CN110938666B - 一种微生物源壳聚糖的制备方法 - Google Patents

一种微生物源壳聚糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物源壳聚糖的制备方法，其特征在于，利用赭曲霉和地衣芽孢杆菌进行混合发酵，再经过脱乙酰化工序制备壳聚糖；包括赭曲霉培养、地衣芽孢杆菌培养、收集滤渣、酸处理、脱乙酰制备壳聚糖等步骤。本发明用发酵法代替碱法去除赭曲霉菌丝体中的蛋白质，有效降低碱废液排放量；采用一步法混菌发酵代替两步法单菌发酵，发酵废液排放量大幅降低。通过本发明的方法制备的微生物源壳聚糖，杂蛋白含量低于0.10％，灰分含量低于0.43％，脱乙酰度为91％。

Description

一种微生物源壳聚糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖的制备工艺，特别涉及一种以赭曲霉与地衣芽孢杆菌混合发酵生产壳聚糖的方法属于微生物制备技术领域。
背景技术
壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-葡萄糖。壳聚糖由于它的大分子结构中存在大量氨基，是自然界中唯一一种碱性多糖，因此它在医疗、营养、保健和化妆品等领域具有广泛的应用价值。
传统生产壳聚糖主要有两个方法：(1)虾蟹壳提取法。(2)微生物发酵法。微生物发酵法相比虾蟹壳提取法具有如下优点：(1)生产原料来源稳定，产品品质稳定，差异小。(2)灰分含量较低，提取过程中需要消耗的酸液少。
目前，微生物发酵法制备壳聚糖的菌种主要为丝状真菌，但其提取方法主要借鉴虾蟹壳法，需要消耗大量碱液去除菌丝体中的蛋白质，产生大量碱废液，环境不友好。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：现有利用丝状真菌发酵生产壳聚糖的提取工艺需要消耗大量碱液，容易对环境造成污染的问题。
为了解决上述问题，本发明提供了一种微生物源壳聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)、赭曲霉发酵：将赭曲霉斜面孢子转接于种子液中培养，再将培养好的种子液转接于发酵培养基中培养，进行赭曲霉发酵；
步骤2)、地衣芽孢杆菌发酵：向步骤1)得到的赭曲霉发酵液中补加已灭菌的营养液，搅拌均匀，调节发酵液pH值至5.5～7.0，后再于无菌操作下，接入5～30g/L的地衣芽孢杆菌粉，继续进行发酵；
步骤3)、收集滤渣：将步骤2)得到的发酵液抽滤，取滤渣，再用清水洗涤滤渣至滤液无色，将滤渣烘干，并于粉碎机中粉碎；
步骤4)、酸处理：按照30g/L的比例向滤渣中加入盐酸溶液，搅拌反应，反应结束后抽滤去除酸液；滤渣用纯化水清洗数次至滤液pH值为中性，再用无水乙醇浸泡脱水3次，抽滤获得滤渣；将滤渣烘干，获得几丁质粉末；
步骤5)、脱乙酰制备壳聚糖：将几丁质粉末加入到氢氧化钠溶液中进行脱乙酰化反应，反应结束后抽滤去除碱液；滤渣用纯化水清洗至滤液pH值为中性，再用无水乙醇浸泡脱水3次，抽滤获得滤渣；将滤渣烘干，获得的白色粉末即为壳聚糖。
优选地，所述步骤1)中发酵所用的赭曲霉(Aspergillus ochraceus)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号为：CGMCC No.15668，保藏日期：2018年04月25日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述步骤1)中种子液的制备方法为：将斜面菌种于无菌操作下，刮取黄色孢子并转移至无菌生理盐水中，制备得到孢子浓度为4.0～7.0×108个孢子/mL的孢子悬液；按照10wt％接种量将孢子悬液转接于种子培养基中，于28℃恒温摇床中180rpm培养24h；将种子液按照10wt％的接种量，无菌操作下转接于发酵培养基中，在温度28℃，转速100～450rpm，通气比0.4～1.6(v/v)/min的条件下培养48h；所述种子培养基每1L包含蔗糖8g/L、酵母膏8g/L、糖蜜2.0g/L及水1L，其pH值为6.0。
优选地，所述步骤1)中种子培养基每1L包含蔗糖8g、酵母膏8g、糖蜜2.0g及水1L，其pH值为6.0；发酵培养基每1L包含蔗糖30g、酵母膏20g、黄豆粉8g、糖蜜1.5、K2HPO4 1.5g、MgSO4·7H2O 2.0g，、FeSO4·7H2O 0.01g、NaH2PO4·2H2O 1.5g及水1L，其pH值为5.5；所有培养基使用前在121℃下湿热灭菌15min，冷却后待用。
优选地，所述步骤2)中营养液每1L包含葡萄糖87.5～350.0g、酵母提取物8.75～87.5g、氯化钠17.5～140g及水1L。
优选地，所述步骤2)中调节发酵液pH值所用的调节剂为质量浓度为30％的氢氧化钠溶液。
优选地，所述步骤2)中的地衣芽孢杆菌菌粉为商品化菌剂，购买于山东中科嘉亿生物工程有限公司。
优选地，所述步骤2)中的发酵条件为：发酵温度为33～39℃，转速为100～350rpm，通气比为0.2～1.0(v/v)/min，培养时间为48h-72h。
优选地，所述步骤3)中滤渣粉碎至粒径小于60目。
优选地，所述的步骤4)中盐酸的浓度为0.1～1.0mol/L，反应温度为4～40℃，反应时间为12～24h。
优选地，所述步骤4)、步骤5)中的烘干为采用真空干燥箱45℃条件下烘干。
优选地，所述步骤5)中脱乙酰化反应所使用的氢氧化钠溶液的质量浓度为30％～50％，固液比为1:(10～30)，反应温度为90～140℃，反应时间为1～8h。
本发明采用赭曲霉与地衣芽孢杆菌进行混合发酵，是一种生产工艺简单、提取碱废液排放较小的生产微生物源壳聚糖的有效方法。本发明制得的微生物源壳聚糖，杂蛋白的质量含量低于0.10％，灰分的质量含量低于0.43％，脱乙酰度为91％。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)用发酵法代替碱法去除赭曲霉菌丝体中的蛋白质，有效降低碱废液排放量；
(2)一步法混菌发酵代替两步法单菌发酵，发酵废液排放量大幅降低。
附图说明
图1为实施例2提取到的壳聚糖与市售壳聚糖标准品的红外光谱对比图；
图2为实施例2提取到的壳聚糖样品实物图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
(1)赭曲霉培养
种子培养基：蔗糖8g，酵母膏8g，糖蜜2.0g，水1L，pH值为6.0；将其在121℃下，湿热灭菌15min，冷却后使用。
将斜面菌种，于无菌操作下，刮取黄色孢子并转移至无菌生理盐水中，调整孢子浓度为4.0～7.0×108个孢子/mL，后按照10wt％接种量转接于已经灭菌的种子培养基中，并于28℃条件下，180r/min培养24h，制得种子液。
发酵培养基：水1L，蔗糖30g，酵母膏20g，黄豆粉8g，糖蜜1.5g，K2HPO41.5，MgSO4·7H2O 2.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，NaH2PO4·2H2O 1.5g，pH值为5.5；将其在121℃，湿热灭菌15min，冷却后使用。
5L发酵罐：总装液量3.5L(体积百分70％)，将种子液350mL无菌操作接入到3150mL发酵培养基中(10wt％接种量)，培养条件为：温度28℃，转速100～450rpm，通气比0.4～1.6(v/v)/min，培养时间48h。菌体干重达到20g/L左右时，停止发酵。
(2)地衣芽孢杆菌培养：向上述发酵液中加入已经灭菌的营养液，搅拌均匀，用30wt％氢氧化钠溶液调节发酵液pH至5.5。营养液中包含17.5g的葡萄糖、1.75g的酵母提取物及3.5g的氯化钠。将地衣芽孢杆菌菌粉按照质量体积分数为0.5％的量接种于发酵液中，并进行发酵。5L发酵罐培养条件为：装液量3.5L，温度33℃，转速100～150rpm，通气比0.2～0.4(v/v)/min，培养时间48h。
(3)收集滤渣：将步骤(2)的发酵液抽滤，取滤渣，再用清水洗涤滤渣并抽滤，清洗至滤液无色。滤渣于45℃真空干燥箱烘干，并于粉碎机中粉碎，粒径为小于60目。
(4)酸处理：按照30g/L的比例向滤渣粉末中加入30倍量的0.1mol/L的盐酸溶液，4℃搅拌处理24h，后抽滤去除酸液，滤渣用纯化水清洗数次至滤液pH中性，再用无水乙醇浸泡脱水3次，抽滤获得滤渣。滤渣于45℃真空干燥箱烘干，获得白色的几丁质粉末。
(5)脱乙酰制备壳聚糖：将步骤(4)的几丁质粉末，用高浓度氢氧化钠溶液脱乙酰化，具体碱液浓度为30％，固液比为1:30，处理温度为90℃，处理时间为8h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗至pH中性；用无水乙醇浸泡滤渣3次，抽滤获得滤渣。滤渣于烘箱中45℃烘干24h，得到的白色粉末即为壳聚糖。
壳聚糖产品杂蛋白含量为0.49％，灰分含量为0.81％，收率为30％，脱乙酰度为85％。
注：壳聚糖脱乙酰度检测方法按照中国药典2015年版第四部——壳聚糖中脱乙酰度检测方法执行。
收率是指从赭曲霉干菌体到终产品壳聚糖的提取收率，计算公式如下：
Figure GDA0002368008890000041
实施例2
(1)赭曲霉发酵培养如实施例1
(2)地衣芽孢杆菌培养：地衣芽孢杆菌培养：向上述发酵液中加入已经灭菌的营养液200mL，搅拌均匀，用质量百分比浓度为30％氢氧化钠溶液调节发酵液pH至6.0。营养液中包含35g的葡萄糖、3.5g的酵母提取物及7.0g的氯化钠。将地衣芽孢杆菌菌粉按照质量浓度为10g/L的量接种于培养基中，并进行发酵。培养条件为：温度37℃，转速150～250rpm，通气量0.4～0.7(v/v)/min，培养时间60h。
(3)收集滤渣：将步骤(2)的发酵液抽滤，取滤渣，再用清水洗涤滤渣并抽滤，清洗至滤液无色。滤渣于45℃真空干燥箱烘干，并于粉碎机中粉碎，粒径为小于60目。
(4)酸处理：按照30g/L的比例向滤渣粉末中加入浓度为0.5mol/L的盐酸溶液，25℃搅拌处理18h，后抽滤去除酸液，滤渣用纯化水清洗数次至滤液pH中性，再用无水乙醇浸泡脱水3次，抽滤获得滤渣。滤渣于45℃真空干燥箱烘干，获得白色的几丁质粉末。
(5)脱乙酰：将步骤(4)的几丁质粉末，用高浓度氢氧化钠溶液脱乙酰化，具体碱液浓度为40％，固液比为1:20，处理温度为110℃，处理时间为4h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗至pH中性，再用无水乙醇浸泡滤渣3次，抽滤获得滤渣。滤渣于烘箱中45℃烘干24h，得到的白色粉末即为壳聚糖，如图2所示。
壳聚糖产品杂蛋白的质量含量为0.10％，灰分的质量含量为0.43％，收率为24％，脱乙酰度为91％。
图1中壳聚糖实验品为上述制备的微生物源壳聚糖，壳聚糖对照品为市售壳聚糖标准品。从红外图谱中可以看出样品与市售壳聚糖对照品出峰波数基本一致，可以判断样品为壳聚糖。
实施例3
(1)赭曲霉发酵培养如实施例1
(2)地衣芽孢杆菌发酵培养：向上述发酵液中加入已经灭菌的营养液200mL，搅拌均匀，用质量浓度为30％的氢氧化钠溶液调节发酵液pH至7.0。营养液中包含70g的葡萄糖、17.5g的酵母提取物及28g的氯化钠。将地衣芽孢杆菌菌粉按照质量浓度为30g/L的量接种于培养基中，并进行发酵。培养条件为：温度39℃，转速250～350rpm，通气量0.7～1.0(v/v)/min，培养时间72h。
(3)收集滤渣：将步骤(2)的发酵液抽滤，取滤渣，再用清水洗涤滤渣并抽滤，清洗至滤液无色。滤渣于45℃真空干燥箱烘干，并于粉碎机中粉碎，粒径为小于60目。
(4)酸处理：按照30g/L向滤渣粉末中加入浓度为1.0mol/L的盐酸溶液，40℃搅拌处理12h后抽滤去除酸液，滤渣用纯化水清洗数次至滤液pH中性，再用无水乙醇浸泡脱水3次，抽滤获得滤渣。滤渣于45℃真空干燥箱烘干，获得白色的几丁质粉末。
(5)脱乙酰：将步骤(4)的几丁质粉末，用高浓度氢氧化钠溶液脱乙酰化，具体：碱液浓度为50％，固液比为1:10，处理温度为140℃，处理时间为1h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗至pH中性，再用无水乙醇浸泡滤渣3次，抽滤获得滤渣。滤渣于烘箱中45℃烘干24h，得到的白色粉末即为壳聚糖。
壳聚糖产品杂蛋白的质量含量为0.08％，灰分的质量含量为0.30％，收率为19％，脱乙酰度为90％。

Claims (6)

1.一种微生物源壳聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1）、赭曲霉发酵：将赭曲霉斜面孢子转接于种子液中培养，再将培养好的种子液转接于发酵培养基中培养，进行赭曲霉发酵；所述种子液的制备方法为：将斜面菌种于无菌操作下，刮取黄色孢子并转移至无菌生理盐水中，制备得到孢子浓度为4.0~7.0×108个孢子/mL的孢子悬液；按照10wt%接种量将孢子悬液转接于种子培养基中，于28℃恒温摇床中180rpm培养24h；将种子液按照10wt%的接种量，无菌操作下转接于发酵培养基中，在温度28℃，转速100~450rpm，通气体积比0.4~1.6/min条件下培养48h；所述种子培养基每1L包含蔗糖8g/L、酵母膏8g/L、糖蜜2.0g/L及水1L，其pH值为6.0；发酵所用的赭曲霉（Aspergillus ochraceus）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号为：CGMCC No.15668，保藏日期：2018年04月25日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
步骤2）、地衣芽孢杆菌发酵：向步骤1）得到的赭曲霉发酵液中补加已灭菌的营养液，搅拌均匀，调节发酵液pH值至5.5~7.0，后再于无菌操作下，接入5~30g/L的地衣芽孢杆菌粉，继续进行发酵；所述营养液每1L包含葡萄糖87.5~560.0g/L、酵母提取物8.75~87.5g/L、氯化钠17.5~140g/L及水1L；所述调节发酵液pH值所用的调节剂为质量浓度为30%的氢氧化钠溶液；发酵条件为：发酵温度为33~39℃，转速为100~350rpm，通气体积比为0.2~1.0/min，培养时间为48h-72h；
步骤3）、收集滤渣：将步骤2）得到的发酵液抽滤，取滤渣，再用清水洗涤滤渣至滤液无色，将滤渣烘干，并于粉碎机中粉碎；
步骤4）、酸处理：按照30g/L的比例向滤渣中加入盐酸溶液，搅拌反应，反应结束后抽滤去除酸液；滤渣用纯化水清洗数次至滤液pH值为中性，再用无水乙醇浸泡脱水3次，抽滤获得滤渣；将滤渣烘干，获得几丁质粉末；
步骤5）、脱乙酰制备壳聚糖：将几丁质粉末加入到氢氧化钠溶液中进行脱乙酰化反应，反应结束后抽滤去除碱液；滤渣用纯化水清洗至滤液pH值为中性，再用无水乙醇浸泡脱水3次，抽滤获得滤渣；将滤渣烘干，获得的白色粉末即为壳聚糖。
2.如权利要求1所述的微生物源壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述种子培养基每1L包含蔗糖8g、酵母膏8g、糖蜜2.0g及水1L，其pH值为6.0；发酵培养基每1L包含蔗糖30g、酵母膏20g、黄豆粉8g、糖蜜1.5g、K2HPO4 1.5g、MgSO4·7H2O 2.0g、FeSO4·7H2O 0.01g、NaH2PO4·2H2O 1.5g及水1L，其pH值为5.5；所有培养基使用前在121℃下湿热灭菌15min，冷却后待用。
3.如权利要求1所述的微生物源壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中滤渣粉碎至粒径小于60目。
4.如权利要求1所述的微生物源壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述的步骤4）中盐酸的浓度为0.1~1.0mol/L，反应温度为4~40℃，反应时间为12~24h。
5.如权利要求1所述的微生物源壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤4）、步骤5）中的烘干为采用真空干燥箱45℃条件下烘干。
6.如权利要求1所述的微生物源壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤5）中脱乙酰化反应所使用的氢氧化钠溶液的质量浓度为30%~50%，固液比为1:(10~30)，反应温度为90~140℃，反应时间为1~8h。
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