CN103930554A - 控制乙醇生产中的细菌生物膜 - Google Patents

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Abstract

一种用于使碳水化合物发酵成乙醇以及预防和/或破坏生物膜的高产方法，包括：a)将发酵原料与含有酵母和/或酶的发酵液混合；b)通过将一种组合物添加到发酵罐中来处理所述混合物，所述组合物含有：10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、另一种抗菌醛，及它们的混合物组成的组；1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；0～20wt％的抗菌萜烯或精油；1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自Ci～C24脂肪酸、Ci～C24脂肪酸盐、Ci～C24脂肪酸甘油酯及Ci～C24脂肪酸酯；以及1～50wt％的水；其中，所述发酵罐中的醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料；以及c)分离乙醇。

Description

控制乙醇生产中的细菌生物膜
技术领域
一种用于生产乙醇的改进的方法，所述方法通过在整个发酵工艺中用一种含有醛、脂肪酸、萜烯和表面活性剂的组合物来处理碳水化合物材料、碳水化合物肉汤或碳水化合物浆料。通过控制发酵系统中生物膜的形成和破坏预存在的生物膜来提高乙醇产量。
背景技术
高油价已带来对可再生燃料的寻找的增长。乙醇是这些可再生燃料之一，当与汽油混合时乙醇可以降低对进口油的需求。
2009年，可再生燃料标准(Renewable Fuels Standard，RFS)倡导将111亿加仑的乙醇和其它生物燃料混入到美国汽车燃料市场中以满足未来需求。这将增加工业上对玉米的需求量，而且同样要求种植能力增加。在2010年，美国一年的营运能力增加了27亿加仑，比2007年的水平增长了34％。
乙醇是一种颇具前景的来自于可再生资源的生物燃料，由谷物(玉米、高粱、小麦、黑小麦(triticale)、黑麦、发芽大麦、水稻)、块茎作物(马铃薯)的淀粉来生产或直接使用糖蜜、甘蔗汁或糖用甜菜汁中的糖来生产。乙醇也可通过纤维素类材料(柳枝稷、松树)的发酵来生产。通过使用植物材料的高温去木质素作用和使用酶和特殊酵母(所述酶和特殊酵母可以使用C-5糖并将它转化成C-6糖或乙醇)，目前来自草或蔗渣的乙醇是商业可购的。因为将硬木转化成易于使用的材料的成本高，所以木材(即松树)的使用仍处于起步阶段。
世界上80％的乙醇由巴西和美国生产。其中的60％是通过玉米或甘蔗汁的酵母发酵来生产。通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)而进行碳源的厌氧发酵来生产乙醇是最著名的生物技术工艺之一并且每年为全球提供超过350亿升的乙醇(Bayrock2007)。
由谷物生产乙醇是从淀粉的水解开始，淀粉的水解使直链淀粉(大部分为直链的α-D-(l-4)-葡聚糖)和支化的支链淀粉(在分支点处具有α-D-(1-6)连接部分的α-D-(1-4)-葡聚糖)转化为可发酵的糖，随后通过酵母(Majovic，2006)或细菌(Dien，2003)将该可发酵的糖转化为乙醇。细菌可以将含纤维素材料转化成用于生产乙醇的可发酵的糖，这些细菌包括：发酵单胞菌(Zymomonasspp.)、基因工程化的大肠杆菌(E.coli)、产酸克雷伯式菌(Klebsiella oxytoca)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、解纤维素醋弧菌(Acetivibriocelluloyticus)等(Dien，2003)。来自甘蔗的乙醇不需要使用酶，因为酵母易于将蔗糖转化成乙醇和CO2。
在美国，干磨和湿磨是用于由谷物制备乙醇的两个基本工艺。在干磨工艺中，将整个玉米(Zea mays)粒或其它淀粉质材料研磨成粉并与水混合以形成浆料。然后将混合物煮熟以使淀粉糊化并降低细菌污染。然后将该混合物冷却并转移到发酵罐中，将酵母和酶添加到该发酵罐中以将糖转化成乙醇。发酵后，将所得混合物转移到蒸馏塔中，在蒸馏塔中分离乙醇。将发酵和乙醇分离后残留的固体加工成具有可溶物的玉米干酒糟(Distiller’s Dried Grains withSolubles，DDGS)，所述干酒糟用于动物生产，例如家禽、猪和牛的饲料。当今80％以上的乙醇产量采用干磨工艺(RFS，2006)。
在湿磨工艺中，将谷物浸没或浸渍在水中以促进谷物分离成其基础营养组分，例如玉米胚芽、纤维、麸质和淀粉。浸渍后，通过一系列研磨器处理玉米浆料并分离各组分。过滤麸质组分并干燥以产生玉米蛋白粉(Core Gluten Meal，CGM)，它是一种在动物生产中用作饲料成分的高蛋白产品。随后，来自玉米浆料的淀粉和任何剩余的水用以下三种方式之一处理：发酵成乙醇，干燥并作为干燥的或改性的玉米淀粉出售，或者加工成玉米糖浆(RFS，2006)。湿磨和干磨两种工艺都是仅将玉米粒的淀粉部分用于乙醇生产。剩余的蛋白质、脂肪、纤维和其它营养组分留作动物饲料。
绕开传统的淀粉糊化条件，一种称为原淀粉水解的工艺将淀粉转化为随后发酵成乙醇的糖。在糖化/发酵中所使用的酶是真菌α-淀粉酶和葡糖淀粉酶(淀粉葡糖苷酶)(Thomas，2001)。这样的同时糖化和发酵可使较高浓度淀粉发酵并产生较高含量的乙醇(Maye，2006)。
甘蔗(sugar cane或“saccharuk officinarum”)，是用于可再生能源生产的最廉价的原料。比较甘蔗和玉米，甘蔗可产生5000～7000升/公顷/年的乙醇，而玉米的乙醇产量为3000升/公顷/年(Lee和Bressa，2006)。巴西和印度是由甘蔗生产乙醇的主要生产者。在甘蔗领域，生产过程开始于培育和收割甘蔗。然后在糖/乙醇研磨厂中处理甘蔗，其中，用酸化水洗涤甘蔗杆，然后将其切碎并压碎以提取甘蔗汁。可将蔗渣(它是提取甘蔗汁后产生的甘蔗)用于产生蒸汽并在工厂内发电或出售给公用电网。在其它研磨厂中，可将来自蔗渣的纤维素用于生产乙醇。在甘蔗汁被提取后，通过使用酵母作为催化剂的发酵工艺来将蔗渣转变成酒精。与使用谷物发酵的72小时相比，来自甘蔗的糖可易于获得酵母，所以发酵仅需要4～12小时。使用开放或封闭的发酵槽可以分批或连续地进行发酵。发酵后，从其它副产物中蒸馏甘蔗乙醇，从而产生约95％的纯度。
另一个生产乙醇的来源是甜菜(sugar beet或“beta vulgaris”)。甜菜可以被贮存一至三天，这取决于贮存的温度和方法，然而，由于糖损失，甘蔗必须在收割后立即进行处理。在由甜菜生产糖期间，将甜菜切片可能会导致一些糖经过分解成为转化糖，然后转化成酸，从而降低糖产量。为了降低细菌作用，使用甲醛(50～100ppm)和pH调节是已知的。此方法仅用于糖生产期间，而不用于糖和酒精生产的组合过程中。Arvanitis等人(2004)提出了使用甲醛或其它成本有效的消毒剂以控制由细菌所产生的葡聚糖。葡聚糖抑制糖的结晶。它还提出了如果甜菜被长期储存就控制细菌以保持糖含量。然而，所有的实验数据是来自7天的研究。由于细菌污染和葡聚糖产生，甜菜的贮存引起糖含量下降。参考文献教导了使用3.7％甲醛来更长时间地储存甜菜以预防由甜菜所生产的糖中细菌污染。没有提出使用更浓缩的甲醛(Arvantis等人使用3.7％而不是37％)用于由甜菜来生产乙醇。使用甲醛的MIC为25～500mg/lt。如果工作溶液为3.7％，那么甲醛的添加量仅为0.925mgr(25mg/lt*0.037)～18.5mgr(500mg/lt*0.037)。
从燃料乙醇发酵中已分离出多种革兰阳性和革兰阴性细菌，包括乳杆菌属(Lactobacillus)、小球菌属(Pediococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)和梭菌属(Clostridium)的种类(Bischoff，2009)。几乎三分之二的所分离的细菌属于乳酸细菌，例如乳杆菌(Skinner，2007)。在甘蔗中，已报道了明串珠菌负面影响乙醇产量。在乙醇发酵期间碳水化合物浆料的污染导致a)乙醇产量降低，b)碳水化合物产生丙三醇和乳酸的渠道增多，c)可发酵的糖耗尽后酵母活性迅速丧失，和d)污染的乳杆菌已生长到较高数目的玉米浆料中酵母的增殖降低(Thomas，2001)。
在由Skinner和Leathers(2004)进行的一项调查中，在湿磨工艺中44～60％的污染物被鉴定为乳杆菌属。在干磨工艺中，37～87％的污染物被鉴定为乳杆菌属。在美国，关于玉米类的工厂中细菌污染物的另一份调查发现，湿磨设备中的细菌载量为约106cfu/mL玉米浆料，而干磨设备中细菌载量可达到108cfu/mL玉米浆料(Bischoff，2007；Chang，1997)。
在106～107cfu/mlml玉米浆料的范围内的乳杆菌属污染可以使乙醇产量降低1～3％。在工业中，即使用活性细菌控制程序来控制乳杆菌属的增殖，因乳杆菌属的碳水化合物损失也能造成盈利能力和非盈利能力之间的差异(Bayrock，2007)。乳杆菌属不仅耐受低pH、高酸度和相对高浓度的乙醇，而且它们在酒精发酵的条件下也能繁殖(Thomas，2001)。细菌污染物竞争酵母所需要的生长因子，并且还产生抑制酵母的副产物，特别是乳酸和乙酸。
发酵期间，乳杆菌副产物即乙酸和乳酸的存在影响酵母生长和代谢，且已将其视为停滞发酵或缓慢发酵的原因之一(Thomas，2001)。若玉米浆料的乳酸含量达到0.8％和/或乙酸浓度超过0.05％，则生产乙醇的酵母被抑制(Bayrock，2007)。乳杆菌会抑制酵母细胞，该酵母细胞释放营养物，尤其是刺激细菌生长的氨基酸和肽(Oliva-Neto，2004)。甜菜糖蜜分批发酵中，浓度为8g/L的乳酸使酵母活性降低95％以及乙醇的生产率降低80％(Bayrock，2001)。
在pH控制操作4天后，乙醇发酵中乳杆菌的存在可使乙醇产量降低44％。这与副干酪乳杆菌(L.paracasei)增多到>1010cfu/ml和乳酸浓度增大四倍到20g/L一致。可以看出，乙醇、乳酸和乙酸的浓度分别为70、38和7.5g/L时，酵母密度降低80％(Bayrock，2001)。
De Oliva-Neto和Yokoya(1994)评估了细菌污染对分批进料的酒精发酵工艺的影响。他们发现，在分批进料工艺中，发酵乳杆菌(L.fermentum)强烈抑制市售面包酵母(baker's yeast)。当总酸(乳酸和乙酸)超过4.8g/L时，将干扰酵母芽的形成和活性，当超过6g/L时，使酒精效率降低。
其它研究表明：a)在通过酵母生产最终乙醇中，106个乳杆菌/mL玉米浆料导致乙醇降低约1％v/v(Narendranath，2004)，b)用玉米浆料中108cfu/mL发酵乳杆菌挑战发酵系统，使乙醇产量降低27％且使残余葡萄糖由6.2g/L增大到45.5g/L(Bischoff，2009)，c)使用105cfu/mL乳杆菌使乙醇产量降低8％且残余葡萄糖增加3.2倍(Bischoff，2009)。
取决于收割、储存和环境条件，甘蔗可能遭受明串珠菌劣化，明串珠菌劣化导致乙醇产量的降低和葡聚糖(葡萄糖多糖)形成的增加，这抑制了糖的结晶。明串珠菌也存在于甜菜工艺中(Eggleston等人，2008)。
发酵槽/液化(liquidfication)槽的条件最适于细菌生长。污染通常源自碳水化合物材料的收割。清洗该材料可以帮助降低污染程度(Mayes，2006)。控制细菌的其它方法包括：添加更多的酵母培养基、严格清洗和消毒、对被指定再使用的酵母进行酸洗和在发酵期间使用抗生素(Hynes，1997)。当用1×108个乳杆菌/mL感染玉米浆料时，增大的酵母接种速率3×107cfu/mL玉米浆料使植物乳杆菌(L.plantarum)产生的乳酸降低80％以上且使副干酪乳杆菌产生的乳酸降低55％以上(Narendranath，2004；Bischoff，2009)。
目前，维吉尼霉素是唯一已知用于干磨工厂的抗生素(Bischoff，2007)。燃料乙醇发酵中维吉尼霉素的推荐剂量一般为0.25-2.0ppm(Bischoff，2009)，但最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)在0.5至大于64ppm之间变化(Hynes，1997)。
在实验室条件下，针对细菌污染物的控制对多种试剂进行了测试，包括防腐剂，例如过氧化氢、焦亚硫酸钾和3,4,4'-三氯二苯脲，和抗生素，例如青霉素、四环素、莫能菌素(monensin)和维吉尼霉素(virginiamycin)。现今市场上销售青霉素和维吉尼霉素，用来处理燃料乙醇发酵的细菌感染，而且一些设备预防性地使用这些抗生素(Skinner，2004)。
若不使用抗生素，则乙醇产量通常损失1～5％。以啤酒槽(distiller's beer)中乳酸含量为0.3％w/w运行的五千万加仑燃料乙醇厂，每年因细菌污染损失约570000加仑乙醇(Maye，2006)。抗生素不存在时，在48小时发酵期间细菌数由1×106cfu/mL增加到6×l06cfu/mL，并产生5.8mg乳酸(Hynes，1997)。
一种细菌控制程序使用维吉尼霉素。维吉尼霉素的一些特征是：a)在低浓度(例如0.3～5ppm)下，它可有效对抗包括乳杆菌属在内的许多微生物，b)微生物没有产生抗性的趋势，c)它没有明显抑制酵母，d)它不受pH或乙醇浓度的影响，和e)它在乙醇蒸馏期间失活，因此乙醇或酒糟中没有残留物(Bayrock，2007；Narendranath，2000；Hynes，1997)。从使用维吉尼霉素的干磨乙醇设备中分离的乳杆菌属中已经观察到对维吉尼霉素易感性的降低，且也已报导出现了对青霉素和维吉尼霉素二者具有多药物抗性的分离物(Bischoff2009)。
在乙醇发酵工艺中，发酵乳杆菌可被浓度为1～10mM的过氧化氢选择性控制(Narendranath，2000)。乳杆菌不含过氧化氢酶，因此其不能分解过氧化氢，因此不能消除其毒性效应(Narendranath，2000)。
已经使用过氧化脲(Urea Hydrogen Peroxide，UHP)作为防腐剂，局部施用于伤口和抵抗牙龈炎及牙菌斑(Narendranath，2000)，在发酵期间亦可用作抗菌剂。UHP不仅对乳杆菌呈现出良好的杀菌活性，而且还具有一个重要的好处：提供呈脲形式的可利用的氮来刺激酵母生长和发酵速率(Narendranath，2000)。
控制细菌污染的其它方法包括使用亚硫酸盐。亚硫酸盐仅在氧存在下证明具有杀菌活性，以及对杀死兼性干酪乳杆菌(L.casei)更有效，而兼性干酪乳杆菌具有高含量的过氧化氢相关酶，包括过氧化物酶(Chang，1997)。当亚硫酸盐的浓度介于100～400mg/L之间，但仅在氧存在下时，细菌载量亦有所降低。该浓度不影响酵母种群(Chang，1997)。
一种存在于酵母培养基上清液中的试剂降低乳杆菌属的生长。该化合物尚未被表征，尽管已知其耐冻，在高温下不稳定且当在90℃下保持20分钟时被破坏(Oliva Neto2004)。
琥珀酸自身含量为600mg/L时，使乳杆菌浓度降低78％，在乙醇存在下，使乳杆菌浓度降低高达96％(Qliva-Neto2004)。
已开发出一种在发酵罐中使用的微生物粘附抑制剂，其呈禽卵抗体形式且对产生乳酸的微生物具有特异性(Nash2009)。
实验室研究已表明，抗体、亚硫酸盐和过氧化物产品有利于控制乳杆菌属，但采用这些产品的问题是，由于这些化学品的氧化和分解造成浓度降低，这将需要恒定监测整个发酵过程以保持有效浓度。
美国专利号7955826提出使用单萜和表面活性剂来提高乙醇的生产。单萜烯是d-柠檬烯。将该组合物添加到发酵介质中，使得降低对清洗的要求。该组合物是添加至0.1～1000ppm的含量的水/油乳液。还提出，提高酵母的活性，并且将它添加到玉米发酵介质中，该乳液含有1～70％的d-柠檬烯、0.2～25％的表面活性剂和余量的水。
为了预防甘蔗劣化，可用8.6ppm的乳链菌肽(Nisin)和0.1％的吐温20的组合来使乳杆菌的滞后期延迟12小时(Franchi等人，2006)。10ppm的Kamoran(莫能菌素的商品名)或青霉素10ppm与四环素的混合物的使用已被用于预防甘蔗劣化(Payot，2004)。在相关研究中，在五种市售抗菌产品中，只有两种含有甲醛(3.7％)或季铵-异丙醇(3.5％)表现出对抗甘蔗设施中乳酸菌的相似效果(Arvanitis等人，2004)。
在使用维吉尼霉素的干磨燃料乙醇工厂中，在发酵系统周围发现发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的六个菌株、约氏乳杆菌(L.johnsonii)的两个菌株以及粘膜乳杆菌(L.mucosae)和淀粉乳杆菌(L.amylovorus)的一个菌株。据认为，生物膜在乙醇生产设施中污染物的持久性方面起作用(Rich等人2011)。
尽管通过对糖化槽和连续的酵母增殖系统进行清洗和消毒来努力预防污染，生物膜还能作为连续重新引入污染物的细菌储存器(Bischoff，2009)。生物膜可以出现在许多地方；例如，在人体中，它们出现在牙龈、牙齿、和耳朵，并且是造成那个区域感染的原因。生物膜细胞被组织成封闭在细胞外物质的基质中有结构的群落。它们表型不同于浮游细胞或悬浮细胞。它们抵抗宿主防御并表现出对抗菌剂的易感性降低(Berit等人，2002)。磨损或划伤的受损线路或管道创造了有机体能够容易附着的表面。在饮用水和机械中，尤其在管道中，生物膜是许多自由浮动的细菌的来源。一旦细菌定植，它们开始形成保存水的糖萼基质，从而制造胶状一致且湿滑一致的膜。这种凝胶状膜围绕微生物细胞并且可以充当对抗消毒剂和抗菌剂的渗透的屏障(Perez-Conesa等人2006)。在Davey和O’Toole(2000)中可以发现微生物生物膜的综述。
几项美国专利描述控制生物膜的产品。US6830745教导了使用一对酶系统，其中一个破坏生物膜结构而另一个具有杀菌作用。US8012461教导了生物膜去除剂，该生物膜去除剂含有卤化季盐表面活性剂和溴离子源的水性溶液。US7165561公开了在错流过滤系统中降低并抑制生物膜生长的酶和表面活性剂。美国公开申请号2011/0123462公开了使用不饱和长链醇和/或醛用于生物膜的破坏，该溶液含有0.005％～5％的活性成分，优选0.05％和22％的乙醇和77％的水。
从切割甘蔗或甜菜一直到最终产品，在整个发酵系统中，控制生物膜的形成是非常重要的。在乙醇发酵的所有这些步骤期间都可以使用本发明。在甘蔗的情况下，可以将本发明的组合物添加到切割和压碎甘蔗后所得到的第一甘蔗汁中。可以将本发明用于将甘蔗汁转移到冷却区期间。可以将本发明用于在进入发酵容器之前混合甘蔗汁以得到合适的糖浓度的时侯。可以将本发明用于将甘蔗汁或与酵母肉汤组合填充到发酵容器的时候。可以使用具有相同结果(即通过控制生物膜所提高的乙醇产量)的添加本发明的其他添加点。本发明能够预防生物膜的形成以及破坏已建立的生物膜。
参考文献
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发明内容
本发明的一个目的是提供一种化学组合物，所述化学组合物在乙醇生产期间通过降低或不允许细菌建立在固体表面上来预防和/或破坏生物膜形成。
另一个目的是一种在发酵罐中使碳水化合物发酵成乙醇的高产方法，包括：
a)将发酵原料与含有酵母和/或酶的发酵液混合；
b)通过将一种组合物添加到所述发酵罐中来处理所述混合物，所述组合物含有：
10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、另一种抗菌醛，及它们的混合物组成的组；
1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
0～20wt％的抗菌萜烯或精油；
1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
1～50wt％的水；
其中，所述发酵罐中醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料；以及
c)分离乙醇
另一个目的是提供一种发酵液或发酵浆料，包括：
a)待发酵的碳水化合物原料、酵母和/或酶；以及
b)一种处理组合物，含有：
10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、另一种抗菌醛及它们的混合物组成的组；
1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
0～20wt％的抗菌萜烯或精油；
1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
1～50wt％的水；
其中，醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料。
另一个目的是提供一种用于在发酵罐中使碳水化合物发酵成乙醇的改进的方法，包括：
a)将发酵原料与含有酵母和/或酶的发酵液混合；
b)通过将一种组合物添加到所述发酵罐中来处理所述混合物，所述组合物含有：
10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、另一种抗菌醛，及它们的混合物组成的组；
1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
0～20wt％的抗菌萜烯或精油；
1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
1～50wt％的水；
其中，所述发酵罐中醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料，以及
c)分离乙醇；
d)收集发酵后剩余的材料并将所述发酵后剩余的材料添加到动物饲料中。
本发明的另一个目的是提供一种用于在乙醇生产的整个工艺过程中通过将一种组合物添加到液体浆料或可发酵的肉汤中来预防生物膜形成的方法，所述组合物包括：
a)10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、其它抗菌醛，及它们的混合物组成的组；
b)1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
c)1～20wt％的抗菌萜烯或精油；
d)1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
e)1～50wt％的水，
其中，在所述发酵罐中醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料。
本发明的另一个目的是提供一种用于通过将一种组合物添加到液体浆料或可发酵的肉汤中来破坏在乙醇生产所使用的整体设备上已建立的生物膜的方法，所述组合物包括：
a)10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、其它抗菌醛，及它们的混合物组成的组；
b)1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
c)1～20wt％的抗菌萜烯或精油；
d)1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
e)1～50wt％的水，
其中，在所述发酵罐中醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料。
本发明的另一个目的是通过将一种组合物添加到发酵系统中来减少在碳水化合物的发酵过程中抗生素和硫酸的使用，所述组合物包括：
a)10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、其它抗菌醛，及它们的混合物组成的组；
b)1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
c)1～20wt％的抗菌萜烯或精油；
d)1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
e)1～50wt％的水，
其中，在所述发酵罐中醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料。
本发明的另一个目的是减少在所产生的碳水化合物发酵的副产物(例如酒糟(distilled grains)、蒸馏的玉米麸质等)中存在的抗生素。
另一个目的是通过给动物喂食由不是抗生素处理的而是本发明处理的底物所得到的发酵副产物来减少动物产品中的抗生素残留物。
另一个目的是抑制发酵期间出现的细菌的耐抗生素菌株的发育。
另一个目的是增加来自已发酵的碳水化合物的乙醇的产量。
另一个目的是通过减少硫酸和酵母预洗的使用以降低细菌含量来提高酵母活性。
具体实施方式
定义
组分的“重量百分比”(wt％)是基于其中包含该组分的配方或组合物的总重量。
“醛”包括甲醛、多聚甲醛和其它灭菌醛。
“有机酸”包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和其它C1至C24脂肪酸，或者C1至C24有机脂肪酸的单、二或三甘油酯或它们的烷基酯。
“抗菌萜烯”可包括烯丙基二硫化物、柠檬醛、蒎烯、橙花醇、香叶醇、香芹酚、丁香酚、香芹酮、茴香脑、樟脑、薄荷醇、柠檬烯、法尼醇、胡萝卜素、麝香草酚、冰片、香叶烯、萜品烯、沉香醇，或它们的混合物。更具体而言，萜烯可包括烯丙基二硫化物、麝香草酚、柠檬醛、丁香酚、柠檬烯、香芹酚和香芹酮，或它们的混合物。所述萜烯组分可包括其它具有抗菌性质的萜烯和精油。
可干扰乙醇发酵的细菌包括乳杆菌属和明串珠菌属(Leuconostoc spp.)，这些细菌致使产生大多数问题。其它这样的细菌包括小球菌属(Pediococcus spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、枯草芽孢杆菌属(Bacillus spp.)和梭状芽胞杆菌属(Clostridia spp.)，以及降低发酵效率的其它细菌。
在由玉米生产乙醇中，抗生素是常见的杀菌剂，例如维吉尼霉素、青霉素、克林霉素(clindamycin)、泰乐菌素(tylosin)、氯霉素(chloramphenicol)、头孢菌素(cephalosporin)和四环素。然而，因为当由甘蔗生产乙醇时最终产品不被喂给动物，所以可以使用其它杀菌剂，因为残留物不会出现同样的问题。在此等情况下，适宜的杀菌剂包括氨基甲酸酯、季铵化合物、苯酚和抗生素(例如，维吉尼霉素、青霉素、克林霉素、泰乐菌素、氯霉素、头孢菌素和四环素)。
术语化合物的“有效量”意指能实现有效量所表达的作用或特性的量，例如无毒但足以在生物膜预防剂或破坏剂中提供抗菌益处的量。因而，有效量可由本领域普通技术人员根据常规实验确定。
配方不但在主要组分(例如醛和有机酸)的浓度方面而且在萜烯类型、表面活性剂和水浓度方面有所变化。本发明可通过添加或去除萜烯、有机酸的种类和使用其它类型的表面活性剂做出改变。
组合物
一般而言，本发明的组合物含有：
a)10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、其它抗菌醛，及它们的混合物组成的组；
b)1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
c)1～20wt％的抗菌萜烯或精油；
d)1～50wt％的有机酸或有机酸的混合物，所述有机酸或有机酸的混合物选自乙酸、丙酸、丁酸或其它C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐形式、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
e)1～50wt％的水。
在本发明的组合物中可使用抗菌萜烯、含有萜烯的植物提取物或精油以及更纯的萜烯。萜烯在市场上容易买到或者可通过本领域已知的方法制备，例如溶剂提取或蒸气提取/蒸馏或化学合成。
表面活性剂是具有通常在平均值左右分布的1～200个乙烯分子的乙氧基化蓖麻油的非离子表面活性剂，优选平均值为10～80。可使用具有类似特征的其它表面活性剂，包括聚山梨醇酯表面活性剂。
方法
本发明可有效抵抗细菌和细菌生物膜。这些感染剂的实例包括大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、梭状芽孢杆菌属、弯曲杆菌属(Campylobacterspp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、短螺菌属(Brachyspira spp.)、李斯特菌属(Listeria spp.)、弓形杆菌属(Arcobacter spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus)、小球菌属(Pediococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、巴斯德醋杆菌(A.pasterurianus)、枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)等。
通过喷嘴来应用本发明的混合物。
通过与可溶性载体混合来将本发明的混合物应用到可发酵的碳水化合物。
通过混合到淀粉类载体中来将本发明的混合物应用到可发酵的碳水化合物。
在添加到可发酵的碳水化合物之前，将本发明的混合物与液体载体或固体载体混合。
将本发明的混合物逐滴应用在发酵液或发酵浆料上。
通过内联注射(inline injection)来将本发明的混合物应用到发酵液或发酵浆料。
在由甘蔗生产糖和乙醇期间，将本发明的混合物应用于任何或所有可处理区域。
在由甜菜生产糖和乙醇期间，将本发明的混合物应用于任何或所有可处理区域。
在由玉米、其它淀粉质或纤维素质材料生产糖和乙醇期间，将本发明的混合物应用于任何或所有可处理区域。
应用上述混合物以向整个碳水化合物底物提供均一且均质的分布。
在整个本说明书中参照多个专利和出版物。每个文件的公开内容以引用方式整体并入本文中。
实施例1
该实施例示出在随后实施例中所使用的基础配方“A”产品
实施例2
该研究的目的是确定制剂“A”对乳杆菌存活的影响。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(B-4496)得自伊利诺斯州的美国农业部微生物基因组学和生物过程研究所(USDA-Microbial Genomics and BioprocessingResearch)。植物乳杆菌在DifcoTM乳杆菌属MRS(Mati-Rogosa-Sharpe)肉汤中生长。该肉汤培养基用无菌蛋白胨水稀释以得到不同浓度的乳杆菌。各稀释液用不同浓度的制剂A(0、1、2和3kg/MT)处理并在室温(20℃)下培养24小时。培养后，取样一式三份，并接种在含有1.5％DifcoTM琼脂颗粒状凝固剂(AgarGranulated solidifying agent)的MRS肉汤培养基上。在菌落计数前将培养皿在37℃下培养24小时。每一处理的平均cfu/mL值皆示于表2中：
观察到，使用2kg/MT的制剂“A”消除了含107cfu/ml的乳杆菌的培养基中乳杆菌的生长。
实施例3
该研究的目的是确定在发酵期间制剂“A”对酵母和乳杆菌存活的影响。将无菌的、磨细的玉米与无菌水在玻璃发酵罐中混合。接着，添加用于处理未蒸煮的淀粉的、含有α-淀粉酶和葡糖淀粉酶掺合物的市售酶溶液(Stargen:Genencor)。一边混合一边向玉米浆料混合物中添加用作发酵酵母的活性干酵母(Fali Yeast)(1010cfu/g；Fleischmann)。最后，将得自伊利诺斯州的美国农业部微生物基因组学和生物过程研究所并在DifcoTM乳杆菌属MRS肉汤中生长的植物乳杆菌(B-4496)，用作发酵罐的代表性细菌污染物。以1Kg/MT的剂量来添加制剂“A”作为发酵工艺开始前的最后步骤。对在4h、24h、48h、72h和96h时取样的液相的样品进行分析酵母和乳杆菌计数。结果示于下面的表中：
观察到，1kg/吨的甲醛类产品降低了乳杆菌的含量，但不影响酵母的含量。
实施例4
本研究的目的是确定制剂“A”的改变是否产生与前面的实施例相似的益处。发酵溶液不含乳杆菌。如表5中所述对制剂“A”进行修改。进行此实施例以模拟甘蔗发酵。
将100ml的12％无菌蔗糖溶液、10ml的酵母(106cfu/ml)和25ul的各种配方添加到250ml的玻璃发酵罐中，并且培养24小时。培养后，对样品取样用于测定乙醇的产量。结果示于表6中。
当在发酵期间不存在细菌竞争时，在除制剂A外的所有处理中，乙醇的浓度是相似的。
实施例5
本研究的目的是确定制剂“A”的改变是否产生与前面的实施例相似的益处。在本实施例中，将乳杆菌添加到发酵罐中以模拟自然存在的乳杆菌。使用与实施例4相同的制剂。将100ml的12％无菌蔗糖溶液、10ml的酵母(106cfu/ml)和25ul的各种制剂添加到250ml的玻璃发酵罐中，并且培养24小时。培养后，对样品取样用于测定乙醇产量以及酵母和乳杆菌。结果示于表7中。
观察到，当发酵持续24小时，在细菌竞争存在下，制剂A、B和C使乙醇产量的数值提高。
实施例6
本研究的目的是确定制剂“A”的改变是否产生与前面的实施例相似的益处。在本实施例中，将乳杆菌添加到发酵罐中以模拟自然存在的乳杆菌。使用与实施例4相同的制剂。将100ml的12％无菌蔗糖溶液、10ml的酵母(106cfu/ml)和25ul的各种制剂添加到250ml的玻璃发酵罐中，然后培养18小时。培养后，对样品取样用于测定乙醇产量以及酵母和乳杆菌。结果示于表8中。
观察到，当发酵持续18小时，在细菌竞争存在下，制剂D使乙醇产量提高。
实施例7
此实施例的目的是确定使用制剂“A”对生物膜的破坏的影响，其中，使用乳杆菌作为形成生物膜的细菌。以0.5或1Kg/MT的剂量添加制剂“A”。如下制备生物膜的形成：
在96孔聚苯乙烯培养皿中：将100μl的营养肉汤中乳杆菌培养基添加到每个孔中并且在厌氧室中37℃下培养48小时。培养后，用蒸馏水将培养皿洗涤5次并且吸干。干燥后，将100ul的制剂“A”添加到孔中，在厌氧室中37℃下培养4小时或24小时，并然后用蒸馏水洗涤5次。吸干后，添加30μl的1％结晶紫，然后在室温下培养15分钟以允许对生物膜染色。用蒸馏水洗涤孔5次，吸干，添加200μl的95％乙醇，并然后在590nm处读取培养皿。结果表示为对照和处理过的样品的O.D.之间的％差异。
制剂“A”的两个剂量化(dosification)都产生了已建立的生物膜的部分破坏。
实施例8
此实施例的目的是确定来自实施例4的制剂对生物膜的破坏的影响，其中，使用乳杆菌作为形成生物膜的细菌。以1Kg/MT的剂量添加所有制剂。如下制备生物膜的形成：
在96孔聚苯乙烯培养皿中：将100μl的营养肉汤中乳杆菌培养基添加到每个孔中，并且在厌氧室中37℃下培养48小时。培养后，用蒸馏水将培养皿洗涤5次并且吸干。干燥后，将100ul的各种制剂添加到孔中，在厌氧室中37℃下培养4小时，并然后用蒸馏水洗涤5次。吸干后，添加30μl的1％结晶紫，并且在室温下将培养皿培养15分钟以允许对生物膜染色。用蒸馏水洗涤孔5次，吸干，添加200μl的95％乙醇，并然后在590nm处读取培养皿。结果表示为对照和处理过的样品的O.D.之间的％差异。
所有配方都对抗已建立的生物膜有效。
实施例9
此实施例的目的是确定前面的实施例中引用的制剂“A”对生物膜形成的预防的影响，其中，使用乳杆菌作为形成生物膜的细菌。以0.5和1Kg/MT的剂量添加制剂“A”。如下制备生物膜的形成的预防：
在96孔聚苯乙烯培养皿中：将100μl的营养肉汤中乳杆菌培养基和100ul的以0.5或1.0Kg/MT的剂量的每种制剂“A”添加到孔中，并且在厌氧室中37℃下培养48小时。培养后，用蒸馏水将培养皿洗涤5次并且吸干。吸干后，添加30μl的1％结晶紫，然后将培养皿在室温下培养15分钟以允许对生物膜染色。用蒸馏水洗涤孔5次，吸干，添加200μl的95％乙醇，并然后在590nm处读取培养皿。结果表示为对照和处理过的样品的O.D.之间的％差异。
两种剂量的制剂“A”都降低生物膜的建立，而1Kg/MT比0.5Kg/MT更有效。
实施例10
此实施例的目的是确定来自实施例4的制剂对生物膜形成的预防的影响，其中，使用乳杆菌作为形成生物膜的细菌。以1Kg/MT的剂量添加所有制剂。如下制备生物膜的形成的预防：
在96孔聚苯乙烯培养皿中：将100μl的营养肉汤中乳杆菌培养基和100ul的以1Kg/MT的剂量的每种制剂添加到孔中，并且在厌氧室中37℃下培养36小时。培养后，用蒸馏水将培养皿洗涤5次并且吸干。吸干后，添加30μl的1％结晶紫，并且在室温下培养15分钟以允许对生物膜染色。用蒸馏水洗涤孔5次，吸干，添加200μl的95％乙醇，并然后在590nm处读取培养皿。结果表示为对照和处理过的样品的O.D.之间的％差异。
所有制剂都降低了生物膜的建立。
实施例11
此实施例的目的是测定使用制剂“A”处理的玉米或添加到发酵罐中的制剂“A”的乙醇生产。
用零(对照)或0.50kg/MT处理整个玉米，并在研磨和设置发酵程序之前将其储存过夜。将已处理的和未处理的磨碎的玉米与水混合，并在厌氧环境中室温下培养6小时。在6小时培养前将配方A添加到发酵罐中。如下面所描述的将其它试剂添加到发酵罐中。
在添加到发酵罐中之前，以1gr/10ml的量使酵母与微温水进行水合。在取样以测定酵母和酒精生产之前，使发酵罐在室温下保持恒定搅拌(低速)72小时。72小时后，取一式三份的样品/发酵罐，并接种在PDA上用于测定酵母计数。在27℃下将培养皿培养48小时并且菌落计数。
结果：
处理 酵母(cfu/gr) ％乙醇
对照 8.69×108 9.95±0.13
制剂“A”处理的玉米 8.13×108 10.60±0.89
在发酵罐中制剂“A”处理 7.94×108 12.05±0.16
与制剂“A”处理的玉米相比，添加配方A到发酵罐中提高了乙醇产量。
对本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明做出若干修改和变更而不背离上述教导的精神和范围。目的在于，本说明书和实施例应认为仅是示例性的，而不是限制性的。

Claims (20)

1.一种用于在发酵罐中使碳水化合物发酵成乙醇的高产方法，包括：
a)将发酵原料与含有酵母和/或酶的发酵液混合；
b)通过将一种组合物添加到所述发酵罐中来处理所述混合物，所述组合物含有：
10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、另一种抗菌醛，及它们的混合物组成的组；
1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
0～20wt％的抗菌萜烯或精油；
1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
1～50wt％的水；
其中，所述发酵罐中醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料；以及
c)分离乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵原料是玉米、高粱、小麦、黑小麦、黑麦、大麦、大米或块茎。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵原料是甘蔗或甜菜。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，待发酵的所述碳水化合物源自纤维素。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，细菌的耐抗生素菌株的发育被抑制。
6.一种发酵液或发酵浆料，包括：
a)待发酵的碳水化合物原料、酵母和/或酶；以及
b)一种处理组合物，含有：
10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、另一种抗菌醛，及它们的混合物组成的组；
1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
1～20wt％的抗菌萜烯或精油；
1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
1～50wt％的水；
其中，醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料。
7.根据权利要求6所述的发酵液，其中，所述碳水化合物原料是玉米、高粱、小麦、黑小麦、黑麦、大麦、大米或块茎，并且所述醛是浓度为0.25～3.0kg/MT的甲醛。
8.根据权利要求6所述的发酵液，其中，所述碳水化合物原料是甘蔗或甜菜。
9.根据权利要求6所述的发酵液，其中，所述碳水化合物原料源自纤维素。
10.根据权利要求6所述的发酵液，其中，细菌的耐抗生素菌株的发育被抑制。
11.一种用于在发酵罐中使碳水化合物发酵成乙醇的改进的方法，包括：
a)将发酵原料与含有酵母和/或酶的发酵液混合；
b)通过将一种组合物添加到所述发酵罐中来处理所述混合物，所述组合物含有：
10～90wt％的醛，所述醛选自由甲醛、多聚甲醛、戊二醛、另一种抗菌醛，及它们的混合物组成的组；
1～50wt％的HLB为4～18的表面活性剂；
0～20wt％的抗菌萜烯或精油；
1～50wt％的有机酸，所述有机酸选自C1～C24脂肪酸、C1～C24脂肪酸盐、C1～C24脂肪酸甘油酯和C1～C24脂肪酸酯；以及
1～50wt％的水；
其中，所述发酵罐中醛的浓度为约0.25～3kg/MT发酵原料；以及
c)分离乙醇；
d)收集发酵后剩余的材料，并将所述发酵后剩余的材料添加到动物饲料中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述有机酸为甲酸、乙酸、丙酸或丁酸。
13.根据权利要求11所述的方法，包括如下量的抗生素以控制细菌，该量小于没有组合物b)的发酵中所述抗生素的最小抑菌浓度。
14.根据权利要求11所述的方法，所述方法不含用于控制发酵中的细菌的抗生素。
15.根据权利要求11所述的方法，其中，细菌包括乳杆菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、梭状芽孢杆菌属、弯曲杆菌属、志贺氏菌属、短螺菌属、李斯特氏菌属、弓形杆菌属、小球菌属、葡萄球菌、肠球菌、醋杆菌属、葡糖杆菌属、巴斯德醋杆菌、枯草芽孢杆菌、肠膜明串珠菌、类肠膜魏斯氏菌以及能够在固体表面上产生生物膜的细菌。
16.根据权利要求11所述的方法，所述方法不含维吉尼霉素或硫酸。
17.根据权利要求11所述的方法，其中，所述碳水化合物原料是玉米、高粱、小麦、黑小麦、黑麦、大麦、大米或块茎，并且所述醛是浓度为0.25～3.0kg/MT的甲醛。
18.根据权利要求11所述的方法，其中，所述碳水化合物原料是甘蔗或甜菜。
19.根据权利要求11所述的方法，其中，所述碳水化合物原料源自纤维素。
20.根据权利要求11所述的方法，其中，细菌的耐抗生素菌株的发育被抑制。
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