CN102086441B - 一种灰褐链霉菌菌株、及利用该菌株制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灰褐链霉菌菌株Streptomyces griseofuscus LS-H1即CCTCC M209211、及利用该菌株制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法。灰褐链霉菌LS-H1是经筛选而获得的一株菌株，将它培养在含有碳源、氮源的培养基中，在优化条件下能积累0.7-20g/L的ε-聚赖氨酸。发酵液经离心或过滤除去菌体后，通过离子交换法分离得到ε-聚赖氨酸及其盐。本发明菌体培养简单，有利于产业化大规模生产。

Description

一种灰褐链霉菌菌株、及利用该菌株制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法

技术领域

本发明属于发酵工程、食品工程技术领域，具体涉及一种高产聚赖氨酸的微生物菌株灰褐链霉菌，将它用于聚赖氨酸及其盐的生产及具体的生产制备方法。

背景技术

聚赖氨酸是由微生物合成的L-赖氨酸同聚物，由ε-氨基与羧基通过肽键连接而成。ε-聚赖氨酸具有抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的活性，是一种性能优良的生物防腐剂。除外，还用作化妆品、基因载体、药物包被物、电子材料和环保材料。

1977年日本酒井平一和岛昭二在大量筛选D.P.阳性物质(生物碱)时发现白色链霉菌发酵液中有大量的D.P.物质，这种物质后来被证明是天然ε-聚赖氨酸(Shojl shima et al.Agric Biol Chem，1977，41(9)：1807～1809)。随后藤井正弘等人在1989年发现Streptomyces noursei也能产生ε-PL(藤井正弘等.公开特许公报[P].JP401187090A)。此后发现了不少能产生ε-PL的菌株，大多集中于链霉菌科。1989年日本Chisso公司利用白色链霉菌实现了产业化生产，几乎垄断了聚赖氨酸的国际市场。

目前，在国内也仅出现利用白色链霉菌生产ε-聚赖氨酸(如专利号2007100672507，200710057098)，利用北地孢菌生产ε-聚赖氨酸(如专利号200510037774)，利用球形节杆菌菌株生产ε-聚赖氨酸(专利号为200910025270)。即相对于国外的垄断生产，在国内ε-聚赖氨酸的生产由于菌株及技术等原因仍然受到许多限制。因此，筛选新的ε-PL生产菌株，了解ε-PL产生菌的生物多样性，开发出高效高产稳定的ε-聚赖氨酸制备方法仍是十分有意义的。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种高产ε-聚赖氨酸的微生物菌株。

本发明的另一个目的是将上述菌株用于ε-聚赖氨酸及其盐的生产，并提供其所制备方法。

上述目的可以通过以下技术方案来实现：

一种灰褐链霉菌菌株，该菌株分类命名为Streptomyces griseofuscusLS-H1，目前该菌株保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，登记入册的编号是CCTCC M 209211，保藏日期是：2009年9月27日。

经鉴定，菌株具有下述性质：

1、形态特征：

菌株在高氏一号培养基上生长较差，在酵母膏蛋白胨培养基上气生菌丝生长良好，孢子丝呈波曲状，孢子成链状排列，在电子显微镜下孢子长椭圆形至椭圆形；菌落及其背面为灰褐色至黑色。

2、培养特征

30℃培养7-10天，观察菌株在下列各种培养基上的特征。

3、生理生化特性：

(1)培养温度：在20-40℃。最适温度为30℃。

(2)明胶液化淀粉水解牛奶胨化：阳性。

(3)牛奶凝固：阳性。

(4)纤维素利用：阴性。

(5)H₂S生成：阴性。

(6)几丁质酶产生：阴性。

(7)色素产生：产黑色素。

4、16SrDNA序列分析：

菌株H1的16srDNA长度1484bp，其序列如下。

GAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCTTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCATCTTGGGCATCCTTGATGGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGATTGTGAAAGCTCGGGGCTTAACCCCGAGTCTGCAGTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGACACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACGCACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACCAGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAACC

将所测序列从GenBank数据库中的相关种进行比较，构建以1 6SrDNA全序列为基础的系统发育树，结果表明：菌株H1与链霉菌属具有较高的同源性，其中与灰褐链霉菌有高达99.7％的同源性。

归纳上述，本发明使用的是灰褐链霉菌，具体为Streptomycesgriseofuscus LS-H1，保藏号为CCTCC M 209211。

利用灰褐链霉菌制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法，具体操作方法为：

将CCTCC M 2092 11菌株斜面活化7天，在含有碳源、氮源的液体培养基中20-40℃培养，生成发酵液经离心或过滤除去菌体后，通过离子交换法分离得到ε-聚赖氨酸及其盐。

本发明使用的培养基含碳源、氮源、无机盐等营养因子。培养基配方为：碳源(葡萄糖、甘油、淀粉、麦芽糖等)1％-10％，氮源(酵母粉、牛肉膏、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等)0.2-2％，无机盐(硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸锌等)0.05％-0.2％。上述比例均为质量百分比。

本发明对碳源并没有特别的限定，可以使用葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、麦芽糖、木糖、半乳糖、棉籽糖等，可单独使用也可复合使用，其中以葡萄糖和甘油较为合适。

氮源包括有机氮源如蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆等也可采用无机氮源如(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃。上述氮源可以单独使用，也可混合使用。

ε-聚赖氨酸及其盐分离纯化：

本发明采用的ε-聚赖氨酸及其盐分离纯化是采用离子交换法。利用离心的方法(3000-5000rpm离心5-10min)除去发酵液中菌体，然后上清液进行离子交换树脂处理(离子交换树脂为阳离子交换树脂处理)，对收集液进行减压浓缩，活性炭脱色，接下来利用低级醇类或/和低级醚类，如乙醇、乙醚，沉淀得到ε-聚赖氨酸及其盐。低级醇或/和低级醚的添加量为浓缩液体积的1-5倍。

本发明制备的ε-聚赖氨酸及其盐具有下列理化性质：

(1)本产品溶于水、盐酸，微溶于乙醇，不溶于乙醚、乙酸、乙酯等有机溶剂；

(2)对茚三酮反应呈阳性，用6N的HCl水解后对茚三酮呈阳性。

(3)6N的HCl水解后，用薄层层析检测，发现水解液中生成单一的氨基酸为赖氨酸；本产品为赖氨酸的高分子聚合物。

(4)采用Sanger法，鉴定了本品的结构为ε-型结构，由一个L-赖氨酸的-NH₂与另一个L-赖氨酸的a-COOH形成的肽键连接而聚合成的高分子ε-聚赖氨酸。

本发明制备的ε-聚赖氨酸及其盐具有高阳离子性，有广谱的抑菌性，由于是L-赖氨酸同聚物，当人体食用后，可降解为L-赖氨酸这一人体必需氨基酸，进一步用于蛋白质合成或继续代谢，无任何毒性，因此它被誉为“营养性防腐剂”。

本发明制备的ε-聚赖氨酸及其盐还具有高吸水性等，可望广泛应用于医药材料、化妆品、美容剂、饲料添加剂、农药食品添加剂、电子材料、高吸水性材料及基因工程载体材料等方面。

本发明的优点：

本发明筛选得到的微生物菌株，可以生产ε-聚赖氨酸及其盐，发酵过程菌丝断裂成短杆状，没有缠绕现象发生，操作比较方便，培养条件十分粗放。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图一是本发明菌株的孢子电镜形态图。

图二是本发明菌株在固体培养基上的正面与背面形态图。

具体实施方式

以下是实施例，将对本发明进一步说明，但对本发明没有限制。

实施例1

斜面培养基：葡萄糖1.0％，蛋白胨0.2％，酵母浸膏0.1％，琼脂1.5％，pH7.5，115℃灭菌2 0min。

摇瓶培养基：葡萄糖5％，(NH₄)₂SO₄1％，K₂HPO₄0.08％，KH₂PO₄0.14％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，ZnSO₄·7H₂O 0.005％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，酵母膏0.5％，pH6.8，115℃灭菌20min。

将纯化的CCTCC M 209211在斜面培养基上30℃培养7天，然后接一环此菌的孢子于摇瓶培养基中，30℃培养72h，摇瓶转速200r/min。最后得到发酵液ε-聚赖氨酸含量为0.7g/L。

实施例2

将3L摇瓶培养基装入一个5升玻璃搅拌发酵罐，121℃蒸汽灭菌15分钟。将CCTCC M 209211用种子培养基30℃培养24h，种子培养基与发酵培养基相同。将种子液240ml接入冷却后的发酵液中，30℃培养，(通风比1：2.5vvm，搅拌速度为350r/min)，到72h时，发酵液中含ε-聚赖氨酸0.8g/L。

实施例3

同实施例2，发酵过程控制pH3.5，加葡萄糖和氮源，以维持葡萄糖浓度10g/L左右，发酵100h，发酵液中累积ε-聚赖氨酸20g/L。将发酵液离心去除菌体，上清液上732阳离子交换树脂吸附，水洗，氨水洗脱，收集液浓缩除氮，活性炭脱色，继续浓缩后用乙醇沉淀，得到ε-聚赖氨酸盐酸盐13.5g。产品的比旋光度a²⁵ _D＝+57.1(c，1 H₂O)，SDS-PAGE电泳测得分子量为5000Da。

Claims (5)

1.一种灰褐链霉菌菌株，其特征在于，该菌株分类命名为Streptomyces griseofuscus LS-H1，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 209211。

2.根据权利要求l所述的灰褐链霉菌菌株Streptomyces griseofuscus LS-H1在制备ε-聚赖氨酸及其盐中的应用。

3.利用权利要求l所述的灰褐链霉菌菌株制备ε-聚赖氨酸盐的方法，其特征在于，将CCTCC M 209211菌株在含有碳源、氮源的培养基中20-40℃培养，生成ε-聚赖氨酸发酵液，发酵液经离心或过滤除去菌体后，通过离子交换法分离得到ε-聚赖氨酸盐。

4.根据权利要求3所述的利用灰褐链霉菌菌株制备ε-聚赖氨酸盐的方法，其特征在于，所述培养基的碳源为葡萄糖、淀粉、甘油、麦芽糖、木糖、半乳糖、棉籽糖、甘露糖或果糖；所述碳源可单独使用也可复合使用。

5.根据权利要求3所述的利用灰褐链霉菌菌株制备ε-聚赖氨酸盐的方法，其特征在于，所述培养基的氮源可采用有机氮源：牛肉膏、酵母膏、蛋白胨或玉米浆；也可采用无机氮源：(NH₄)₂S0₄、NH₄C1或NH₄N0₃；所述氮源可以单独使用也可以复合使用。

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