CN111363692B - 一种复合菌剂及其发酵产物的应用 - Google Patents

一种复合菌剂及其发酵产物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合菌剂，其包括：黑曲霉AS3.316以及卷曲乳杆菌CGMCC 12743；所述复合菌剂用于发酵牛至。上述复合菌剂用于发酵牛至的方法：(1)制作牛至培养基：将新鲜牛至洗净，紫外消毒后，研磨成糊状成为牛至糊；按照如下重量份数配置牛至培养基；(2)接种黑曲霉AS3.316：将保存的黑曲霉AS3.316活化后按照1％的接种量接种于牛至培养基中，保持30℃培养48小时，期间每2小时翻动1次；(3)接种卷曲乳杆菌CGMCC 12743。

Description

一种复合菌剂及其发酵产物的应用
技术领域
本发明涉及一种复合菌剂及其发酵产物的应用，属于微生物领域。
背景技术
抗生素滥用在养殖业中问题突出,一直备受人们关注。在养殖业不断追求高生产效率的同时,抗生素替代成为一项热门研究。牛至油是世界范围内认可的天然饲料添加剂,它能较好地促进动物生长、提高动物机体免疫力,无毒副作用,是一种天然、环保、安全的理想抗生素替代品。植物牛至又名止痢草、牛膝草、小叶薄荷等,是唇形科牛至属多年生草本植物。植物牛至的花和叶均可提取牛至油,目前在饲料的应用均通过提取牛至油来添加。牛至油呈淡黄色至红棕色透明油状液体,具有百里香油似的辛辣气味,溶于乙醇和大多数非挥发性油,不溶于甘油和水。
已知牛至油增强动物机体免疫力的方式是通过提高巨噬细胞的吞噬能力,增加吞噬细胞数目,促进机体免疫器官的生长发育,提高脏器指数等发挥免疫调节作用。牛至油高剂量与低剂量添加对机体免疫力产生不同效应。高剂量牛至油不利于小鼠免疫,甚至起阻碍作用；而低剂量的牛至油可提高小鼠的体液免疫效应。但是牛至油提升动物免疫力的效果很有限。
本发明旨在提供一种用于发酵复合菌剂用于发酵牛至，可以降低成本不需要进行复杂的萃取牛至油工艺，并且提升其增强动物免疫力的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于发酵复合菌剂用于发酵牛至，可以降低成本不需要进行复杂的萃取牛至油工艺，并且提升其增强动物免疫力的效果。
牛至本身含有抗菌成分，很难寻找合适的用于发酵其的菌株。我们在大量的研究实践中，发现了特定的菌株以及发酵工艺，不仅可以快速发酵牛至，而且发酵后的产物具有很有的提升动物免疫力的效果。发酵产物可以直接用于添加于饲料，不需要进行复杂的再加工。
本发明用到黑曲霉AS3.316以及卷曲乳杆菌CGMCC 12743均由市购获得。
卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)CGMCC 12743购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
黑曲霉(Aspergillus niger)AS3.316购买于中国工业微生物菌种保藏中心。
本发明团队在研究和实践过程中，发现首先将中国工业微生物菌种保藏中心提供的黑曲霉菌株AS3.316活化后接种于牛至中发酵，此时对牛至的生物改性，不仅可以提升其效果，而且可以降低牛至对枯草芽孢杆菌的抑制，此时灭活后进一步接种卷曲乳杆菌，可以显著增加牛至提升动物免疫力的效果。
本研发团队首次将黑曲霉和卷曲乳杆菌用于发酵牛至，并且产生了很好的效果：显著提高提升动物免疫力的效果。
一种复合菌剂，其由以下两种菌组成：
黑曲霉AS3.316以及卷曲乳杆菌CGMCC 12743；
所述复合菌剂用于发酵牛至。
菌种的种子液制备：
黑曲霉：称取保藏的黑曲霉菌种，接种到黑曲霉固体培养基中24小时。挑取平板中长势较好的单菌落接种至黑曲霉液体培养基中活化，培养24h后即可作为5*107(CFU/ml)黑曲霉菌种子液，培养条件：25℃，200r/min。即可作为黑曲霉酵母种子液。黑曲霉固体培养基：5°Bé麦芽汁1.0L，琼脂15.0g，自然pH。黑曲霉液体培养基：5°Bé麦芽汁1.0L，自然pH。
卷曲乳杆菌：取一环乳酸菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成5*107(CFU/ml)卷曲乳杆菌种子液。
上述复合菌剂用于发酵牛至的方法：
(1)制作牛至培养基：
将新鲜牛至洗净，紫外消毒后，研磨成糊状成为牛至糊；
按照如下重量份数配置牛至培养基：
牛至糊10-12份，麸皮2份，玉米粉1份，硫酸铵0.1份，磷酸二氢钾0.2份；
(2)接种黑曲霉AS3.316：
将保存的黑曲霉AS3.316活化后按照1％的接种量接种于牛至培养基中，保持30℃培养48小时，期间每2小时翻动1次；
(3)接种卷曲乳杆菌CGMCC 12743：
将黑曲霉AS3.316发酵后的牛至培养基加热到80℃，保持10min，以适度灭活黑曲霉AS3.316，接种将卷曲乳杆菌CGMCC 12743活化后，按照接种量1％接种入灭活后的牛至培养基，38℃，pH4-5，继续发酵6-8小时。
本发明的优点：
首先将中国工业微生物菌种保藏中心提供的黑曲霉菌株AS3.316活化后接种于牛至中发酵，此时对牛至的生物改性，不仅可以提升其效果，而且可以降低牛至对枯草芽孢杆菌的抑制，此时适度灭活后进一步接种卷曲乳杆菌，可以显著增加牛至提升动物免疫力的效果，在动物饲养上有非常重要的意义和广阔的前景。
附图说明
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
实施例1
菌种的种子液制备：
黑曲霉：称取保藏的黑曲霉菌种，接种到黑曲霉固体培养基中24小时。挑取平板中长势较好的单菌落接种至黑曲霉液体培养基中活化，培养24h后即可作为5*107(CFU/ml)黑曲霉菌种子液，培养条件：25℃，200r/min。即可作为黑曲霉酵母种子液。黑曲霉固体培养基：5°Bé麦芽汁1.0L，琼脂15.0g，自然pH。黑曲霉液体培养基：5°Bé麦芽汁1.0L，自然pH。
卷曲乳杆菌：取一环乳酸菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成5*107(CFU/ml)卷曲乳杆菌种子液。
一种复合菌剂，其包括：
黑曲霉AS3.316以及卷曲乳杆菌CGMCC 12743；
所述复合菌剂用于发酵牛至。
上述复合菌剂用于发酵牛至的方法：
(1)制作牛至培养基：
将新鲜牛至洗净，紫外消毒后，研磨成糊状成为牛至糊；
按照如下重量份数配置牛至培养基：
牛至糊10份，麸皮2份，玉米粉1份，硫酸铵0.1份，磷酸二氢钾0.2份；
(2)接种黑曲霉AS3.316：
将保存的黑曲霉AS3.316活化后按照1％的接种量接种于牛至培养基中，保持30℃培养48小时，期间每2小时翻动1次；
(3)接种卷曲乳杆菌CGMCC 12743：
将黑曲霉AS3.316发酵后的牛至培养基加热到80℃，保持10min，以适度灭活黑曲霉AS3.316，接种将卷曲乳杆菌CGMCC 12743活化后，按照接种量1％接种入灭活后的牛至培养基，38℃，pH5，继续发酵8小时。
实施例2
菌种活化和制备同实施例1。
(1)制作牛至培养基：
将新鲜牛至洗净，紫外消毒后，研磨成糊状成为牛至糊；
按照如下重量份数配置牛至培养基：
牛至糊12份，麸皮2份，玉米粉1份，硫酸铵0.1份，磷酸二氢钾0.2份；
(2)直接接种卷曲乳杆菌CGMCC 12743：
将卷曲乳杆菌CGMCC 12743活化后，按照接种量1％接种入灭活后的牛至培养基，38℃，pH4，发酵8小时。
显微镜观察显示，卷曲乳杆菌基本上不能增殖。这证明黑曲霉的发酵可以解除牛至本身对卷曲乳杆菌的抑制作用。
实施例3
菌种活化和制备同实施例1。
只进行黑曲霉发酵：
(1)制作牛至培养基：
将新鲜牛至洗净，紫外消毒后，研磨成糊状成为牛至糊；
按照如下重量份数配置牛至培养基：
牛至糊10份，麸皮2份，玉米粉1份，硫酸铵0.1份，磷酸二氢钾0.2份；
(2)接种黑曲霉AS3.316：
将保存的黑曲霉AS3.316活化后按照1％的接种量接种于牛至培养基中，保持30℃培养48小时，期间每2小时翻动1次。
实施例4
用本发明实施例1-3的制备方法制备的发酵混合物，对猪瘟疫苗进行免疫效果试验，试验分为：空白对照组、疫苗组、发酵组和牛至油组，每组均采用健康猪10头。
材料和方法
动物：30日龄猪仔；猪瘟兔化弱毒疫苗。
方法
试验方法：空白对照组，正常饲料喂养。疫苗对照组，疫苗注射，同时正常饲料喂养。发酵组合物组2组，疫苗注射，正常饲料喂养，每日二次喂入本发明发酵组合物(每公斤体重1g)。牛至油组，疫苗注射，正常饲料喂养，每日二次喂入牛至油(每公斤体重0.05g)。
疫苗抗体水平检测
疫苗免疫前、疫苗免疫后的7天、14天、30天、60天，分别采血分离血清，采用猪瘟抗体检测试剂盒测定，结果如下(log2)：
Figure GDA0003431839870000061
Figure GDA0003431839870000071
上表数据表明，实施例1在40日龄、60日龄、90日龄时，受试猪体内猪瘟抗体水平与对照组,实施例3组，牛至油组均存在显著差异(P<0.05)，结果表明：，本发明的发酵组合物能提高猪瘟疫苗抗体滴度，大大优于疫苗对照组，牛至油组，并且卷曲乳杆菌发酵后才能大幅增加其提供免疫力的效果。
综上，本发明首先将中国工业微生物菌种保藏中心提供的黑曲霉菌株AS3.316活化后接种于牛至中发酵，此时对牛至的生物改性，不仅可以提升其效果，而且可以降低牛至对枯草芽孢杆菌的抑制，此时适度灭活后进一步接种卷曲乳杆菌，可以显著增加牛至提升动物免疫力的效果，在动物饲养上有非常重要的意义和广阔的前景。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种复合菌剂，其由以下两种菌组成：
黑曲霉(Aspergillus niger)AS3.316以及卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)CGMCC 12743；
所述复合菌剂用于发酵牛至。
2.权利要求1所述复合菌剂用于发酵牛至的方法：
(1)制作牛至培养基：
将新鲜牛至洗净，紫外消毒后，研磨成糊状成为牛至糊；
按照如下组分配置牛至培养基：
牛至糊，麸皮，玉米粉，硫酸铵，磷酸二氢钾；
(2)接种黑曲霉AS3.316：
将保存的黑曲霉AS3.316活化后接种于牛至培养基中，培养48小时，期间每2小时翻动1次；
(3)接种卷曲乳杆菌CGMCC 12743：
将黑曲霉AS3.316发酵后的牛至培养基加热到80℃，保持10min，以适度灭活黑曲霉AS3.316，将卷曲乳杆菌CGMCC 12743活化后接种入灭活后的牛至培养基，pH4-5，继续发酵6-8小时。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于：
按照如下重量份数配置牛至培养基：
牛至糊10-12份，麸皮2份，玉米粉1份，硫酸铵0.1份，磷酸二氢钾0.2份。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于：
将保存的黑曲霉AS3.316活化后按照1％的接种量接种于牛至培养基中，保持30℃培养48小时。
5.权利要求3所述的方法，其特征在于：
将卷曲乳杆菌CGMCC 12743活化后，按照接种量1％接种入灭活后的牛至培养基，pH4-5，38℃继续发酵6-8小时。
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