CN1107722C - 汽爆秸秆固态发酵生产高活性纤维素酶的方法 - Google Patents

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本发明属于利用微生物生产纤维素酶的技术领域，特别涉及汽爆秸秆固态发酵生产高活性纤维素酶的方法。向发酵原料为80-95%经汽爆处理的秸秆和5-20%麸皮中加入无机盐溶液，其中，固液比以W/V计为1∶2-2.5，调pH值5-6；灭菌，接液体菌种，用密闭式压力脉动固态发酵反应器发酵；浸提发酵产物，上清液为高活性纤维素酶。本发明可生产高活性组分齐全的纤维素酶；其纤维素酶的β葡萄糖苷酶活接近于滤纸酶水平。

Description

汽爆秸秆固态发酵生产高活性纤维素酶的方法
本发明属于利用微生物生产纤维素酶的技术领域，特别涉及汽爆秸秆固态发酵生产高活性纤维素酶的方法。
纤维素酶解转化应用的最大障碍在于成本太高，纤维素酶制剂的成本是纤维质原料的五十倍。许多丝状真菌可以合成大量的胞外纤维素酶，被认为是最有希望投入实际生产的微生物菌群。象里氏木霉(Tricherma reesei)等丝状真菌，其胞外纤维素酶蛋白质已达30-40g/l，接近或已达到高产淀粉酶的胞外蛋白质浓度，似乎已无大幅度提高的可能。但这些工作多数是采用纯的纤维素粉，无机盐等配制而成的合成培养基，进行液态发酵。正如《发酵与生物技术杂志》(Chahal，P.S.，Chahal，D.S.，and Andre，G.，J.Ferment.Bioengng)，1992，74：126-128所指出的液态发酵存在着对培养基要求高，酶系不齐全和易造成环境污染等问题。而利用天然秸秆如麦草、玉米秸秆等，固体发酵纤维素酶得率低，并且所产纤维素酶的β葡萄糖苷酶活也很低。为了提高纤维素酶中的β葡萄糖苷酶活，在《酶与微生物技术》(Zhao，X.，et al.，Enzyme Microb.Technol.)，1993，15：62-68一文中报道了在纤维素酶的使用中，需要复配β葡萄糖苷酶活，或在纤维素酶的发酵过程中混合接种高产β葡萄糖苷酶活的菌株，但这样就增加了纤维素酶的生产成本，所以目前难于推广。
本发明的目的是克服现有技术存在的酶活低、组分不全、生产成本高、易染菌、生产不稳定的缺点；利用密闭式压力脉动固态发酵反应器，提供一种新的、廉价的汽爆秸秆固态发酵生产高活性纤维素酶的方法。
本发明的技术方案是：以汽爆处理的秸秆为主要培养料，按一定配方制成发酵用培养料，以斜卧青霉(Penicillium decumbensJUA10)为菌种，用密闭式压力脉动固态发酵反应器生产纤维素酶，所产生的纤维素酶酶活较高，组分齐全，滤纸酶活为53.0 IU/g干曲，β葡萄糖苷酶活51.1 IU/g干曲，生产稳定。而纤维素酶的浸提和纯化仍采用传统的酶提取纯化的方法，对于酶泥采用真空冷凝干燥。
本发明方法以重量百分比计，向发酵原料为80-95％经汽爆处理的秸秆和5-20％麸皮中加入无机盐溶液，制成发酵培养料，其中，固液比以W/V计为1∶2-2.5，无机盐溶液含(NH4)2SO4 1.5％，MgSO4 0.6％，KH2PO4 0.3％；调pH值5-6；灭菌，接液体菌种，将发酵培养料送入密闭式压力脉动固态发酵反应器中进行固态发酵；向固态发酵产物中加入pH值4.8的乙酸缓冲溶液浸提一段时间后，离心除去固形物，上清液为所得高活性纤维素酶。
所述的汽爆处理是将秸秆粗切至20-30mm长，再装入汽爆罐，于1.3-1.7Mpa的蒸汽压力下维压5-10分钟，瞬间减压释放即得汽爆料；所述的秸秆是指麦草、稻草或玉米秆；所述的以密闭式压力脉动固态发酵是指在0.05Mpa-0.25Mpa压力范围内，以15-60分钟为周期进行周期充压和泻压，培养温度28℃-32℃，发酵周期3.5-4.5天；所述的液体菌种为以10％麸皮浸汁(已灭菌)为培养基，接入斜卧青霉试管斜面种子30℃发酵24小时而成液体种子，接入量为相对于固体料重的7-12％；灭菌方法为常规蒸汽灭菌方式。
本发明所用压力脉动固态发酵反应器是一环行耐压容器。本发明纤维素酶的浸提和纯化可采用传统的酶提取纯化的方法，对于酶泥采用真空冷凝干燥。其是将95％乙醇和浸提酶液按1∶1比例混合，静止5小时后，压滤得滤饼；滤饼在50000-90000Pa下，35℃干燥24小时后，粉碎至60目。
本发明纤维素酶活测定按照国际化学会制定的方法。
汽爆秸秆固态发酵生产高活性纤维素酶的主要条件结论：
(1)本发明采用的蒸气爆碎处理技术，使秸秆中的半纤维素和木质素部分降解，以此利用汽爆秸秆作为纤维素酶固态发酵的主要原料，它既是营养物，膨松剂，又是纤维素酶的很好诱导物，因此，用汽爆秸秆作底物固态发酵与直接用碎麦草作底物相比，不仅使滤纸酶提高了2-5倍，而且使β葡萄糖苷酶活接近了FPA水平，免去了混合培养的麻烦和复配纤维素酶中的β葡萄糖苷酶成本，这样大大降低了高活性纤维素酶生产成本。
(2)密闭式压力脉动固态发酵方式不仅提高了纤维素酶的酶活，而且大大降低了染菌的几率，提高了固态发酵生产的稳定性
(3)不同纤维质原料对产酶的影响(培养箱发酵)：见表1。
                表.1 不同纤维质原料对产酶的影响
失重率％  滤纸酶活IU/g干曲  β-葡萄糖苷IU/g干曲
麦草 35.0  24.6  15.91
汽爆麦草 55.6  53.0  51.1
水洗汽爆麦草 51.7  50.2  43.0
乙醇萃取麦草 62.9  50.9  40.7
纸浆 61.7  53.2  37.9
(4)不同固态发酵方式对产酶的影响：见表2。
                    表2 不同固态发酵方式对产酶的影响
发酵时间(天) 失重率％ 滤纸酶活IU/g干曲 β-葡萄糖苷IU/g干曲
压力脉动固态发酵(浅盘) 4 64.5 61.6 60.8
培养箱(三角瓶) 4 53.6 52.4 50.1
保温发酵间(浅盘) 4 46.7 48.2 46.0
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
图1.本发明的工艺流程图。
实施例1：汽爆麦草固态发酵生产纤维素酶
1.汽爆麦草
将已粗切至约25mm长的麦草80kg装入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.5Mpa，维压10分钟，打开放料阀，瞬间减压释放即得汽爆麦草。
2.发酵用培养料的制备及灭菌
向发酵原料为90％汽爆处理的麦草和10％麸皮中加入无机盐溶液，制成发酵培养料，其中，固液比为1∶2.5，无机盐溶液含(NH4)2SO4 1.5％，MgSO4 0.6％，KH2PO40.3％，pH值为5左右。将发酵培养料分成几份用白棉布和纸包好放在大型灭菌锅中，在0.1Mpa压力下维持50分钟灭菌。
3.接种及装盘发酵
将已灭菌的培养料打散，在无菌室中接入已经准备好的斜卧青霉液体种子(以10％麸皮浸汁为培养基，30℃发酵24小时而成)，接种量为相对于固体料重的7％，混匀，装入已灭菌的不锈钢盘中，送入密闭式压力脉动发酵反应器中进行固态发酵，在0.05Mpa-0.20Mpa压力范围内，以15分钟为周期，进行周期充压和泻压，培养温度30℃，发酵周期4天。
4.酶液的制备
向固态发酵产物中加入相对于发酵产物重20倍的pH值4.8的乙酸缓冲溶液浸提5小时，离心除去固形物，上清液为纤维素酶液。
汽爆麦草固态发酵生产纤维素酶的滤纸酶活为59.7 IU/g干曲，β-葡萄糖苷酶活56.2 IU/g干曲。
实施例2：汽爆麦草固态发酵生产纤维素酶
1.汽爆麦草
将已粗切至约25mm长的麦草80kg装入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.7Mpa，维压5分钟，打开放料阀，瞬间减压释放即得汽爆麦草。
2.发酵用培养基的制备及灭菌
向发酵原料为80％汽爆处理的麦草和20％麸皮中加入无机盐溶液，制成发酵培养料，其中，固液比1∶2，无机盐溶液含(NH4)2SO4 1.5％，MgSO4 0.6％，KH2PO40.3％，pH值为6左右。将发酵培养料分成几份用白棉布和纸包好放在大型灭菌锅中，在0.1Mpa压力下维持50分钟灭菌。
3.接种及装盘发酵
将已灭菌的培养料打散，在无菌室中接入已经准备好的斜卧青霉液体种子(以10％麸皮浸汁为培养基，30℃发酵24小时而成)，接种量为相对于固体料重的10％，混匀，装入已灭菌的不锈钢盘中，送入密闭式压力脉动发酵反应器中进行固态发酵，在0.05Mpa-0.15Mpa压力范围内，以30分钟为周期，进行周期充压和泻压，培养温度30℃，发酵周期4天。
4.酶液的制备
向固态发酵产物中加入相对于发酵产物重20倍的pH值4.8的乙酸缓冲液浸提5小时，离心除去固形物，上清液为纤维素酶液。
汽爆麦草固态发酵生产纤维素酶的滤纸酶活为59.7 IU/g干曲，β-葡萄糖苷酶活56.2 IU/g干曲。
实施例3：汽爆玉米秸秆固态发酵生产纤维素酶
1.汽爆玉米秸秆
将已粗切至约30mm长的玉米秸秆80kg装入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.7Mpa，维压5分钟，打开放料阀，瞬间减压释放即得汽爆玉米秸秆。
2.发酵用培养基的制备及灭菌
向发酵原料为80％汽爆处理的玉米秸秆和20％麸皮中加入无机盐溶液，制成发酵培养料，其中，固液比1∶2，无机盐溶液含(NH4)2SO41.5％，MgSO4 0.6％，KH2PO40.3％，pH值为5.5左右。将发酵培养料分成几份用白棉布和报纸包好放在大型灭菌锅中，在0.1Mpa压力下维持50分钟灭菌。
3.接种及装盘发酵
将已灭菌的培养基打散，在无菌室中接入已经准备好的斜卧青霉液体种子(以10％麸皮浸汁为培养基，30℃发酵24小时而成)，接种量为相对于固体料重的12％，混匀，装入已灭菌的不锈钢盘中，送入密闭式压力脉动发酵反应器中进行固态发酵，在0.05Mpa-0.15Mpa压力范围内，以60分钟为周期，进行周期充压和泻压，培养温度30℃，发酵周期4天。
4.酶液的制备
向固态发酵产物中加入相对于发酵产物重20倍的pH值4.8的乙酸缓冲液浸提5小时，离心除去固形物，上清液为纤维素酶液。
汽爆麦草固态发酵生产纤维素酶的滤纸酶活为62.0 IU/g干曲，β-葡萄糖苷酶活58.6 IU/g干曲。

Claims (6)

1.一种汽爆秸秆固态发酵生产高活性纤维素酶的方法，其特征在于该方法以重量百分比计，向发酵原料为80-95％经汽爆处理的秸秆和5-20％麸皮中加入无机盐溶液，制成发酵培养料，其中，固液比以W/V计为1∶2-2.5，无机盐溶液含(NH4)2SO4 1.5％，MgSO4 0.6％，KH2PO4 0.3％，调pH值5-6；灭菌，接液体菌种，将发酵培养料送入密闭式压力脉动固态发酵反应器中进行固态发酵；向固态发酵产物中加入pH值4.8的乙酸缓冲溶液浸提一段时间后，离心除去固形物，上清液为所得高活性纤维素酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的汽爆处理是指在汽爆罐中装入粗切的秸秆，于1.3-1.7Mpa的蒸汽压力下维压5-10分钟，瞬间减压释放。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的秸秆是指麦草、稻草或玉米秆。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的菌种为斜卧青霉。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的以密闭式压力脉动固态发酵是指在0.O5Mpa-0.25Mpa压力范围内，以15-60分钟为周期进行周期充压和泻压，培养温度28℃-32℃，发酵周期3.5-4.5天。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的液体种子接种量为相对于固体料重的7-12％。
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