于：
本发明采用枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)N-2作为降解茶皂素的菌种；采用霉菌的降解效果好但时间长，而本菌株60h时就高达72.19％，降解时间大大缩短，节省了大量的时间成本。并且本菌株固态发酵时不需要添加其它物质，相比霉菌，细菌的污染也会减少，细菌也更加稳定。相比铜绿假单胞菌液态发酵降解茶皂素，固态发酵具有便于大批量发酵的优点。
本菌株固态发酵降解饼粕中茶皂素的最佳工艺条件为：含水量83.7％，温度36.3℃，接种量10.5％，发酵时间60h，此时茶皂素降解率达到72.18％。本技术单菌发酵，避免了复合菌种发酵的繁琐复配工艺，条件易控制，可降低人工成本。不需要添加其他物质，霉菌却需要加酸。节约了经济成本；时间短效率中上，节约了时间成本。本菌株也是一种益生菌，利用其降解茶皂素后，可将发酵饼粕应用于饲料业，对动物有益。本菌株在保证油茶饼粕兼具营养成分增加、有毒物质减少的特性时，实现了油茶饼粕的高附加值利用，为后期的饲用价值提供了理论基础。
附图说明
图1为初始含水量(A)、发酵温度(B)、接种量(C)、发酵时间(D)对茶皂素降解率的影响。
图2为各因素交互作用对茶皂素降解率影响的响应面和等高线图。
图3为筛菌及应用过程图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
一种快速降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌，所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)N-2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2022623，保藏日期为2022年05月13日。
枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)N-2为本发明研究人员从油茶饼粕中经分离纯化、初筛、复筛得到，菌株在37℃、pH＝7于营养琼脂培养基上活化，种子液为37℃、150r/min的摇床中培养22h。菌株经过革兰氏染色后呈蓝紫色及不规则长杆状，是革兰氏阳性菌；其菌落大，表面粗糙，边缘不规则，有隆起。
1、菌株筛选：
(1)分离纯化：取自然发酵的油茶饼，加入无菌水，于37℃、150r/min振荡30min，静置，进行梯度稀释后，然后取10-2～10-4稀释度的菌悬液于LB、NA及PDA固体培养基上涂布，置37℃培养箱中培养48h；分离挑选单菌落，在平板上进行4次划线纯化，编号后存于固体斜面培养基中，倒30％甘油保存于-20℃冰箱中；
(2)初筛：从斜面上挑取一环接种于固体培养基中进行活化，重复两次后挑选单个菌落于相应液体培养基上，于37℃，150r/min震荡培养48h后作为种子液，在添加10％茶皂素的平板上稀释，并在37℃的倒置培养48小时，进行菌落计数，菌落数为108～109cfu/mL时记为”+++”，菌落数为107～108cfu/mL时记为”++”，菌落数<105cfu/mL表示为”-“，各菌株分别重复三次，取平均值。选取活菌数高于107cfu/mL的菌株进行复筛；
(3)复筛：将初筛得到的菌株摇床培养48h得到种子液，按10％的接种量接入含水量为80％的油茶饼粕中，37℃发酵48h，结束后取出测定其茶皂素降解率，3个平行,筛选得到枯草芽孢杆菌N-2。
2、上述快速降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，包括以下步骤：
接种活化后的枯草芽孢杆菌N-2于对应的NA液体培养基中培养22h，将N-2种子液接种到发酵培养基中进行发酵，在发酵前让水与油茶饼粕充分混合，12h翻料一次，整个过程无需光照。
进一步，枯草芽孢杆菌N-2种子液的接种量为10.5％。
进一步，所述的发酵温度为36.3℃，发酵时间为60h。
进一步，所述的发酵培养基是由水与油茶饼粕组成，其中初始含水量为83.7％。
使用Lai et al2013的方法对油茶饼粕中的茶皂素含量进行检测，此条件下茶皂素为6.24％,初始茶皂素为22.43％,降解率达到72.18％。
实施例2
实施例1分离筛选得到的枯草芽孢杆菌N-2在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，包括以下步骤：
接种活化后的枯草芽孢杆菌N-2于对应的NA液体培养基中培养22h，将N-2种子液接种到发酵培养基中进行发酵，在发酵前让水与油茶饼粕充分混合，12h翻料一次，整个过程无需光照。
进一步，枯草芽孢杆菌N-2种子液的接种量为10％。
进一步，所述的发酵温度为34℃，发酵时间为60h。
进一步，所述的发酵培养基是由水与油茶饼粕组成，其中初始含水量为80％。
使用Lai et al2013的方法对油茶饼粕中的茶皂素含量进行检测，此条件下茶皂素为7.78％,初始茶皂素为22.43％,降解率达到65.31％。
实施例3
实施例1分离筛选得到的枯草芽孢杆菌N-2在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，包括以下步骤：
接种活化后的枯草芽孢杆菌N-2于对应的NA液体培养基中培养22h，将N-2种子液接种到发酵培养基中进行发酵，在发酵前让水与油茶饼粕充分混合，12h翻料一次，整个过程无需光照。
进一步，枯草芽孢杆菌N-2种子液的接种量为12％。
进一步，所述的发酵温度为37℃，发酵时间为60h。
进一步，所述的发酵培养基是由水与油茶饼粕组成，其中初始含水量为80％。
使用Lai et al2013的方法对油茶饼粕中的茶皂素含量进行检测，此条件下茶皂素为7.95％,初始茶皂素为22.43％,降解率达到64.55％。
实施例4
实施例1分离筛选得到的枯草芽孢杆菌N-2在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，包括以下步骤：
接种活化后的枯草芽孢杆菌N-2于对应的NA液体培养基中培养22h，将N-2种子液接种到发酵培养基中进行发酵，在发酵前让水与油茶饼粕充分混合，12h翻料一次，整个过程无需光照。
进一步，枯草芽孢杆菌N-2种子液的接种量为12％。
进一步，所述的发酵温度为34℃，发酵时间为60h。
进一步，所述的发酵培养基是由水与油茶饼粕组成，其中初始含水量为90％。
使用Lai et al2013的方法对油茶饼粕中的茶皂素含量进行检测，此条件下茶皂素为8.87％,初始茶皂素为22.43％,降解率达到60.45％。
对照组1
采用公开号为CN108977367A的专利文件方法，发酵温度31.3℃，发酵时间103.5h，初始加酸量4.57mL，初始含水量80％，此时黑曲霉L-2对油茶饼粕中茶皂素的降解率为93.96％。
对照组2
采用公开号为CN108977367A的专利文件方法，发酵时间8d，发酵温度38.7℃，培养基初始pH为6.14，摇床转速为125r·min-1，接种量1.25％时黑曲霉的降解率为(79.97±0.82)％
对照组3
施氏假单胞菌液态发酵降解茶皂素在培养时间5d，培养温度23℃，培养基初始pH为8，瓶口纱布层数为6层，接种量为1％的条件下降解率达到66.92％。
对照组4
地衣芽孢杆菌最在发酵时间10.9d，发酵温度28.89℃，摇床转速150r·min-1，接种量为9.11％的条件下对茶皂素的降解率达到(63.83±0.28)％。
对照组5
铜绿假单胞菌在发酵时间13d，发酵温度29℃，摇床转速150r/min，菌悬液接种量9.0ml/(100ml)的条件下茶皂素的降解率达到71.95％。
通过对本发明技术方案的单因素实验及响应面优化结果，对比对照组1-5不同菌株对茶皂素的降解率结果可知，枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)N-2在降解时间上的优势是极大的，并且在60h的降解时间条件下其降解率依然可以达到72.18％，条件易控制，可降低人工成本。不需要添加其他物质，节约了经济成本；时间短效率中上，节约了时间成本。同时本菌株(枯草芽孢杆菌)在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物，在动植物生产中广泛应用，实现了油茶饼粕的高附加值利用，为后期的饲用价值提供了理论基础。
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。
Claims (6)
1.一种降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌，其特征在于，所述菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.）N-2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2022623，保藏日期为2022年05月13日。
2.如权利要求1所述的一种降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌在降解油茶饼粕中茶皂素的应用。
3.如权利要求2所述的一种降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，其特征在于，包括以下步骤：
接种活化后的芽孢杆菌N-2于对应的NA液体培养基中培养22个小时，将N-2种子液接种到发酵培养基中进行发酵，在发酵前让水与油茶饼粕充分混合，12h翻料一次，整个过程无需光照。
4.如权利要求3所述的一种降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，其特征在于，芽孢杆菌N-2种子液的接种量为6-12%。
5.如权利要求3所述的一种降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，其特征在于，所述的发酵温度为31-37℃，发酵时间为48-108h。
6.如权利要求3所述的一种降解油茶冷榨饼粕茶皂素的专用菌在降解油茶饼粕中茶皂素的应用，其特征在于，所述的发酵培养基是由水与油茶饼粕组成，其中初始含水量为80-100%。
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