CN103184169A - 纤维素酵母、双菌种酿酒酵母组合物及纤维素乙醇的发酵方法 - Google Patents

纤维素酵母、双菌种酿酒酵母组合物及纤维素乙醇的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纤维素酵母、双菌种酿酒酵母组合物及其在纤维素乙醇发酵中的应用，该纤维素酵母的保藏号为CCTCC NO：M2011324。本发明提供的双菌种酿酒酵母组合物包括48-63重量份的上述纤维素酵母，12-25重量份的耐高温酿酒高活性干酵母，5-20重量份的酸性蛋白酶，3-14重量份的植酸酶，以及1-5重量份的木聚糖酶。本发明提供的酵母组合物可有效降低最终发酵醪液中的残还原糖、残总糖、过滤总糖、残淀粉和残糊精的含量，提高出酒率和发酵酒度，还具有耐酸、耐酚、耐醛的特性，适用于纤维素乙醇发酵。

Description

纤维素酵母、双菌种酿酒酵母组合物及纤维素乙醇的发酵方法
技术领域
本发明涉及酒精发酵工艺领域，尤其涉及一种纤维素酵母，以及包括该纤维素酵母的双菌种酿酒复合酵母和一种纤维素乙醇发酵方法。
背景技术
在酒精发酵工业中，通常采用单一酵母进行发酵。采用这种方式，醪液的最终酒度只能达到11％-12％，若醪液最终酒度再提高，则醪液中残还原糖和淀粉浓度偏高，原料出酒率下降，且废弃的残还原糖、残淀粉及酒醪液对环境会造成一定的污染。
为了改善单一酵母存在的上述缺陷，人们将单一酵母与酿酒复合酶配制成超级酿酒高活性干酵母进行酒精发酵，提高了原料的利用率和发酵醪液的浓度。将单一的酵母与相应的酶制剂混合制成酵母组合物，与之前使用单一的酵母相比，虽然提高了醪液的最终酒度而又将残还原糖和残淀粉浓度保持在一个合理的水平，在一定程度上解决了单一酵母存在的问题，但这种酵母组合物对恶劣发酵环境的适应性还不足，特别是随着目前纤维素乙醇发酵的发展，对酵母的适应性提出了更高的要求。因为在纤维素乙醇发酵过程中，纤维素的水解产物，如醛类、有机酸、呋喃、木素的降解物、盐类等将抑制酵母菌体的生长，降低酵母对营养物质的利用率，从而抑制乙醇的生成，降低了乙醇产率。
因此，如何研制出一种性能良好的酿酒发酵剂，既能在酒精发酵过程中提高醪液的最终酒度，并保持残还原糖和残淀粉浓度在合理的水平，又能适应各种恶劣的发酵环境，例如，可耐受纤维素乙醇发酵中的各种抑制物，是目前急需解决的重大问题。
发明内容
为了解决现有酿酒发酵剂存在的各种技术问题，本发明提供了一种纤维素酵母，还提供了一种可提高醪液的最终酒度并保持残还原糖和残淀粉浓度在合理的水平，又具有耐酸、耐酚及耐醛特性的双菌种酿酒酵母组合物，以及该酵母组合物在纤维素乙醇发酵中的应用。
本发明提供的纤维素酵母的保藏号为CCTCC NO.：M2011324，该酵母属于酿酒酵母种属，拉丁名称为saccharomyces cerevisiae al.39。
本发明提供的双菌种酿酒酵母组合物，包括48-63重量份的纤维素酵母，12-25重量份的耐高温酿酒高活性干酵母，5-20重量份的酸性蛋白酶，3-14重量份的植酸酶，以及1-5重量份的木聚糖酶。
优选地，该酵母组合物包括50-60重量份的上述纤维素酵母，16-25重量份的耐高温酿酒高活性干酵母，13-15重量份的酸性蛋白酶，8-10重量份的植酸酶，以及2-3重量份的木聚糖酶。
优选地，上述酵母组合物包括55重量份的纤维素酵母，18重量份的耐高温酿酒高活性干酵母，15重量份的酸性蛋白酶，9.5重量份的植酸酶，以及2.5重量份的木聚糖酶。
优选地，上述酵母组合物包括50重量份的纤维素酵母，25重量份的耐高温酿酒高活性干酵母，13重量份的酸性蛋白酶，9重量份的植酸酶，以及3重量份的木聚糖酶。
优选地，上述酵母组合物包括60重量份的纤维素酵母，15重量份的耐高温酿酒高活性干酵母，14.5重量份的酸性蛋白酶，8.5重量份的植酸酶，以及2重量份的木聚糖酶。
本发明的另一目的在于提供一种纤维素乙醇发酵方法，包括将上述酵母组合物进行扩培，将扩陪后的酵母组合物加入到发酵原料中进行发酵，制得乙醇。
本发明所提供的纤维素酵母以及包括其的双菌种酿酒酵母组合物，可有效降低最终发酵醪液中的残还原糖、残总糖、过滤总糖、残淀粉和残糊精的含量，从而提高出酒率和发酵酒度，降低发酵的生产成本。另外，本发明提供的酵母组合物还具有耐酸、耐酚、耐醛特性，适用于纤维素乙醇发酵，能大大发酵时间，提高发酵酒度。
附图说明
图1是市售酵母与本发明提供的纤维素酵母之间的乙醇得率转化对照图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
本发明提供了一种纤维素酵母，属于酿酒酵母种属，拉丁名称为saccharomyces cerevisiaeal.39，上述纤维素酵母已经在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，该保藏中心的地址为中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO.：M 2011324。提交保藏的日期为2011年9月21日，于2011年9月25日检测后鉴定为存活状态。
本发明提供的双菌种酿酒酵母组合物，包括48-63重量份的上述纤维素酵母，以及12-25重量份的耐高温酿酒高活性干酵母。本发明所指的耐高温酿酒高活性干酵母的拉丁名为saccharomyces cerevisiae YY。本发明的具体实施方式中采用的耐高温酿酒高活性干酵母为安琪酵母公司生产的耐高温酿酒高活性干酵母，其已经为市售产品。
本发明所提供的酿酒酵母组合物与现有酿酒酵母组合物的区别之一在于，本发明提供的酿酒酵母组合物具有两种酵母，通过实验发明人惊奇地发现，上述两种酵母具有协同作用，使得该酵母组合物可提高醪液的最终酒度并保持残还原糖和残淀粉浓度在合理的水平，又具有耐酸、耐酚及耐醛的特性。除了上述两种酵母之外，本发明提供的双菌种酿酒酵母组合物中还包括5-20重量份的酸性蛋白酶，3-14重量份的植酸酶，以及1-5重量份的木聚糖酶。在上述成分的共同作用下，本发明提供的酵母组合物发挥了有益效果，在发酵过程中酵母可充分利用营养物质较快较好的生长，从而促进了乙醇等目标产物的生成。本发明所采用的酸性蛋白酶、植酸酶以及木聚糖酶均为市售产品。
一、纤维素酵母的提纯与获得
1.初始筛选醪液的采集
纤维素酵母属于酿酒酵母的一种，是兼氧性微生物，主要生长在偏酸性的潮湿含糖环境中。本发明提供的纤维素酵母的初始筛选醪液取样自纤维素乙醇酒精厂的废液。
2.纤维素酵母菌株的分离和筛选
2.1培养基的制备
按照质量百分比计算，培养基包括的组成成分为：10％的蔗糖，2％的酵母浸粉，0.1％的MgSO4·7H2O，0.1％K2HPO4，2％琼脂，自然pH，其余为水。充分混合搅拌后，在121℃高温高压灭菌120min。
酵母浸粉是采用新鲜酵母为原料，经酵母酶解自溶、分离过滤、浓缩、干燥而得到的一种黄色的粉状物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色至浅棕色，较澄清。酵母浸粉富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素、微量元素。主要作用是补充氮源和提供微生物生长的各种维生素及氨基酸及生长因子。酵母浸粉已经被广泛应用，本发明采用的酵母浸粉为市售产品。
2.2平板培养基的制备
将灭菌的培养基放在室温下冷却50-55℃，倒入灭过菌的培养皿中，每个培养皿倒入15ml左右的培养基，然后放在平台上冷却制成平板，以上操作均在无菌条件下进行。
2.3稀释涂布接种
待平板准备好后，取1ml初始筛选醪液加入到9ml灭过菌的生理盐水中，充分震荡混合均匀，然后再吸取1ml该溶液加入到9ml灭过菌的生理盐水中，如此反复，分别得到稀释倍数为10-5，10-6，和10-7的初始筛选醪液稀释液。吸取上述浓度的稀释液各0.1ml，分别涂布到相应的平板培养基上。以上所用工具均要提前灭菌处理，以上操作也均在无菌条件下进行。
2.4纤维素酵母的培养、挑菌和纯化
将上述接种好的培养皿倒置于30℃的恒温培养箱中培养，2-3天候即可长出纤维素酵母菌落。选择形态较大、质地均匀，颜色均一的菌落进行挑取，对于生长较慢的纤维素酵母菌可延长分离平板的时间，分批进行挑菌，初步筛选的时候尽量多挑几个菌落并进行分类编号。将编号的菌落再按照上述方法进行进一步的分离纯化，并对筛选出的菌株进行相关的发酵性能实验，如此反复交替，直到选出一只各项指标均最优的纤维素菌株，即为本发明提供的纤维素酵母生产菌株。这里所指的各项指标主要是指发酵过程中乙醇转化率及发酵速率，乙醇转化速率和发酵速率均为最优者，即为本发明所筛选出来的菌株。
二、本发明筛选出的纤维素酵母与现有酵母的发酵性能对比实验
选取相同的纤维素酶解液，发酵过程中保证pH、温度相同，分别添加市售酵母和纤维素酵母酵母(市售酵母为目前市场上用于酒精发酵较好的酵母)，每8小时进行镜检和色谱分析，结果见表1：
表1
表1示出了市售酵母与本发明提供的纤维素酵母发酵过程中各项指标的数值变化。图1是二者乙醇得率转化对照图。从表1及图1可以看出，用纤维素酵母进行发酵的样品在32小时时乙醇得率开始增长，而用市售酵母进行发酵的样品在72小时时乙醇得率才开始增长。从中我们可以明显看出用纤维素酵母进行发酵要好于用市售酵母进行发酵，发酵时间提前了40小时左右。说明纤维束酵母能更好的适应纤维素酶解液的恶劣环境，更适用于纤维素酒精发酵。
三、酵母组合物的制备
本发明将纤维素酵母、耐高温酿酒高活性干酵母、酸性蛋白酶、植酸酶和木聚糖酶按比例组合，然后搅拌，混合均匀而制成酵母组合物。本发明提供的具体实施例的详细配方请见表2，表3示出了实施例1-5所采用的原料的来源。
表2
Figure BDA0000128211080000051
表3
  名称   生产厂家   活力指标
  纤维素酵母   安琪酵母股份有限公司   活细胞数200亿个/克
  耐高温高活性干酵母   安琪酵母股份有限公司   活细胞数300亿个/克
  酸性蛋白酶   海宁金潮实业有限公司   50000u/g
  植酸酶   北京挑战生物技术有限公司   5000u/g
  木聚糖酶   北京挑战生物技术有限公司   10000u/g
四、本发明提供的酵母组合物在玉米酒精发酵工艺中的应用
以下具体阐述了本发明所提供的双菌种酿酒酵母组合物用于玉米酒精连续发酵工艺的流程、使用方法及效果。
玉米酒精连续发酵的工艺步骤为：酵母组合物的扩培——分流——发酵——检测
具体操作如下：
(1)酵母组合物的扩培：以有效体积为100m3的酒母罐为例，先进50m3的待发酵物的成熟醪液，然后分别加入实验组和对照组提供的酵母进行扩培发酵。
实验组：加入40kg实施例1-5所提供的酵母组合物作为实验组；
对照组1：单菌种超级酿酒高活性干酵母(该酵母属于酿酒酵母，购自安琪公司，其活细胞数为220亿个/克)。
对照组2：以55％的耐高温酿酒高活性干酵母，25％酸性蛋白酶，10％植酸酶以及10％木聚糖酶组成单酵母组合物。
将40kg实验组和对照组1和2的酿酒酵母组合物缓慢进料，进料速度大约为6-7m3/h，进料之前确保酒母罐是干净的，防止染菌。整个扩培过程中一直保持搅拌，扩培温度控制在28-30℃，前期保持通风，风速大约为30m3/h，扩培时间大约10-12h。
(2)分流：待实验组的酒母罐中的酵母组合物培养成熟后(即醪液的酵母细胞数达到1.6亿个/ml左右时)开始将酒母罐的酵母组合物往1号发酵罐分，分流的速度根据1号发酵罐中的酵母数和酒度来控制，一般1号发酵罐的酵母细胞数控制在2.5亿个/ml左右，酒度％(v/v)控制在5.0-6.0。发酵罐中具有待发酵的玉米作为原料。
(3)发酵：发酵罐的进出料速度主要是根据1号发酵罐来控制，每隔两小时检测各发酵罐中的发酵指标，然后调节1号发酵罐的进出料速度，确保发酵罐中的酒母细胞数在2.5亿个/ml左右，酒度％(v/v)控制在5.0-6.0。1号发酵罐的温度控制在30-32℃，与酒母罐的温差不要超过2℃。2-5号发酵罐的温度控制在32-34℃之间，后面发酵罐的温度一般要回落到32℃左右。
(4)检测：从酒母罐到发酵罐，每隔2小时就要取样进行酒精发酵的常规检测，一旦发现哪个数据不正常就要及时做出相应的调整，确保整个发酵过程顺利进行。对照组的试验条件与实验组相同，在此不再赘述。表4示出了实验组和对照组在玉米酒精连续发酵过程中的检测结果，此数据均为一个月的平均数据。
表4
Figure BDA0000128211080000061
从表4数据可以看出，与对照组1的单菌种超级酿酒高活性干酵母相比，双菌种酿酒酵母组合物可降低最终发酵醪液中的残还原糖、残总糖，过滤总糖，残淀粉和残糊精的含量，提高了原料利用率和出酒率，对照组与实施例的上述数据存在显著性差异的。与对照组2所提供的酵母组合物相比，双菌种酿酒酵母组合物表现出更好的发酵效果，本发明提供的双菌种酵母组合物具有显著的协同作用。
五、本发明提供的双菌种酿酒酵母组合物在纤维素(玉米秸秆)乙醇发酵中的应用
以下具体阐述了本发明提供的双菌种酿酒酵母组合物在纤维素(玉米秸秆)乙醇发酵中的应用及效果，仍然采用对照组1和对照组2所提供的酵母或酵母组合物作为对照：
具体操作如下：
称取200g处理好的玉米秸秆酶解液，放置在500ml的三角瓶中，然后分别加入0.1％(w/w)的对照组1的单菌种超级酿酒高活性干酵母、对照组2的酵母组合物与本发明实施例1-5提供的双菌种酿酒酵母组合物，搅拌均匀，用透气的棉塞塞住瓶口，最后放入32℃的培养箱中进行发酵，每隔一段时间称重，记录发酵过程中的失重情况，待失重趋于平衡时，说明发酵已经完全，检测指标见表5。
表5
Figure BDA0000128211080000071
以上数据为三组平行试验的平均数据
众所周知，纤维素水解后的产物包括纤维二糖、葡萄糖、木糖等多种糖，乳酸、甘油、乙酸以及乙醇都是发酵得到的产物。纤维素酒精发酵的主要目的在于得到乙醇，但发酵过程中也会产生乳酸、甘油、乙酸等其他副产物。同一水平下乳酸、甘油和乙酸含量越低，乙醇含量越高，说明所采用的酵母组合物越好。并且正如背景技术中所记载的，在以玉米秸秆为原料的纤维素乙醇发酵中，其所处的环境为酸性，并含有酚、醛类化合物，在此环境下，对照组1采用的单菌种超级酿酒高活性干酵母的适应性比较差。如表4所示，单菌种超级酿酒高活性干酵母在56小时后的总失重仅有1.8克，乙醇的含量仅达到了1.29g/100ml，对照组2提供的酵母组合物在在56小时后的总失重仅有5.2克，乙醇的含量仅达到了2.326g/100ml。本发明提供的双菌种酿酒酵母组合物可缩短发酵时间，从各个时间段的失重情况可以看出，达到相同的失重实施例明显比对照组需要的时间短，发酵速度越快，相同时间内的失重就越多，总的发酵时间就缩短，更彻底的利用原料，从而提高原料利用率和出酒率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种纤维素酵母，其特征在于，所述酵母的保藏号为CCTCC NO.：M2011324。
2.一种双菌种酿酒酵母组合物，其特征在于，所述酵母组合物包括48-63重量份的权利要求1所述的纤维素酵母，12-25重量份的耐高温酿酒高活性干酵母，5-20重量份的酸性蛋白酶，3-14重量份的植酸酶，以及1-5重量份的木聚糖酶。
3.根据权利要求2所述的酵母组合物，其特征在于，所述酵母组合物包括50-60重量份的所述纤维素酵母，16-25重量份的所述耐高温酿酒高活性干酵母，13-15重量份的所述酸性蛋白酶，8-10重量份的所述植酸酶，以及2-3重量份的所述木聚糖酶。
4.根据权利要求2所述的酵母组合物，其特征在于，所述酵母组合物包括55重量份的所述纤维素酵母，18重量份的所述耐高温酿酒高活性干酵母，15重量份的所述酸性蛋白酶，9.5重量份的所述植酸酶，2.5重量份的所述木聚糖酶。
5.根据权利要求2所述的酵母组合物，其特征在于，所述酵母组合物包括50重量份的所述纤维素酵母，25重量份的所述耐高温酿酒高活性干酵母，13重量份的所述酸性蛋白酶，9重量份的所述植酸酶，3重量份的所述木聚糖酶。
6.根据权利要求2所述的酵母组合物，其特征在于，所述酵母组合物包括60重量份的所述纤维素酵母，15重量份的所述耐高温酿酒高活性干酵母，14.5重量份的所述酸性蛋白酶，8.5重量份的所述植酸酶，2重量份的所述木聚糖酶。
7.一种纤维素乙醇的发酵方法，其特征在于，将权利要求2-6中任一项所述的酵母组合物进行扩培，将扩陪后的酵母组合物加入到发酵原料中进行发酵，制得乙醇。
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