CN108546663A

CN108546663A - 一种猪源卷曲乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN108546663A
Application number: CN201810443254.9A
Authority: CN
Inventors: 张董燕; 季海峰; 刘辉; 王四新; 王雅民
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-05-10
Filing date: 2018-05-10
Publication date: 2018-09-18
Anticipated expiration: 2038-05-10
Also published as: CN108546663B

Abstract

本发明提供了一种耐酸耐胆盐卷曲乳酸杆菌，所述菌株保藏名称为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus ZLC020，保藏号为：CGMCC No.11531。本发明公开的菌株具有优良的抑菌性能，特别是对猪源大肠埃希氏菌有显著抑菌效果，本发明所述的菌株、相关的菌剂以及相关的饲料能提高生长猪的生产性能，改善肠道菌群组成，促进机体氨基酸代谢，具有良好的开发应用前景。

Description

一种猪源卷曲乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种猪源卷曲乳杆菌及其应用。

背景技术

饲料中长期大量使用抗生素促生长剂，能够导致肠道致病菌耐药性增强，引起畜产品安全及环境污染等问题，对动物健康和人类健康带来了威胁。欧盟已从2006年1月1日起禁止向动物饲料中添加抗生素生长促进剂。在食用动物饲料中禁用抗生素已经成为世界共识。我国农业部第2428号公告于2016年11月1日禁止了硫酸粘杆菌素作为生长促进剂使用，第2638号公告决定于2018年5月停止喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等用于食品动物生产。因此，研发新型饲料添加剂已迫在眉睫。乳酸菌类制剂作为一种新型的绿色饲料添加剂，具有安全、优质、无毒副作用，有着良好的应用前景，越来越多地受到人们重视。

卷曲乳杆菌是人和动物肠道中的正常菌，属于乳酸杆菌属。目前，有关于卷曲乳杆菌的研究主要集中在人类医学与药品研发方面。公布号CN104630083A、CN104178437A和申请号201310731833.0的国家发明专利，报道了菌株L.crispatus CGMCC 6469对加德纳菌、阿托波菌及白色念珠菌具有较好的抑制效果，应用于妇科外用药物和消毒产品中。申请号CN201510659003.0的国家发明专利，报道了由卷曲乳杆菌组成的复合物可以用于治疗或预防子宫肌瘤相关疾病，具有减小子宫肌瘤体积，降低雌二醇浓度的作用。公布号CN103074270A的国家发明专利，报道了菌株L.crispatus CGMCC 6406对浅黄色微球菌、绿脓杆菌和蜡样芽胞杆菌有抑制效果，在调节菌群平衡方面有良好作用。申请号201710586291.0的国家发明专利，报道了卷曲乳杆菌能产生III型细菌素，具有防腐及抑菌功能。有研究报道，同源乳酸菌对宿主的益生作用优于异源菌株，即理想的乳酸菌菌种最好来自于同源动物的肠道。

到目前为止，对于卷曲乳酸杆菌用于猪饲料，以提高猪的生产性能，改善肠道菌群组成还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种猪源卷曲乳杆菌。

优选的，所述菌株保藏名称为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus ZLC020，保藏号为：CGMCC No.11531。

优选的，所述菌株来源于哺乳仔猪消化道。其具有较好的、耐酸和耐胆盐性能。

所述菌株的16SrDNA的序列如下：

GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGAAAGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGATGATCAGCTTTTAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAAGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATGGGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTAAATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATGTATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATTTGTAGAGATACAAAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAACGAGACGCAACCCTTGTTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAACGACAAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCC。

该菌株的特点是抑菌性好，实验证明，当接种量为3％，42℃培养时间为72h，蔗糖添加量为5％、蛋白胨添加量为2％时，该菌株上清液对猪源大肠埃希氏菌(血清型K88)抑菌性能较强，抑菌直径在32mm以上。

优选的，所述菌株生长36h后，其生长pH值为3.8-4.1。

优选的，所述菌株生长36h后，其生长pH值为3.8。

本发明提供了一种菌剂，包含所述的菌株。

优选的，所述菌剂进一步包括冻干保护剂。

优选的，所述冻干保护剂包括：16％脱脂乳、10％糊精、0.15％谷氨酸钠、0.1％半胱氨酸、4％乳糖，其余为水。

本发明提供了一种菌剂的制备方法，包括如下步骤：

将所述菌株进行发酵培养，得到发酵液，将所述发酵液离心分离菌体，得到菌泥，向所述菌泥中加入冻干保护剂，混匀、冻干，即得到所述益生菌冻干制剂。

本发明提供了一种猪饲料添加剂，所述添加剂包含所述的菌株和/或所述的菌剂。

本发明还提供一种猪饲料，，该猪饲料包含含有所述菌株和/或所述的菌剂的猪饲料添加剂。

本发明进一步公开了所述菌株和/或所述的菌剂和/或所述的饲料添加剂和/或所述猪饲料在猪生产中的应用。

本发明进一步提供所述菌株的培养方法，其包括如下步骤：将所述菌株经活化培养及扩大培养后，移入发酵罐进行发酵培养，发酵罐温度为37℃，接种量1％，装液量为50％，转速为100r/min，最初pH6.5，自始至终维持罐压在0.05MPa，发酵周期为24h。试验证明，本发明公开的菌株除了对猪源大肠埃希氏菌有显著抑菌效果外，还能提高生长猪的生产性能，改善肠道菌群组成，促进机体氨基酸代谢，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为菌株生长OD600nm值和pH值筛选试验结果。

图2为菌株耐酸耐胆盐性能筛选试验结果。

图3为猪源卷曲乳杆菌菌体形态。

图4为卷曲乳杆菌进化树分析。

图5为猪源卷曲乳杆菌生长曲线(从左至右接种量一次为4％、5％、3％、2％、1％)。

图6为猪源卷曲乳杆菌pH值图。

图7为猪源卷曲乳杆菌在不同培养方式下抑菌结果。

图8为不同碳源对猪源卷曲乳杆菌抑菌性能的影响。

图9为不同氮源对猪源卷曲乳杆菌抑菌性能的影响。

图10猪源卷曲乳杆菌抑菌效果图。

图11为猪源卷曲乳杆菌对生长猪菌群组成(属水平)的影响(每组中上部为对照组下部为试验组)。其中：Prevotella_9:普氏菌属9；Megasphaera:巨型球菌属；Prevotellaceae_NK3B31_group:普雷沃氏菌科NK3B31群；Streptococcus:链球菌属；unclassified_f_Lachnospiraceae:未分类毛螺旋菌科；norank_f_Bacteroidales_S24-7_group:norank_f_拟杆菌目S24-7群；Prevotella_1:普氏菌属9；Selenomonas:月形单胞菌属；Lactobacillus:乳杆菌属Ruminococcaceae_UCG-002:瘤胃菌科UCG-002；Allprevotella:总普氏菌属Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9_gut_群；Phascolarctobacterium:考拉杆菌属；Ruminococcaceae_UCG-005:瘤胃菌科UCG-005.

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1乳酸菌菌株的分离

采集哺乳仔猪新鲜粪便，称取25g，置于盛有225ml无菌生理盐水的带有玻璃珠的三角瓶中，充分震荡摇匀，然后吸取1.0ml菌液于盛有9.0ml无菌生理盐水的试管中，此稀释度为10^-1，重复以上过程,依次制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液。选择10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度,吸取0.1ml菌液分别滴于上述培养基平板上，采用厌氧罐37℃培养24～48h，挑取典型菌落进行API50和16SrDNA鉴定。根据乳酸菌发酵糖类产酸使培养基变成黄色来判定菌株利用糖情况，对产生黄色圈的、不同形态的菌落进行纯化培养、革兰氏染色，镜检和过氧化氢酶试验，初步筛选出20株乳酸菌菌株。

实施例2乳酸菌菌株的筛选试验

菌株活化后，接种于MRS液体培养基中，培养24h后取一定量菌液测定OD600nm值，以不接菌为对照，观察菌株生长性能。同时将菌株接种于MRS液体培养基中培养24h，取5ml发酵液于6000rpm离心5分钟，加入5ml含有0.2％胆盐pH＝3的液体培养基中，保温2h，再以10％接种于新鲜培养基中保温4h，分别以不进行任何处理培养作为对照测定OD_600nm值，计算菌株耐酸耐胆盐性能。

经过生长、耐酸和耐胆盐性能试验筛选，见图1和图2，确定菌株R2(图中)为目的菌株(本实验室编号为L.crispatus ZLC020)，菌体形态见图3。并送至中国工业微生物菌种保藏中心进行鉴定检验及保藏。

实施例3卷曲乳杆菌的鉴定

将菌株R2(本实验室编号为L.crispatus ZLC020)送至中国工业微生物菌种保藏管理中心进行了鉴定，经生理生化特征(表1)、分子生物学鉴定，确定该菌株为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。将该菌株于2015年10月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行了保藏，菌株名称为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)ZLC020，其保藏号为CGMCC No.11531。

表1猪源卷曲乳杆菌生理生化特征

注：表中“+”表示≥90％菌株阳性，“－”表示≥90％菌株阴性。

菌株分子生物学鉴定结果，测定的菌株16srDNA的序列如下：

保藏信息如下：

菌株命名：卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus ZLC020，保藏号：CGMCCNo.11531，保藏日期：2015年10月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所邮政编码：100101。

实施例4猪源卷曲乳杆菌的生理特性

4.1生长曲线

将菌株活化后，以1％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养，分别在培养的第0，3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42h。取一定量菌液测定OD_600nm值和pH值，绘制生长曲线。结果可知，接种量为4％时，菌株生长OD_600nm值最高，生长36小时后，生长pH值为3.80。具体生长情况如图5和图6所示。

4.2培养方式对菌株抑菌性能的影响

将猪源大肠埃希氏菌(血清型K88)(以下简称大肠杆菌)活化两次，用无菌生理盐水将浓度稀释到10⁷cfu/mL，取100μL致病菌加入MH(A)培养基平板上均匀涂布，静置放30min。将已灭菌的牛津杯(外径8mm)放在已涂好的MH(A)平板上，然后取培养好的乳酸菌菌液200μL加入牛津杯中，在冰箱中静置4h，放入37℃培养箱中培养9h，测量抑菌直径，记录结果。

采用接种量(0.5％，1％，2％，3％)、培养时间(24h、48h、72h)和培养温度(37、42℃)进行了卷曲乳杆菌发酵上清液抑菌性能的研究。结果显示，菌株接种量为3％、培养时间为48h，培养温度为42℃时，对大肠杆菌抑菌直径最高，为27mm。抑菌情况如图7所示。

4.3碳源对抑菌性能的影响

在上述结果最优培养方式，对碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖)(2％、5％、10％、15％)、其中，接种量为3％，42℃培养时间(24h、48h、72h)，测定抑菌直径。结果显示，猪源卷曲乳杆菌在蔗糖含量为5％，培养72h后，菌株对大肠杆菌抑菌直径最高，为28mm。如图8所示。4.4氮源对抑菌性能的影响

在上述结果基础上，对氮源(蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨)(2％、5％、8％、10％)进行了抑菌特性测定，结果发现，随着接种量、培养时间及温度的增加，抑菌圈直径增加，其中，接种量为3％，42℃培养时间为72h，蔗糖添加量为5％、蛋白胨添加量为2％时，卷曲乳杆菌上清液抑菌性能最强，抑菌直径达32mm。如图9和图10所示。

实施例5猪源卷曲乳杆菌在生长猪生产中的应用效果

5.1猪源卷曲乳杆菌冻干制剂的制备

将猪源卷曲乳杆菌采用7.5L发酵罐扩大培养，发酵罐温度为37℃，培养基采用MRS培养基，接种量1％，装液量为50％，转速为100r/min，最初pH6.5，自始至终维持罐压在0.05MPa，发酵周期为24h。发酵结束后，采用冷冻离心机6000rpm离心，收取菌泥，加入到与离心前发酵液体积相等的冻干保护剂(16％脱脂乳、10％糊精、0.15％谷氨酸钠、0.1％半胱氨酸、4％乳糖，其余为水)中，置于冻干机中冻干23h后收取冻干粉，并进行粉碎，分装于铝箔袋中抽真空保存。

5.2动物试验

选取健康生长猪120头，随机分成2组，每组60头。对照组饲喂基础日粮，试验组日粮中添加卷曲乳杆菌冻干制剂(5.0×109cfu/kg饲料)。猪群自由采食，自由饮水，常规免疫。其他饲养管理和免疫程序均按规模化猪场统一进行，饲喂期为30天。

5.3生产性能提高

试验组饲喂猪源卷曲乳杆菌制剂后，猪群末重提高了5.52％(P<0.05)，平均日增重提高了7.32％，料重比比对照组降低了5.68(P<0.05),说明猪源卷曲乳杆菌在提高生长猪生产性能方面具有积极的作用。具体结果如表2所示。

表2猪源卷曲乳杆菌对生长猪生产性能的影响

注：同行数字肩标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)。表中数据为均值±标准差。

5.4生长猪肠道菌群结构改善

采用Illumina Miseq测序技术对菌群组成进行测定，结果见图9，由结果可知，猪源卷曲乳杆菌组猪群粪中普氏菌属(Prevotella_9)、巨型球菌属(Megasphaera)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)及月形单胞菌属(Selenomonas)等属水平比例增加，链球菌属(Streptococcus)属水平比例显著降低。由此可见，该菌株能够通过改善消化道菌群结构，促进生长猪的肠道健康。具体结果如图11所示。

5.5血清游离氨基酸变化

游离氨基酸指以游离态存在的单个氨基酸分子，可以被机体直接吸收利用。本试验结果显示，日粮中添加猪源卷曲乳杆菌制剂，显著增加了生长猪血清中丙氨酸、脯氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸含量，这说明该菌株在促进生长猪氨基酸营养代谢方面有积极作用。具体结果参见表3所示。

表3生长猪血清游离氨基酸的影响

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种猪源卷曲乳杆菌及其应用

<130> P1810155

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1390

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatttacttc ggtaatgacg ttaggaaagc gagcggcgga tgggtgagta acacgtgggg 60

aacctgcccc atagtctggg ataccacttg gaaacaggtg ctaataccgg ataagaaagc 120

agatcgatga tcagctttta aaaggcggcg taagctgtcg ctatgggatg gccccgcggt 180

gcattagcta gttggtaagg taaaggctta ccaaggcgat gatgcatagc cgagttgaga 240

gactgatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag 300

ggaatcttcc acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt 360

tcggatcgta aagctctgtt gttggtgaag aaggatagag gtagtaactg gcctttattt 420

gacggtaatc aaccagaaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480

gtggcaagcg ttgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gaagaatggg 540

tctgatgtga aagccctcgg cttaaccgag gaactgcatc ggaaactgtt tttcttgagt 600

gcagaagagg agagtggaac taaatgtgta gcggtggaat gcgtagatgt atggaagaac 660

accagtggcg aaggcggctc tctggtctgc aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta 720

gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gatgagtgct aagtgttggg 780

aggtttccgc ctctcagtgc tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac 840

cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 900

taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tctagtgcca tttgtagaga 960

tacaaagttc ccttcgggga cgctaagaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1020

gtgagatgtt ggggttaagt cccgcaacga gacgcaaccc ttgttattag ttgccagcat 1080

taagttgggc actctaatga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140

aagtcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatgggca gtacaacgac 1200

aaagcgagcc tgcgaaggca agcgaatctc tgaaagctgt tctcagttcg gactgcagtc 1260

tgcaactcga ctgcacgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga 1320

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtctgc aatgcccaaa 1380

gccggtggcc

1390

Claims

1.一种卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)菌株，其特征在于，所述菌株保藏名称为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus ZLC020，保藏号为：CGMCC No.11531。

2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株来源于哺乳仔猪消化道。

3.含有权利要求1或2所述菌株的菌剂。

4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，该菌剂为冻干制剂。

5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，进一步包括冻干保护剂。

6.权利要求3-5任一项所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1或2所述的菌株进行发酵培养，得到发酵液，将所述发酵液离心分离菌体，得到菌泥，向所述菌泥中加入冻干保护剂，混匀、冻干，即得到所述益生菌冻干制剂。

7.一种猪饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂包含权利要求1或2所述的菌株和/或权利要求3-5任一权利要求所述的菌剂。

8.一种猪饲料，其特征在于，包含权利要求7所述的添加剂。

9.权利要求1或2所述的菌株和/或权利要求3-5任一权利要求所述的菌剂和/或权利要求7所述的饲料添加剂和/或权利要求8所述的猪饲料在猪生产中的应用。